JPH02104570A

JPH02104570A - 新規な１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ↓３誘導体及びその製造法

Info

Publication number: JPH02104570A
Application number: JP63255705A
Authority: JP
Inventors: Miyuki Tanabe; 田那辺　幸; Shigeru Ikuta; 生田　茂
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1988-10-11
Filing date: 1988-10-11
Publication date: 1990-04-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規なｌα、２５−ジヒドロキシビタミンＤ
、アミノ酸誘導体を合成し、それをハプテンとして担体
蛋白質と結合させて免疫することにより得た抗体と、ヨ
ードの放射性同位元素で標識された新規なヨードの放射
性同位元素標識１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
誘導体を用いて、被験液中の活性型である１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３量を定量することを目的とし
て確立した発明であり、合成化学、免疫化学および放射
化学の分野に係る。

〔従来の技術〕

従来、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定量法
として、ラジオレセプターアッセイ法（ＲＲＡ）とラジ
オイムノアッセイ法（ＲＩ　Ａ）が報告されており、こ
れらのアッセイ法における標識化合物は、トリチウム〔
３Ｈ〕標識化合物が用いられている。ＲＲＡ法に用いら
れているレセプターは、一般にはニワトリ小腸粘膜細胞
質両分由来のレセプターが使用されている（Ａｒｃｈ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、１７６．２３５〜
２４３　　（１９７６）；ビタミン５５巻１２号（１２
月）５９５〜６０５　（１９８１）、臨床検査２６、　
１　（１月）７〜１８（１９８２））。また、ＲＩＡ法
において用いられる抗体を作製するためのハプテンとし
ては、側鎖末端にカルボニル基をもつもの等が知られて
いる（Ｃ１ｉｎｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ、５↓、３２９〜
３３２　（１９７８）；Ｃｌ１ｎｃａｌ　　Ｃｈｅｍ、
、２７／３．４５８〜４６３　（１９８１）；　１ｂｉ
ｄ、、２６１５．５６２〜５６７　　（１９８０）；１
ｂｉｄｉ２９／１，１９６〜２００　（１９８３）ｉＪ
。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、９８，９９１〜９９８　（１９８５
）；Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、、Ｃｏ
ｍｍ、、４３１〜４３６　（１９８３）；特開昭５５−
４７６’５３号公報；特開昭５８−１９３４６３号公報
；特開昭５８−９２６５６号公報；特開昭５９−１４８
７７５号公報；特開昭６１−４８４９７号公報〕。

いづれの定量法においても、標識化合物としては、１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のトリチウム〔３Ｈ
〕標識化合物を用いる点で共通している。

〔発明が解決しようとする課題〕

被験液中の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、の定
量において、前述の従来用いられているトリチウム（’
　Ｈ）標識化合物は、放射線エネルギーが　３２ｐや１
２５　１と比較して極めて低く、そのためにトリチウム
〔３Ｈ〕標識化合物を用いた定量法は、液体シンチレー
ションカウンター等による検出装置を必要とするため、
高価であり且つ測定操作が煩雑であった。そのため高感
度でより簡便な測定法が望まれていた。

〔課題を解決するたの手段〕

本発明者らは、前述の問題点を鑑み鋭意研究の結果、高
放射線エネルギーを有し、汎用性において優れている放
射性ヨードで標識された１α、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３誘導体を開発した。従来単位時間当りの放射エ
ネルギーの低いβ線放出核種であるトリチウム〔３Ｈ〕
による種々のビタミンＤ３標識化合物が存在した。しか
し、トリチウム〔３Ｈ〕と同様にラジオイムノアッセイ
に汎用される放射エネルギーの高いγ線放出核種のヨー
ド（１２５１）で標識されたビタミンＤ３誘導体は、ビ
タミンＤの特徴でもある共役トリエン構造の不安定さゆ
え、ラジカル反応を誘発し自己分解を越すと考えられ、
現在まで報告されていない。しかるに、本発明者らが開
発したヨード〔１２’　　りで標識された１α、２５−
ジヒロキシビタミンＤ、誘導体はγ線による構造的分解
を起こすこな（安定であり、ラジオイムノアッセイに利
用し得るものであることを見出した。

一般に低分子化合物の放射性ヨード標識法としては、直
接標識法（クロラミン−Ｔ法）と間接標識法（ポルトン
−ハンター試薬による方法）がある（Ａｍｅｒｓｈａｍ
；アマシャームノートｌＮ０Ｖ、１９８１）、Ｌかし、
ビタミンＤ頚は酸、酸素、酸化剤、熱、光に対して非常
に不安定であるため、緩和な反応条件で進行する間接標
識法を用いることが最も好ましい。間接標識法を実施す
るに当り、まず、側鎖末端にアミノ基を有する新規な１
α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体を
合成した。さらに、該誘導体をハブテンとして担体蛋白
質と結合せしめ、これを動物に接種して抗体を得た。ま
た同誘導体にヨードの放射性同位元素標識を行った。さ
らに、得られた抗体とヨードの放射性同位元素標識化合
物を用いてラジオイムノアッセイの測定系を確立するに
到り、被験液中の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ
３　（以下、１α、２５　　　（ＯＨ）ｚ　Ｄ：ｌと略
すことがある）の定量に際して、該測定系を用いるアッ
セイ法が高感度かつ簡便な極めて有用性に富む定量法で
あることを見出した。

また、コンペティティブプロテインパインデインアフセ
イ法（ＣＰＢＡ法）によっても本発明のヨード放射性同
位元素標識化合物用いて高感度に１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３を定量測定することを見出した。

即ち本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので
あって、式（１）〔式中、Ｒ＋、Ｒｚは何れか一方が水酸基で他方が−Ｏ
Ｃｏ　　Ｒ２ＮＨ２を示し、Ｒ１は炭素数１〜１０のア
ルキレン基を示す〕で表される新規な１α、２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体および、式（Ｉり以下余白〔式中、Ｒ＋　、　Ｒｚは何れが一方が水酸基で他方が
−０−ＣＯ−Ｒ３Ｎ　Ｈ−Ｒ４を示し、Ｒ１は炭素数１
〜１０のアルキレン基、Ｒ４はアミノ保護基を示す〕で
表される１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘導体
を、塩基存在の不活性溶媒中でアミノ保護基を脱離せし
めることを特徴とする、弐（Ｉ）で表される新規な１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸誘導体の製
造法であり、式（ＩＩＩ）〔式中、Ｒ，、Ｒ２は何れか一方が水酸基で他方が−０
−Ｃｏ−Ｒｓ−ＮＨ−Ｒ５を示し、Ｒ１は炭素数遍〜１
０のアルキレン基、Ｒ３はヨードの放射性同位元素を有
する残基を示す〕で表されるヨードの放射性同位元素標
識１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体導体であ
る。また、被験液に式（ＩＩＩ）で表されるヨードの放
射性同位元素標ｔｉｌｌα、２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ、誘導体とｌα、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
抗体（以下、抗体とのみ略すことがある）またはビタミ
ンＤバインディングプロティン（以下、ＤＢＰと略すこ
とがある）とを反応せしめて生成する該ヨードの放射性
同位元素標識１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘
導体□抗体結合体または該ヨードの放射性同位元素標識
ｌα、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体□ＤＢＰ
結合体と、未反応該ヨードの放射性同位元素標識１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体とを分離し、次
いで分離したいずれか一方の放射性同位元素である標識
ヨードの量を定量することを特徴とする該被験液中の１
α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定量法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、式（Ｉ）で表される１α、２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ３アミノ酸誘導体は、アミノ酸を１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３の１位炭素のα水酸基又は３
位炭素のβ水酸基を介して共有結合せしめて得られるも
ので、式（１）のＲＩは炭素数１〜ＩＯのアルキレン基
である。また、この式（１）で表される１α、２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸誘導体は、後述の１α
。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体作製時のハブテン
のＦｍ体としても用いられ、ハプテンの誘導体として担
体蛋白質と結合させる際の架橋基の鎖長は、炭素数にし
て１〜１０個が好ましく、特に好ましくは２〜６個が挙
げられることから、Ｒ１は直鎖状炭素数２〜６個からな
るアルキレン基であることが特に好ましい。

式（Ｔ）で示す１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
アミノ酸誘導体は、１α、２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３にアミノ基が保護されたアミノ酸を反応せしめ、式
（Ｕ）で表される１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ
３誘専体を得、該誘導体（［１からアミノ保護基を脱離
せしめることにより得られる。

