JPH0193538A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規抗腫瘍剤に関する。

〔従来の技術〕

ハイプリドーマ技術の導入によりモノクローナル抗体（
ＭｏＡｂ）の作製が可能となり、　ＭＯＡｂを用いた癌
治療の開発が広く行われるようになってきた。

ＭｏＡｂを応用した癌治療には、　ＭｏＡｂ単独（よる
ものの他Ｋ　ＭｏＡｂに放射性同位元素や抗癌剤を結合
させて標的細胞への到達性の向上を目標とする方法があ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ＭｏＡｂ　　単独による治療は血液筋に対して一定の成
果が報告されているが未だに長期間の寛解を得るには至
っておらず、アイソトープ結合ＭｏＡｂ　　の抗ｍ瘍効
果も十分であるとはいえない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、Ｙハプテンを認識する抗体と細胞毒性物質を
結合させた抗腫瘍剤に関する。

Ｙハプテンは蛋白質や脂質に結合した糖鎖の末端が下記
の構造を有するもので、このＹハプテンを認識する抗体
としては例えばＮＣＣ−１３Ｔ−４３，Ｓがあげられる
。

ＮＣＣ−ＢＴ−４５５は国立がんセンター病理部におい
てヌードマクス町移植性ヒト胃癌株を抗原として得られ
たＭｏＡｂであり、抗原決定基ｅｐｉｔｏｐｅはＹ−ｈ
ａｐｅｅｎであるとされている。本ＭｏＡｂは免疫組織
化学的に胃癌の７０％、大腸癌の９５・９チに陽性であ
り、一部の正常消化管上皮にも反応することが知られて
いる。

本発明に用いる抗腫瘍性物質としては、５１織への集積
性が抗議瘍効果だ関係すると言われているものが好まし
く１例えばペプロマイシン（ｐｚｐ）があげられる。

抗体と抗腫瘍性物質との結合は公知の常套手段を応用す
ることができる。例えば抗１＆瘍性物質を「７フーマコ
ａジカル・レビュー　（ＰｈａｒｍａｃＯｌ。

Ｒｅｖ、　２９巻、＋９７８．＋ｏｓ　〜＋ａ４）Ｊに
記載の方法例えばカルボジイミド法、活性エステル法、
グルタルアルデヒド法、過ヨク素駿酸化法およびブロム
シアン法などの方法に従い中間支持体に結合し１次いで
抗腫瘍性物質−中間支持体結合物を既知の方法１列えば
「有機分析化学、４２巻。

１９８４．２８３〜２９２」に記載されている方法で抗
体に結合すればよい。また予め抗体に結合した中間支持
体に細胞毒性物質を結合してもよい。

中間支持体としては多Ｓ類、蛋白質、ポリアミノ酸など
挙げられ、その具体例としてデキストラン。

血清アルブミン、トランスフェリン、ポリリジンまたは
ポリグルタミン酸が挙げられる。このような中間支持体
の利用により、抗腫瘍性を損なうことなく多量の細胞毒
性物質を抗体て結合させることができる。ポリアミノ酸
を使用する場合例えばポリリジンの場合その重合度は５
〜１５程度が好ましい。

本発明の抗腫瘍剤の製剤化および投与方法は従来公知の
種々の方法が適用できる。すなわち、投与方法としては
注射、直腸投与などが可能である。

製剤形態としては注射剤、生薬などの形態がとり得る。

製剤化の際には有効成分に悪影響を与えない限り、医薬
用に用いられる種々の補助剤、すなわち。

担体やその他の助剤１例えば賦形剤、安定剤、防腐剤、
無蒲化剤、乳化剤等が必要廻応じて使用されうる。例え
ば、賦形剤、安定剤としては、マンニトール、　乳ｍ、
マルトース、テキストラン、テンプン類、ポリエチレン
グリコールなど。

防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアル
コール、パラベン類、 無痛化剤としては、ベンジルアルコール、イノシトール
、プドワ糖、など。

乳化剤としては、ポリンルベート類、脂−肪酸エステル
類。

生薬の基材としては、脂肪酸トリグリセリド、ポリエチ
レンｆ　リ＝−−ル、ホＩＪビニルアルコール。

等が必要に応じて使用されうる。

製剤において、有効成分の含量は製剤形態等により広範
囲に変えることが可能であり、一般には有効成分を０．
０１〜１００％（重量）、好ましくは０．１〜７０％（
重量）含有し、残りは通常医薬用に使用される担体その
他の補助剤からなる。

