JPH02101097A - ペプチドの分子内ジスルフィド結合の形成法 - Google Patents
ペプチドの分子内ジスルフィド結合の形成法Info
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- JPH02101097A JPH02101097A JP63254530A JP25453088A JPH02101097A JP H02101097 A JPH02101097 A JP H02101097A JP 63254530 A JP63254530 A JP 63254530A JP 25453088 A JP25453088 A JP 25453088A JP H02101097 A JPH02101097 A JP H02101097A
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- peptide
- intramolecular disulfide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明はペプチドの分子内ジスルフィド結合の新規な
形成法に関するものである。
形成法に関するものである。
従来の技術と問題点
ペプチドの分子内ジスルフィド結合を形成する方法とし
ては、空気酸化［Ｂ、 Ｂ、 Ｒ，Ｃ，１１９，１３１
（１９８４）参照コ、ヨード酸化［Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ２２９−２３４ （１９８４”）参照
］、フェリシアン化カリウム酸化［Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４１−２４６ （１９８４）参照
］等が知られているが、空気酸化は反応が緩慢でありか
つペプチドの高塩濃度溶液ではほとんど反応が起らず、
ヨード酸化はペプチドの構成アミノ酸のチロシンをヨー
ド化するおそれがあると共に反応終了後生成したＩ２を
還元する必要があり、フェリシアン化カリウム酸化はシ
アン廃液の問題があるなどペプチドの分子内ジスルフィ
ド形成剤としては工業的に満足できるものではない。他
方、有機化合物の酸化剤として過酸化水素はよく知られ
ているが、システィンの他にメチオニンを含有するペプ
チドを過酸化水素で処理すれば、分子内ジスルフィド結
合形成と同時にメチオーンも酸化を受け、所望の生物学
的に活性なペプチドを製造することはできないと信じら
れていた。
ては、空気酸化［Ｂ、 Ｂ、 Ｒ，Ｃ，１１９，１３１
（１９８４）参照コ、ヨード酸化［Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ２２９−２３４ （１９８４”）参照
］、フェリシアン化カリウム酸化［Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４１−２４６ （１９８４）参照
］等が知られているが、空気酸化は反応が緩慢でありか
つペプチドの高塩濃度溶液ではほとんど反応が起らず、
ヨード酸化はペプチドの構成アミノ酸のチロシンをヨー
ド化するおそれがあると共に反応終了後生成したＩ２を
還元する必要があり、フェリシアン化カリウム酸化はシ
アン廃液の問題があるなどペプチドの分子内ジスルフィ
ド形成剤としては工業的に満足できるものではない。他
方、有機化合物の酸化剤として過酸化水素はよく知られ
ているが、システィンの他にメチオニンを含有するペプ
チドを過酸化水素で処理すれば、分子内ジスルフィド結
合形成と同時にメチオーンも酸化を受け、所望の生物学
的に活性なペプチドを製造することはできないと信じら
れていた。
問題点を 決するための手段
この発明者等は大腸菌を宿主とする遺伝子組換え技術や
有機合成法により製造されたシスティン含有ペプチドの
分子内ジスルフィド結合の形成法について、種々研究の
結果、従来の予測に反し、システィンの他にメチオニン
を含有するペブチドに過酸化水素を作用させることによ
り、該ペプチドのメチオニンがほとんど酸化を受けるこ
となく、分子内ジスルフィド結合が極めて効率よく形成
されるという驚くべき事実を見い出し、さらに鋭意研究
の末、この発明を完成した。
有機合成法により製造されたシスティン含有ペプチドの
分子内ジスルフィド結合の形成法について、種々研究の
結果、従来の予測に反し、システィンの他にメチオニン
を含有するペブチドに過酸化水素を作用させることによ
り、該ペプチドのメチオニンがほとんど酸化を受けるこ
となく、分子内ジスルフィド結合が極めて効率よく形成
されるという驚くべき事実を見い出し、さらに鋭意研究
の末、この発明を完成した。
この発明の方法は、分子内ジスルフィド結合を形成する
ことにより生物学的に活性なペプチドを与えるシスティ
ン含有ペプチドに過酸化水素を作用きせることにより行
なわれる。
ことにより生物学的に活性なペプチドを与えるシスティ
ン含有ペプチドに過酸化水素を作用きせることにより行
なわれる。
ここで、システィン含有ペプチドの例としては、遺伝子
組換え法または有機合成法により製造され、生物学的に
活性化されるためには分子内ジスルフィド結合の形成が
必要ないわゆる還元型ペプチドが挙げられ、そような例
としては、還元型α−ｈＡＮＰ （ヒト心房由来ナトリ