まず、アミノ基を保護するために使用する原料アミノ酸
としては、下記の式（ｒＶ）ＨＯＯＣ−Ｒｉ　−ＮＨ２（ＩＶ）（式中Ｒ３は前記と同じ基を示す）で表されるものであ
り、Ｒ３で示されるアルキレン基は炭素数ｎ−１＋　グ
リシン、ｎ＝２．β−アラニン、ｎ−３、γ−アミノー
ｎ−酪酸、ｎ＝４．δ−アミノペンタ酸、ｎ＝５．ε−
アミノ−ｎ−カプロン酸、ｎ＝６．７−アミノへブタン
酸、さらにｎ＝１０．１１−アミノウンデシル酸であっ
て、アミノ酸中の炭素構造は好ましくは直鎖状であり、
炭素数２〜６個のアルキレン基を有するものが好ましく
、本発明の思想からすれば、δ−アミノ−レブリン酸、
グリシルグリシンやδ−アミノ酸であるＤおよび／また
はＬ体のリジン等を用いることもできる。さらに、側鎖
に水酸基を有するアミノ酸、例えば４−アミノ−３−ヒ
ドロキシブチリックアシド等でも水酸基を保護すること
によって同様に用いることができる。

また、アミノ酸のアミノ保護基としては、アミノ保ｇ１
！基の脱離操作に際して、苛酷な脱離条件を要する場合
にはビタミンＤＨ自体が分解されることもあり得ること
から、弱塩基条件下で緩和に短時間で脱離できるもので
あればよく、例えば、９−フルオレニルメチルオキシカ
ルボニル基〔以下、Ｆｍｏｃと略すことがある）、９−
（２−スルホ）フルオレニルメチルオキシカルボニル基
、１、■−ジメチルー２−シアノエチルオキシカルポニ
ル基、５−ベンズイソキサゾリルメチルオキシカルボニ
ル基等が挙げられるが、特に好ましくは容易にアミノ酸
のアミノ基を保護することができる９−フルオレニルメ
チルオキシカルボニル基が、アミノ基の保護基として良
い。アミノ基を保護したアミノ酸を得るに当たっては、
上述のアミノ保護基を有する活性誘導体として、例えば
Ｆｍ。

Ｃをもつ活性エステルである、Ｎ−（９−フルオレニル
メチルオキシカルボニルオキシ）サクシニミドが挙げら
れ、その他にも９−フルオレニルメチルクロロホルメー
トを用いることができる。またアミノ基の保護を行うに
際しては、該活性誘導体と目的のアミノ酸を公知の方法
（シ、＾、Ｃａｒｐｉｎ。

ａｎｄ　　Ｇ、Ｙ、Ｈａｎ　　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、
　　、３７．　３４０４　　　（１９７２）　　）にて
反応せしめＦｍｏｃ−アミノ酸を得ればよい。

さらに、アミノ基を保護したアミノ酸としてＦｍｏｃ−
アミノ酸を用いて式（ＩＩ）のｌα、２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ１アミノ酸誘導体を得るだめの方法を例に
とると、Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ−アミノ酸を１α、２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ、の１位炭素のα水酸基または３位
炭素のβ水酸基を介して共有結合せしめるに当り３α、
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３１当量に対してＦ　ｍ
　ｏ　ｃ−アミノ酸またはその酸無水物、酸ハライドま
たは活性エステル等の通常使用されるカルボキシル基反
応性誘導体を１当量用いることにより式（ＩＩ）で表さ
れる化合物が得られる。より好ましくは、Ｆｍｏｃ−ア
ミノ酸１当量と”他の酸”１当量からなる混合酸無水物
を、不活性ガス霊気下、塩基存在の無水溶媒中で反応ゼ
しめる。該混合酸無水物を用いて１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３と反応せしめるのは、１α、２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３の炭素２５位の水酸基にＦｍｏ
ｃ−アミノ酸が結合した副生成物を生成させないためで
あり、該混合酸無水物を調製するに当り”他の酸“とし
ては、吉草酸、ピバリン酸、イソブチルオキシカルボン
酸が用いられ、特にピバリン酸が好ましい。１α、２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３とＦｍｏｃ−アミノ酸との
反応において、無水溶媒としてはテトラヒドロフラン、
ジオキサン等の無水有機溶媒が好ましい。また、塩基と
しては、特にジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）およ
びピペリジノビリジン（ＰＰＹ）が好ましい。これは、
立体障害のある２級アルコール、３級アルコールのエス
テル化に有用である。不活性ガスとしては、アルゴンお
よび窒素ガスが好ましい。また、反応に当たり、反応温
度は０〜２０℃、反応時間は１〜３時間が好ましい。こ
のようにして得られた式（Ｉ［）で表されるｌα、２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体は、１α、２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ、のｌα位又は３β位に下記の式
〔Ｖ〕 −０−ＱＣ−Ｒ，−ＮＨ−Ｒ，（Ｖ）（式中Ｒ３，Ｒ４は前記と同じ基を示す）で表される残
基が共有結合した化合物の混合物であり、必要に応じて
ＨＰＬＣ等により分離・精製するこができる。

さらに式（ＩＩ）で表される該ｌα、２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ３誘導体を、塩基存在の不活性溶媒中でア
ミノ保護基の脱離操作（脱Ｆｍｏ　ｃ化）により、式［
１）で表される１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
アミノ酸誘導体とする。

この保護基の脱離操作を行うに当たり、用いられる塩基
としては、ピペリジン、モルホリン、エタノールアミン
等があり、特にモルホリンが好ましく、不活性溶媒とし
ては、エタノール、メタノールが良く、特に無水エタノ
ール、無水メタノールが好ましい。また反応は不活性ガ
ス霊気下、遮光状態で行ない、反応温度は０〜２０℃、
反応時間は１〜３時間が好ましい。式（ＩＩ）で表され
る１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体として
、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の１α位また
は３β位に式（Ｖ）で表される残基が共有結合した化合
物の混合物を使用した時には、必要に応じてＨＰＬＣ等
により対応して生成する式（Ｔ）で表される２種の混合
物を単離精製すればよい。また前工程にて単離精製した
１種の式〔■〕で表される化合物を使用した時には、必
要に応じてカラムクロマトグラフィー、ＴＬＣ等の精製
手段を用いて精製してもよい。

また、前述の合成工程において副生ずる１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ、の１α位及び３β位に
式〔ｖ〕で表される残基が共有結合した化合物は、先ア
ルカリ水溶液で加水分解処理することにより原料の１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、とすることができる
。さらに前述の副生ずる化合物をモルホリン処理するこ
とにより式（Ｖｒ〕〔式中、Ｒ６，Ｒ７は一０ＣＲ１−
ＮＨ２を示し、Ｒ３は前記と同じ基を示す〕で表される
化合物が得られ、ハプテン化合物として利用することも
できる。

次いで、式［ｌ１１）で表されるヨードの放射性同位元
素標識ｌα、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体に
ついて述べる。Ｒ３については上述の式（１）において
説明したＲ１と同意味を示し、Ｒ３はヨードの放射性同
位元素を有する残基であり、用いられるヨードの放射性
同位元素としては、＋２５１や１３１１などが用いられ
るが、好ましくは半減期の比較的長い１２５Ｉが良い。

ヨード〔１２ＳＩ〕の放射性同位元素を有する残基とし
ては、３−（４−ヒドロキシ−３−ヨード（＋２５１）
フェニル）プロピオニルＭ、３−　（３，５−ショート
（１２’Ｉ）−４−ヒドロキシフェニル）プロピオニル
基、２−（４−ヒドロキシ−３−ヨード〔１２５ｒ　）
フェニル）アセチル基、２−　（３，５−ショート（”
Ｊ）−４−ヒドロキシフェニル）７−ｔ＝チ／Ｌ４．２
−ヨード（＋２５　りアセチル基、４−ヨード（１２％
　ｌ　）−ベンゾキシメチルカルボニル基、Ｎ−置換−
３−ヨード（１２５１）チロシン残基などが挙げられる
。特に３−（４−ヒドロキシ−３−ヨード（Ｉｔｓ　ｔ
　）フェニル）プロピオニル基および３−　（３，５−
ショート〔Ｉｚｓ　□−４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオニル基が好ましい。

ヨードの放射性同位元素標識１α、２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ、誘導体の製造においては、式（１）で表さ
れる１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘
導体に、間接標識法（例えば、ポルトン−ハンター試薬
による方法）により放射性ヨードで標識せしめることに
より、式〔■〕で表されるヨードの放射性同位元素標識
１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体を得る。

ここでいう間接標識法とは、ヨードの放射性同位元素を
有する残基を構成成分とする後記の反応性誘導体〔■〕
と、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸誘
導体を反応せしめ、放射性ヨードを標識せしめた式（Ｉ
ＩＩ）で表されるヨードの放射性同位元素標識１α、２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３Ｂ上記した反応性誘導体〔■〕は、式％式％（で表され、Ｒ２は前述と同じ意味を示し、Ｘは、サクシ
ニイミディルーＮーオキシ基、フタルゴミデイルーＮ−
オキシ基、５−ノルボルネン−２。

