JPH0196195A - 生体蛋白質の分離方法 - Google Patents
生体蛋白質の分離方法Info
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- JPH0196195A JPH0196195A JP62254875A JP25487587A JPH0196195A JP H0196195 A JPH0196195 A JP H0196195A JP 62254875 A JP62254875 A JP 62254875A JP 25487587 A JP25487587 A JP 25487587A JP H0196195 A JPH0196195 A JP H0196195A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucomannan
- spherical particles
- ester
- solution
- biological proteins
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- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は生体蛋白質をクロマトグラフィ法によって分離
する方法に関するものである。
する方法に関するものである。
ゲル濾過法は、分離技術として信頼性が高く、取り扱い
が簡単であることから酵素、多糖類。
が簡単であることから酵素、多糖類。
核酸、タンパク質などの分離精製の分野で重要な位置を
占めている。このゲル濾過法には充填剤として親水性ゲ
ル粒子が用いられる。例えばデキストラン、アガロース
、セルロース、ポリビニルアルコール及びポリアクリル
アミドなどの球状粒子が適用されている。
占めている。このゲル濾過法には充填剤として親水性ゲ
ル粒子が用いられる。例えばデキストラン、アガロース
、セルロース、ポリビニルアルコール及びポリアクリル
アミドなどの球状粒子が適用されている。
ところが、従来のゲル粒子では耐圧性、即ち強度が弱く
、高流速の条件で通液すると、運転中、通液圧力で粒子
が変形し、圧力損失が上昇し、分離効率が大巾に下がる
という問題があった。
、高流速の条件で通液すると、運転中、通液圧力で粒子
が変形し、圧力損失が上昇し、分離効率が大巾に下がる
という問題があった。
そこで、本発明は、前記問題点を解決すると同時に、と
くに生体蛋白質の分離に有効な方法を開発することを目
的とするものである。
くに生体蛋白質の分離に有効な方法を開発することを目
的とするものである。
とりわけ、血漿蛋白質であるアミラーゼ、トランスフェ
リン（β１−グロブリン）、γ−グロブリン、アルブミ
ン等の分離は血液の血漿成分分画製剤上極めて重要であ
り、これらは現在コーンのエタノール法（段階的にアル
コール濃度を変えて血漿蛋白質を分別沈澱する方法）、
アガロース系やデキストラン系ゲルを用いたカラムクロ
マトグラフィーにより分離されている。
リン（β１−グロブリン）、γ−グロブリン、アルブミ
ン等の分離は血液の血漿成分分画製剤上極めて重要であ
り、これらは現在コーンのエタノール法（段階的にアル
コール濃度を変えて血漿蛋白質を分別沈澱する方法）、
アガロース系やデキストラン系ゲルを用いたカラムクロ
マトグラフィーにより分離されている。
しかしコーン法は工程が多くて繁雑であり、又今のゲル
は流速がとれない（０，１〜０．３ｍＱ／ｍがせいぜい
）という問題があり、この解決が本発明の１つの目的で
ある。
は流速がとれない（０，１〜０．３ｍＱ／ｍがせいぜい
）という問題があり、この解決が本発明の１つの目的で
ある。
本発明は、架橋されたグルコマンナン球状粒子を充填し
たカラムに生体蛋白質を含む液を通液することを特徴と
する生体蛋白質の分離方法に関する。
たカラムに生体蛋白質を含む液を通液することを特徴と
する生体蛋白質の分離方法に関する。
生体蛋白質としては、各種塩基、ヌクレオシド、ヌクレ
