JPH04356426A - 抗癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、上皮増殖因子受容体（
ＥＧＦＲ）を産生する腫瘍細胞に特に有効な抗癌剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
扁平上皮癌に対してはペプロマイシンあるいはその誘導
体を投与することによって治療を行っていた。しかしな
がら、この治療はペプロマイシンあるいはその誘導体に
よる副作用を高率に認めるため有効な治療方法とはなっ
ていない。

【０００３】本発明は前記した事情に鑑みてなされたも
のであり、その目的は従来のペプロマイシンおよびその
誘導体投与対象となる腫瘍細胞に対して有効で、かつ副
作用の少ない抗癌剤を提供するにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、前記目的を達
成するためペプロマイシンあるいはその誘導体と腫瘍細
胞を識別する抗体との接合体からなることを特徴として
いる。

【０００５】腫瘍細胞が食道癌や肺癌などの扁平上皮癌
細胞の場合、この細胞には上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ
Ｒ）が過剰に産生していること、及びこの扁平上皮癌細
胞のＥＧＦＲは正常細胞のそれと異なり低親和型である
ところから、その細胞を識別する抗体は低親和型のＥＧ
ＦＲに対するモノクローナル抗体が選択される。

【０００６】

【作用】本発明は、前記した構成になっているので、腫
瘍細胞を識別する抗体が腫瘍細胞上に存在する抗原と複
合体を形成し、この複合体が細胞内に陥入することによ
りペプロマイシンを細胞内に導入し、腫瘍細胞の蛋白質
合成を阻害する。

【０００７】

【実施例】ペプロマイシンの調製：市販の含銅ペプロマ
イシン（日本化薬社製）にグリオキシル酸とシアノ水素
化ホウ素ナトリウムを添加し、４０℃で２０時間反応後
、反応液を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平
衡化したＣＭセファデックスＣ−２５（ファルマシア社
製）を充填したカラムに吸着させた。その後、前記緩衝
液に０．１モル塩化ナトリウムを添加した溶液を用いて
、前記カラムに吸着した含銅ペプロマイシン誘導体を溶
出させた。次で溶出液をアンバーライトＸＡＤ−２（ロ
ーム・アンド・ハース社製）で脱塩を行い、ダウエック
ス４４（ＯＨ型：ザ・ダウ・ケミカル社製）で中和した
後、凍結乾燥を行い、本ペプロマイシンとなる含銅ペプ
ロマイシン誘導体を得た。

【０００８】腫瘍細胞を識別する抗体の調製：本抗体は
次のように調製した扁平上皮癌細胞を識別するマウスモ
ノクローナル抗体を用いた。上皮増殖因子受容体（ＥＧ
ＦＲ）を過剰に産生する扁平上皮癌細胞（Ａ４３１）を
抗原とし、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫し、その脾細胞と
マウス骨髄細胞を細胞融合させた。このときの融合はポ
リエチレングリコール（分子量４０００，シグマ社製）
中で行い、スクリーニングはＥＬＩＳＡ法によって行っ
た。この融合で得られたハイブリドーマを１５％牛血清
を含んだＲＰＭＩ１６４０培地で増殖した後、プリスタ
ンを投与したＢａｌｂ／ｃヌードマウスの腹腔内に細胞
（１０８　／匹）を投与し、約３週間後、腹水を取出し
た。この腹水はその後遠心分離を行い、その上澄をプロ
テインＡカラム（ファルマシア社製）にかけて精製し、
本抗体となるマウスモノクローナル抗体を得た。

【０００９】ペプロマイシンと腫瘍細胞を識別する抗体
との接合体の調製：本ペプロマイシンをジメチルホルム
アミドで溶解後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド，及び
ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、室温で２０
時間反応させた。反応液はアセトン沈殿法により未反応
液を除去し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
溶解した本抗体を添加して室温で６時間反応後セファデ
ックスＧ−５０（ファルマシア社製）を充填したカラム
にかけて精製した。この精製により本接合体は素通り分
画に溶出されて得られた。