３−ジカルボキシゴミデイルーＮ−オキシ基またはマレ
イミダイル−Ｎ−オキシ基を示し、Ｒ３が３−（４−ヒ
ドロキシ−３−ヨード（＋２％　　Ｉ）フェニル）プロ
ピオニル基であり、Ｘがサクシニルイミダイル−Ｎ−オ
キシ基であるＮ−サクシニルイミディル３−（４−ヒド
ロキシ−３−：ｌ？−Ｆ（目５　同フェニル）プロピオ
ネートは（ｌａｓｔ）ポルトン−ハンター試薬として市
販されており、筒便に使用できる。

例えば、この〔Ｉｚｓ　　１）ポルトン−ハンター試薬
を用いて、式（１）で表される１α，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ，アミ２８ｍ８体に間接標識を行うために
、ヨードの放射性同位元素とアミノ基を介して共有結合
せしめる際は、反応に用いるヨード（Ｉｔｓ　　１）ポ
ルトン−ハンター試薬数ｐｍｏｌｅ〜数ｍｍｏｌｅに対
して、１α．２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸
Ｌｔｄ，　ｊｌＬ体〔Ｉ〕を５００〜２０００倍程度過
剰に添加、するのが好ましく、特に１０００倍で添加す
るのが好ましい。通常、反応は０〜３０℃、１２〜７２
時間行えばよい。ここで、反応生成物であるヨード（１
２Ｓ　　Ｉ）の放射性同位元素標識１α，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３ｇ３体（ＩＩＩ）は、ｔＡ法または
ＣＰＢＡ法における利用率を高めるために、ＴＬＣまた
は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などでよ
り純度を亮くすることが好ましい。このようにして得ら
れたヨード（Ｉｔｓ　ｌ　）標識１α，２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ，誘導体（Ｉ［Ｉ］は、エタノール溶液
中に一２０℃保存においてヨード（Ｉｔｓ　１　）の半
減期である２ケ月以上安定であり、ラジオイムノアッセ
イに充分使用し得るものであった。この際、保存温度は
できるだけ低温が良く５℃〜−２０℃以下、特に−２０
℃以下が好ましい。溶媒はアルコール系、エーテル系が
好ましく、保存の際は不活生ガスで置換することが好ま
しい。

つぎに、ハプテンである１α、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３の抗体作製のために用いる、前述の如くに得ら
れた式（１）で表される１α、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３アミノ酸ＨＡ　”５体を担体蛋白質と結合させ
、それを動物に接種することにより１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３抗体を作製し得る。１α、２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３抗体を得るにあたり、まず抗体
作製のために用いるハブテンの免疫原性抗原を得るに必
要な担体蛋白質としては、例えば、単純蛋白質、ポリペ
プチド、糖蛋白などの複合蛋白質等が挙げられ、単純蛋
白質としては牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清ア
ルブミン、ヒト血清グロブリンなどがあり、ポリペプチ
ドとしては、ポリリジン等で、Ｆ”ｆＨ白としてはムコ
蛋白質等が挙げられる。中でも単純蛋白質が好ましく、
特に牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが好ましい
。１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸誘導
体（１）と上述の担体蛋白質とを縮合剤、架橋剤の存在
下で共有結合せしめる。その際、縮合剤、架橋剤として
は、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、酸無
水物、グルタルアルデヒドなどが用いられるが、中でも
特にＤＣＣが好ましい。１α、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、アミノ酸誘導体と担体蛋白質との結合比率は、
一般に多過ぎても少な過ぎても得られる抗体の力価が低
下するため、担体蛋白質一分子当りにつき、１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体を１０
〜４０個結合せしめるのが好ましい。

かくして得られる抗体作製のための上記の結合体は、動
物に接種して抗体を生産させることができる。動物に接
種するには、非経口的に投与する方法が採用され、例え
ば皮下または皮肉に注射することによって行われる。接
種する際には、例えば、上述の操作で得られたｌα、２
５−ジヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸誘導体−担体蛋
白質の結合抗原を緩衝液または生理食塩水に溶解し、同
量のコンプリート・フロイント・アジュバント（Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ　ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ：　
Ｃ，Ｆ、　Ａ）を加え、充分乳化した後、用いる溢血動
物の皮下、皮肉に投与し、１〜３週間毎に同一結合抗原
を約１０回はど投与して免疫せしめる。また必要により
、結合抗原を免疫担当中枢器官である肺臓に直接接種し
てもよい。この間、一定期間毎に血中抗体価を測定しな
がら最高時点で全採血しこれを静置し、凝固せしめて遠
心分離し、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗体
を含有する抗血清を得る。また、この場合に用いる温血
動物としては抗体産生能のある動物であれば何れを用い
てもよく、大量の抗体を得るにはヤギ、ウシ、ヒツジ等
の大型動物を用いるのが好ましい。通常はニワトリ、ウ
サギ、ラット、マウスを用いるが、何ら限定されるもの
ではない。さらにこれらの被免疫動物から得られたｌα
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗体を含有する抗血
清から１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を得
るには、通常用いられる抗体の精製手段の方法によって
行なえばよく、例えば抗血清を硫安分画し、次いでイオ
ン交換クロマトグラフィーあるいはゲル濾過によって精
製・採取すればよい。

さらに１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を得
る荊法としては、上述の１α、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３アミノ酸誘導体−担体蛋白質の結合体抗原を接
種した動物の目的抗体産生肺臓細胞と株化された骨髄腫
細胞とを融合せしめて得られるハイブリドーマ（融合細
胞）が産生ずるモノクロナール抗体を製造する方法を用
いてもよい。特に、哺乳動物としてマウスを用いる方法
がよく利用されている。例えばマウス（Ｂａｌｂ　／　
ｃ　）を用い、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
アミノ酸誘導体−担体蛋白質の結合抗原を緩衝液または
生理食塩水に溶解し、同量のコンプリート・フロイント
・アジュバントを加えて混和懸濁した乳化液をマウスの
皮下に投与し、その後約１週間毎に複数回追加投与し、
感作を行う。その後、最終感“作の３〜５日後に細胞融
合の作業を行う。これは最終感作３〜５日後の肺臓にお
ける抗体産生前駆細胞を使用する細胞融合は、目的抗体
の産生能を有するハイプリドーマが最も得られやすいと
いわれているためであって、通常このような細胞が最も
多くなる最終感作後３日目頃の肺臓細胞が融合に用いら
れる。それ故、最柊惑作から３〜５日後に、１α、２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体産生細胞である肺臓細
胞を採取して、これを長期培養可能な株化骨髄腫細胞と
融合させる。長期培養可能な株化細胞とは、インビトロ
またはインビボの条件下で長期間生育し増殖する免疫グ
ロブリンまたはその類縁蛋白質の産生細胞であればよく
、通常は増殖が旺盛な腫瘍細胞株が用いられる。好まし
い代表例を挙げると骨髄腫細胞株（ミエローマ細胞）で
あるＰ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８ＵＩ、ＳＰ２／Ｕ−Ａｇ　１４、ＭＰＣＩＩ−４５
，６゜７Ｇ、１．７等の細胞株が挙げられるが、本発明
においてはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１が好適である。こ
れらの細胞株は通常の細胞培養培地で培養保存される。

例えば培養は１０％ＦＣ３添加ＲＰＭ１１６４０　（商
品名：ＲＰＭ１１６４０：フローラボラトリー社製）に
グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイ
シン等を加えた培地で行い、保存には同じ培地にＳ−ア
ザグアニンを添加した培養液が用いられる。細胞融合に
際しては１回の融合に１〜３Ｘ１０８個のミエローマ細
胞を使用すればよい。融合に用いられる抗体産生細胞で
ある肺臓細胞は、前記したような感作後のマウスを解剖
して肺臓をとり出し、細断した後、細胞用メソシュ上で
すりつふし、肺臓細胞懸濁液を調製する。細胞は洗浄等
の処置をしてからミエローマ細胞との融合に使うが、１
回の融合には、通常１〜３Ｘ１０”個の細胞が使用され
る。細胞融合は上記の如くして得られた肺臓細胞とミエ
ローマ細胞を混合して行われる。混合の割合は、経験的
にミエローマ細胞：肺臓細胞を１：３〜１０の割合で行
われる。細胞融合はハイプリドーマ用培地で行われる。

融合に際しては、通常の細胞融合の方法、即ちセンダイ
ウィルスやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融合
促進剤を用いるのがよいことは言うまでもないが、本発
明においてはＰＥＧの使用が最適である。このように細
胞促進剤を加えて融合した細胞を前記したハイブリドー
マ用培地へ分注し、培養を行う。このようにしてマウス
肺臓細胞とマウスミエローマｍ胞の融合が行われるが、
融合細胞のみを選択するためにＨＡ　Ｔ培地にて融合細
胞を識別増殖させる。ＨＡＴ培地は前記したハイブリド
ーマ用培地にヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを添加した培地である。このように選択したハイブリ
ドーマは一般に細胞選択用プレートの１穴当り２個以上
のハイブリドーマが生育しており、２種以上抗体が分泌
される可能性があることや、他に抗体を分泌できないハ
イブリドーマが混在していたりするので、同一の性質を
有する細胞を得るために、個々のクローンを分離する必
要がある。即ち、クローン化（クローニング）を行うこ
とが必要である。クローン化の方法としては、限界希釈
法や軟寒天法が用いられるが、本発明においては限界希
釈法が簡便である。

