JPH0197860A - 支持体上のシグナル生成剤を用いる診断測定法及びそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、直接的又は間接的に酵素の基質を提供する
分析対象の診断分析に関する。

（従来の技術） 医院において又は家庭においてモニターされることが好
ましい生理的流体中に存在する多くの分析対象がある。

特に、訓練を受けていない個人が定量的結果を得るため
に診断測定をすることが要求される場合、手法及び装置
は比較的簡単であるべきである。装置は容易に操作する
ことができ、そして結果に影響を与えるであろう変性、
損傷又は他の変化を受けるべきでない。手法は最少の段
階及び最少の測定回数を用いるべきである。段階及び測
定回数が少なくなるに従って測定を行う者によって持ち
込まれる誤差が少なくなるであろう。

個人が多数の分析対象を測定する必要があるため、個人
により使用されることができそして比較的簡単な方法及
び装置を作ることにかなめの注意が払われてきた。しか
しながら、多くの場合において、測定は結果を定量化す
るために電子装置を必要とし、このことが使用者にかな
りの出費をもたらす。さらに、方法の幾つかは多数の段
階及び測定を必要とし、このことが結果に有意な誤差を
導入することが認められる。従って、訓練を受けていな
い個人による分析対象の迅速な測定のた代替技法の必要
性が常に存在する。

米国特許ｒｌｈ４．１６８，１４６　、Ｉ’に４．２９
８．６８８・１．Ｎｌ４．２９９，９１６　、阻４．３
６１，５３７　、隘４，３６６．２４１　　、隘４，４
３５，５０４　、隘４．４４２，２０４．１１ｈ４，５
３３，６２９　、隘４．４４６，２３２．１１ｋ１４，
４４７，５２６　、及び隘４．４５４，０９４は種々の
スティックアッセイ及びストリップアッセイを記載して
いる。５ｌｏａｎ等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　（１９８
４）３０　：　１７０５−１７０７　；並びにＶｉｒａ
ｐｅｎ及びＨａｒｄｉｎｇ。

（発明の概要） 吸水性支持体に非拡散的に結合した検出可能な試薬を含
む新規な装置が提供される。この装置は試薬組成物と組
合わせて使用され、この試薬組成物は分析対象と直接的
又は間接的に反応して生成物を生成する少な（とも１種
類の酵素、便利には複数の酵素の混合物を含み、前記生
成物は結合した試薬と直接的又は間接的に反応して検出
可能なシグナルを生成する。所定の点からシグナルがも
はや容易に観察されない点までの測定された距離が分析
対象の定量測定を成す。

（具体的な記載） 直接又は間接に酵素基質である分析対象を検出するため
の方法及びキットが提供され、この酵素反応が生成物を
もたらし、この生成物が触媒的又は非触媒的反応により
、支持体に非拡散性に結合した試薬と反応して検出可能
なシグナルを生じさせる。この方法はサンプルと酵素組
成物とを組合わせることを含み、ここで該酵素組成物は
分析対象との反応のために要求される追加の基質を含む
。

酵素生成物が所望の速度で結合した試薬と反応しない場
合、追加の成分を酵素反応混合物中に、支持体上に又は
発色剤溶液中に加えて結合した試薬と酵素生成物との間
の反応の速度を増強することができる。

この発明は酵素と又は酵素の生成物と反応して生成物を
生成することができる任意の分析対象と共に用いること
ができ、前記生成物は直接的又は間接的に試薬と反応し
て検出可能なシグナルを生成する。試薬との反応は触媒
されても触媒されな（でもよく、特に酵素触媒される。

種々の分析対象、特にアルカノール、例えばグルコース
、コレステロール、エタノール等を使用することができ
る。分析され得る他の化合物には尿素、ＮＡＤ　（Ｐ）
　／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ，ＰＡＤ／ＦＡＤＨ，ＦＭＮ／ＦＭ
ＮＨ等が含まれ、ここでコファクターは他の分析対象と
カップリングして所望の結果を与えることができる。酵
素系の記載については、米国特許１１ｍ４，１３４．７
２９及び阻４．３７４．９２５を参照のこと。はとんど
の場合、酵素は酸化還元酵素であろう。種々の分析対象
の濃度範囲は分析対象に依存して異るであろう。従って
、酵素反応成分の濃度は分析対象の性質及び注目の分析
対象の濃度範囲に関連するであろう。