ウム排泄性ポリペプチド）、還元型ソマトスフチン、還
元型ＩＬ−２（インターロイキン−２）、還元型ＩＮＦ
（腫瘍壊死因子）等が挙げられる。
組換え法または有機合成法により製造され、生物学的に
活性化されるためには分子内ジスルフィド結合の形成が
必要ないわゆる還元型ペプチドが挙げられ、そような例
としては、還元型α−ｈＡＮＰ （ヒト心房由来ナトリ
ウム排泄性ポリペプチド）、還元型ソマトスフチン、還
元型ＩＬ−２（インターロイキン−２）、還元型ＩＮＦ
（腫瘍壊死因子）等が挙げられる。
この反応は通常ｐＨ６〜１１で行なわれ、好ましくはｐ
Ｈ７〜１１で行なわれる。反応に使用する過酸化水素水
とシスティン含有ペプチドのモル比は１：１〜１００：
１の範囲、好ましくは１：１〜３：１の範囲から適宜選
択される。反応はシスティン含有ポリペプチドを適当な
緩衝液に溶解した溶液中で行なえばよい。反応温度は通
常、室温農産で十分迅速に進行する。
Ｈ７〜１１で行なわれる。反応に使用する過酸化水素水
とシスティン含有ペプチドのモル比は１：１〜１００：
１の範囲、好ましくは１：１〜３：１の範囲から適宜選
択される。反応はシスティン含有ポリペプチドを適当な
緩衝液に溶解した溶液中で行なえばよい。反応温度は通
常、室温農産で十分迅速に進行する。
次に実施例によりこの発明をより詳細に説明する。
実施例１
還元型α−ｈＡＮＰ１０ｍｇを０．５Ｍ塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１８．５
） ９．３ｍＨに溶解し、１０ｍＭ過酸化水素水０．
６６ｍＱを加え室温で１０分間放置した。反応終了後、
反応液中の酸化型α−ｈＡＮｐ （ジスルフィド結合が
形成きれた天然型α−ｈＡＮＰ ）を逆相分配高速液体
クロマトグラフィー＊（以下ＲＰ−ＨＰＬＣと称する）
で定量した。その結果、酸化型α−ｈＡＮＰの収量は９
．６ｍｇ （収率：９６％）であり、メチオニンが酸化
きれたα−ｈＡＮＰ［Ｍｅｔ（０） −ａ−ｈＡＮＰ］
は０．１５ｍｇとほとんど生成しなかった。
を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１８．５
） ９．３ｍＨに溶解し、１０ｍＭ過酸化水素水０．
６６ｍＱを加え室温で１０分間放置した。反応終了後、
反応液中の酸化型α−ｈＡＮｐ （ジスルフィド結合が
形成きれた天然型α−ｈＡＮＰ ）を逆相分配高速液体
クロマトグラフィー＊（以下ＲＰ−ＨＰＬＣと称する）
で定量した。その結果、酸化型α−ｈＡＮＰの収量は９
．６ｍｇ （収率：９６％）であり、メチオニンが酸化
きれたα−ｈＡＮＰ［Ｍｅｔ（０） −ａ−ｈＡＮＰ］
は０．１５ｍｇとほとんど生成しなかった。
なお参考までに空気酸化の比較例を次に示す。
還元型α−ｈＡＮＰ１１０ｍｇを０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５
） ５０ｍＱに溶解し、室温で一夜放置後、同様にＲＰ
−ＨＰＬＣにて定量したところ酸化型α−ｈＡＮＰの収
量は３３．８ｍｇ（３０，７％）にすぎず、大部分の原
料（６８，６ｍｇ ）は未反応のまま回収された。
ムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５
） ５０ｍＱに溶解し、室温で一夜放置後、同様にＲＰ
−ＨＰＬＣにて定量したところ酸化型α−ｈＡＮＰの収
量は３３．８ｍｇ（３０，７％）にすぎず、大部分の原
料（６８，６ｍｇ ）は未反応のまま回収された。
＊
註） ＲＰ−）ＩＰＬＣ条件 カラムＹＭＣＡＰ−３
０２０ＤＳ（φ４．６ｘ１５０ｍｍ ） 溶媒 Ａ ２０％Ｃ）１３ｃＮ ｘｎＯ，ＯＩＭＴ
ＦＡ Ｂ ６０ＸＣＨ３ＣＮ ｉｎ Ｏ，ｏｌＭｒＦＡ 溶出 Ａ−Ｂ、４０分 流速 １．ＱｍＱ／ｍｉｎ 検出 ２１４ｎｒｎ 実施例２ 還元型α−ｈＡＮＰ０．５ｍｇを６Ｍグアニジン塩酸塩
を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．０）
１ ｍａに溶解し、１０ｍＭ過酸化水素６０縛を加え、
室温で１０分間装置した。反応液を実施例１記載の条件
でＨＰＬＣ分析した結果、酸化型α−ｈＡＮＰの収量は
０．４５ｍｇ（９０％）でＭｅｔ（０）−α−ｈＡＮＰ
の生成量は２５犀にすぎなかった。
０２０ＤＳ（φ４．６ｘ１５０ｍｍ ） 溶媒 Ａ ２０％Ｃ）１３ｃＮ ｘｎＯ，ＯＩＭＴ
ＦＡ Ｂ ６０ＸＣＨ３ＣＮ ｉｎ Ｏ，ｏｌＭｒＦＡ 溶出 Ａ−Ｂ、４０分 流速 １．ＱｍＱ／ｍｉｎ 検出 ２１４ｎｒｎ 実施例２ 還元型α−ｈＡＮＰ０．５ｍｇを６Ｍグアニジン塩酸塩
を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．０）
１ ｍａに溶解し、１０ｍＭ過酸化水素６０縛を加え、
室温で１０分間装置した。反応液を実施例１記載の条件
でＨＰＬＣ分析した結果、酸化型α−ｈＡＮＰの収量は
０．４５ｍｇ（９０％）でＭｅｔ（０）−α−ｈＡＮＰ
の生成量は２５犀にすぎなかった。
他方、還元型α−ｈＡＮＰ０．５ｍｇを６Ｍグアニジン
塩酸塩を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）ｌ ｍＱに溶解し室温で一夜放置後、反応液を実施例
１記載の条件でＨＰＬＣ分析した結果、空気酸化は全く
起こらず原料が定量的に回収された。