【００１０】実験例：本接合体の殺細胞効果，および抗
腫瘍効果を次の方法で判定した。 供試腫瘍細胞 供試腫瘍細胞の種類と、各細胞のＥＧＦＲ数は表１に示
す通りである。

【表１】

【００１１】方　　法 殺細胞効果の判定：抗癌剤として本接合体，およびペプ
ロマイシン単独（比較例）を用いた。本接合体およびペ
プロマイシン単独を０．２２μｍフィルターで除菌し、
供試腫瘍細胞培養液中に投与し、投与後７２時間後の生
存細胞数を計測した。

【００１２】細胞増殖抑制率は前記計測生存細胞数から
次式に従って算出した。 細胞増殖抑制率＝（Ｃ０　−Ｃ１　）／Ｃ０　×１００
ここで、Ｃ０　は供試腫瘍細胞に生理食塩水を投与した
（コントロール）ときの生存細胞数を、Ｃ１　は前記計
測生存細胞数をそれぞれ示す。

【００１３】抗腫瘍効果の判定：除菌した本接合体（ペ
プロマイシン量として５．２μｇ，２００μ１）をＡ４
３１細胞（１０７　個）を皮下に移植して腫瘍形成した
Ｂａ１ｂ／ｃヌードマウスの腹腔内に５日間にわたり、
５回投与し、推定腫瘍重量変化を観察した。投与は推定
腫瘍重量が約４００ｍｇになったとき、開始した。推定
腫瘍重量（Ｗ（ｍｇ））は、Ｗ＝０．５×Ｌ×Ｓ２　か
ら算出した。このとき、Ｌは腫瘍の長径（ｍｍ），Ｓは
短径（ｍｍ）である。

【００１４】また、同時に、比較例として、除菌された
生理食塩水（ＰＢＳ）（２００μｌ），あるいはペプロ
マイシン単独（５．２μｇ，２００μｌ）を、上記と同
じ条件にあるヌードマウスに、５日間、５回投与し、そ
の推定腫瘍重量変化を観察した。

【００１５】本接合体，ペプロマイシン単独，ＰＢＳ投
与開始後３５日して、ヌードマウスから腫瘍を切除し、
腫瘍重量測定および体重測定を行った。

【００１６】結　　果 殺細胞効果：扁平上皮癌細胞Ａ４３１，肺小細胞癌細胞
Ｈ６９に対する抗癌剤濃度と細胞増殖抑制率との関係を
示すと図１および図２の通りとなる。各図においてａは
本接合体，ｂは比較例としてペプロマイシン単独投与を
示している。

【００１７】供試腫瘍細胞において、抗癌剤の５０％細
胞増殖抑制率を示す抗癌剤濃度ＩＣ５０を求めると表２
の通りとなる。

【表２】 ａ：本接合体（本発明）　　　　ｂ：ペプロマイシン単
独（比較例）ｂ／ａ：ａに対するｂのＩＣ５０値の割合
を示す。 表１および表２から明らかなように、本接合体（ａ），
及びペプロマイシン単独（ｂ）からなる抗癌剤はＥＧＦ
Ｒをより多く産生する腫瘍細胞ほど少量で殺細胞効果を
示し、ＥＧＦＲを全く産出しない腫瘍細胞（Ｈ６９）に
対しては全く殺細胞効果を示さないことが理解できる。 すなわち、本接合体（ａ）のＩＣ５０値はＥＧＦＲを最
も多く産生するＡ４３１に対しては０．１で最も少量で
殺細胞効果を示すのに対して、これよりＥＧＦＲ数が少
なくなるＴＥ１及びＴＥ８に対しては０．７及び１．５
となる。同様にペプロマイシン単独（ｂ）のＩＣ５０値
はＡ４３１，ＴＥ１，及びＴＥ８に対してそれぞれ０．
６，２．０，及び５．０となる。

【００１８】表１および表２から、本実施例で用いた抗
癌剤ａ，ｂは腫瘍細胞のＥＧＦＲ数に依存しており、そ
の作用機序はＥＧＦＲを介したものであることを示唆し
ている。

【００１９】また、ｂ／ａ項から本接合体（本発明）は
ペプロマイシン単独（比較例）に比べて３〜６分の１の
少量で同等のＩＣ５０値が得られることが理解できる。 このことは本接合体はペプロマイシン単独に比べて数倍
の殺細胞効果を示している。

【００２０】抗腫瘍効果：Ａ４３１細胞を移植し、腫瘍
を形成したヌードマウスの腹腔内に、本接合体，ペプロ
マイシン単独，ＰＢＳを投与したとき、推定腫瘍重量の
時間的変化を示すと図３の通りになる。図３において、
ａは本接合体投与，ｂはペプロマイシン単独投与，ｃは
ＰＢＳ投与をそれぞれ示す。図３から次のことが理解で
きる。即ち、ＰＢＳ投与では、腫瘍重量は対数的に増加
している。ペプロマイシン単独投与では、投与後１０日
間は腫瘍重量の増加は抑制されるがそれ以降になると、
ＰＢＳ投与の場合と同様、対数的に増加していく。本接
合体投与では、腫瘍重量の増加が著しく抑制される。

【００２１】上記実験に用いたヌードマウスの体重変化
，実測腫瘍重量を示すと表３の通りになる。

【表３】 　　＊（　　）内の数字は使用抗癌剤のコントロールに
対する実測腫瘍重量の割合を示す。

【００２２】表３から次のことが理解できる。即ち、本
接合体，およびペプロマイシン単独のそれぞれの投与は
、その投与で得られた各実測腫瘍重量が、ＰＢＳ投与に
より得られた実測腫瘍重量の２６％，および５５％とな
り、腫瘍重量の増加を抑制することが理解できる。中で
も本接合体は前記抑制効果が顕著である。体重は本接合
体，ペプロマイシン単独，およびＰＢＳの各投与におい
て、それぞれ２．５ｇ，２．６ｇ，および７．２ｇ減少
した。

【００２３】また、本接合体，あるいはＰＢＳを、Ａ４
３１細胞に移植し、腫瘍を形成した２０匹のヌードマウ
スに５日間投与し、投与開始後２５日して、体重変化，
腫瘍重量を実測すると表４に示した通りになる。

【表４】 ＊ペプロマイシン換算量 このとき、１日の本接合体の投与量は、ペプロマイシン
に換算すると約５μｇと約１０μｇとなる。

【００２４】表４から次のことが理解できる。即ち、本
接合体投与量を増加すると、より高い抗腫瘍効果が確認
された。体重は、ペプロマイシン１０μｇ相当，ペプロ
マイシン５μｇ相当の本接合体，そしてＰＢＳ投与にお
いて、それぞれ１．２ｇ，１．２ｇ，２．７ｇ減少した
。

【００２５】以上のことから本接合体は、ペプロマイシ
ン単独よりも、抗腫瘍効果，およびその効果の持続性に
おいてすぐれており、副作用軽減の点からも、より有効
であると考えられる。

【００２６】

【発明の効果】本発明は以上述べたように、ＥＧＦＲを
産生する腫瘍組織に対して、ペプロマイシンよりも有効
な抗腫瘍効果を示し、副作用を軽減する抗癌剤を提供す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】扁平上皮癌細胞Ａ４３１に対する細胞増殖抑制
率と抗癌剤濃度との関係を示すグラフである。

【図２】肺小細胞癌細胞Ｈ−６９に対する細胞増殖抑制
率と抗癌剤濃度との関係を示すグラフである。

【図３】ヌードマウスに形成されたＡ４３１扁平上皮癌
細胞の腫瘍の推定重量と日数との関係を示すグラフであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ペプロマイシンあるいはその誘導体と
   腫瘍細胞を識別する抗体との接合体からなることを特徴
   とする抗癌剤。