酵素反応組成物は分析対象と直接的又は間接的に反応す
る酵素、及び試薬と反応する生成物を生成するのに必要
な追加のコファクター又は基質を含むことができる０例
えば、分析対象がコレステロールエステルである場合、
酵素反応混合物はコレステロールエステラーゼ及びコレ
ステロールオキシダーゼを含有するであろう。この反応
の生成物は過酸化水素である。結合した試薬に依存して
、前記混合物はパーオキシダーゼを含有することができ
、このパーオキシダーゼは、今の場合ロイコ色素である
結合した試薬と、前記過酸化水素との間の反応を触媒す
るために役立つであろう。グルコースのためにはコレス
テロールオキシダーゼの代りにグルコースオキシダーゼ
を使用することができ、他方り一又はＤ−アミノ酸の”
ためにはコレステロールオキシダーゼの代りにアミノ酸
オキシダーゼを用いることができる。これらの酵素はい
ずれも酸化における水素受容体として酸素を用い、過酸
化水素を生成する。従って、酵素反応と直接的又は間接
的に関連付け（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）られ得る任意の分析
対象をこの発明において用いることができる。

同一の又は他の分析対象及び他の酵素について用いるこ
とができる他の系はへキソキターゼ及びグルコース−６
−ホスフェート・デヒドロゲナーゼとグルコース及び試
薬Ｎ−ニトロフェニルホルマザン、ラクテート・デヒド
ロゲナーゼと乳酸及び試薬メチルテトラゾール、アルコ
ールデヒドロゲナーゼとエタノール及び試薬トリクロロ
フェノリントフェノール等、を包含する。特に米国特許
１１ｍ４，３７４，９２５　、第２５〜３０欄を参照の
こと。

検出可能なシグナルを提供することができる試薬が拡散
しない様に結合した吸水性ストリップを含む種々の装置
が使用され得る。はとんどの場合、試薬はロイコ色素で
あり、このものは周囲条件下で安定であるがしかし酸化
剤又は還元剤との反応の後検出可能な色の生成をもたら
す。逆の状況が可能の場合、漂白される着色された色素
、好ましくはロイコ色素が試薬として使用されるであろ
う。

吸水性ストリップは、液体特に水性溶液の毛細管移動を
許容する広範囲の種類の材料から調製することができる
。種々の材料にはセルロース性材料、例えば紙、ニトロ
セルロース、シリカ、アルミナ、ガラス繊維等が含まれ
る。クロマトグラフィーは必要ではなく、むしろ重要な
因子は試薬が便利に支持体に結合し、支持体が検出可能
なシグナルの生成を妨害せず、そして好ましくは支持体
が検出可能なシグナルを有する領域と検出可能なシグナ
ルが欠けている領域との間の明瞭な区別を可能にするこ
とである。吸水性材料として使用される特定の材料はこ
の発明にとって臨界的ではなく、しかし便利には紙が使
用されよう。

装置は種々の構造を仮定することができる。１つの観点
において、装置は目盛を付された簡単な計量棒（ｄｉｐ
ｓｔｉｃｋ）であることができ、従って発色された検出
可能なシグナルとシグナルの不存在との間を描写する領
域を装置に印刷された目盛から読み取ることができる。

標示が装置に添付されているのが通常好ましいであろう
が、「目盛を付された」なる語は、分析対象の濃度に関
連付けられたスケールを提供するように試薬が所定の態
様で分配されることを意図する。ストリップは、一方の
寸疾が他方の寸法より実質的に大きい線状であることが
でき、環状であることができ、又は環状もしくは線状ス
トリップにより支持された反応パッドを有することがで
きる。あるいは、吸水性材料で満たされた毛細管を使用
することができ、この場合毛細管の充填材は検出可能な
試薬の支持体として機能する。

吸水性支持体の厚さは一般に約５〜５ｏミルであって支
持体の種類に依存し、不活性充填物を有することができ
る。種々の不活性充填ｉ、例えばミラー（Ｍｙｌａｒ）
　、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン等を使用することが
できる。ストリップは一般に１ｕ＋以上の幅、通常は２
１１以上の幅を有し、そして一般に約２Ｃ１ｍ以上の長
さ、さらに普通には約３０以上であり約１０ａｍ以下の
長さを有する。

ディスクは一般に約１ａｉ以上で約５０１１以下の直径
を有する。毛細管は一般に約０．２鶴以下で約２鶴以下
の直径、及び一般に約２ｃ１１の長さ、通常約１０ｃｓ
ｅ以下の長さを有する。

検出可能なシグナル試薬は種々の方法で吸水性支持体に
一詰合せしめることができる。幾つかの試薬については
、該試薬は熱の助けを伴って又は伴わないで、通常約６
０ｈｃ以下の温度において、吸着により非共有結合で結
合することができる。加熱は約５分間〜約６時間行うこ
とができる。シグナル試薬が物理的に吸収される場合、
生ずる着色生成物もまた結合したままであるべきであり
、そしてそのもとの位置から拡散すべきでない。あるい
は、試薬上に存在する官能基と反応するであろう活性官
能基提供するように種々の支持体を活性化することがで
きる。試薬上に存在する官能基はアルコール、メルカプ
タン、アミン等であることができる。

種々の支持体、特にヒドロキシル基を有する支持体は臭
化シアンを用いて活性化することができ、スペーサー又
はリンカ−アームを用いることができ、この場合カルボ
キシル基又はアミノ基を支持体に連結することができ、
官能化されたアルキルシリル基を用いることができ、こ
の場合官能基はアミノ、カルボキシ等であり、あるいは
アリール基を共有結合により支持体に結合することがで
き、この場合はアリール基をハロメチル、例えばクロロ
メチル、アミノ　（所望によりジアゾ化されていてもよ
い）等により官能化することができる。種々の官能基を
試薬に結合せしめることができ、試薬が便利な官能基を
有する場合、連結が検出可能なシグナルを提供する性質
に不都合な影響を与えない場合には直接的に、あるいは
三官能連結基を用いて試薬を支持体に連結することがで
きる。

試薬は種々の方法により支持体に適用することができ、
例えばそれ自体により、連結基に共有結合したそれ自体
により、連結基を共同で用いて、又は類似の方法により
適用することができる。支持体に適用される溶液中の試
薬の濃度は一般に約０．０１〜５■／−１さらに普通に
は約０．０５〜２■／−であり、そして測定されるべき
分析対象の濃度範囲に依存するであろう。種々の揮発性
溶剤、例えば水、メタノール、エタノール、アセトン等
、又はこれらの組合せを用いることができる。

試薬は種々の方法により、例えば噴霧、浸漬、ロール処
理等により支持体に適用することができる。通常、試薬
は均一に分配されるべきであるが、幾つかの場合には非
均−分布を有することが望ましく、例えば低い分析対象
濃度を測定する領域で低い濃度であることが望ましい′
。

種々の化合物を試薬として使用することができる。過酸
化水素の場合、便利な試薬にはテトラメチルベンジジン
、２−クロロ−１−ナフトール、ＡＢＴＳ、ジカルボキ
シジン等が含まれる。他の酵素生成物、例えばアンモニ
アについては、使用される試薬にはブロモクレゾールグ
リーンが含まれる。

酵素反応混合物は、すでに示したように、適切な酵素、
及び違加のコファクター、基質、又は分析対象との反応
を提供しそしてその反応生成物が結合した試薬と反応し
て検出可能なシグナルを生成する条件下で該生成物を生
成するために必要な他の添加物を含有するであろう。酵
素反応混合物の種々の成分の濃度は、特定の酵素、該酵
素の活性、分析対象の濃度範囲等により広く異るであろ
う。コレステロールについては、コレステロールエステ
ラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの濃度は一般に
過剰量であり、そしてそれぞれ約０．１〜１００■υの
範囲、さらに普通にはそれぞれ約０．５〜１０１υの範
囲である。グルコースについては、グルコースオキシダ
ーゼ濃度は一般に約０．１〜１００１ｔ）　、さらに普
通には約０．５〜１０１Ｎ（Ｄ濃度である。

