JPH02109977A - 新規無血清培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、動物細胞による生理活性物質の製造に用いる
無血清培地に関する。本発明は、抗癌剤として有用なイ
ンターフェロンの細胞培養などに応用できるので医薬品
産業に有用である。

従来技術 無血清培地を用いる動物細胞の培養法としては下記文献
に記載の方法が知られている。

ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴイロロジイ（Ｊ、　
ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）　４４．２２７−２２９　（１
９７９）によると、ＲＰＭＩ−１６４０を基礎培地とし
、１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、０．２５％メチル
セルロース、０．７５％ブリマトンＲＬ（蛋白分解物）
などを加えた無血清培地の記載がある。ジャーナル・オ
ブ−ティッシュ・カルチャー・メソッヅ（、ｒ、ｔｌｓ
ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　８　　（４
）、　１６７〜１７１　（１９８３）　によると、同上
基礎培地に３　ｐｇ／ｍｌインスリン、５ｔｔｇ／ｍｌ
）ランスフェリンを蛋白成分とする無血清培地の記載が
ある。

本発明のようにヒト細胞由来物質を用いる無血清培地に
ついては知られていない。

発明の解決課題および解決手段 動物細胞を培養して生理活性物質を生産する方法におい
ては、従来培地中に血清を存在させて培養するのが通常
である。血清の存在は必須で、血清の種類、ロフト差が
細胞収量や物質生産に大きな影響を与える。従って血清
を含まない培地の開発が望まれている。

本発明者は、血清を含まない培地の研究を行った結果、
骨髄性白血病細胞株に５６２−ＴＩが生産する新規蛋白
性物質を血清の代りに培地に添加することによって動物
細胞を効率よく培養し、生理活性物質の生産を行うこと
ができることを見出し、本発明を完成した。

発明の構成 本発明は、骨髄性白血病細胞株に５６２−Ｔｌが生産す
る蛋白性物質を含有する無血清培地を提供する。

本発明物質は、下記理化学的性質を有する。

ｌ）分子量：２０．０００±２．　ＯＯＯ分子量はＳ　
Ｄ　Ｓ　（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａ
ｔｅ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔新実験化
学講座（２０）生物化学（１）ｐＨ８、日本化学会（丸
善社出版）〕によって測定した。濃縮ゲル３％および分
離ゲル１６％のアクリルアミド濃度で分析した結果、流
動サンプル量２０ρで単一バンドを示した。

なお、染色には、第一化学薬品社製　銀染色試薬「第一
」を用いた。分子量マーカーとしては、リゾチーム（Ｍ
Ｗ１４．４００）　、大豆トリプシンインヒビター（Ｍ
Ｗ２１．５００）　、カーボニック・アンヒドラーゼ（
ＭＷ　３１，０００）、卵白アルブミン（ＭＷ４５．０
００）　、牛血清アルブミン（ＭＷ６６、２００）およ
びフォスフォリラーゼＢ　（ＭＷ９２、５００）を用い
た。分子量マーカーはすべてＢＩＯ−ＲＡＤ　　Ｌａｂ
３社製。

（２）Ｎ末端側蛋白質一次構造 Ｍｅｔ−Ｇｉｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙ　５−
Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　１　ｙ　−Ｌｙｓ−
Ｔｈ　ｒ−Ｉ　１　ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−
Ｖａ　Ｉ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｘ　−１１ｅ
−Ｘ−Ａ　ｓ　ｎ−Ｖ　ａ　ｌ　−Ｘ−Ａ　ｌ　ａ−Ｘ
−ｒｌｅ− （Ｘは未同定アミノ酸を示す。） アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステムズ（＾ｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製４７０Ａ型シ
ーケンサ−およびスペクトラ・フィジクス（Ｓｐｅｃｔ
ｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ）社製　高速液体り０？トゲラフ
イーとの組合せによって決定した。

（３）熱安定性：ｐＨ７，３，５０℃、３０分間の処理
に安定。

本発明物質（凍結乾燥粉末ンを培養上清の２０倍濃度と
なるようにｐ　Ｈ７，３のＰＢＳ　（−）（ＮａＣ１８
ｇ／ｌ、ＫＣｊ！　　０．２ｇ／ｊ！。

ＮａｚＨＰＯｓ　　１．１５ｇ／ｊ！、ＫＨｚＰＯ４０
，２ｇ／ｊりに溶かし、５０℃の水浴中で３０分間加温
後、リンパ芽球細胞ナマルバ株を用い、下記方法で細胞
増殖促進活性を測定した。