オチド、核酸、酵素、ホルモン、その他の蛋白質が含ま
れる。具体的には動物グロブリン、植物グロブリンを含
むグロブリン類、例えば；血清グロブリン、ミオシン、
インシュリン、ジデロフィリン（トランスフェリン）、
チログロブリン、リゾチーム；アルブミン例えば血清ア
ルブミン；アミラーゼ；フェリチン；チトクロムなどの
名前を挙げることができる。
オチド、核酸、酵素、ホルモン、その他の蛋白質が含ま
れる。具体的には動物グロブリン、植物グロブリンを含
むグロブリン類、例えば；血清グロブリン、ミオシン、
インシュリン、ジデロフィリン（トランスフェリン）、
チログロブリン、リゾチーム；アルブミン例えば血清ア
ルブミン；アミラーゼ；フェリチン；チトクロムなどの
名前を挙げることができる。
本発明で使用される架橋されたグルコマンナン球状粒子
は、膨潤度１．５以上、排除限界分子量２００〜ｔｏｏ
、０００，０００（好ましくはｔｏ、ｏｏｏ以上）であ
って、かつ粒径１〜５００μｍのものである。
は、膨潤度１．５以上、排除限界分子量２００〜ｔｏｏ
、０００，０００（好ましくはｔｏ、ｏｏｏ以上）であ
って、かつ粒径１〜５００μｍのものである。
架橋されたグルコマンナン球状粒子は、グルコマンナン
のエステルを単独に、又は希釈剤と共に、水性媒質より
沸点が低く、水性媒質に溶解しないか又は僅かしか溶解
しない溶媒中に溶解させた液を原液とし、この原液を水
性媒質中に懸濁させて液滴を診成させ、次いで液滴中の
溶媒を蒸発し、得られたグルコマンナンのエステルの球
状粒子をけん化し、架橋剤と反応させて架橋を行わせる
ことにより製造することができる。
のエステルを単独に、又は希釈剤と共に、水性媒質より
沸点が低く、水性媒質に溶解しないか又は僅かしか溶解
しない溶媒中に溶解させた液を原液とし、この原液を水
性媒質中に懸濁させて液滴を診成させ、次いで液滴中の
溶媒を蒸発し、得られたグルコマンナンのエステルの球
状粒子をけん化し、架橋剤と反応させて架橋を行わせる
ことにより製造することができる。
本発明で用いるグルコマンナンのエステルは次のように
して製造する。
して製造する。
即ち、市販のグルコマンナンをそのままか、又はグルコ
マンナンを一度水に溶解させ、次にエチルアルコール中
に沈澱させたコンニャクマンナン精製物をホルムアミド
又はジメチルホルムアミド等の溶媒に溶かし、触媒とし
てピリジンを用い、酸を加えてグルコマンナンのエステ
ルを作る。
マンナンを一度水に溶解させ、次にエチルアルコール中
に沈澱させたコンニャクマンナン精製物をホルムアミド
又はジメチルホルムアミド等の溶媒に溶かし、触媒とし
てピリジンを用い、酸を加えてグルコマンナンのエステ
ルを作る。
用いる酸としては酢酸、無水酢酸、プロピオン酸、醋酸
、硝酸など、任意の有機酸や無機酸が挙げられる。
、硝酸など、任意の有機酸や無機酸が挙げられる。
酸は１種だけでなく、複数種用いて混合エステルを得て
もよい。
もよい。
次に、こうして得られたエステルを溶媒に溶かすが、溶
媒としては、後記の水性媒質より沸点が低く、かつ水性
媒質に全く溶解しないか。
媒としては、後記の水性媒質より沸点が低く、かつ水性
媒質に全く溶解しないか。
又は僅かしか溶解しないものであることが必要である。
具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭
素及びトリクロロエチレン等の塩素化炭化水素が使用さ
れ、これらを単独又は混合して用いる。
素及びトリクロロエチレン等の塩素化炭化水素が使用さ
れ、これらを単独又は混合して用いる。
グルコマンナンのエステルの溶解濃度としては前記溶媒
が蒸発除去された後１粒子が球状を保ち、充填剤として
の強度を持っておればよいのであって１通常０．５〜２
０重量％、好ましくは２〜１０重量％とする。
が蒸発除去された後１粒子が球状を保ち、充填剤として
の強度を持っておればよいのであって１通常０．５〜２
０重量％、好ましくは２〜１０重量％とする。