律速的でないように十分な基質及びコファクターが提供
される。一般に、個々の成分の濃度は約ＩＭを超えず、
通常約０．５　Ｍを超えない。

約６〜１０、普通約６．５〜９の範囲のｐＨを有し、一
般に約５０〜５００ｍｍｏ　１の濃度の緩衝化された溶
液を提供する様に緩衝剤が存在する。種々の緩衝剤、例
えばＴｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、ＭＯＰＳ等を使用す
る゛ことができる。酵素に依存して特定の緩衝液を使用
し、緩衝液の不都合な効果を最小にする。含まれる他の
添加剤は所望のイオン強度を与えるための塩、安定剤、
殺生物剤等である。さらに、混合物に嵩を与えるため賦
形剤を与えることができる。はとんどの場合、混合物は
乾燥粉末として、特に、常用の凍結乾燥技法に従って凍
結乾燥粉末として与えられるであろう。例えば、米国特
許阻４．４４７．５２７を参照のこと。

粉末として存在する酵素反応混合物を有するのではなく
、幾つかの場合においては、全体的に又は部分的に支持
体に拡散不能に結合した酵素反応混合物をそなえること
が好ましい、支持体は装置の一領域であることができ、
この場合この領域は同一のシートであることができ、又
は別の層であってこの層から装置の他の部分への毛細管
移送を許容するものとして存在することができる。この
状況において、サンプルが酵素反応混合物を含有する領
域と接触し、１つの部位において反応が起こり、次に検
出可能なシグナルを与える試薬を含有する測定領域を通
って生成物が移動するのが好ましい。過酸化水素を生成
するオキシダーゼについては、測定領域の外側の部位に
おいて表面に該酵素が結合していることが、必要なすべ
てである。

分析対象との反応が迅速に且つ実質的に完全に進行する
限り、表面に結合する酵素の量は臨界的ではない、酵素
を吸水性表面に結合せしめるための多くの方法が知られ
ており、ロイコ色素の結合のために使用される方法の多
くが前記酵素のために使用することができる。

血液、又は細胞（細胞は測定を妨害するかも知れない）
のごとき粒子を含有する他の媒体を使用する場合、測定
を行う前に該粒子を分離するのが望ましい。

血液を使用する場合、これは膜を用いて達成することが
でき、この膜はサンプルが置かれた部位から除去され、
あるいは細胞又は他の粒子がアッセイ装置からふき取ら
れる。あるいは、血液サンプルを溶血し、又は小麦胚ア
グルチニンもしくは抗−赤血球抗体のごとき試薬により
凝集せしめることができる。

測定の実施に当っては、測定ユニットへの液体輸送の関
連において酵素反応混合物が支持体に結合されるか、又
は別個の混合物として使用されるかに依存して異る手法
が用いられよう。

サンプルは任意の生理学的流体、例えば尿、赤血、血漿
、血清、加工流体等であることができる。

測定において使用する前に、サンプルを種々の処理、例
えば緩衝媒体中への稀釈、遠心、抽出、濃縮、クロマト
グラフィー等にかけることができる。

サンプルを処理する特定の方法はこの発明にとって臨界
的ではなく、そしてサンプルの種類に依存する。すでに
述べたように、血液については、膜を通して測定装置へ
の血漿の通過及び細胞の保持を可能にする細胞分離膜を
用いることができる。

この発明の一層の理解のため、ここで図を考えよう。第
１図において、キットの構成要素が概略示されている。

このキットはアルコール綿１０゜及びランセット１２を
有し、この装置は血液分析のために使用される。患者は
指又は耳たぶをランセットで刺し、血液滴を吸引する。

血液を吸引するプラスチックシリンジ１４が与えられ、
これにより患者が血液の容積を測定することができる。

試験管１６は栓１８を有し、そして酵素化学的試薬２０
を底に有する。栓を除去し、そして血液を加えることが
できる。試薬を凍結乾燥粉末として与え、サンプルを添
加する前に水を加えて試薬を溶解する。この発明の方法
は濃度感受性ではなく、生成された生成物の絶対量に対
してのみ感受性であるから、限界内であれば、添加され
る液体の量は臨界的ではない。従って、添加すべき流体
の量は試験管上の目印によりおよそ示すことができ、こ
うして患者は酵素反応成分のすべての溶解を保証するの
に十分な量の水を添加することができる。

計量棒２２は小袋２６に入れられ、この小袋は計量棒２
２を取り出すために、小袋を開くためのギザギザの角２
６を有する。計量棒は溶液に浸漬するための領域２８を
一端に有し、この領域には目盛が付されていない。この
領域はまた、細胞が領域２８を越えて目盛が付された領
域３０に移行するのを防止する膜を有することができる
。目盛が付された領域３０は図示されている様に多数の
目盛線３２を有し、シグナルが検出され得る高さの測定
を可能にしている。領域２８の逆の端にありそして文字
りで示されるバンド３４は色素を有し、これは溶出液に
より湿めされた後可視化され−る。試験管１６中の液体
はバンドＤまで吸い上げられ、そして次に計量棒２２を
測定溶液から取り出す。次に、シグナルが観察され得る
点の高さの結果としてサンプル中の分析対象の量を直接
読み取ることができる。

第２図（ａ）及び（ｂ）において、他の態様が側面図及
び平面図として示されている。装置５０は不活性裏地５
２及び吸水性ストリップ５４を有し、これに検出可能な
試薬が結合される。パッド５６は吸水性ストリップ５４
と液体連絡される。

酵素反応成分がパッド５６に結合され、この成分は直接
的又は間接的に分析対象と反応するために役立ち、シグ
ナル生成試薬と反応する生成物を生成する。パッド５６
の頂部に膜５８が存在し、これは細胞及び他の粒子をサ
ンプルから除去するために役立ち、そしてフィルター装
置として役立った後、装置５０をさらに使用する前にパ
ッド５６から除去することができる。前記の計量棒２２
の場合と同様に、測定が停止されるべき時を示すために
バンド６０が設けられている。

測定を行うに当って、前記のキットに類似するキットが
与えられる。しかしながら、この測定を行うためには、
血液滴を膜５８の頂部に置き、そしてパッド６０に吸い
込ませる。次に、膜から赤血球をふき取り、そして次に
装置５０を、酵素反応混合物の残りの構成員を含有する
溶液に浸漬する。例えば、コレステロールを検出する場
合、パッドにコレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼを含浸せしめ、他方、展開溶液は、
吸水性１１５４上に含浸された色素と過酸化水素との間
の反応を惹起するためにパーオキシダーゼを有する。展
開溶液がパッド５６のみを通過することを保証するため
不活性保護バリヤー６２を設ける。溶液がパッド５６の
みを通過する必要はないが、生成物が吸水性ストリップ
５４を通過する間に生成物が過度に稀釈されないことが
好ましい。

はとんどの場合、展開溶液はまた、酵素反応混合物につ
いて前記した種々の薬剤、例えば緩衝剤、安定剤、消泡
剤等を含むであろう。

次に、例によりこの発明を具体的に記載するが、これに
より本発明の範囲を限定するものではない。

〔実　験〕

成−１ グルコース、コレステロール（２００■／ｄ！、水溶液
標準）　、４−ＣＩ−１−ナフトール、グルコースオキ
シダーゼ（Ｇｏ）　、コレステロールオキシダーゼ、及
び西洋ワサビパーオキシダーゼはシグマ・ケミカル社か
ら購入した。ワ・ノドマン濾紙＃５４１はＶＷＲサイエ
ンティフィック・サブライズから購入した。Ｔｒｉｓ緩
衝液は５５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　０．１　ｍｌ／Ｉ　Ｔｒｉ
ｔｒｏｎ　Ｘ　　１００（ｐＨ８，０）であった。

Ｕ上への４−ＣＩ−１−ナフトールの古里化 １０−のエタノール中４−ＣＩ−１−ナフトール（２０
ｗ）を２５ｍ１のＴｒｉｓ緩衝液で稀釈し、そして穏和
に撹拌しながら濾紙をこの溶液中に浸漬した。１０分間
の後、濾紙を取り出し、空気乾燥し、そして５　ｃｍ　
Ｘ　Ｏ，４Ｃ１ｍのストリップに切断した。