（４）　　ｐＨ安定性；４℃、ｐＨ２〜３．２４時間の
処理に安定。

Ｋ５６２−ＴＩ株の培養上清を分子量カット３、０００
のホロファイバーで２００倍に濃縮し、これを０．１％
酢酸を用い４℃で２４時間透析を行い、透析液の細胞増
殖促進活性をリンパ芽球細胞ナマルバ株を用い、下記方
法で測定した。

（５）等電点：６．５±０．５ 等電点電気泳動法は、ｔ　ｔ　ＱｍｌのＬＫＢ８１００
（ＬＫＢ社製スウェーデン）カラムを用い、両性電解質
アンホライトの濃度を１．９〜０．６２５％とし、ｐＨ
３〜１０の匂配を用いる。４℃に冷却し、９００Ｖ、１
０ｍＡで４８時間の泳動を行い、終了後、フラクション
コレクターにて分画し、各フラクションのｐＨおよび活
性を測定する。

（６）ＤＮＡ合成促進活性および細胞増殖促進活性ＤＮ
Ａ合成促進活性測定法 被検細胞１〜５Ｘ１０’細胞／ｍｌをＲＰＭＩ−１６４
０培地（日永製薬社製）にグルタミン（４ｍＭ）、スト
レプトマイシン（２５ｘ／ｍｌ　）　。

ベニシリ：’　（２５Ｕ／ｍ＋）　、　ヘペス（１０ｍ
Ｍ）重曹（０，０１％）および子牛血清（１０％）を加
えた培地２５ｍ１で２日間、３７℃で培養した。

培養物を８００ｘｇ、５分間遠心して細胞を集め、５Ｘ
１０’細胞／ｍｌの濃度となるように、上記培地から子
牛血清を除いた培地に懸濁し、２４穴マルチデイツシユ
プレートに分注し、３７℃で２４時間培養後、新鮮な培
地に交換し、３７℃、１６時間培養した。再び、新鮮な
培地に交換し、試料Ｑ、１ｍｌ、培地Ｑ、９ｍｌを添加
した。

３７℃、６時間培養後、トリチウムチミジン０．５μＣ
ｉ／穴になるように加え、液体シンチレイションカウン
ターにより、その取込み活性を測定した。測定値は、２
回以上の実験の平均値を示した。

細胞増殖促進活性 被検細胞株５〜ｌ０ＸＩＯ’細胞／＋ｎｌをＲＰＭＩ−
１６４０培地（日永製薬社製）にグルタミン（４ｍＭ）
、ストレプトマイシン（２５ｕ／ｍｌ）　。

ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）　、　ヘペス（１０ｍＭ）
。

重曹（０，０１％）および子牛血清（１０％）を加えた
培地７５ｍｌで３７℃で４８時間培養した。

培養物を８００ｘｇ、５分間遠心して細胞を集め、上記
の培地から血清を除いた培地で洗浄し、２４穴マルチデ
イツシユプレートに分注し、９．９ｍｌの血清を含まな
い培地と、Ｑ、１ｍｌの試料液を添加した。３７℃、Ｃ
Ｏ□インキュベーターで３日間培養後、細胞数を血球計
算板を用いて測定した。

接着依存性細胞の場合には、測定する直前に、０．１％
トリプシンを加えて、細胞を浮遊化した後に測定した。

活性は、試料液無添加のものを１００とし、試料添加の
場合の細胞数を無添加の場合の細胞数で割った値をもっ
て示した。

以上の測定方法で得られた蛋白性物質の各種細胞に対す
るＤＮＡ合成促進活性および細胞増殖促進活性は第１表
に示すとふりであった。第１表中の細胞は＊印以外はす
べてヒト由来細胞である。

第 表 ＣＢＦ中 Ｎ口は未同定を示す。

＋は活性あり、 −は活性なしを示す。

本発明物質は、下記のごとく製造することができる。

本発明に用いる蛋白性物質は、ヒト骨髄性白血病細胞に
５６２−Ｔ１株を培地に培養し、培養物中に蓄積させ、
該培養物から採取することによって製造することができ
る。

Ｋ５６２−ＴＩ株は、Ｋ５６２株を胎児子牛血清ｌＯ％
を含有するハムＦＩＯ培地から順次血清濃度を低下させ
、約１年間の馴化期間を経た後、得られた無蛋白培地馴
化細胞である。Ｋ５６２株は、プロシイ−ディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）、　ＵＳＡ、、　　７６、１２９
３　（１９７９）、　　ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、　４
５．３２１　（１９７５）、　　ガン（ＧＡＮＮ）、　
　７３゜９７　（１９８２）などに記載されている公知
の細胞株で一般的に人手可能な細胞株である。