このようにして得られた、高力価の１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３抗体を分泌するハイブリドーマを保
存するのであれば、なるべ（早い時期の内に凍結保存す
るのがよい。凍結保存は通常の方法にしたがい、例えば
凍結用小試験管やアンプルに細胞液を入れ、−８０℃の
フリーザー中で凍結させて、更に液体窒素中にて保存す
ればよい。さらに、ハイプリドーマ増殖法の一例として
は、予めプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎ＋２＋　６＋　１
０＋　１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａ
ｎｅ　、アルドリッチ社ｖＪＡ）を腹腔的投与したプリ
スタン処理マウスの腹腔に、前記のハイブリドーマを投
与し、約１０日後腹水を採取することにより抗体の大量
調製を行うこともできる。また該ハイブリドーマをウシ
胎児血清含有ＲＰＭＩ培地やダルベツコ変法イーグル培
地等にて培養してもよい。得られた抗体は通常用いられ
る精製手段、例えば抗体を硫安分画し、次いでイオン交
換クロマトグラフィーあるいはゲル濾過やアフィニティ
ークロマトグラフィー等を行って、ＩｇＧ分画を行う。

このようにして精製された１α、２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ３モノクロナ−ル抗体を得ればよい。また、１
α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３モノクロナール抗
体産生細胞を、組織適合性抗原を同じくする動物や無胸
腺のヌードマウスの体内で腫瘍として生育せしめ、これ
から採取、精製してもよい。

さらに、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定量
に際し、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ポリク
ロナール抗体または１α、２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３モノクロナール抗体（以下、−括して１α２２５−
ジヒドロキシビタミンＤ、抗体と略すことがある）は、
そのままの可溶性の状態で用いてもよく、または不溶性
担体に固定化した固相体として用いてもよい。このよう
な固相体としては、不溶性担体とｌα、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３抗体とを、多官能性試薬を用いて結合
せしめ、且つこの結合抗体がｌα、２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３に対して抗体活性を保持していればよい。

用いられる多官能性試薬としては、アミノ基、水１．Ｈ
、カルボキシル基、チオール基等の官能基と反応し得る
基を二つ以上有する多官能性試薬であればよく、例えば
、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポア
アルデヒド等のアルデヒド化合物、マロン酸、グルタル
酸、アジピン酸等のジカルボン酸またはその反応性誘導
体、ヘキサメチレンジイソシアナート、２．４−トルエ
ンジイソシアナート等のジイソシアナート化合物、ヘキ
サメチレンジイソチオシアナート等のジイソチオシアナ
ート化合物、マレイミド安息香酸、マレイミドフェニル
酢酸等のマレイミドカルボン酸またはその反応性誘導体
、Ｎ、Ｎ’　　−エチレンビスマレイミド、Ｎ、Ｎ”　
−〇−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化合物
、ビスジアゾベンジジン、ジエチルマロンイミデート、
ジメチルアジピンイミデート、Ｎ、Ｎ’−ポリメチレン
ビスヨードアセトアミドや３−（２”−ベンゾチアゾリ
ル−ジチオ）プロピオン酸、３−　（２’−ピリジルジ
チオ）プロピオン酸等のチオカルボン酸化合物またはそ
の反応性誘導体等が挙げられ、これらの多官能性試薬は
、１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ：ｌ抗体のアミノ基・、
カルボキシル基、水酸基、チオール基等の官能基との結
合を考慮して選択すればよい。用いられる不溶性担体と
しては、用いる抗体を結合させることができる多官能性
試薬の官能基以外の他の官能基と反応し得る基を導入せ
しめたものであればよく、例えばアルブミンやゼラチン
等の不溶化蛋白質、アガロース、セルロースやデキスト
リン等のエピクロルヒドリン処理による不溶化多ｔｉ類
や臭化シアン処理およびアミノ基ぶ入を目的として、こ
れに対応するスペーサーが導入され、且つ不溶化された
アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステル、
メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、ビニルアル
コール、酢酸ビニル、スチレン、アミノスチレン、クロ
ルスチレン、マレイン酸、フマル酸等の重合体または共
重合体等の不溶性合成高分子系担体やケイ素やアルミニ
ウム等の無機化合物にアミノ基等の官能基導入の不溶性
無機系担体が挙げられる。また用いる不溶性担体は、単
なる物理的な吸着作用により、１α、２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ、抗体を結合し得るものであってもよい。

これらの不溶性担体は、通常少なくとも濾過等の手段に
より容易に単離できる粒径のものがよく、例えば径１ｍ
ｍ以上、好ましくは５ｍｍ以上のものがよく、ビーズ状
のものが繁用される。また、ビーズ状の代わりに、抗原
抗体反応管の管底部の形状と相似した紡錘形の形状のも
のとして用いてもよい。

１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体にスペーサ
ー導入試薬を用いて反応し得る基を導入するに当たって
は、例えば、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド
、アジボアルデヒド等のジアルデヒド化合物、ω−アミ
ノ酪酸、ω−アミノグルタミン酸の酸クロライド、スク
シンイミドエステル、ｐ−ニトロフヱニルエステル等の
反応性誘導体、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸等のジカルボン酸化合物の反応性＝ｉ体、ヘキサ
メチレンジアミン、デカメチレンジアミン等のジアミン
化合物、３−　（２’　　−ピリジル−ジチオ）プロピ
オン酸、３−（２”　−ベンゾチアゾリルージチオ）プ
ロピオン酸等の反応性誘導体、Ｓ−アセチルメルカプト
サクシニック・アンハイドライド、２−アミノエタンチ
オール等のチオール化合物等のスペーサー導入試薬の１
個または２個以上を用いて新たにアルデヒド基、カルボ
キシル基、アミノ基、チオール基等の官能基を４人すれ
ばよい。

次いでこのような不溶性担体の反応し得る基に、１α、
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を直接または多官
能性試薬を用いて結合せしめるのであるが、縮合におい
ては、通常ｐｒｔ６．ｏ〜８゜５の緩衝液または有機溶
媒またはこれらの混合媒体中で０〜４０℃にて各々を反
応せしめればよい。また別の固相体を製造する方法とし
ては、用いる不溶性担体の物理的な吸着能を利用して吸
着固定化せしめてもよい。さらに、この１α、２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ、の抗体産生に用いた動物の血清
に存在する通常の免疫グロブリン画分を用いて他種の動
物、特に大型哺乳動物に免疫せしめて得られた第二抗体
を用い、この第二抗体を不溶性担体に固定化せしめ、次
いでこれに１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗体
を抗原抗体反応により結合せしめて得られる１α、２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体活性がほとんど失活せ
しめることのない固定化手段によって同相体を得てもよ
い。さらにこのようにして得られた同相体は、洗浄、保
存すればよい。

さらにまた上記の固相体を用いる代わりに１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を可溶性のままで用いて
、被検液中の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を
定量する場合には、予め一定量の式（Ｔａｒ）で表され
るヨードの放射性同位元素標識１α、２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ３誘導体が加えられた被検液に、最適量の
１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗体を添加する
ことによって産生される上記の標識１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３誘導体および被検液中に存在する１
α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３とｌα、２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３、抗体との抗原抗体反応結合体
と未反応の標識１α、２５−ジヒドロキシビタミン０３
３Ｍ導体とを分離するために、１α、２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ、抗体に対する特異的抗体が用いられる。

この特異的抗体は第二抗体とも呼ばれ、第二抗体は例え
ば１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の抗体産生に
用いた動物の血清に存在する通常の免疫グロブリン画分
を抗原として用い、これを公知の免疫手段により他種の
動物、特に大型哺乳動物の皮下、または皮肉に注射して
免疫し、その抗血清から得ることができる。この第二抗
体は必要に応じて公知の精製手段により抗血清から抗体
を得てもよく、また抗血清の状態にて利用することが簡
便である。