本発明薬剤はその有効量を上記の製剤の形態でｍ癌患者
に投与される。その１日当りの投与量は。

基礎薬効実験から注射剤としては０．０１〜５ｒｎ９／
辱、好ましくはＱ、１−１　ｍ９７　Ｋｐ　、受刑では
０．０１１９−　Ｉ　Ｏ”Ｓ’／Ｋｐ、好ましくはＯ１
＋〜２Ｒ９／訃が望ましい。

〔作用〕

抗遁瘍効果の検討 対象に用いた培養ヒト癌細胞株は、付着型増殖を示すＴ
−２４（膀胱癌）、　（＝１　（大腸癌）。

Ｈｓｌａ　（子宮頂癌）および浮遊型のＫＡＴＯ［［（
胃癌）。

Ｋ５６２（白血病）である。このうちＴ−２４，Ｃ−１
、ＫＡＴＯＩＩＩへは免疫組織学的にＮ（：Ｃ−８Ｔ−
４３３關性であり、ＨｅＬａ、　Ｋ　５６２は陰性であ
ることが知られている。

被験薬剤知はＰＥＰ単独、ｐｚｐの末端ＮＨ基とｏｌｉ
ｇＱＬｙａｉｎｅ（Ｌｙ８１０）をカルボン酸を介−し
て共有結合させたもの（ＰＫＰ＝Ｌｙｅ　＋　Ｏ）　、
及び後記実施例記載のｐＫｐ＝ＬｙＢ＋　Ｏの末端とＮ
ＣＣ＝ＳＴ−４５３のＳＨ基をマレイミド基を媒介にし
て結合させたもの（ＰＫＰ＝ｈＪＣＣ−８Ｔ　−’４５
３　）の３剤を用い、ＮＣＣ−８Ｔ−４５Ｓ琳独の効果
についても検討した。薬剤の濃度はＮＣＣ−８Ｔ−４３
５は２５０μ９／ｐｉとし、他のＰＥＰ含有化合物は０
・０５〜５０μ？／Ｉｌとした。なお、このＰＫＰ＝Ｎ
　ＣＣ−８Ｔ−４３３はＮＣＣ−３Ｔ−４３５１分子に
つき８分子のＰＩＦが結合していた。

抗重瘍効果の判定はｇｒｏｗｔｈ二す七ｉｏｎ　ａｓｓ
ａｙにより行い。

浮遊型細胞は２４穴の、付着型細胞は６穴のＦａｌｃｏ
ｎ　ｐｌａｔｅｓに５Ｘ１０４の細胞を播種し、付着型
細胞は２４時間の予備培養ののちに、浮遊型細胞は直ち
に各種薬剤と接触させた。薬剤の接触時間は７２〜９６
時間とし培養終了時に細胞数を測定し、（１−治療群の
細胞数／対照群の細胞数）Ｘ＋ＯＯを増殖抑制率とじた
。薬剤濃度と増殖抑制率の間で標本回帰方程式を導き５
０％抑制濃度（工Ｃ３ｏ）を算出した。

ＰＩ！：Ｐ＝ＮＣＣ−ｓ’ｒ−４３３のｉｎｖ、ｉ七「
０における抗ｍｇＪ効果を図４〜６１表１に示した。

第４図はＫＡＴＯＩＩＩに対する各種結合体の抗腫瘍効
果を示している。ｐｚｐ単独、　　ＰＩＦ＝＝Ｌ７Ｅ＋
１０．ＰＥＰ＝ＮＣＣ−８Ｔ−４１５の３剤はいずれも
用量依存的にＫＡＴＯ［１の増殖を抑制し、その抗腫瘍
効果はＰＲ：Ｐ＝ＮＣＣ−ｓ’ｒ−４ｓ　５　）Ｐ　Ｐ
　Ｐ＝Ｌ７＋１１０　＞ｐ　ｚ　Ｐ単独の順〈高かった
。ＮＣＣ−８Ｔ−４５５２５０μｆ／ａｔ単独の効果は
示されなかった。

