JPH0195793A

JPH0195793A - 微生物によるプロピレンの製造法

Info

Publication number: JPH0195793A
Application number: JP25265487A
Authority: JP
Inventors: Hideo Fukuda; 秀雄福田; Ryuhei Ogawa; 隆平小川; Takao Fujii; 隆夫藤井
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-10-05
Filing date: 1987-10-05
Publication date: 1989-04-13
Also published as: JPH0424035B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は微生物の培養によるプロピレンの改良された製
造法に関する。

〔従来の技術〕

従来から、プロピレンは石油分解ガスや天然ガスから製
造されている。しかし、地球上でのこれらの埋蔵量には
おのずから限界がある。

微生物によるプロピレンの生成については、マツシュル
ームがエタン、エチレン、フロパン、フロピレン、ｎ−
ブタンを少量生成したとの報告（Ｅ、Ｍ、Ｔｕｒｎｅｒ
、Ｍ、Ｗｒｉｇｈｔ　、Ｔ、Ｗａｒｄ、ａｎｄＤ、Ｊ、
０ｓｂｏｒｎｅ　、Ｊ、Ｇｅｎ０Ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．
．９１　、１６７−１７６（１９７５））、および、牛
ふん中の混合菌（菌株の分離、同定をしていない）での
嫌気的メタン発酵、ならびにペニシリウム・ジギタツム
（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＡＴ
ＣＣＮ１１００８０の寒天平板培養で、少量のエタン、
エチレン、プロパン、プロピレンを検出したとの報告（
Ｊ、Ｂ、Ｉ）ａｖｉｓａｎｄ　Ｒ，Ｍ、５ｑｕｉｒｅｓ
、５ｃｉｅｎｃｅ、１１９，８８１−８８２（１９５４
））がある。しかし、これらの報告ではいづれもプロピ
レンの生成量が少く、嫌気培養か固体表面培養であり、
関与する微生物が不明確か、または、生成炭化水素の化
学構造が不明確である。

「炭素数３または／および４の炭化水素の製造法」、お
よび、「炭化水素混合物の製造法」、に関する本出Ｍ発
明者らの出願が公開（特開昭６０−８４１８７号、同６
１−９２５２９７号）されているが、プロピレン生産菌
の種類と培地に含まれるべきアミノ酸の種類が異り、プ
ロピレンの生成量にも大きな差異がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記の従来の報告では、いずれもプロピレンの生成量が
少く、嫌気や固体表面培養は工業的大量生産には必ずし
も適していない。また、微生物の種類が明確でないので
、再現性にも乏しい。

また、本出願発明者らによる前記出願では、使用する微
生物の種類、培地に含まれるべきアミノ酸の種類および
培養の方法が異り、生成するプロピレン量も必ずしも充
分ではない。

〔問題点を解決するための手段および作用〕本発明者ら
は、充分な再現性のもとで、効率のよい、微生物による
プロピレンの製造法について、種々研究を重ねた結果、
好気的培養条件下にプロピレンを生成しうる微生物、た
とえば、数種の属に属する糸状菌を好気的に培養して生
育させたのち、特定のアミノ酸の存在下に好気培養を継
続すると驚くべき量のプロピレンが生成することを見出
した。

本発明はこの知見に基くもので、プロピレンを生成する
能力を有する微生物を好気的に培養してプロピレンを生
産させる方法において、微生物を予め好気条件下で培養
して生育させ、次いでＬ　−バリン、またはＬ−バリン
とＬ−イソロイシンの存在下で好気的に継続培養し、生
成するプロピレンを採取することを特徴とする微生物に
よるプロピレンの製造法である。

本発明においては、好気条件下の培養によりプロピレン
を生成しうる微生物が用いられる。好ましい微生物はペ
ニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ペシロマイセ
ス（ｐａｅｃｉ　ｌｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　　またはリゾラプス（ｌ（
ｈｉｚｏｐｕｓ）のような属に属する糸状菌およびその
変異株である。それらの微生物のうち、プロピレン生成
量の著るしく多い代表的菌株を挙げれば下記のとおりで
ある。