さらに、上述の如く得られた１α、２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３抗体とヨードの放射性同位元素標識１α、
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体を用いた被検液
中の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の定量法を
述べる。まず、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、
の含有量を測定しようとする被検液、例えばヒトの血清
において、まず血清中の１α、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ３を抽出する。血清と同量の有機溶媒を加えて攪
拌・静置後、遠心分離にて抽出し、得られた上清液を分
離し、カラムクロマトグラフィーにて１α、２５−ジヒ
ドロキシビタミンＤ３を粗精製し３α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３の溶出画分を分取する。さらに好まし
くは、これをＨＰＬＣカラムにチャージし、溶出するこ
とにより精製するのがよい。１α、２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ、の溶出画分は、予めトリチウム〔３Ｈ〕の
放射性同位元素標識ｌα、２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３を用いて確認しておきその両分を集めて１α、２５
−ジヒドロキシビタミンＤ３を回収する。この１α、２
５−ジヒドロキシビタミンＤ３？８出画分を減圧乾燥し
、アルゴンガスで置換し、さらにエタノールに溶解し、
被験液として測定に用いる。次いで、該被験液中の１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を定量する。まず、
該被験液に一定適量のヨードの放射性同位元素標識１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘導体を添加し、次
いで最適量の１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗
体′を加え、抗原抗体反応用溶媒、例えばリン酸緩衝液
やベロナール緩衝液中４〜５℃程度にて約１５時間〜７
２時間インキュベートして抗体に対する放射性ヨード標
識ハプテンと定量すべき無標識ハプテンとの競争反応を
惹起せしめる。その後、抗体に対する放射性ヨード標識
ハプテンと定量すべき無標識ハプテンとの競争反応の結
果、生成した抗原抗体結合体、特にヨードの放射性同位
元素標識２５−ジヒドロキシビタミンＤ、誘導体＝Ｉα
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗体の結合体（Ｂ）
と、結合体形成に関与しないで残存する未反応のｉ離体
（Ｆ）、特に未反応ｉｆｌ　Ｌｕ体であるヨードの放射
性同位元素標識１α、２５−ヒドロキシビタミンＤ３誘
ｇ体とを分シｕするために、デキストラン−チャコール
法（ＤＣ法）により、濾過または遠心分′４（３０ＱＱ
ｒｐｍ、１５分）によりＢ−Ｆ分離を行ない各々の放射
活性を測定し、そのＢ／（Ｉ３＋Ｆ）あるいはＢ／Ｆの
放射活性を算出して、被検液中の１α、２５−ジヒドロ
キシビタミンＤ３　　（Ｈ）の量を求める。すなわち、
Ｈの量が増大すれば、Ｂの放射活性は減少し、Ｆの放射
活性は増大する。

したがって、未知量のＨが存在する条件下でＢとＦの放
射活性を測定すれば、あらかじめ既知量を用いて作製し
ておいた標準曲線から未知量のＨの里を測定できる。

また、Ｂ−Ｆ分離に当たって、用いる抗体が可溶性のま
まであり、第二抗体を用いる二抗体法を採用する場合に
は、競争反応後、第二抗体、さらに好ましくは第二抗体
を含有するＩｇＧ、必要に応じてキャリアーとしてｌα
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、抗体作製に用いた同
一種の動物のＩｇＧを加えて、１−１２時間インキュベ
ートし、その後抗原抗体反応によって生成した結合体を
３００Ｏｒｐｍ、１０〜３０分程度の遠心分離で沈殿せ
しめた沈澱部分（Ｂ）とその上清部分（Ｆ）とを分別し
、洗浄した沈澱物または上清のいづれか一方の放射活性
を測定すればよい。

本測定によって、２　ｐｇ　／　Ｔ　ｅ　ｓ　ｔ　〜２
５６　ｐｇ／Ｔｅ　ｓ　ｔまでの標準曲線が作製でき、
この測定系において、反応時間は５℃、１６時間または
３７℃、１時間で、迅速性を有し、反応後の処理操作は
簡便であり、被検液の希釈および添加回収試験も直線性
をもつことから、かなり高精度である。

また、従来より用いられているＤＢＰを抗体の代わりに
使用しても、本発明中のｌα、２５−ジヒドロキシビタ
ミンＤ、−ヨード〔ｌ！ｓ■〕放射性同位元素標識誘導
体と反応し、１〜３２ｐｇ／’ｌ”ｅｓｔの間で標準曲
線が作成できる。ＤＢＰは、ニワトリ、ラット、マウス
、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ヒトなどの動物の血清
より得られる。

次いで、本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に
述べるが、本発明は何らこれらによって限定されるもの
ではない。

参考例１血清中の１α、２５−　（ＯＨｚ　＞Ｄｆｆの抽出・精
製法血清０．５ｍＡに対してアセトニトリル０．　５ｍ７！
を加え、ポルデックスミキサ−にて攪拌後３０分静置し
た。その後遠心分ｉｉｉｔｌ（３０００ｒｐｍ、１０分
）し、得られた上清液０．８ｍｆｆ１を分取した。その
上清液０．８ｍｌをセソプパソクＣ−１８カートリッジ
カラム（商品名、旧ＬＬＩＰＯＲＥ　。

Ｗａ　ｔｅｒｓ社製）にチャージし、含水アセトニトリ
ルで溶出し粗精製した。その際、セフデパックＣ−１８
カートリツジカラムは常法に従いエタノールで活性化し
、５０％アセトニトリルで平衡化したものを使用した。

チャージ後、５０％アセトニトリル４ｍｌで洗浄し、次
に６４％アセトニトリル４ｍｌで溶出（１ｃｘ、　　２
５−　（ＯＨｇ　）　Ｄｆｆを含む両分）し、次に７３
％アセトニトリル４ｍｌで溶出（２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ３．２４．２５−ジヒドロキシビタミンＤ、を含
む両分）した。

６４％アセトニトリル溶出画分を減圧乾燥し、アルゴン
ガスで置換することにより１α、２５−（ＯＨ）ｚ　Ｄ
ｊ画分を得た。さらに好ましくは、この粗精製画分をｎ
−ヘキサンーイソプロバノール（９：　１）の混合溶媒
２００μｌに溶解し、ＨＰＬＣのＺ　ｏ　ｒ　ｂ　ａ　
ｘ　−Ｓ　Ｉ　Ｌ　（ＤｕｐｏｎＬ社Ｖ）Ｏ，４６Ｘ２
５ｃｍカラムにチャージしてン容出することにより精製
した。ここで、セップパソクＣ−１８カートリッジカラ
ムおよびＴＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃにおける１α、　　２５−　
（ＯＩＩ）　Ｚ　Ｄ３の溶出画分は、予めトリチウム（
’１１）の標識ｌα、２ｓ−（ｏｒＪ）ｚ　Ｄ３　　（
２６，２７−メチル−３Ｈ）を用いて確認した。ＨＰＬ
Ｃのｌα、　　２５−　（ｏｎ）　２　Ｄｆｆ溶出画分
（Ｒｔ＝９〜１３分）を減圧乾燥し、アルゴンガスで置
換した。この溶出画分を１０μβのエタノールに溶解し
、測定に使用した。

本操作による１α、２５−　（ｏｎ）２　Ｄ３の回収率
は９５±２％（ｎ＝１０）であった。

参考例２３−（Ｎ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミ
ノプロピオン酸の合成！１−　（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルオ
キシ）サクシニミド（６７４ｍｇ、２ｍ　　ｍｏｌｅ）
をテトラヒドロフラン〔以下、Ｔ）ＩＦと称す〕−ジメ
チルホルムアミド〔以下、ＤＭＦと称す）−ＨｚＯ（１
：　２　：　２）２５ｍＡの混合溶媒に溶かし、γ−ア
ミノーｎ−プロピオン酸（別名β−アラニン）（１７８
ｍｇ、２ｍ　　ｍｏｌｅ）を加えて、室温下、−晩反応
せしめた。その後、反応液を減圧留去し、残渣をシリカ
ゲルカラム〔充填剤商品名　ワコーゲルＣ−２００，７
５ｇ；溶出溶媒　ＣＨＣｌ　、−メタノール−９：１〕
にて分離・精製して、表題の目的物５３８．８ｍｇ（収
率８６．５％）を得た。

ＮＭＲ，δ（ＤＭＳＯ−ｄ６　）２．５０−２．６０　（２ｎ、　ｔ、　−ＣＩｌｚ−Ｃ
Ｏ）３．２８Ｊ、３５　（２１１，ｍ、　−ＣＨｚ−Ｎ
　）４．３３−４．４４　（３１１，ｍ、　Ｆｍｏｃ　
　）７．３５−８．０６　（８１１，ｍ、　Ｆｍｏｃ　
　）実施例１１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（（３−（Ｎ−
フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ）プロピ
オン酸エステル〕　〔以下、１α。

２５　　（ＯＨ）　ｚ　Ｄ３−β−Ａｌａ−Ｆｏｍｃと
称す〕の合成法３−（Ｎ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミ
ノプロピオン酸（以下、Ｆｃｏｍ−β−Ａｌａと称す）
７．７７５ｍｇ　（０，０２５ｍｍｏ　ｌ　ｅ）を無水
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２ｍｌ！に熔解し、トリ
メデルアセチルクロリド（別名ピバロイルクロリド）３
．０７μＮ　　（０，０２５ｍ　　ｍｏｌｅ）及びジメ
チルアミノピリジン〔以下、ＤＭＡＰと称す）３．０５
ｍｇ　（０，０２５ｍ　　ｍｏｌｅ）を−１５℃に保っ
たまま添加し、約１０分間−１５℃を保った。その後、
１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３　１０．４ｍｇ
（０，０２５ｍ　　ｍｏｌｅ）を添加し、−１５℃で５
分間、次いで０℃で１．５時間保った。反応後、メタノ
ール０．５ｍｌ加えた後、反応溶媒を減圧情夫し、シリ
カゲルカラムクロマトグラフィー〔充填剤商品名　ワコ
ーゲルＣ−２００，１５０ｇ；溶出溶媒　酢酸エチル−
ヘキサン＝４：ｌ）で分離し、以下に示す３つの両分を
得た。