なお、グルコマンナンのエステルを前記溶媒に溶かす際
、前記エステルを単独で溶かしてもよいが、適当な希釈
剤をさらに加えてもよい。
、前記エステルを単独で溶かしてもよいが、適当な希釈
剤をさらに加えてもよい。
希釈剤は球状粒子を作った後、除去されて球状粒子を多
孔化せしめるために使用されるもので、具体的には、テ
トラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、エチル
ベンゼン、ジエチルベンゼン、ドデカン酸メチル、トル
エン、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール及びオ
クチルアルコール等が使われる。
孔化せしめるために使用されるもので、具体的には、テ
トラヒドロナフタレン、デカヒドロナフタレン、エチル
ベンゼン、ジエチルベンゼン、ドデカン酸メチル、トル
エン、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール及びオ
クチルアルコール等が使われる。
希釈剤の濃度としては使用するコンニャクマンナンのエ
ステルに対してｌＯ〜５００重景％、好ましくは５０〜
４００重量％である。
ステルに対してｌＯ〜５００重景％、好ましくは５０〜
４００重量％である。
以上の操作の結果、グルコマンナンのエステルを含む原
液が得られるが、本発明では、次にこの原液を水性媒質
中に懸濁させる。
液が得られるが、本発明では、次にこの原液を水性媒質
中に懸濁させる。
水性媒質としては親水性保護コロイド、例えばポリビニ
ルアルコール、カルボキシメチルセルロース、エチルセ
ルロース、メチルセルロース、可溶性澱粉並びにゼラチ
ン等が用いられる。
ルアルコール、カルボキシメチルセルロース、エチルセ
ルロース、メチルセルロース、可溶性澱粉並びにゼラチ
ン等が用いられる。
これらは０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重景％
水溶液として使用するのがよい。また、水性媒質の使度
量としてはコンニャクマンナンエステル溶液の少くとも
２倍以上好ましくは２〜５０倍容量とするのがよい。
水溶液として使用するのがよい。また、水性媒質の使度
量としてはコンニャクマンナンエステル溶液の少くとも
２倍以上好ましくは２〜５０倍容量とするのがよい。
水性媒質中に前記原液を懸濁させる方法とし ・では、
水性媒質中に前記原液を全量加え、撹拌して分散、懸濁
する方法や、水性媒質を撹拌状態とし、これに前記原液
を一度に又は滴下状に添加する方法等が挙げられる。
水性媒質中に前記原液を全量加え、撹拌して分散、懸濁
する方法や、水性媒質を撹拌状態とし、これに前記原液
を一度に又は滴下状に添加する方法等が挙げられる。
液滴中の有機溶媒を蒸発除去する時の温度としては、水
性媒質の氷点以上で有機溶媒の沸点以下の温度が用いら
れるが、蒸発除去を促進させ、かつ粒子形状を良好に保
つためには有機溶媒の沸点より１〜５℃低い温度が好ま
しい。
性媒質の氷点以上で有機溶媒の沸点以下の温度が用いら
れるが、蒸発除去を促進させ、かつ粒子形状を良好に保
つためには有機溶媒の沸点より１〜５℃低い温度が好ま
しい。
次にグルコマンナンのエステルの球状粒子をけん化する
が、その場合１球状粒子の形状をこわさずにその形状を
保ちつつ、けん化するようなけん化浴を用いることが必
要である。けん化浴の例としては水酸化ナトリウム又は
水酸化カリウムのメタノール溶液や、水酸化ナトリウム
又は水酸化カリウムを硫酸ナトリウム等の塩類水溶液に
溶解させた溶液が挙げられる。
が、その場合１球状粒子の形状をこわさずにその形状を
保ちつつ、けん化するようなけん化浴を用いることが必
要である。けん化浴の例としては水酸化ナトリウム又は
水酸化カリウムのメタノール溶液や、水酸化ナトリウム
又は水酸化カリウムを硫酸ナトリウム等の塩類水溶液に
溶解させた溶液が挙げられる。
前者の例でけん化の具体的方法をのべると、グルコマン