ペニシリウム・シクロピウム・パル・エキヌラ）　ラム
（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　Ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ　ｖａ
ｒｅｃｈｉｎｕ　ｌａｔｕｍ）　ＩＦＯ−７７５８、ペ
ニシリウム・エクスパンスム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ　
ｅｘｐａｎｓｕｍ）ＩＦＱ−７１００、ペニシリウム・
リビドゥム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｌｊｖｉｄｕｍ）
ＩＦＯ−６１０２、ペシロマイセス・フモソＯセウス（
ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　　ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕ
ｓ）ＩＦＯ−７０７２、ペシロマイセス・カルネウス（
ｐａｅｃｉ　ｌｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｎｅｕｓ）ＩＦＯ
−８２９２、ペン０フイセス・ニレガフ　ス（ｐａｅｃ
ｉ　ｌｏｍｙｃｅｓｅｌｅｇａｎｓ）ＩＦＯ−７０６０
、アスペルギルス・クラバラス（、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ　ｃｌａｖａｔｕｓ）ＩＦＯ−８６０６、リゾラプ
ス・ヤポニクス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｓ）ＩＦＯ−４７５８など。

これらの微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、無
機塩類、その他の栄養素を含有するものであればよく、
上記に例示した微生物については通常のカビ用の培地を
用いうる。

炭素源としては、グルコース、シュクロース、マルトー
ス、澱粉、キシロース、ソルビトール、などの炭水化物
、グリセリン、エタノールなどのアルコール、醋酸、脂
肪酸などの有機酸、さらにはこれらを含有する粗原料が
用いられる。とりわけ、天然界および人為的に副生する
再生産可能なバイオマス、たとえば農産、林産、水産、
畜産などから発生する廃食源、廃棄物、あるいは、各種
製造工場から排出される工場廃水、産業廃棄物、あるい
は、公共下排水、各種工場排水などの生産的処理から副
生する汚泥類、あるいはし尿などが、この発明にとって
有用な主原料として用いられる。

これらの主原料は、使用する各種菌株によって異るが、
必要に応じて予め溶解または分解の前処理を行なうこと
もある。

窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩などが望ましい。なお、前記のようなバイオ
マスを主原料として使用する場合には、これらの窒素源
の添加を必要としないこともある。

無機塩類としては、リン酸塩、カリ塩、マグネシウム塩
、ナトリウム塩、カルシウム塩などの通常ノモのであり
、バイオマスの場合には不要のこともある。

ビタミン、アミノ酸、およびこれらを含有する酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、コーンスチーフリカーなどは
、本菌株の生育促進もしくはプロピレンの生成に寄与す
ることがある。

特に、本発明の方法では、０．２５　ｍＭ以上の２価ま
たは３価の鉄イオン、０．０８〜０．４８μＭの２価の
銅イオンを含有する培地を使用することが好ましい。そ
の詳細は後記の実施例で説明する。

プロピレン生成微生物の培養において、前記のの段階で
微生物が生育（増殖）し、次いで培養を継続すればプロ
ピレンが生成する。

本発明においては、特に継続培養をＬ−バリン、または
Ｌ−バリンとＬ−インロイシンの存在下に行う。これら
のアミノ酸を微生物の生育段階で培地に添加すると菌体
の構成に消費されて、その添加効果を示さないことがあ
るので、微生物がある程度生育した時期、すなわち継続
培養の段階をこれらのアミノ酸の添加の下に行うのが好
ましい。

Ｌ−バリン、またはＬ−バリンとＬ−インロイシンの好
ましい添加量は培地に対してそれぞれ０．１〜３ダ／ｅ
、好ましくは１〜２１／ｌであ゛る。しかしながら、微
生物がこれらのアミノ酸をその菌体構成に必要な量以上
に自己供給できる性質を持っている場合はこれらのアミ
ノ酸を培地に外部から添加する必要がないことは言うま
でもない。

培養は好気的条件、たとえば通気攪拌培養、もしくは、
静置培養で行なう。好ましくは、培地の１）Ｈは３〜８
、培養温度は２０〜３５°Ｃに制御しつ＼、各菌株によ
って最良の条件を設定する。