Ｆｌ：ｌα、　　２５　　　（ＯＨ）ｚ　　Ｄ３　　ｂｉｓ　
　（β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ）（ｌα、２５−ジヒロキシ
ビタミンＤ、−１α、３β−Ｏ−ビス（（３−（Ｎ−フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ））プロピ
オン酸エステル〕の略〕収率　：１９．１％　（Ｒｆ　：　０．５９）Ｆ２：ｌα、２５−　（Ｏｆｆ）　２Ｄ、−３β−０−β−Ａ
ｌａ−Ｆｍｏｃ　（ｌα、２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３−３β−０−（（３−（Ｎ−フルオレニルメチルオ
キシカルボニル）アミノ）プロピオン酸エステル〕の略
〕と１α、２５−　（ＯＨ）２Ｄ３　１α　Ｏ−β−Ａ
ｌａ−Ｆｍｏｃ　（１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ３　１α−０−［（３−
（Ｎ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ）
プロピオン酸エステル〕の略〕の混合物収率　：２０．３％　（Ｒｆ：０．４７）Ｆ３：原料１α、２５−　（ＯＨ）ｚ　Ｄｓの回収収率　：４
１．２％　（Ｒｆ：０．２０）得られたＦ２画分（１α
、　　２５　　（０１１）’ｚ　Ｄｚ−３β−０−β−
Ａｌａ−Ｆｍｏｃ及びｌα、２５−　　（ＯＴＴ）　　
ｚ　　Ｄｉ　　−１ｃｘ−０−β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃの
混合物）はＨＰＬＣ（カラム商品名　Ｚｏ　　ｒ　　ｂ
ａ　　ｘ−ＯＤＳ　　；　　φ　０．　４６Ｘ２５ｃｍ
；；守山溶媒　１０％１１２０−メタノール；流速１ｍ
ｌ／分）によって夫々の成分に分離された。

各生成物の物性を以下に示す。

ｌα、　　２５−（０１（）　Ｚ　Ｄｉ　−３β−Ｏ−
β−Ａｌａ−ＦｍｏｃＨＰＬＣＲｔ＝１７．４６分（条件は前記に同じ）Ｎ　Ｍ　Ｒ、δ　（ＣＤＣｊ！：＋　）Ｉ）　ｐｍｏ、
５５　　（３Ｈ，ｓ）　、０．９４　　（３Ｈ，ｄ）、
１．２２　　（６１１，ｓ）　、２．５３　　（２Ｈ，
ｔ）、３．４４〜３．４８　　（３１１，ｍ）　、４．
２２（ＩＨ，ｔ）　、４．３７　〜４．　４１　　（３
１−Ｔ。

ｍ）　、５．０３　　（ＬＨ，ｄ　　）　、５．２７〜
５．３０　　（２１１，ｍ）　、５．３　５　　（ＩＨ
，ｍ）、　６．０１（ＩＨ，ｄ）、　６．　　３４（Ｉ
Ｈ。

ｄ）　　、　７．　２９〜７．　７７　　（８１１、ｍ
）ＵＶλ’４＋’ｉ”Ａ　　　　（ｎｍ）　　３００．
　　ｓ、２６６．３２１４．６１α、　　２５　　　（ＯＨ）ｚ　　Ｄｉ　　　１　α
−０−β−Ａｉａ−ＦｍｏｃＨＰＬＣＲｔ＝１４．９２分（条件は前記に同じ）ＮＭＲ，δ　、（ＣＤＣ１３）　　ｐｐｍ０．５０　　
（３Ｈ，ｓ）　、０．９０　　（３１−Ｔ、ｄ）、１．
２０　　（３Ｈ，ｓ）　、１．２７　　（３Ｈ，ｓ）、
４．０４〜４．０５　　（ＬＨ，ｍ）　、４．２１　　
（ＬＨ，ｍ）　、４．４１〜４．４６　　（２Ｈ，ｍ）
、５．０５　　（ＩＨ，ｄ）　、５．２７　　（ＬＨ，
ｔ）、　５．　　３２　　　（ＩＨ，ｍ）　　、　５．
　　５０　　　（ＬＨ，ｔ）、５．９０　　（ＩＨ，ｄ
）　、６．３０　　（ＬＨ，ｄ）、７．２８〜７．７９
　　（８Ｈ，ｍ）ＵＶλａｔｏｐ　　　　（ｎｍ）　　
３００．４．２６６．４２１４．３１　α、　　２５　　　（ＯＨ）ｚ　　Ｄｉ　　　ｂｉ
ｓ　　（β−Ａｌａ−Ｆｍｏｃ）ＮＭＲ，δ　（ＣＤＣ７！：＋　　）　　ｐｐｍ０、　
５０　　（３Ｈ，ｓ）　　、０．　９０　　（３Ｈ，ｄ
）　　、１、　２０　　（３Ｈ，ｓ）　　、１．　２６
　　（３Ｈ，ｓ）　　、２、　４０〜２．　６５　　（
４Ｈ，ｍ）　　、３．　３０〜３、　５５　　（４１１
，ｍ）　　、４．　１０〜４．　５０　　（６Ｈ，ｍ）
　　、５．　０５〜５．　６０　　（６Ｔ［、ｍ）　　
、５、　９０　　（ｌｌｒ、　　ｄ）　　、６．　３２
　　（ＩＩｒ、　　ｄ）　　、７、２０〜７．　８３　
　（１６Ｈ，ｍ）実施例２（１）１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−３β−
０−（３−アミノプロピオン酸エステル）〔以下、１α
、２５−　（ＯＨ）ｚ　Ｄｉ　−３β−Ｏ−β−ΔＩａ
と称ず〕の合成法ｌα、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−３β−Ｏ−（
（３’　　＝（Ｎ−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ル）アミノ）プロピオン酸エステル〕〔以下、１α、２
５　　　（ＯＨ）ｚ　Ｄｉ　　　３β−０−β−Ａｈａ
−Ｆｍｏｃと称す）１３．４ｍｇ　（１Ｂ、８６Ｘ１０
−’ｍ　　ｍｏｌｅ）をエタノール２．５ｍＡに溶解し
、室温下、２．５ｍｊ２のモルホリンを添加した。これ
をアルゴンガス霊気下、室温下２時間攪拌の後、反応溶
液を減圧留去することにより目的化合物の粗生成物を得
た。この粗生成物中に残存するモルホリンを除去するた
め商品名ＬＨ２０（Ｈｚ　０，１０ｍｌ容量）を用い、
Ｈ２Ｏ２０〜３０ｍ１で洗浄した。目的物をメタノール
で溶出させ、Ａｍｐ　ｒ　ｅ　ｐ−ＮＯ３（アマージャ
ム製、５０　Ｑｍｇ、ヘキサン−ジクロロメタン＝１：
１）にチャージし、ヘキサン−ジクロロメタン（１：　
１）　３０ｍＪ！で洗浄し、エタノールで溶出し生成目
的化合物を得た。

収ｆｆｉ　　８．７３Ｘ１０−’ｍ　　ｍｏｌｅ　（収
率４６．２５％）ＵＶ　　λＥｔＯＨＨ２Ｏ４，２ＨｍａＸニンヒドリン呈色　陽性ＴＬＣ（シリカゲルＭｅｒｋ５７１５；展開溶媒　酢酸
エチル−メタノール−１：４）Ｒｆ：０．１５（２）１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−１α−
０−（３−アミノプロピオン酸エステル）　〔以下、１
α、　　２５　　（０■Ｉ）　ｚ　Ｄｔ　　　１α−〇
−β−Ａｌａと称す）の合成法上記（１）において１α、２５−　（０１１）Ｚ　Ｄ３
−３β−〇−β−Ａ　ｌ　ａ−Ｆｍｏ　ｃの代わりに１
α、２５−　（０１１）Ｚ　Ｄ３−１４−Ｑ−一β−Ａ
ｌａ−Ｆｍｏｃを用いた他は（１）と同様に行って目的
化合物を得た。