第５図にＴ−２４に対する各種薬剤の抗Ｗ１瘍効果を示
した・。Ｔ−２４に対してもＭｏＡｂ単独の抗腫瘍効果
は低かった。ＰＥＰ単独、　ＰＫＰ＝Ｌ７（１１０゜Ｂ
Ｅ！Ｐ＝＝ＮＣＣ−ＥＩＴ−４３３の３剤はいずれも投
与量依存的にで−２４の増殖を抑制したが、３剤のｄｏ
ｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｃｕｒｖｅはほぼ同等であり
。

ＫＡＴＯ［［におけるような差は認められず、工Ｃ５０
も０．０９〜０．１６μｆ／／ｎｌと近似していた。

第６図ＫＮＣＧ−８Ｔ−４３５陰性（１）Ｋ５６２に対
する各種薬剤の抗腫瘍効果を示した。ｐｌｊｐ＝Ｌｙｓ
１０．ＰＦｌｆＰ＝ＮＣＣ−８Ｔ−４５ｓの抗腫瘍効果
はいずれもＰＥＰ単独のそれよりも優れていたが、結合
体２剤の効果のあいだには著しい差はなく、工Ｃｓｏか
らみると、Ｐ！ｌ１Ｐ＝１７日＋０．０．２２μｐ／ｄ
、ＰＥ１Ｐ＝＝ＮＣＣ−９Ｔ−４３３０，３７μｆ／ｘ
ｔとむしろＰ　Ｋ　Ｐ　＝　Ｌｙｇｌｏのほうが　ＰＥ
Ｐ＝ＮＣＣ−８Ｔ−４３３よりも高い抗腫瘍活性を示し
た。

表１に５種類の培養細胞株に対するｐｉｐ単独（Ａ）、
Ｐ　ＴＢ　Ｆ　＝＝Ｌｙａ１０（Ｂ）、ＰＺＰ＝ＮＣＣ
−８Ｔ−４３５（Ｃ）の抗腫瘍効果を工Ｃ３ｏｌＣシて
示した。

Ｐ　Ｅ　Ｐ　＝＝　Ｌ７１１１０およびＰＫＰ＝＝ＮＣ
Ｃ，−８Ｔ−４３３のＬｎ　ｖｉｔｒｏ　　Ｋおける控
遁瘍活性１４’ｌ’−２４を除く４株においてＦＤＰ単
独の効果よりも優れていた。Ｔ−２４においてはＰＥＰ
単独の抗腫瘍効果は二種類の結合体とほぼ同等であった
。

Ｐ　！！！　Ｐ　＝　ＩＪ７Ｅ１１０とＰＥ１Ｐ＝＝Ｎ
ＣＣ−８Ｔ−４５３の抗腫瘍効果は％１（ＣＣ−ＦＥＴ
−４５Ｓ陽性のＴ−２４と陰性のＫ　５６２　、　Ｈｅ
１ａではほぼ同等であったが、抗体陽性のＫＡＴＯ■に
おいてはＰＥＰ＝ＮＣＣ−８Ｔ−４５５の効果がＰ　Ｅ
　Ｐ　＝＝　Ｌ７日１０のそれよりも優れていた。しか
しながら同じく抗体陽性のＣ−１においてはＰＫＰ＝Ｌ
ｙ８１０のぼうがｐＨ！Ｐ＝ＮＣＣ−ＢＴ−４３ｓより
も高い抗腫瘍活性を示した。

〔効果〕

ＭＯＡｂと薬剤を結合するにあたっては、　ＭｏＡｂの
抗体価と薬剤の抗腫瘍活性とを低下させずに、比較的高
濃度で薬剤を導入することが望まれる。木根においては
ＰＦｉＰの抗腫瘍活性に影響の少ない末端のＮＨ基にカ
ルボン酸を介してｏｌｙｇｏｌｙｓｉｎ。

を結合サセ、　ｏｌｙｇｏｌｙａｉｎ８１個につき５個
のＰＥＰを結合させることができた。このＰ　Ｆ！　Ｐ
　＝　Ｌｙｓ＋０はｉｎ　ｖｉｌ：ｔｏにおいてはｐｚ
ｐ単独よりも抗腫瘍活性は高＜、ＮＣＣ−８Ｔ−４３３
抗原の陽、陰性とは関係なく４株の増殖を非特異的に抑
制した。