ナンのエステルの球状粒子を予め５〜１０倍重量のメタ
ノールに１〜２時間浸漬したものに、マンナンエステル
の５０重量％に相当するメタノール（水酸化ナトリウム
水溶液含有）を添加し、室温で２４時間撹拌することに
よってけん化を行う。
ナンのエステルの球状粒子を予め５〜１０倍重量のメタ
ノールに１〜２時間浸漬したものに、マンナンエステル
の５０重量％に相当するメタノール（水酸化ナトリウム
水溶液含有）を添加し、室温で２４時間撹拌することに
よってけん化を行う。
後者の例でけん化の具体的方法をのべるとグルコマンナ
ンのエステルの球状粒子をアルカリとして水酸化ナトリ
ウム又は水酸化カリウム。
ンのエステルの球状粒子をアルカリとして水酸化ナトリ
ウム又は水酸化カリウム。
無機塩として硫酸ナトリウムを水に溶解した液に投入し
室温下２４時間撹拌を続けることによって行われる。
室温下２４時間撹拌を続けることによって行われる。
上記水溶液に対してアルカリ濃度は１０〜１５重景％で
あり、アルカリの量はグルコマンナンエステルに対して
５０重量％以上とする。硫酸ナトリウムは上記水溶液に
対して２０〜３０重量％とする。
あり、アルカリの量はグルコマンナンエステルに対して
５０重量％以上とする。硫酸ナトリウムは上記水溶液に
対して２０〜３０重量％とする。
次にけん化されて得たグルコマンナンの粒子を架橋する
方法について述べる。
方法について述べる。
架橋剤の例としてエピクロロヒドリン、ジェポキシブタ
ン、トリレンジイソシアナート、ヘキサメチレンジイソ
シアナート等の２官能性化合物を挙げることができる。
ン、トリレンジイソシアナート、ヘキサメチレンジイソ
シアナート等の２官能性化合物を挙げることができる。
これらの架橋剤は有機性媒体液中に溶解させて使用する
。
。
架橋剤媒体液としては灯油又は流動パラフィン又はその
混合物（例えば容量比７：３）に界面活性剤（非イオン
界面活性剤例えばソルビタン脂肪酸エステル）を１〜２
重量％混合したものが用いられる。又別の架橋剤媒体液
としてはアセトンとジメチルスルホオキシドからなる混
合液（例えば容量比６：４）が用いられる。架橋剤の濃
度は上記架橋媒体液に対して０．Ｏ１〜１５ｍｏ Ｑ
／ Ｑの範囲である。
混合物（例えば容量比７：３）に界面活性剤（非イオン
界面活性剤例えばソルビタン脂肪酸エステル）を１〜２
重量％混合したものが用いられる。又別の架橋剤媒体液
としてはアセトンとジメチルスルホオキシドからなる混
合液（例えば容量比６：４）が用いられる。架橋剤の濃
度は上記架橋媒体液に対して０．Ｏ１〜１５ｍｏ Ｑ
／ Ｑの範囲である。
架橋剤溶液１００容量部に対し、グルコマンナン球状粒
子を１〜５重量部加え、室温下に２４〜３６時間撹拌を
続けることによりグルコマンナンの球状粒子は架橋され
る。架橋反応粒子を決別し、アセトン次いで中性洗剤で
洗浄し次に水洗することによって架橋されたグルコマン
ナンの球状粒子が得られる。
子を１〜５重量部加え、室温下に２４〜３６時間撹拌を
続けることによりグルコマンナンの球状粒子は架橋され
る。架橋反応粒子を決別し、アセトン次いで中性洗剤で
洗浄し次に水洗することによって架橋されたグルコマン
ナンの球状粒子が得られる。
（１）架橋されたグルコマンナン球状粒子Ａ、Ｂの製造
コンニャクマンナン粉４０ｇを６０〜７０℃のイオン交
換水４Ｑに加え撹拌溶解した。これを６Ｑのエタノール
中に少しづつ滴下し、沈澱させ、決別、風乾１．２０℃
で真空乾燥させた。
コンニャクマンナン粉４０ｇを６０〜７０℃のイオン交
換水４Ｑに加え撹拌溶解した。これを６Ｑのエタノール
中に少しづつ滴下し、沈澱させ、決別、風乾１．２０℃
で真空乾燥させた。
この乾燥マンナン３０ｇをホルムアミドＩＱ中に入れ、
２日間膨潤させた後、ピリジン３００ＩＩＩＱ、無水酢
酸３００ｍ Ｑを加え、５０℃で５日間反応させた。こ
の反応混合物を７Ｑの水中に撹拌しながら加えた。生じ
た沈澱を決別、更に水洗した。これを風乾、真空乾燥し