収串　６２．５％ｔＯＨＵｖ　λｍａｘ　　　：２６５．４βｍニンヒドリン呈
色　腸性Ｔ１．Ｃ（シリカゲルＭｅｒｋ５７１５酢酸エチル−メ
タ／−ル＝１　：　４）　Ｒｆ　：０．２５実施例３１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−３β−０−（
３−（ＵＳＡ−アミノ）−プロピオン酸エステル〕およ
び１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ抗血清の作製（１）１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−３β−
０−［１−（ＢＳＡ−アミノ）プロピオン酸エステル］
の作製Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ基を脱保護することによって得られた１
α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、−３β−一〇−（
３−アミノ−プロピオン酸エステル）　（１２，２ｍｇ
、２５．０５Ｘ１０−’ｍ　　ｍｏｌｅ）をＴＨＦｌｍ
ｆｆに）８解した。トリス緩衝ン夜（０、１Ｍ、　ｐＦ
４８．６）　１０ｍｊ！にＩ”３ＳＡ（ＭＷ。

約６５０００．３２．５ｍｇ、１１５０Ｘ２５゜ｏｓｘ
ｔｏ−３ｍ　　ｍｏｌｅ）を溶解し、０℃に冷却後、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（６，３ｍｇ、１．３Ｘ２５．０５Ｘ１
０−’ｍ　　ｍｏｌｅ）を惰力１１した。この溶液を０
℃で３時間反応後、この反応溶液にクロロホルム１０ｍ
Ｎを４回加えて、未反応の１α、２５−ジヒドロキシビ
タミンＤ３−３β−０−（３−アミノプロピオン酸エス
テル）を除去した。水溶液層を凍結乾燥させ、表題の目
的物の凍結乾燥品２８．０ｍｇが得られ、Ｂ５Ａｌ分子
当り１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−３β−０
−（３−アミノプロピオン酸エステル）がその３のアミ
ノ基を介して１８分子結合したもので、これを略して表
題化合物の式として記載した。

（２）１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３抗血清の
作製（１）で得られた凍結乾燥品ｌα、２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ３−３β−０−（３−（ＵＳＡ−アミノ）−
プロピオン酸エステル〕　〔以下、抗原と略す〕をトリ
ス緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ８，６）に溶解し、これに同
量のコンプリート・フロイント・アジュバントを加え、
充分に混和懸濁し、抗原が１Ｍｇ〜１００μｇ　／　ｍ
　１となるように調整した。この乳化液を、２週間の間
隔をおいて、約１０回、ＩＯＴ〜２　Ｑ　Ｏｒ／匹をウ
サギの皮下に注射した。この間、１０日毎に中途採血し
て、抗体力価を調べ、抗体力価が最高になった時点で全
採血をし、６０分間室温にてこれを静置し、凝固せしめ
た後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ。

抗体を含有する抗血清を得、硫安分画し、ＩｇＧ画分を
採取した。

（３）１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３モノクロ
ナール抗体の作製Ｂ　ａ　Ｒｂ　／　ｃマウス（雌、４週齢）に、（１）
で得られた凍結乾燥１α、２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ、−３β−０−（３−（ＢＳＡ−アミノ）−プロピオ
ン酸エステル〕　〔以下、抗原と略す〕を、ｐＩ−Ｉ７
．２のリン酸緩衝液に溶解したもの５０γをＣ，Ｆ、Ａ
と共に皮下に投与し、−週間後、５０γを再び皮下に投
与し、最′Ｐａ作として二週間後、抗原単独で５０γを
腹腔に投与した。この最終感作より３日後、マウスを解
剖し３ｌ１ｌＩ！臓をとり出し細断し、さらに細胞用メ
ツシュ上ですりつぶし、肺臓細胞懸濁液を調製した。細
胞融合はマウスのミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ−３−Ａｇ８
Ｕ１を使用して、常法に従って実施した。まず、３０％
ＰＥＧ　（分子量１０００）水溶液を３７℃にインキュ
ベートし、次いで上記の肺臓細胞とミエローマ細胞（両
細胞の総数、４Ｘ１０’個、５：ｌ）をＲＰＭＩのみの
培地（５ｒｒＷりのみに懸濁し、両細胞を合わせてゆっ
くり混ぜ、１０分間１０ＱＱｒｐｍで遠心し、上清を吸
引除去した。再びＲＰＭｒ培地（１０ｍｆｆ）で細胞を
洗浄し、遠心の後、上清を吸引除去した。試験管をゆっ
くりたたいて細胞ベレットを混ぜ、これにｌ、Ｑｍ、ｉ
！のＰＥＧ溶液をゆっくりと加えてゆるやかに攪拌した
。ゆるやかに振盪しつつ３７°Ｃでインキュベーション
を行った後、常用培地（Ｉ　Ｑｍ＃）をゆっくり加えて
融合反応を止め、再び細胞を懸濁した。

これを、５分間］０００ｒｐｍで遠心し、沈澱した細胞
ペレットを、試験管をゆっくりとたたいて分散させた後
、ＩＴ　Ａ　Ｔ培地（５ｍｌにゆるやかに懸濁し、次い
でＨＡ　Ｔ培地（１ｍ＃）入りの容器に移し、生ＩＩ胞
を顕鏡検査した。細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔ
ｅに１穴当り２００μ／づつ入れ、ＣＯ２インキユベー
タ中で細胞を増殖させた。融合細胞をＨＡＴ培地で選択
後、限界希釈法によりクローニングした。得られたクロ
ーン懸濁液を用いて、Ｑ、５ｍｊ！プリスタン処理Ｂａ
１ｂ／ｃマウス腹腔内にて増殖せしめ、これより腹水お
よび直情を採取し、常法によりｔｇｃ画分を回収し、さ
らにプロティンＡ結合セファロースＣＬ−４Ｂのアフィ
ニティークロマトグラフィーにてＴｇＧ画分を精製し、
これをモノクロナル抗体として使用した。これより得ら
れたＩｇＧのサブクラスはＩｇＧ１であった。

実施例４（１１ヨード（＋２５　　ｒ）の放射性同位元素標識１
α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体１α、２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ３−３β−Ｏ−［（３−（Ｎ−３
−（４−ヒドロキシ−３−ヨード（１２５１）フェニル
）プロピオニル）アミノコプロピオン酸エステルコの製
造法実施例３（１）で得られた１α、２５−ジヒドロキ
シビタミンンＤ３−３β−０−（３−アミノプロピオン
酸エステル）　　（７２，８ｎ　　ｍｏｌｅ／２５μｊ
２ＥｔＯＨ）のエタノール溶液にテトラヒドロフラン（
ＴＨＦ）７５μ／、　　）リエチルアミン（Ｅｔ３　Ｎ
）３００ｐ　ｍｏｌｅ及びヨード〔１２５））ポルトン
−ハンター試薬（ＮＥＮ、ＮＥＸ−１２０−１０，２２
００Ｃｉ／ｍ　　ｍｏｌｅ、０．３３ｍＣ１／１００μ
＃ベンゼン：５０μＣｉ）を加え、霊気下、室温で２４
時間反応させた。この反応液をＨＰ　Ｌ　Ｃにより分離
・精製し表題の目的物を得た。

放射能回収率　２７．４μＣｉ　　（５４，７％）ＨＰ
　Ｌ　Ｃ条件 ■カラムＺｏｒｂａｘ−ＯＤＳ；φ４．６ｘ２５０ｍｍ
　　　５μｍ溶出溶媒１５％■１□０−メタノール；流速１ｍｎ／分
；Ｒｔ：１３．５〜１５．６分■カラムＺｏｒｂａｘ−
３ＩＬ；φ４．６Ｘ２５０ｍｍ　　　５μｍ＋Ｐｒｅｃ
ｏｌｕｍｎＨφ４．６Ｘ５０ｍｍ溶出溶媒２０％イソプロパノ−ルーへキサン；流速１ｍ
１／分；Ｒｔ：１６〜２２分（２）１α、２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３−１α−０−［（３−（Ｎ−３−（
４−ヒドロキシ−３−ヨード（１２５１）フェニル）プ
ロピオニルアミノコプロピオン酸エステルコの製造法上
記（１）において１α、２５　　　（ＯＨ）２　Ｄ：＋
　−３β−０−β−Ａｌａの代わりに１α、２５−（Ｏ
Ｈ）　２　Ｄ３−１　αＯ−β−Ａｌａを用いた他は（
１）と同様に行って目的化合物を得た。

放射能回収率　３０．２μＣｉ　　（６０，４％）ＨＰ
ＬＣ■条件は上記■に同じ、Ｒｔ：１４゜２〜１６．８
分 ■条件は上記■に同じ、Ｒｔ：１３゜６〜１６．１分実施例５（１）１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−（３β
−〇−及び−１α−０）−（３−アミノプロピオン酸エ
ステル）混合物の合成法１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−〔（３−（Ｎ
−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ）プロ
ピオン酸エステル〕混合物８．４ｍｇ　　（１１，８３
Ｘ１０−３ｍ　　ｍｏｌｅ）　エタノール２ｍ　Ｉｔに
溶解し、室温下モルホリン２ｍ７！を加え、アルゴン霊
気下室温で２時間反応させた。