生成されたバイオガス中のそれぞれの炭化水素の量は次
のようにして測定されうる。培養途中または培養終了時
の被検液ｘ＝ｌ〜５　ｍｌを、予め滅菌した全容ｖ＝ｉ
ｏ〜５０ｍ１の試験管に採取し、滅菌ゴムキャップで密
栓し、２０〜３５°Ｃでｔ−１〜２４時間、往復振とう
する。使用菌株によって呼吸速度が異るので、振とう中
に酸素が欠乏しないような条件設定つまり、Ｖ、ｘ、ｔ
の水準を必要に応じて、適宜かえることが好ましい。

往復振とう終了後、試験管上方の空間部からガスシリン
ジで、Ｖ＝０．１〜２　ｙｔｔｌのガスを抜き取り、Ｆ
ＩＤ法（カラム充填剤の種類によってカラム温度を５０
〜１２０°Ｃの最適温度にかえる。注入温度も充填剤の
種類こと応じて変える。）、キャリアーガスに窒素ガス
を使う常法のガスクロマトグラフィーにかける。なお、
カラムの充填剤の好ましい例は、ｐｏｒａｐａｋ　Ｑ、
Ｘ−２８，Ｂｏｎｄ−（ｒＣ／ＰＩＣ。

Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ａｌｕｍｉｎａなどであり、測定
する炭化水素の種類によって適宜選択して使用するのが
よい。

別途、あらかじめ各種炭化水素の標準物質を使って、上
記と同じ条件下で、同じ操作で、ガスクロマトグラフィ
ーにかけ、それぞれの炭化水素の記録紙上での滞留時間
を測定しておく。また、各種炭化水素の標準物質を使っ
て、それぞれの炭化水素毎に検量線を求めておく。

上記被検ガスのガスクロマトグラフィーについて、記録
紙上の各ピーク部分の滞留時間を測定して前記標準ガス
のそれと対比して、該当する炭化水素の種類を判定する
。ついで、それぞれの炭化水素の該当部分の面積を測定
し、前記標準ガスについての検量線を使って、それぞれ
の炭化水素の量Ｅｉｎｌ　を求める。

なお、次式を使って、被検ガス中のそれぞれの炭化水素
の生成速度Ｐｉ”／ｍｌ・ｈｒを算出することができる
。こ＼に添字ｉは、被検ガス中に混在する各種炭化水素
の種類によって変ることを示している。

生成バイオガスから、目的とするプロピレンを分離、採
取するには、生成バイオガスをそのま＼ゼオライトある
いは活性炭などの適当な吸着剤に吸着して不純ガスと分
離した後に脱着したり、もしくは、予め苛性ソーダ液に
接触させて副生ずる炭酸ガスを除去した後に、上記吸着
剤に吸着、脱着することもできる。ゼオライトとしては
、モレキュラーシーブス８　Ａ、　　４　Ａ、　　５　
Ａ、およびＩＯＸ〔ユニオン昭和（燭製〕、ゼオラムＡ
−３，Ａ−４゜Ａ−５，およびＦ−９〔東洋ツーダニ業
■製〕などが使用される。また、活性炭としてはモレキ
ュラーシービングカーボン〔武田薬品工業（勾製〕など
が使用される。

〔発明の効果〕

本発明の特長としては、使用する主原料として、容易に
入手可能で、しかも再生産可能なバイオマス、とりわけ
、農産、林産、水産、畜産などから発生する廃資源、廃
棄物、あるいは、各種製造工場から排出される工場廃水
、産業廃棄物、あるいは、公共下排水、各種工場排水な
どの生産的処理から副生ずる汚泥類、あるいはし尿など
が、有利に使用できること、ならびに、本発明の方法を
実施することによって、上記主原料として使用するバイ
オマス類の一種の微生物学的な廃液処理、廃棄物処理を
行なうことに相当すること、などをあげることができる
。さらに、原油や天然ガスがらの現行製造法に較べると
、主原料が再生産可能なバイオマスであるから枯渇する
恐れのないこと、微生物の作用を利用する反応であるか
ら比較的低温、低圧の緩和な条件のもとて製造できるこ
と、本発明の方法によって副生ずる不純ガスとしては炭
酸ガスがその大部分であり、したがって目的とするプロ
ピレンの精製が容易であり、製品の純度も高いこと、な
どの特長があげられる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

〔実施例１〕８００ｍ１三角フラスコに第１表に示す合成培地（たゾ
しカルボキシ・メチル・セルロース（ＣＭＣ）を、３０
　’ｊ／ｌ培養液、ずつ添加）を１００　ｍｌずつ仕込
み、１２０°Ｃ，１５分間、加圧蒸気滅菌し、冷却後、
斜面培養した各種菌株の２白金耳ずつを接種し、常法通
り２５°Ｃで３日間、回転振とう培養機（回転半径７　
ｃｍ、　　１８０　ｒｐｍ）で前培養した。

３００ｙ／三角フラスコに、第１表に示す合成培地（Ｃ
ＭＣ無添加）を１００　ｍｌずつ仕込み、同上のように
滅菌、冷却後、上記前培養液５　ｍｌずつを移植し、常
法通り２５°Ｃで５２時間、上記回転振とう培養機で本
培養した。

このようにして得られた培養液１ゴを８４ｍ１容（１８
ｗｌ〆）の滅菌済試験管にそれぞれ採取し、滅菌水１　
ｍｌ　１または、Ｌ−バリン（Ｌ　−ｖａｇ含有液１　
ｍｌ　（元の培養液に換算して１１／ｌになる濃度（７
）　Ｌ　−Ｖａｌ液）、または、Ｌ　−Ｖａ＃とＬ−イ
ソロイシン（Ｌ　−Ｉｃｅ）含有液１ｍ１（元の培養液
に換算して、それぞれ１ｙ／４になる濃度の液）を、そ
れぞれ分注し、直ちに密栓して、２５°Ｃで１５時間往
復振とう機（ｉ−ａ　ｏ回／分、振幅３．５ａ）にかけ
てシール状態での培養を続け、バイオガスを発生させた
。なお、本文に前記したように使用菌株によって呼吸速
度が異るので、シール培養期間中に酸素が欠乏しないよ
うな条件設定が重要である。

シール培養の終了後、試験管上方の気相部からガスシリ
ンジで、それぞれ１ゴずつの生成バイオガスを抜きとり
、本文記載の方法でガスクロマトグラフィーにかけて、
目的とするプロピレンの生成速度を算出した。

結果が第２表に示されている。Ｌ　−Ｖａ＃、または／
およびＴＪ−ＶａｎとＬ　−Ｉｆｆｅの無添加時には、
いずれの菌株もプロピレンを生成しないのに、これらの
アミノ酸を添加すると、プロピレンを生成し、特にＬ　
−ＶａｌとＬ　−１１ｅを同時に添加すると、著量のプ
ロピレンを生成した。Ｐ、ｃｙｃｌｏｐｉｕｍＩＦＯ７
７５８について、Ｌ−Ｉｌｅ単独添加時の実験を追加し
、整理した結果が第３表に示されている。Ｌ　−ｖａｎ
とＬ　−Ｉｃｅ両者を同時添加すると、明らかに相乗的
な効果を示している。

現時点では詳細は不明であるが、プロピレンの生成に対
して、Ｌ　−Ｖａ＃が前駆物質的、Ｌ　−角ｅが促進物
質的な作用をもっているようにも考えられる。

以下余白注１．使用菌数：　ｐ、ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ　ＩＦＯ７
７５８注２．　合成培地使用、たゾし、上表中のＬ　　
Ｖ　ａ　ｌＮＬ　−Ｉｌｅの添加量は、いずれも１ｇ／
４培養液。

注３．第１表の合成培地組成に示すように、Ｆｅ３＋濃
度は０．０５ｍＭ、、Ｃｕ　濃度は０．０８μＭ０〔実
施例２〕３００　ｍｌ三角フラスコに、第１表に示す合成培地１
００ｍ／を仕込み、実施例１と同様に前培養、本培養、
シール培養を行なった。たゾし、Ｐ。

ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ　ＩＦＯ７７５８を使用した。また
、第１表記載の合成培地成分中のＦｅ２（ＳＯ４）ａ、
０．０１１１／ｌの代りに、第４表に記載した鉄塩を使
用し、さらに、ＣｕＳＯ４・５■２０の量を２Ｗ／ｌか
ら３　ＷＩＶＩ（培地中のＣｕ２＋濃度として０．１２
μＭ）に変更した。

結果が第４表に示されている。この結果から、培地に含
まれる鉄イオンの濃度は０．２５ｍＭ以上が好ましい。

第４表　鉄イオン濃度の影響注２９合成培地使用、たゾし、第１表中のＦｅ２（８０
４）８を上表のように、また、ＯＬ＋　　　濃度を０．
１２μＭに変更した。

注Ｉ　　Ｌ−ＶａＡおよびＬ　−Ｉｃｅを同時に１　ｆ
／／１培養液、ずつ添加した。

〔実施例３〕８００　ｍｌ三角フラスコに、第１表に示す合成培地１
００　ｍｌを仕込み、実施例１と同様に前培養、本培養
、シール培養を行なった。たゾし、Ｐ。

ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ　ＩＦＯ７７５８を使用した。また
、第１表記載の合成培地成分中のＣｕＳＯ４・５Ｈ２０
２ｍｌ／１無機塩類溶液（０，０２〜／ｌ培養液、Ｃｕ
　　として０．０８μＭ）の代りに、第５表に記載した
銅濃度に変更し、さらに、Ｆｅ２（ＳＯ４）ｓの量を０
．０１ｇ／ｌから０．２５ｆｌ／Ｉｃ培地中のＦｅ３＋
濃度として１．２５ｍＭ　）に変更した。

結果が第５表に示されている。培地に含まれる銅イオン
の濃度としては、０．０８〜０．４８μＭが好ましい。

第５表　銅イオンの影響注１．使用菌株：　ｐ、ｃｙｃｌｏｐｉｕｍＩＦＯ７７
５８注２０合成培地使用、たゾし、第１表中のＣｕＳＯ
４・５■２０　　を上表（培養液１４当りに換算）のよ
うに、また、Ｆｅ２（８０４）８をＦｅ３＋濃度として
１．２５　ｍＭに変更した。

注８．　　Ｌ−Ｆｅ６およびＬ−Ｉｌｅを同時に、１ｇ
／４培養液、ずつ添加した。

〔実施例４〕温州みかんを圧搾してジュースを搾汁した後の残渣（水
分ニア７％、固形分＝２３％、全糖：１９．４％）４０
０ｇに水約５００　ｖｒｌ添加して、ミキサーでホモジ
ネートし、硝酸ソーダを１ｇ添加し、液量を１１にして
、２．６１のミニジャーファーメンタ−に仕込み、１２
０°Ｃ１２０分間オートクレーブに入れて滅菌し、冷却
後、予め同じ培地で振とう培養したｐ、ｃｙｃｌｏｐｉ
ｕｍ　ＩＦＯ７７５Ｂ　の前培養液５０Ｍ／を移植し、
０．　Ｉ　ＶＶＭの無菌空気を通気し、攪拌回転数４０
　Ｏｒｐｍ、培養温度２５°Ｃで１０日間培養した。な
お、培地中のＬ　−Ｖａｌ含量は約０．３（／／ＩＩＸ
Ｌ−Ｉｌｅ含量は約０．１５ｇ／ｌであった。

この全培養期間を通じて、排気を１０％苛性ソーダ液槽
、水洗槽、水分分離槽に順次導いて不純ガスを除去し、
ついでゼオラムＡ−３〔東洋ツーダニ業（＋４１１製〕
の層を通過させて、さらに不純ガスを吸着除去し、通過
ガスをゼオラムＡ−４〔東洋ツーダニ業（内装〕の充填
管に導びき、吸着したプロピレンを真空吸引して脱着回
収した。

得られたプロピレンは約１．７〜であった。

Claims

【特許請求の範囲】１　プロピレンを生成する能力を有する微生物を好気的
に培養してプロピレンを生産させる方法において、微生
物を予め好気条件下で培養して生育させ、次いでＬ−バ
リン、またはＬ−バリンとＬ−イソロイシンの存在下で
好気的に継続培養し、生成するプロピレンを採取するこ
とを特徴とする微生物によるプロピレンの製造法。２　微生物がペニシリウム属、ペシロマイセス属、アス
ペルギルス属またはリゾップス属に属する特許請求の範
囲第１項記載の製造法。３　微生物微量の、好ましくは０．２５ｍＭ以上の２価
または３価の鉄イオンを含有する培地に培養する特許請
求の範囲第１項記載の製造法。４　微生物を微量の、好ましくは０．０８−０．４８μ
Ｍの２価の銅イオンを含有する培地に培養する特許請求
の範囲第１項記載の製造法。