Ｐ　Ｅ！　Ｐ　＝　Ｌ７８ｉｏの１０個の１ｙｓｉｎｅ
のうちｐｇｐの結合していない５〜６個の１ｙｓｉｎｅ
は（＋）に荷電をきたすものと考えられることから、こ
の（＋）荷電が腫瘍細胞の（−）荷電と親和性を有しｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏにおける抗腫瘍活性を増強させたのかも
しれない。

ＰＥＰ＝ＮＣＣ−ＳＴ−ａ　５３のＩＨｖｉｔｒｏにお
ける抗腫瘍活性はＮＣＣ−８Ｔ−４５３陰性のに５６２
とＨｅ１ａ　テはＰ　Ｅ　Ｐ　＝　１７１１１０とほぼ
同等であったが、抗原陽性のＫＡＴＯ■ではＦＤＰ：Ｌ
７１１１０より優れ、Ｃ−１ではＰ　Ｋ　Ｐ　＝　Ｌｙ
ｇｌｏに劣り、Ｔ−２４ではほぼ同等であった。Ｔ−２
４においてはＰＥＰ単独の効果が工Ｃ５００，１０μ９
７ａｔと５株中もつとも強（、このために３剤の差が十
分に現われなかった可能性がある。またＮＣＣ−３Ｔ−
ａ３５の抗原性同定は組織において免疫組織学的に行わ
れているためて、抗原の質的証明は可能であるが、これ
ら３株の間には抗体の量的な差があり、ＰＥＰ＝ＮＣＣ
−９Ｔ−ａ３３の抗謹瘍性が発揮されなかったことも考
えられる。

以上のことから、ＰＫＰ＝ＮＣＣ−ｓ’ｒ−４５３はＰ
ＩＦの抗腫瘍活性とＮＣＣ−５’ｒ−４３５の抗体価を
低下させずに、抗体１個につき８分子のｐＥＸｐを結合
させ得ることから、　　ｉｎ　ｖｉｆ、ｒｏのｅａｒｇ
θｅｉｎｇ薬剤として有用であろうと考えられた。

なお、ＮＣＣ−８Ｔ−４３３はヌードマウス可移植性ヒ
ト胃癌株ＳＬ−４を抗原として作製されたＩｇＭ型のＭ
ｏＡｂであり、胃癌、大腸癌の多くに陽性であり正常組
織における反応は限られている。実際に本抗体に　Ｉを
標識してヒト胃癌を担癌したヌードマウスに投与したと
ころ、投与後３〜６日目に腫瘍部に一致した高率のアイ
ソトープの集積がガンマンカメラによって観察されてお
り、肝。

牌等の正常組織における取り込みは軽度であった。

また本抗体は免疫組織化学的検索による高い組織陽性率
にもかかわらず流血中の陽性率は比較的低いことから、
　　ｃｙｔｏｔｏｘｌｃ　ａｇｅｎｔの担体として有用
であろうと考えられた。

〔実施列〕

第’　図ｆＣ工ｇＭ　Ｗ　ＭＯＡｂ　Ｎ　ＣＣ−Ｓ　Ｔ
　−４３３、！：ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ　（ＰＥＰ：　
　５−（（Ｓ）−＋’−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉ
ｎｏ）ｐ　ｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ　ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ
、日本化薬株式会社、東京）の結合方法を要約した。

ＰＥＰの末端側に位置する二級アミンに還元的なアルキ
ル化を行いカルボキシメチル基を導入した。このカルボ
ン酸とオリゴリジン（Ｌｙｓ＋ｏ　）の側鎖のアミノ基
の間で共有結合を行い、　Ｌｙｅｄ）１分子につき５分
子のＰＥＰを結合させた（ＰＥＰ：　Ｌｙｓｌｏ　）　
、　ツいでＬｙｓ　＋　０のｔ−ブチルオキシカルボニ
ル基を除去し、マレイミド基を導入した。

ＭｏＡｂ　Ｎ　ＣＣ−Ｓ　Ｔ　−４５３をシスティン処
理し単量体（ＩｇＭ日）を作製した。マレイミド基を導
入したＰ　Ｋ　Ｐ　＝　Ｌｙｓ＋ＯとＮＣＣ−８Ｔ−４
Ｓ　３ＴｇＭｓを２０！１の割合でリン酸緩衝液（ｐＥ
ｆ　７．２）中で３７℃１時間反応させ、ｐｚｐとＮＣ
Ｃ−３Ｔ−４５３の結合体（ＰＢ’Ｐ＝＝ＮＣＣ−８Ｔ
−４３！Ｓ）を合成した。