反応液を減圧留去し、残渣を実施例３（１）と同様に商
品名ＬＨ−２０（Ｈ２０，１０ｍ１　　（７アルマシア
製）で粗精製した後、更に実施例３（１）と同様にＡｍ
ｐｒｅｐ−ＮＨｚ　　（アマージャム製５００ｍｇ）で
精製した。

回収率　５．１３×ｌＯ−’ｍ　　ｍｏｌｅ　　（４３
゜４％）（１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−３β−〇−（３−アミノプロピオン酸エステル）（以下、−３ β−０−と称す）および１α、２５− ジヒドロキシビタミンＤ３−１α−０ −（３−アミノプロピオン酸エステル）（以下、−１α−０−と称す）を約２．５：１の割合で含む混合物として）ＵＶ　　Ａ”ｍ
穀　　２６５．Ｏｎｍニンヒドリン呈色　陽性ＴＬＣ（シリカゲルＭｅｒｃｋ５７１５展開溶媒　酢酸
エチル−メタノール−１：４）Ｒ「　（３β−０−）：
Ｑ、１５　　Ｒｆ：　　（１α−０−）：０１２５（２）ヨード〔Ｉ２Ｓ■〕放射性同位元素標識１α。

２５−ジヒドロキシビタミンＤ、−（３β−〇−及びｌ
α−０−）−［（３−（Ｎ−３−（４−ヒドロキシ−３
−ヨード（１２５Ｉ）フェニル　）プロピオニル）アミ
ノコプロピオン酸エステル］ン昆合物の製造法及びその
混合物の分離・精製法上記（１）で得られた混合物のエ
タノール溶液（２０５ｎ　　ｍ　ｏ　ｌ　ｅ　／　１０
０　ＩＩ　ｌエタノール）にＴＨＦ３０．ｃｒｊｌ！、
）リエチルアミン６００ｐｍ。

ｌｅ及びヨード（Ｉｔｓ　ｌ　）−ポルトン−ハンター
試薬（ＮＥＮ、ＮＥＸ−１２０−１０，２２００Ｃ４／
ｍ　　ｍｏｌｅ、０．３３ｍＣ１／１００μｌベンゼン
；１００μＣ４）を加え、アルゴン霊気下室温で２４時
間反応させた。反応液をＨＰ　ＬＣにより精製すること
により表題の目的物を混合物として得た。

放射能回収率　５０．７μＣＩ　　（５０，７％）ＨＰ
　Ｌ　Ｃ■条件は前記に同じ、Ｒｔ：１３〜１７分 ■条件は前記に同じ、Ｒｔ：１３〜２２分さらに、反応液又は精製して得られた混合物をＨＰＬＣ
■の条件によって精密分取することにより３β−０−と
１α−０−をそれぞれ分離・精製した。

１α−０−Ｒｔ：１３．Ｏ〜１５．６分放射能回収量　
１６．３μＣｉ３β−０−Ｒｔ：１５．Ｑ〜２１．２分放射能回収量　
３４６５μＣｉ１α−Ｏ−と３β−０−の回収比は１：２．１であり、
脱Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ前の原料中のｌα−Ｏ−と３β−０−
の存在比と一敗した。

実施例６１α、２５　　　（ＯＨ）２　Ｄｓのラジオイムノアッ
セイによる標準曲線の作製法ｌα、２５　　　（ＯＨ）２　Ｈ３の標準品のエタノー
ル溶液を希釈し、標準溶液として０（Ｂｏ用）、２０４
８　（ＮＳＢ用）、４．８．１６．３２．６４．１２８
．２５６．５１２．１１０２４ｐ／２０μβのエタノー
ル溶液を作り、各濃度につきチューブ２木に２０μβづ
つ分注する。次ぎに得られたヨード（ＩＺＳ■）標識化
合物（３β−〇−）のエタノール溶液を各チューブに２
０μβづつ（約１２０００ｃｐｍ）分注する。さらに、
ヒツジを免疫することにより得えられた抗血？〃をｐ　
Ｈ８，６トリス緩衝液で希釈した溶液を１　ｍ　ｌ各チ
ューブに加え、５℃にて約１６〜２４時間インキュベー
ションする。この反応液にデキストラン−チャコールを
２００μｌ加え、５℃で３０分間遠心分離によってＢ−
Ｆ分離をした。その上清液１ｍｌを分取しオートウェル
γ−カウンターで測定した。得られたカウントの各濃度
の平均を算出し、その値（Ｂ）よりＮＳＢを引き、以下
の計算式［３−ＮＳＢ（Ｘ　１００）より算出した値をプｏ−Ｎ５Ｂロットすることにより、第１図に示す１α、２５（ＯＨ
）２　Ｄｔの標準曲線が得られる。

〔発明の効果〕

以上に述べた如く、本発明は高放射線エネルギーを有し
、汎用性に優れている放射性ヨードで標識されたｌα、
２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体を提供できるも
のである。従来は、単位時間当りの放射エネルギーの低
いβ線放出核種であるトリチウム（’Ｈ〕による種々の
ビタミンＤ３標識化合物が存在した。しかしトリチウム
（’　ＴＩ〕と同様にラジオイムノアッセイに汎用され
る放射エネルギーの高いγ線放出核種のヨード〔１２５
Ｉ〕で標識されたビタミンＤｚ誘Ｒ体は、ビタミンＤの
特徴でもある共役トリエン構造の不安定さゆえ、ラジカ
ル反応を誘発し自己分解を起こすと考えられ、現在まで
報告されていなかった。しかるに、本発明者により提供
されるヨード（１ｇ５　１〕で標識された１α、２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体はγ線による構造的分
解を起こすことなく、非常に安定であり、ラジオイムノ
アッセイに利用し得るものであることを見出した。

一般にビタミンＤ３は、生体内において肝臓もしくは腎
臓によって代謝され、活性型のビタミンＤ３となる。こ
れらの活性型のビタミンＤ３　（２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ３．１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）や
、１α−ヒドロキシビタミンＤ３．１α、２４−ジヒド
ロキシビタミンＤ３などの活性型ビタミンＤ３類は、臨
床的に骨粗Ｒ症、骨軟化症等の治療薬として用いられ、
あるいはその開発が行われている。これらの薬物のしｎ
床用量は、その強い生理作用の為通常著しく少ない。一
方、薬理作用は薬物の血・清中濃度、組織中濃度と相関
を有しており、特にヒトにおける薬物の血清中濃度の測
定は臨床上極めて重要な意義を有する。これより、本発
明は臨床上、活性型ビタミンＤ３類を測定する上で高い
利用価値を有する。

【図面の簡単な説明】

図面は、ヨード（＋２５■）の放射性同位元素標識１α
、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘導体を用いた標準
曲線を示す。平成２年　１月１ｏ日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
−Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ＿２を示し、Ｒ＿３は炭素数
１〜１０のアルキレン基を示す〕で表される新規な１α
，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３アミノ酸誘導体。
（２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
−Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ−Ｒ＿４を示し、Ｒ＿３は炭
素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿４はアミノ保護基を
示す〕で表される１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
＿３誘導体を、塩基存在の不活性溶媒中でアミノ保護基
を脱離せしめることを特徴とする、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
−Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ＿２を示し、Ｒ＿３は炭素数
１〜１０のアルキレン基を示す〕で表される新規な１α
，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３アミノ酸誘導体の
製造法。
（３）アミノ保護基が、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル基である請求項２記載の製造法。
（４）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
−Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ−Ｒ＿５を示し、Ｒ＿３は炭
素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿５はヨードの放射性
同位元素を有する残基を示す〕で表されるヨードの放射
性同位元素標識１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿
３誘導体。
（５）ヨードの放射性同位元素が、＾１＾２＾５Ｉであ
る請求項４記載のヨードの放射性同位元素標識１α，２
５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体。
（６）ヨードの放射性同位元素を有する残基が、３−（
４−ヒドロキシ−３−ヨード〔＾１＾２＾５Ｉ〕フェニ
ル）プロピオニル基又は３−（３，５−ジョード〔＾１
＾２＾５Ｉ〕−４−ヒドロキシフェニル）プロピオニル
基である請求項４記載のヨードの放射性同位元素標識１
α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体。
（７）被験液に、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２は何れか一方が水酸基で他方が
−Ｏ−ＣＯ−Ｒ＿３−ＮＨ−Ｒ＿５を示し、Ｒ＿３は炭
素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿５はヨードの放射性
同位元素を有する残基を示す〕で表されるヨードの放射
性同位元素標識１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿
３誘導体と１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３抗
体またはビタミンＤバインディングプロテイン（ＤＢＰ
）とを反応せしめて生成する該ヨードの放射性同位元素
標識１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体−
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３抗体結合体ま
たは該ヨードの放射性同位元素標識１α，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ＿３誘導体−ビタミンＤバインディン
グプロテイン結合体と未反応該ヨードの放射性同位元素
標識１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体と
を分離し、次いで分離したいずれか一方の放射性同位元
素である標識ヨードの量を定量することを特徴とする該
被験液中の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ＿３の
定量法。