た後、その３ｇをデカヒドロナフタリン７ｍＱ（ゲルＡ
）又は１０．５ｍＱ（ゲルＢ）を含むクロロホルム３０
０ｍＱに溶解した。、５７℃の９０％ケン化ポリビニル
アルコールの２％水溶液３Ｑ中に撹拌しながら上記溶液
を滴下し、撹拌して、粒径４４〜１０５μｍの粒子を形
成させた。２４時間後徐冷し、球状粒子を炉別し、水洗
した。これをメタノール２７０ｍ Ｑ、ｌ０Ｎ−ＮａＯ
Ｈ液３０ｍ Ｑ中に加え、撹拌下、２４時間放置し、ケ
ン化した。その後ケン化球状粒子を決別し、アセトンと
ジメチルスルホオキシド１：１の混合溶液３００ｍｎ中
にエビクロロヒドリン３５ｇを加えた架橋浴中に球状粒
子を投入し、６０℃で２４時間処理した。
２日間膨潤させた後、ピリジン３００ＩＩＩＱ、無水酢
酸３００ｍ Ｑを加え、５０℃で５日間反応させた。こ
の反応混合物を７Ｑの水中に撹拌しながら加えた。生じ
た沈澱を決別、更に水洗した。これを風乾、真空乾燥し
た後、その３ｇをデカヒドロナフタリン７ｍＱ（ゲルＡ
）又は１０．５ｍＱ（ゲルＢ）を含むクロロホルム３０
０ｍＱに溶解した。、５７℃の９０％ケン化ポリビニル
アルコールの２％水溶液３Ｑ中に撹拌しながら上記溶液
を滴下し、撹拌して、粒径４４〜１０５μｍの粒子を形
成させた。２４時間後徐冷し、球状粒子を炉別し、水洗
した。これをメタノール２７０ｍ Ｑ、ｌ０Ｎ−ＮａＯ
Ｈ液３０ｍ Ｑ中に加え、撹拌下、２４時間放置し、ケ
ン化した。その後ケン化球状粒子を決別し、アセトンと
ジメチルスルホオキシド１：１の混合溶液３００ｍｎ中
にエビクロロヒドリン３５ｇを加えた架橋浴中に球状粒
子を投入し、６０℃で２４時間処理した。
（２）各種生体蛋白質の分離
上記製造法で得られたグルコマンナン球状粒子Ａ、Ｂを
内径６ｍｍのステンレスカラムに充填高さが２５０ｍｍ
となるようにそれぞれ充填した。各種生体高分子物質を
１ ｍｇ／ｍ Ｑ含む０、ＩＭ Ｎａ２ＨＰＯ，、０，
３Ｍ ＮａＣＱ水溶液をｌμｆｌ注入し、０．ＩＭ Ｎ
ａ２’ＨＰＯ，、０，３Ｍ ＮａＣＱ水溶液を１．０ｍ
Ｑ ／ｍｉｎの流速で通液して溶出させた。各物質の
溶出容量は、Ｕｖ検出器を用いて測定した。得られた結
果からカラム容量（Ｖｔ）に対する各物質の溶出容量（
Ｖｅ）の比： Ｖｅ／Ｖｔ（％）の値を求めた。
内径６ｍｍのステンレスカラムに充填高さが２５０ｍｍ
となるようにそれぞれ充填した。各種生体高分子物質を
１ ｍｇ／ｍ Ｑ含む０、ＩＭ Ｎａ２ＨＰＯ，、０，
３Ｍ ＮａＣＱ水溶液をｌμｆｌ注入し、０．ＩＭ Ｎ
ａ２’ＨＰＯ，、０，３Ｍ ＮａＣＱ水溶液を１．０ｍ
Ｑ ／ｍｉｎの流速で通液して溶出させた。各物質の
溶出容量は、Ｕｖ検出器を用いて測定した。得られた結
果からカラム容量（Ｖｔ）に対する各物質の溶出容量（
Ｖｅ）の比： Ｖｅ／Ｖｔ（％）の値を求めた。
結果を第１表に示す。各、生体高分子物質は分子量の大
きさの順に溶出してくることを確認できた。
・ 第１表 このデータから、特に血漿分画製剤であるグロブリン、
アルブミンなどが容易に分取できることがわかる。
きさの順に溶出してくることを確認できた。
・ 第１表 このデータから、特に血漿分画製剤であるグロブリン、
アルブミンなどが容易に分取できることがわかる。
本発明によれば、生体蛋白質を含む液を従来のゲル粒子
充填カラムでは通液できないような高流速の条件で通液
して分離できるため、分離効率が大巾に上昇する。又、
本発明で用いる架橋されたグルコマンナン球状粒子は高
強度なので層高を高くすることができるため分前性能が
大巾に向上する。
充填カラムでは通液できないような高流速の条件で通液
して分離できるため、分離効率が大巾に上昇する。又、
本発明で用いる架橋されたグルコマンナン球状粒子は高
強度なので層高を高くすることができるため分前性能が
大巾に向上する。
Claims (1)
- １、架橋されたグルコマンナン球状粒子を充填したカラ
ムに、生体蛋白質を含む液を通液することを特徴とする