５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００（ｓｕｐｅｒｆｉｎｓ
）　　２５０　ｍｌカラムを用いてゲル濾過を行い、Ｐ
ＫＰ＝＝ＮＣＣ−８Ｔ−４３３を原料および重合体より
分離した。溶出Ｗ、　Ｉｃ　ハｏ、　ｏ　５　モ＃　ｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（
ｐＨ７，５）を用い、流速７．４　ａｔ　／　ｈｒ、分
画Ｌ８５Ｋｔ／１ｕｂｅの条件で操作した。ゲル濾過に
よりｆ「６２−６９の部分を採取し、紫外部吸収および
ＦＤＰ中の銅の原子吸光の測定によりＮＣＣ−８Ｔ−４
３３とｐｚｐの結合量を推定した。なおマーカー蛋白質
にはフェリチン４４０に、ノーマルラビットエｇ０１４
８に、　ミオグロビン１７．８Ｋを用いた。

Ｐ　ＴＤ　Ｐ　＝　ＬｙｌｉＮＯの組成を検討するため
に：、ＰＥＰ分子内スレオニンとＬｙｓＩＱのリジンの
比をアミノ酸分析により測定したところ、ＬｙＢｌｏ　
１分子につきＦＤＰ　５分子が結合していることが明ら
かとなった。さらにコＯＰ　Ｆｉ　Ｐ　＝　Ｌｙｇｌｏ
とＮＣＣ−３Ｔ−４３３を結合させたＰＫＰ＝ＮＣＣ−
８Ｔ　−４３５をゲル濾過にかけた成績は第２図のごと
くである。高分子域にはＦＢＣＰ＝ＮＣＣ−８Ｔ−４３
３の重合体が認められ、Ｐ１ｉｉＰ＝ＮＣＣ−８Ｔ−４
３３の単量体は分子量約２０万の部位より回収された。

これより小さい分子量約１万の部分には非結合体である
Ｐ　Ｅ　Ｐ　＝　Ｌ７８１ｏが分離された。

ＰＫＰ＝＝ＮＣＣ−８Ｔ−４３３の組成を紫外部吸収お
よびＰＥＰ中の銅の原子吸光により測定したところ、Ｎ
ＣＣ−８Ｔ−４３５抗体１分子に結合するＰＥＰは約８
Ｍであることが明らかとなった。

以上の成績からＰＥＰ＝：ＮＣＣ−８Ｔ−４３５の構造
を模式的に示したものが図５である。

ＬｙｓＩＱ　１分子につき４〜５分子のＰＥＦがカルボ
キシメチル基を介して結合しており、このＰＥＰ＝Ｌｙ
、ｓｌｏはマレイミド基゛を媒介にし−て工ｇＭ単量体
のＮＣＣ−８Ｔ−４５５のＳＨ基に各１個計２個結合し
ている。この構造模式図から、ＮＣＣ−８Ｔ−４５５の
抗体活性を有するＦ（ａｂ）　　基はブロックされず、
ＰＥＰは末端のＮＨ基を介してＬ７ｓ＋　Ｑと結合して
いるために抗腫瘍活性を維持しているであろうことが推
測された。

参考列　Ｙハプテンを認識するモノクローナル抗体の作
製 ヒト胃低分化盟腺癌のヌードマウス移植株（Ｓｔｆ７ｃ
　ｎｕ／ｎｕ　（胸腺欠損ヌードマウス）の皮下に移植
し、約１ケ月半後、牒瘍最大径が１０都となった。

一方、　ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／＋ヌードマウスの１匹の牌
臓を細切後、ステンレスメツシュを通し生理食塩水０．
５ｄを用い細胞浮遊液としこれを前述のＢＡＬＢ／Ｃｎ
ｕ／ｎｕ担癌フウス（約１０鑓の腫瘍を持ったＢＡＬＢ
／Ｃｎｕ／ｎｕ）の腹腔内に投与した。