塩酸塩を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）ｌ ｍＱに溶解し室温で一夜放置後、反応液を実施例
１記載の条件でＨＰＬＣ分析した結果、空気酸化は全く
起こらず原料が定量的に回収された。
以上より、空気酸化が全く起らない高塩濃度の条件下で
も、この発明の方法では効率よくジスルフィド結合が形
成されて、酸化型α−ｈＡＮＰが得られることが明らか
である。
も、この発明の方法では効率よくジスルフィド結合が形
成されて、酸化型α−ｈＡＮＰが得られることが明らか
である。
実施例３
還元型ソマトスタチンを実施例２と同様にして過酸化水
素で酸化したところ、酸化型ソマトスフチン（ジスルフ
ィド結合が形成された天然型ソマトスタチン）が９３％
の収率で得られた。
素で酸化したところ、酸化型ソマトスフチン（ジスルフ
ィド結合が形成された天然型ソマトスタチン）が９３％
の収率で得られた。
Claims (1)
- 分子内ジスルフィド結合を形成することにより生物学的
に活性なペプチドを与えるシステイン含有ペプチドに過
酸化水素を作用させることを特徴とするペプチドの分子
内ジスルフィド結合の形成法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63254530A JP2682061B2 (ja) | 1988-10-07 | 1988-10-07 | ペプチドの分子内ジスルフィド結合の形成法 |
| US07/417,323 US5102985A (en) | 1988-10-07 | 1989-10-04 | Process for the formation of intramolecular disulfide bridge in a polypeptide |
| AT89310185T ATE127127T1 (de) | 1988-10-07 | 1989-10-05 | Verfahren zur herstellung einer intramolekularen disulphid-brücke in polypeptiden. |
| EP89310185A EP0363192B1 (en) | 1988-10-07 | 1989-10-05 | A process for the formation of intramolecular disulfide bridge in a polypeptide |
| ES89310185T ES2078908T3 (es) | 1988-10-07 | 1989-10-05 | Un procedimiento para la formacion de un puente intramolecular de disulfuro en un polipeptido. |
| DE68924033T DE68924033T2 (de) | 1988-10-07 | 1989-10-05 | Verfahren zur Herstellung einer intramolekularen Disulphid-Brücke in Polypeptiden. |
| GR950402406T GR3017288T3 (en) | 1988-10-07 | 1995-09-01 | A process for the formation of intramolecular disulfide bridge in a polypeptide. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63254530A JP2682061B2 (ja) | 1988-10-07 | 1988-10-07 | ペプチドの分子内ジスルフィド結合の形成法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02101097A true JPH02101097A (ja) | 1990-04-12 |
| JP2682061B2 JP2682061B2 (ja) | 1997-11-26 |
Family
ID=17266324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63254530A Expired - Fee Related JP2682061B2 (ja) | 1988-10-07 | 1988-10-07 | ペプチドの分子内ジスルフィド結合の形成法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5102985A (ja) |
| EP (1) | EP0363192B1 (ja) |
| JP (1) | JP2682061B2 (ja) |
| AT (1) | ATE127127T1 (ja) |
| DE (1) | DE68924033T2 (ja) |
| ES (1) | ES2078908T3 (ja) |
| GR (1) | GR3017288T3 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9004047L (sv) * | 1990-12-19 | 1992-06-20 | Francisco Batista | Metod foer immobilisering av tiolfoereningar via aktivering av polymerer, aktiverade polymerer, och produkter erhaallna med metoden |