このストリップを、使用するまで栓をしたビン中、暗中
に貯蔵した。

０　　　　彎′についての′１ 過酸化水素のストック溶液（０，０５，０，０２５，０
，０２゜０．００５　、０．００２５％）を調製し、そ
して約３００ｍのアリコートをデイスポーザブル・ミク
ロキュベツトに移した。各ミクロキュベツトに１滴の１
：１０稀釈ＨＲＰ（−７１０）を添加し、そして弱くた
たくことにより溶液を混合した。濾紙ストリップを垂直
に保ちながら約０．２５ｃｍの深さに浸漬した。吸い上
げが完了した後、ストリップを取り出し、そして発色の
高さを測定した。少なくとも７Ｘ１０””ＭＨ，Ｏ□の
感度をもって直線的カーブが達成された。

久土旦ニム夏撒定 １００■のグルコースを１０−のＴｒｉｓ緩衝液に溶解
し、そしてＴｒｉｓ緩衝液により逐次稀釈して１０〜０
．２５■／ｉｔｓ　（５０〜１．４団）の６種類の溶液
を得た。

アリコート（約２４０μ）をミクロキュベツトに移し、
そして３０ｍずつのＧｏ溶液及びＨＲＰ溶液を穏和に撹
拌しながら添加した。個々のストリップを前記の様にし
て該溶液に浸漬し、そして吸い上げを完全に行った。次
に青色の高さを測定した。

１．４〜５．６　Ｘ　１０−ｈＭグルコースの範囲で直
線状の標準曲線を得た。

ストリップ上の４−Ｃ１−１−ナフトールの濃度を変え
ることにより感度を変えることができた。

ストリップは前記のようにして、異る４−Ｃ１−１−ナ
フトール濃度を用いて調製した。上記のグルコース溶液
を用いて標準曲線を得た。得られた勾配は次の通りであ
った。

４−ＣＩ−１−ナフトール　　　標準曲線のの濃度　■
／−８勾配 ０、５７　　　　　　　　　１．０ ０、２９　　　　　　　　　０．９４ ０、１４　　　　　　　　　０．７０ 上記の結果から、本発明が少ない段階及び最少の測定回
数のＦ！単で迅速な方法を提供することが明らかである
。この方法は相対的に実施者に依存せず、サンプルの測
定のみが必要であって、測定の他の観点は実施者の誤り
による誤差から実質的に開放されている。支持体に結合
された最適化された量の試薬を持ちそして迅速かつ効率
的に生ずる反応を用いることにより、シグナルの発生の
ための長い経路が回避され、その結果比較的シャープな
検量線を得て正確な読みを得ることができる。

この発明のキットは非常に簡単であり、再現性よく容易
に製造することができ、そして測定を実施するために必
要な訓練された技法を必要としないで家庭又は医院にお
いて使いることができる。読み取りに高価な装置を必要
とせず、使用者が旅行する場合に高価な装置を携行しな
いでどこででも行うことができる。試験管は容易に再使
用することができ、個々の小袋が必要とする空間は非常
に小さく、そして適当な小袋で試薬の再充填を行うこと
ができるから、１つのキットで多数の測定を行うことが
できる。