投与後１ｔ月で腫瘍は消失した。そこで５ｔ−４のホモ
ジネート０．２　ｄ　ｔ−ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕの腹
腔に投与した。その３日後に７９スから牌臓を摘出した
。

細胞融合の方法は、渡辺等の方法（免疫実験操作法■、
２９６５〜２９６７．１９７８）に準じて行った。

即ち、摘出した牌臓を細切したのち、ステンレス）７’
／ユを通し、　　１’５００　ｒｐｍ、２　ｏｏ（）で
遠沈して得た沈渣に５０ｄの０．７％ＮＨ４Ｃｌを加え
赤血球を除き、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄して得た
牌細胞１×１０　個に、マウス骨髄遁細胞（Ｐ３−ＸＡ
３−Ａｇ８−σ１　）（以下Ｐ３Ｕ　１という）をＲＰ
Ｍニー１６４０で２回洗浄して得たＰＳσ１２Ｘ＋Ｏ個
（５：１）ｔ”混合１．．２００ｒｐｌ！１，２００Ｇ
で１０分間遠沈した。沈澱細胞をよ（ときほぐした後、
４５％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール４０００（
メルク社）を含有した３７℃、ｐＨ７，４のＲＰＭニー
１６４０．１ｍ（を加え８分間処理した。

反応１分後からＲＰ、Ｍニー１６４０を徐々に加え総量
４０ゴとして細胞融合を終了した。１１０００ｒｐ、１
００Ｇで遠沈後１０チ牛脂児血清を含んだＲＰＭニー１
６４０　４Ｑｄを加えて細胞浮遊液を作り３７℃、５％
ＣＯ２充填培養器中で培養した。２４時間後、ＥＡＴ培
地（ヒポキサンチン。

アミノプテリン、チミジン１０％牛脂児血清）に入れ換
え、　Ｃｏｇｔａｒ　ｍ１ｃｒｏ　ｃｕｌｔ、ｕｒｓ　
ｐｌａｔｅ　Ｋ　、　１ウエルあたり０．２ｄずつ分注
培養した。１０日日日上清を取り出し、胃癌組織のホル
マリン固定・（ラフイン切片を酵素抗体法で染色するこ
とにより抗体産生の有無を確かめ、抗体産生が陽性を示
したウェル中のハイプリドーマを１ウエルあたり０．６
個となるよう限界希釈法によりクローニングラ行った。

培地は最初ＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン、１０％牛
脂児血清）を用い、　ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙ−ｅ「とし
てＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃｎｕ／　＋　マウスの胸腺細
胞５×１０　ウェルを加えた。次に１０チ牛脂児血清を
加えたＲＰＭニー１６４０培地に置換した。

限界希釈法によるクローニングは２回行った。

また、大量培養には１ウエルのハイプリドーマを５クエ
に、’　２４　ウニｒ−ｋ　（Ｆａｌｃｏｎ　３Ｇ０８
）と増量しながら、最終的にはＦ’ａｌｃｏｎ　ｅｉｓ
ａｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｌ−ａａｋ培養で得た上滑
にＮａ　Ｎ　５を０．１％加え４℃にて保存した。

種組織の染色はＥｌｓ　ｕ、　１３．Ｍ。等の方法（Ｊ
、　Ｈ１ｓ七ｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｏｍ−、２９，５７７〜５８０．１９８１
　）に準じてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複
合体法によるホルマリン固定、パラフィン切片の染色に
より行った。即ち、広く一般的に用いられている１０チ
ホルマリン固定後パラフイン包埋、薄切されたヒト胃癌
組織、他のヒト癌組織及びヒト正常組織を脱パラフイン
後、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにて２０分間処
理した。その後リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗った後
、１０％正常豚血清を含むＰＢＳＫて３０分間処理した
。

次いで、抗体を含む溶液と室温で２時間反応させ、更だ
４℃で一夜反応させた。そしてＰＢＳで１５分間洗った
後、ビオチン化抗ヤクス免疫グロブリン（７・５μ９／
ｒｄ　）にて３０分間処理した。これをＰＢＳで゛１５
分間洗った後、アビジンＤＨ−ビオチン化ペルオキシダ
ーゼ複合体と室温で３０分間処理した。これをＰＢＳで
１５分間洗った後。