生体蛋白質の分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62254875A JPH0196195A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 生体蛋白質の分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62254875A JPH0196195A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 生体蛋白質の分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0196195A true JPH0196195A (ja) | 1989-04-14 |
Family
ID=17271046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62254875A Pending JPH0196195A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 生体蛋白質の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0196195A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5034466A (en) * | 1990-04-30 | 1991-07-23 | Shell Oil Company | Polymer and process for making the same |
| US5055536A (en) * | 1990-08-09 | 1991-10-08 | Shell Oil Company | Process to prepare vinyl ether polymers |
| US5068294A (en) * | 1990-09-28 | 1991-11-26 | Shell Oil Company | Process to produce polymers of styrene derivatives |
| US5073610A (en) * | 1990-09-28 | 1991-12-17 | Shell Oil Company | Polymers of alkoxystyrenes and a process to produce polymers of alkoxystyrenes |
-
1987
- 1987-10-09 JP JP62254875A patent/JPH0196195A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5034466A (en) * | 1990-04-30 | 1991-07-23 | Shell Oil Company | Polymer and process for making the same |
| US5055536A (en) * | 1990-08-09 | 1991-10-08 | Shell Oil Company | Process to prepare vinyl ether polymers |
| US5068294A (en) * | 1990-09-28 | 1991-11-26 | Shell Oil Company | Process to produce polymers of styrene derivatives |
| US5073610A (en) * | 1990-09-28 | 1991-12-17 | Shell Oil Company | Polymers of alkoxystyrenes and a process to produce polymers of alkoxystyrenes |
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