以上、この発明を幾分具体的に記載したが、本発明の本
質を逸脱することなく多くの変更を行うことができよう
。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のキットの構成部品の略図である。 第２図はこの発明の装置の他の態様であって、ストリッ
プ上に置かれたパッドを有する装置の側面図及び平面図
である。 ｒ７＋百の浄書（六ににま更なし） ↑ 蝕雪 ＩＧ−２ ＩＧ−２ Ｒ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６３年特許願第１５２４３９号 ２、発明の名称 支持体上のシグナル生成剤を用いる診断測定法及びその
ためのキット ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 氏名　ピャール　カーンナ　　（外／、ｆＦ、）４、代
理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正命令の日付　　　　　　　′ 昭和６３年９月２７日（発送日）　　゛６、補正の対象 （１）委任状 （２）明細書 （３）図　面 （４）特許出願人（第１）の住所証明書７、補正の内容 （１）　＋４）　　別紙の通り （２）明細書の浄書（内容に変更なし）（３）図面の浄
書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析対象の測定方法であって、該分析対象は酵素と
   直接的又は間接的に反応して生成物を生成することがで
   きるものであり、該生成物は試薬と直接的又は間接的に
   反応じて検出可能なシグナルを生成することができるも
   のであり、該測定方法は前記試薬が結合された目盛が付
   された領域を有する吸水性支持体を用い、そして該測定
   方法は、液体媒体中前記分析対象を含有することが推定
   されるサンプル、第一の酵素、前記分析対象が反応して
   前記生成物を生成せしめるために必要な追加の酵素反応
   成分、及び前記試薬と反応して前記検出可能なシグナル
   を生成するために必要な追加の検出可能シグナル生成剤
   を、分析混合物受理部位において接触せしめ； 前記生成物の実質上すべてが前記試薬と反応するのに十
   分な距離を前記液体媒体が移行することを許容し；そし
   て 前記サンプル中の前記分析対象の量の測定として、検出
   可能なシグナルの前記受理部位からの最も遠い距離を前
   記目盛が付された領域内において測定する； ことを含んで成る方法。 ２、前記サンプル及び前記酵素の反応混合物の液体媒体
   中で少なくとも１種類の前記の検出可能シグナル生成剤
   を混合する追加の段階を含む、請求項１に記載の方法。 ３、分析対象の測定方法であって、該分析対象は酵素と
   反応して生成物を生成することができるものであり、該
   生成物は試薬と直接的又は間接的に反応して検出可能な
   シグナルを生成できるものであり、該方法は前記試薬が
   結合された目盛を付された領域を有する吸水性支持体を
   用い、そして該方法は、 前記分析対象を含有すると推定されるサンプル、第一の
   酵素、前記分析対象が反応して前記生成物を生成するた
   めに必要な追加の酵素反応成分、及び前記試薬と反応し
   て前記検出可能なシグナルを生成するために必要な追加
   の検出可能シグナル生成剤を、液体媒体中測定混合物受
   理部位において接触せしめ； 前記生成物の実質上すべてが前記試薬と反応するために
   十分な距離を前記液体媒体が移行することを許容し；そ
   して 前記サンプル中の前記分析対象の量の測定として、検出
   可能なシグナルの前記受理部位からの最も遠い距離を測
   定する； ことを含んで成る方法。 ４、前記第一の酵素が酸化還元酵素であり、そして前記
   生成物が酵素触媒反応によって前記試薬と反応する、請
   求項３に記載の方法。 ５、前記生成物と試薬との前記酵素触媒反応の酵素が西
   洋ワサビパーオキシダーゼである、請求項４に記載の方
   法。 ６、前記分析対象がコレステロール又はその前駆体であ
   り、そしてそして前記第一の酵素がコレステロールオキ
   シダーゼである、請求項５に記載の方法。 ７、前記分析対象がグルコース又はその前駆体であり、
   そして前記第１の酵素がグルコースオキシダーゼである
   、請求項５に記載の方法。 ８、吸水性支持体であって、目盛を付された測定領域に
   おいて該支持体に結合した検出可能なシグナルを生成す
   ることができる試薬及び測定反応混合物部位を有するも
   の；前記試薬と直接的又は間接的に反応することができ
   る生成物を生成するために分析対象と反応することがで
   きる第一の酵素を含んで成る測定反応混合物；前記第一
   の酵素の反応のために必要な追加の成分；並びに前記生
   成物と前記試薬との反応のために必要な追加の構成員、
   を含んで成る診断キット。 ９、前記第一の酵素が酸化還元酵素であり、そして前記
   追加の構成員が西洋ワサビパーオキシダーゼである、請
   求項８に記載の診断キット。 １０、吸水性支持体であって、第一の酵素（この第一の
   酵素は分析対象と反応して生成物を生成することができ
   ることを特徴とする）が結合する測定反応混合物部位と
   して前記吸水性支持体上に置かれた吸水性パッド、及び
   目盛を付された測定領域において前記支持体に結合した
   検出可能なシグナルを生成することができる試薬（前記
   生成物及び前記試薬は直接的又は間接的に反応して検出
   可能なシグナルを生成することができる）を有するもの
   ；前記第一の酵素の反応のために必要な追加の成分；並
   びに前記生成物と前記試薬との反応のために必要な追加
   の構成員、を含んで成る診断用キット。