ジアミノベンチジン溶液（５０ｍ９ジアミノベンチジン
、０．００６チＦｉ２０２．トリスバツハア−ｐＨ７，
６）Ｋて５〜１０分間反応させた。細胞核をへ一’）キ
シリンにて染色後１通常の方法で封入し検鏡した。

４００ウエル中７８ウエルについて産生抗体ノ反応性を
調べ、その中から、免疫組織学的検索で大腸癌２５／２
６、胃癌７　／　１０　、肺小細胞癌７／ａ、　ＶＣ反
応し、正常組織では胃底腺、近位大７暢。

膀胱上皮と反応するモノクローナル抗体を産生ずる・・
イブリド−７１株を選択した。

抗原決定基の検討は免疫組織化学的分布、および薄層ク
ロマドグ多フィーで展開された糖脂質との免疫反応から
行われ、このモノクローナル抗体はＹハブテンを認識す
ると考えられた。また、このモノクローナル抗体は、す
でに知られているＹハブテンを認識するモノクローナル
抗体ＡＨ−６で、その抗厚への結合が阻害されることが
わかった。なおこのモノクローナル抗体の免疫グロブリ
ンのクラスは工ｇＭであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はペプロマイシンとＮＣＣ−８Ｔ−４５５の結合
方法を示したものである。 第２図はゲル濾過によるＰＥＰ＝ＮＣＣｓ’ｒ−４３３
の分離のパターンを示したものである。 第Ｓ図はペプロマイシン＝ＮＣＣ−８Ｔ−４５３の構造
模式図である。 第４図はペプロマイシン結合体のＫＡＴＯ［［ｌＣ対す
る効果を示したものである。 口ＰＥＰ（工Ｃ５０：　０．９５μＶａｔ　）○　Ｐ　
　Ｆｉ　　Ｐ　　−ＣＭ　　−Ｌｙｓ＋０　−　○Ｅ七
（工Ｃｓｏ　：　０．４　ｐ　μＶｍｌ　）・ＳＴ　４
Ｓ　５　（ＰＥＰ−ＣＭ−Ｌｙａｌｏ　）ＣＱｎｊｕｇ
ａｔｓ　（工Ｃ３（１：　０．１４μ９／！Ｌりム５Ｔ
４３３　（２５０μ９７ｍｅ　）Ｃｅｌｌ　　：　Ｋ　
Ａ　Ｔ　Ｏ■（７２ｈｒ　ｅｒｅａｅ、　　）第５図は
ペプロマイシン結合体のＴ−２４に対する効果を示した
ものである。 口ＰＥＦ　（工Ｃｏｏ　；　ｏ、　１ｏ　Ｉｔ９／ｒｔ
ｌ　）ＱＰ　　Ｅ　　Ｐ　　−ＣＭ　　−Ｌ７Ｅ＋１０
　−　０Ｊｌｆ：ｅ　　　　（工Ｃ５ｏ　：Ｑ−０９ｐ
？／ｐｔｌ　） ・ＳＴ　４３３−（ＰＥＰ−ＣＭ−ＬｙｓＮ］　）ｃｏ
ｎ、Ｉｕｇａｅｅ　　（工Ｃ５０：　　０．１　　ｂ　
ｐ’ｊＡｌ　）ム５Ｔ４３３（５００μ？鷹） Ｃｅｌｌ　：　Ｔ　２４　（７２ｈｒ　ｌ：ｒｅａＬ　
　）萬６図はペプロマイシン結合体のに５６２に対する
効果を示したものである。 口ＰＩＨＰ　（工Ｃ５ｏ：　０．８０μ７鷹）ＱＰ　Ｋ
　Ｐ　−ＣＭ　−Ｌｙｓｌｏ−０’Ｂｌ：（工Ｃ５ｏ：
０、２２　ｐ？／ｌｔ　） ・Ｓ　Ｔ　４　Ｓ　３−（ＰＥＰ−ＣＭ　−］Ｊ７Ｂ１
０　）Ｃｏｎｊｕｇａむｅ（ＩＣ５ｏ：　ｏ、　Ｓ　７
　ｐ９／ａｔ　）ム５Ｔ４３３（５００μ？／ｃｄ　）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｙハプテンを認識する抗体に抗腫瘍性物質を結合させた
   抗腫瘍剤。