培地としては、ハムＦＩＯ培地、ハムＦ１２培地（以上
フローラボ社！Ｉｌ）　、ダルベツコＭＥＭ培地、ＭＥ
Ｍ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地（以上日永製薬社製）
などの無蛋白培地およびそれらの混合培地が用いられる
。培地には、必要により、グルタミン０．５〜５ｍＭ、
抗生物質〔ペニシリン（２５Ｕ／ｍり　、ストレプトマ
イシン（２５μｇ／ｍｌ）など〕１重曹（０，０１％）
などを適量加えてもよい。

培養には、種々の培養ビン、シャーレ、ローラボトル、
スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを用い
ることができる。培地は、通常種細胞密度５Ｘ１０’　
ＸＩ〜１０’細胞／ｌＴｌ１トし、３０〜４０℃、２〜
４日間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に培
養液中に生成する。たとえば、Ｉ　Ｘ　１０’細胞／　
ｍ　ｌの種細胞密度、３７ｔ、　　２日間の培養では、
培養液中に３００単位／ｍｌの活性物質が生成する。

培養物からの本発明物質の採取は次のとおり行う。すな
わち、得られた培養液上清を、凍結乾燥限外濾過１強酸
性イオン交換樹脂などを用いて濃縮する。溶出には、弱
塩基性の緩衝液または低濃度のアルカリ溶液を用いる。

濃縮液中には、低分子の塩や不純物が多く含まれるので
、１％酢酸で透析する。これによって多くの不純蛋白が
沈澱として除かれる。凍結乾燥によって酢酸を除き、さ
らに濃縮し、粗精製物とする。粗精製物を陽イオン交換
樹脂に通塔する。活性物質は陽イオン交換樹脂に弱い相
互作用を有するのみで吸着せず溶離してくる。この活性
画分を集め、凍結乾燥などでａｗａ後、さらにゲル濾過
法により、培地由来の低分子物質を除く。ゲル濾過剤と
しては、セファデックス類（ファルマシア・ファイン・
ケミカル社製）、バイオゲル類（バイオラッド社製）、
コントロール・ボア・グラス（コーニング・グラス・ワ
ークス社ＩＪ）、）ヨパール（東洋曹達社製）などを用
いる。

Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−６０などを用いると、活性画分は
ボイドボリウム（Ｖｏ）と塩などの低分子物質との間に
位置する。

上記操作で得られるａ種物は、さらに高速液体クロマト
グラフィーを行うことによって単一成分として精製する
ことができる。

本発明に用いる自白性物質の具体的製造法は参考例１に
示す。

本発明方法に用いる動物細胞としては、Ｎａｍａｌｖａ
　。

Ｌｕｋ　Ｉ［などのＢ−リンパ球細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥ
ＭなどのＴ−ＩＪンバ球細胞、Ｋ５６２などの非Ｔ非Ｂ
　Ｕンバ球系細胞、ＫＢなどの上皮細胞、５Ｋ−Ｌｙ−
１８、ＲＰＭＩ−８２２６などのＭｙｅｌｏｍａ系細胞
、ＨＬ−６０などのＭｏｎｏｃｙｔｅ系細胞などがあげ
られる。

本発明方法で製造される生理活性物質としてはインター
フェロン−α、−β、−γ１　インターロイキン−１，
−ＩＩ、　−ＩＩＩ、　ＴＮＦ、　　リンホトキシン、
ＩｇＧなどのモノクローナル抗体、免疫抑制物質など、
動物細胞が生産し得るものであればいかなるものも含む
。

本発明方法で、動物細胞の培養に用いる培地としては、
基礎培地としてＲＰＭＩ−１６４０ＭＥＭ、ＤＭＥ（以
下田水製薬社製）、ハムＦ１０゜ハムＦ１２．ＧＥＭ（
以上フローラボ社製）、ＤＭ１６０、ＤＭ１７０　（以
上極東製薬工業社製）など一般に市販されている培地が
あげられる。

培地には、必要により、グルタミン０．５〜５ｍＭ。

ペニシリン１０〜５０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１
０〜５０　ｘ／ｍｌ、重曹０．０５〜０．５％、ヘベス
１．Ｏ〜５０ｍＭ、　　ピルビン酸ソーダ０．５〜５０
ｍＭ、亜セＬ／７酸１０−”　〜１０−”Ｍ、ガラクト
ース０．１〜１０ｍｇ／ｍｌなどを適量加えてもよい。

蛋白性物質は１〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に加
える。

培養には、種々の培養ビン、シャーレ、ローラボトル、
スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを用い
ることができる。培養は、通常種細胞密度５Ｘ１０’　
〜ｌＸｌ０’細胞／ｍ　ｌとし、３０〜４０℃、２〜４
日間行うと、各細胞密度に応じ、生理活性物質が主に培
養液中に生成する。

培養物からの生理活性物質の採取は次のとおり行う。す
なわち、得られた培養液上清を、凍結乾燥、限外と過、
ゲルｐ過、イオン交換樹脂などを用いて採取する。

本発明の無血清培地は、前記基礎培地に、必要によりグ
ルタミン０．５〜５ｍＭ、ヘペス１〜５　ｍＭ。

ペニシリン１０〜５０Ｕ／ｍｔ、ストレプトマイシン１
０〜５０ｍＭ、重曹０．０５〜０．５％、ピルビン酸ソ
ーダ０．５〜５０ｍＭ、亜セレン酸１０−ａ〜１０−”
Ｍ、ガラクトース０．１〜１　、Ｏｍｇ／ｍ１などを加
え、これに骨髄性白血病細胞が生産する蛋白性物質を５
，０％以下好ましくは２．０〜０，０１％（圓／Ｖ）加
えたものである。

実施例１゜ ＲＰＭＩ−１６４０培地（日永製薬社製）を基礎培地と
し、４ｍＭグルタミン、１０ｍＭヘペス。

２５Ｕ／ｍｌベニシリア、　　２５Ｊｔｇ／ｍｌストレ
プトマイシン、０．０１％重曹および参考例１で製造さ
れるＬＧＦ−１１％（ｗ／ｖ）を含む無血清培地１０ｍ
１に、５Ｘ１０’個／ｍ　ｌのナマルバ細胞を浮遊さ＋
、２５ｃｔｌコ一ニング社製培養フラスコで３７℃２日
間培養した。

培養後、３０ｍｌになるように同無血清培地を加え７５
ｃｄコ一ニング社製培養フラスコで３７℃２日間培養し
た。培養後、さらに９０ｍ１になるように同無血清培地
を加え、２５　Ｑｍｌスビンナーフラスク（柴田バリオ
社製）で３７℃２日間培養した。培養後、５００ｍｌと
なるように同無血清培地を加え、ソジウムブチレイトを
１ｍＭ加え、３７℃でさらに１日間培養した。このとき
の細胞密度は７Ｘ１０５細胞／ｍ　Ｉであった。

培養物にＨＶＪ　　（センダイウィルス）５０ＨＡＵ／
ｍ　ｌとなるように加え、３７℃で５時間放置してウィ
ルスを吸着させ、次いで２８℃で１６時間放置してイン
ターフェロンを誘導した。培養物を５．００　Ｏｒｐｍ
　、　５分間遠心分離し、細胞を分離し、上清５００ｍ
ｌをトレーに入れてＵＶランプでウィルスを殺菌した。

上清中のインターフェロン活性を前記方法で測定した結
果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 実施例２゜ 無血清培地ＬＧＦ−Ｒ１用いて各種細胞の培養を行った
。各細胞５Ｘ１０’個／ｍ　ｌを２４穴マルチタイター
プレートに分注し、Ｃ０２インキユベータ内で３７℃、
３日間培養した。培養液中の細胞数を血球計算板を用い
て測定した。ＬＧＦ−１無添加培地を１としたＬＧＦ−
１客演度における増殖率を第３表に示す。

第 表 実施例３゜ 基礎培地に下記物質を混合して無血清培地ＬＧＦＲ１と
する。

基礎培地ＲＰＭＩ−１６４０（田水製薬社製）グルタミ
ン　　　　　　　４ｍＭ ペニシリン　　　　　　２５Ｕ／ｍｌ ストレプトマイシン　　２５■／ｍ　１ヘペス　　　１
０ｍＭ 重　　　　曹　　　　　　　　０．０１％ＬＧＦ−１２
，０〜０．０１％（１１／Ｖ）（参考例１で製造）　　
（用途に応じて適宜調整）実施例４゜ 基礎培地に下記物質を混合して無血清培地ＬＧＦ−ＤＩ
とする。

基礎培地　ダルベツコらのＭＥＭ　（田水製薬社製）グ
ルタミン　　　　　　　４ｍＭ ペニシリン　　　　　　１５Ｕ／ｍｌ ストレプトマイシン　　１５埒／ｍ１ 重　　　　曹　　　　　　　　０．０１％ＬＧＦ−１２
，０〜０．０１２５％（ｗ／ｖ）（用途に応じて適宜調
整） 参考例１゜ 骨髄性白血病細胞株に５６２−ＴＩ株を８×１０’個／
ｍｌの濃度で、８！の下記培地を含む２０Ｉｌ大型スピ
ンナフラスコに入れ、３７℃で３日間培養した。培地は
、基礎培地として、ハムーＦＩＯ培地（フローラボ社製
）右よびダルベツコらのＭＥＭ培地（田水製薬社製）を
３＝１の比率で混合したものに、ピルビン酸（５ｍＭ）
、亜セレン酸（１，２５Ｘ　１０−’Ｍ）　、ガラクト
ース（１ｍｇ／ｍｌ）、グルタミン（４ｍＭ）、ペニシ
リン（２５Ｕ／ｍｌ）　、ストレプトマイシン（２５Ａ
ｇ／ｍｌ）および重曹（０，０１％）を加えた無蛋白培
地を用いた。培養物上清１２０ｊ’をホローファイバー
（分子量カット−３０００，アミコン社製）を用い約１
０　Ｑｍｌに濃縮した。濃縮物約１０　Ｑｍｌを１％酢
酸を用い、４℃２４時間透析した。生じた沈澱物を遠心
分１（１２，００Ｏｒｐｍ、１０分間）で除き、上清を
酢酸除去のために凍結乾燥し粉末を得た。これを蒸留水
１２　Ｑｍｌに溶解した。

１６　Ｑｍｌ容量のＱ　Ａ　Ｅ　−３ｅｐｈａｄｅｘ　
−Ａ３０（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）カ
ラムに上記で得られた溶液を６０ｍ１ずつ二度に分けて
通塔した。ＰＢＳ　（−＞　　１５　Ｑｍｌで溶出し、
さらに０．１％の酢酸１９　Ｑｍｌで溶出し、ＰＢＳ　
（−）で溶出した活性画分３０　Ｑｍｌを得た。活性回
収率は、約８．３％であり、活性は１．９倍に上昇した
。

この活性画分３０　Ｑｍｌを凍結乾燥し、２９ｍ１の蒸
留水に溶解し、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−６０４０Ｑｍｌを
含むカラムにＳ　Ｖ　５．　Ｏで２回に分けて通塔した
。ＰＢＳ（−）で溶出し、溶出液を６１Ｔｌｌずつに分
画し、４１〜４５番目の画分６０＋ｎｌを得た。活性の
回収率は１．７％で、比活性は１３．３倍に上昇した。

この活性画分をファルマシア・ファイン・ケミカル社製
Ｆ　Ｐ　ＬＣ（Ｆａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｉｑｕｉ
ｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）Ｍｏｎｏ　３　５
ｍｌを含むカラムに通塔した。ＰＢＳ（−）で洗浄し、
０〜０．５Ｍ食塩水で溶出した。

溶出液を１ｍｌずつに分画し、５３番目の両分に活性が
認められた。活性の回収率は０．２％で、比活性は３６
００倍に上昇した。本活性物質をＬＧＦ＝１とよぶ。

上記精製工程の結果は第４表のとおりである。

第 表 発明の効果 本発明は、動物とくにヒト由来の細胞を培養するに適し
た無血清培地を提供する。本発明の無血清培地はヒト由
来の蛋白質を含み異種蛋白の混入がないのでヒト由来細
胞の培養に適しており、培養物からの有用物質の採取精
製にも有利である。

特許出願人　（１１４）工業技術院長

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２−Ｔ１が生産し、か
   つ下記理化学的性質を有する蛋白性物質を含有する無血
   清培地。 １）分子量：２０，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡ
   ＧＥ法） ２）Ｎ末端側蛋白質一次構造 【遺伝子配列があります】 （Ｘは未同定アミノ酸を 示す。） ３）熱安定性：ｐＨ７．３、５０℃、３０分間の処理に
   安定。 ４）ｐＨ安定性：４℃、ｐＨ２〜３、２４時間の処理に
   安定。 ５）等電点：６．５±０．５
2. （２）該蛋白質物質を５．０％（ｗ／ｖ）以下の割合で
   含む特許請求の範囲第１項記載の無血清培地。