| WO2010089757A2 (en) | 2008-11-07 | 2010-08-12 | Usv Limited | An improved process for synthesis of cyclic octapeptide |
| SI2865387T1 (sl) | 2008-11-21 | 2019-10-30 | Kobenhavns Univ University Of Copenhagen | Primiranje imunskega odziva |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3929758A (en) * | 1974-09-12 | 1975-12-30 | Armour Pharma | Cyclization of cysteine-containing peptides |
| US4216141A (en) * | 1978-07-19 | 1980-08-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Method for cyclization of peptides |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US4656248A (en) * | 1985-04-23 | 1987-04-07 | Smithkline Beckman Corporation | Cupric oxidation of 1,6-dimercapto-containing peptides |
| US4835254A (en) * | 1987-08-24 | 1989-05-30 | Eli Lilly And Company | Process for reducing methionine sulfoxide residues in peptides or proteins |
| IT1219454B (it) * | 1988-02-17 | 1990-05-18 | Serono Cesare Ist Ricerca | Metodo di rottura alla metionina di polipeptidi contenenti pontidisolfuro |
-
1988
- 1988-10-07 JP JP63254530A patent/JP2682061B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-10-04 US US07/417,323 patent/US5102985A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-05 ES ES89310185T patent/ES2078908T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-10-05 AT AT89310185T patent/ATE127127T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-10-05 DE DE68924033T patent/DE68924033T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-10-05 EP EP89310185A patent/EP0363192B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-09-01 GR GR950402406T patent/GR3017288T3/el unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOCHEMISTRY=1988 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1988 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2078908T3 (es) | 1996-01-01 |
| EP0363192B1 (en) | 1995-08-30 |
| JP2682061B2 (ja) | 1997-11-26 |
| EP0363192A3 (en) | 1991-09-11 |
| US5102985A (en) | 1992-04-07 |
| GR3017288T3 (en) | 1995-12-31 |
| DE68924033D1 (de) | 1995-10-05 |
| DE68924033T2 (de) | 1996-01-25 |
| EP0363192A2 (en) | 1990-04-11 |
| ATE127127T1 (de) | 1995-09-15 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |