JPH0262560B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0262560B2 JPH0262560B2 JP60246241A JP24624185A JPH0262560B2 JP H0262560 B2 JPH0262560 B2 JP H0262560B2 JP 60246241 A JP60246241 A JP 60246241A JP 24624185 A JP24624185 A JP 24624185A JP H0262560 B2 JPH0262560 B2 JP H0262560B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- human
- substance
- cells human
- ile
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、細胞増殖促進作用およびDNA合成
促進作用を有する新規生理活性蛋白性物質を提供
する。本発明物質は、免疫賦活剤、抗癌剤として
の用途が期待される。 従来技術 従来、DNA合成促進作用および細胞増殖促進
作用を有する物質としては、下記のごとき例が知
られている。 (1) PDGF（Platelet−derived growth factor）
Proc.Natl.Acad.Sci.，76，1809（1979） (2) TGF（Transforming growth factor）J.
Biol.Chem.257，5220（1982） (3) EGF（Epidermal growth factor）Anal.
Biochem.111，195（1981） (4) FGF（Fibroblast growth factor）Ann.Rev.
Biochem.45，531（1976） (5) FSLA（Fibroblast Somatomedin like
activity） J.Cellular Physiology107，317（1981） (6) IGF−（Insulin like growth factor）J.
Endocr.85，267（1980） (7) IGF−（Insulin like growth factor）
Diabetes31，2823（1982） (8) MSA（Multiplication stimulating activity
Nature272（23），776（1978） これらのうちNo.１〜４，６および７の物質につ
いて一次構造が明らかにされているが、本発明物
質とはＮ末端構造において明らかに異なる。他の
物質については、培地成分との分離が困難で実用
的価値を有さない。 特開昭59−181293には、骨髄性白血病細胞が生
産するDNA合成促進活性蛋白性物質の開示があ
るが、分子量その他の性質で本発明物質とは明ら
かに異なる。 発明の解決課題および解決手段 本発明者らは、有用な免疫賦活剤、抗癌剤を得
るために、動物細胞におけるDNA合成促進作用
ならびに細胞増殖促進作用を有する物質の検索を
行つた。その結果、骨髄性白血病細胞を蛋白質を
含まない培地を用いて培養した場合、培養上清中
にバーキツトリンパ腫由来リンパ芽球細胞を顕著
に増殖促進させる新規物質が蓄積することを見出
した。この物質は動物細胞のDNA合成促進作用
および細胞増殖促進作用を持つ蛋白性物質であ
り、その顕著な活性に基づいて免疫賦活剤および
抗癌剤としての用途が期待される。 発明の構成 本発明は、動物細胞のDNA合成促進作用およ
び細胞増殖促進作用を有する新規蛋白性物質を提
供する。 本発明物質は、下記理化学的性質を有する。 (1) 分子量：20000±2000 分子量は、SDS（sodium dodecyl sulfate）−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔SDS−
PAGE法、新実験化学講座（20）生物化学（）
p118，目本化学会編丸善社出版〕によつて測定
した。濃縮ゲル３％および分離ゲル16％アクリル
アミド濃度で分析した結果、流動サンプル量20μl
で単一バンドを示した。なお、染色には、第一化
学薬品社製 銀染色試薬「第一」を用いた。分子
量マーカーとしては、リゾチーム（MW14400）、
大豆トリプシンインヒビター（MW21500）、カー
ボニツク・アンヒドラーゼ（MW31000）、卵白ア
ルブミン（MW45000）、牛血清アルブミン
（MW66200）およびフオスフオリラーゼＢ
（MW92500）を用いた。分子量マーカーはすべて
BIO−RAD Lab.社製。 (2) Ｎ末端側蛋白質一次構造 Met−Gln−Ile−Phe−Val−Lys−Thr−Leu
−Thr−Gly−Lys−Thr−Ile−Thr−Leu−Glu
−Val−Glu−Pro−Ｘ−Asp−Ｘ−ILe−Ｘ−
Asn−Val−Ｘ−Ala−Ｘ−Ile− （Ｘは未同定アミノ酸を示す。） アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステム
ズ（Applied Biosystems）社製470A型シーケン
サーおよびスペクトラ・フイジクス（Spectra
Physics）社製 高速液体クロマトグラフイーと
の組合せによつて決定した。 (3) 熱安定性：PH7.3，50℃，30分間の処理に安
定。 本発明物質（凍結乾燥粉末）を培養上清の20倍
濃度となるようにPH7.3のPBS（−）（NaCl ８
ｇ／、KCl 0.2ｇ／、Na2HPO4 1.15ｇ／、
KH2PO4 0.2ｇ／）に溶かし、50℃の水溶中で
30分間加温後、リンパ芽球細胞ナマルバ株を用
い、下記方法で細胞増殖促進活性を測定した。 (4) PH安定性：４℃，PH２〜３，24時間の処理に
安定。 K562−T1株の培養上清を分子量カツト3000の
ホロフアイバーで200倍に濃縮し、これを0.1％酢
酸を用い４℃で24時間透析を行い、透析液の細胞
増殖促進活性をリンパ芽球細胞ナマルバ株を用
い、下記方法で測定した。 (5) 等電点：6.5±0.5 等電点電気泳動法は、110mlのLKB8100（LKB
社製スウエーデン）カラムを用い、両性電解質ア
ンホライトの濃度を1.9〜0.625％とし、PH３〜10
の勾配を用いる。４℃に冷却し、900V、10mA
で48時間の泳動を行い、終了後、フラクシヨンコ
レクターにて分画し、各フラクシヨンのPHおよび
活性を測定する。 (6) DNA合成促進活性および細胞増殖促進活性
DNA合成促進活性測定法 被検細胞１〜５×105細胞／mlをRPMI−1640
培地（日水製薬社製）にグルタミン（4mM）、ス
トレプトマイシン（25μｇ／ml）、ペニシリン
（25U／ml）、ヘペス（10mM）、重曹（0.01％）お
よび仔牛血清（10％）を加えた培地25mlで２日
間、37℃で培養した。培養物を800×ｇ、５分間
遠心して細胞を集め、５×105細胞／mlの濃度と
なるように、上記培地から仔牛血清を除いた培地
に懸濁し、24穴マルチデイツシユプレートに分注
し、37℃で24時間培養後、新鮮な培地に交換し、
37℃、16時間培養した。再び、新鮮な培地に交換
し、試料0.1ml、培地0.9mlを添加した。37℃、６
時間培養後、トリチウムチミジン0.5μCi／穴にな
るように加え、液体シンチレイシヨンカウンター
により、その取込み活性を測定した。測定値は、
２回以上の実験の平均値を示した。 細胞増殖促進活性 被検細胞株５〜10×105細胞／mlをRPMI−
1640培地（日水製薬社製）にグルタミン
（4mM）、ストレプトマイシン（25μｇ／ml）、ペ
ニシリン（25U／ml）、ヘペス（10mM）、重曹
（0.01％）および仔牛血清（10％）を加えた培地
75mlで37℃で48時間培養した。培養物を800×ｇ、
５分間遠心して細胞を集め、上記の培地から血清
を除いた培地で洗浄し、24穴マルチデイツシユプ
レートに分注し、0.9mlの血清を含まない培地と、
0.1mlの試料液を添加した。37℃、CO2インキユ
ベーターで３日間培養後、細胞数を血球計算板を
用いて測定した。 接着依存性細胞の場合には、測定する直前に、
0.1％トリプシンを加えて、細胞を浮遊化した後
に測定した。活性は、試料液無添加のものを100
とし、試料添加の場合の細胞数を無添加の場合の
細胞数で割つた値をもつて示した。 以上の測定方法で得られた本発明物質の各種細
胞に対するDNA合成促進活性および細胞増殖促
進活性は第１表に示すとおりであつた。第１表中
の細胞は＊印以外はすべてヒト由来細胞である。 【表】 性なしを示す。
本発明物質は上記のとおり各種動物細胞に対し
てDNA合成促進活性および細胞増殖促進活性を
有しており、下記のごとき用途が期待される。 (1) 抗体産生能を有するＢ−cell系細胞の増殖を
促進するので、免疫賦活剤として用いることが
できる。 (2) Erythro leukemia細胞（K562）の増殖を促
進するので、貧血症への応用ができる。 (3) Ｔ−cell系細胞の増殖を促進するので、細胞
性免疫機能を向上させ抗癌剤として用いること
ができる。 (4) 顆粒球（K562）、マクロフアージ細胞
（Monocyte）の増殖を促進するので抗癌剤と
して、また上皮系細胞のDNA合成を高めるの
で創傷などの治療剤として用いることができ
る。 (5) Ｂ−cell系やMyeloma系細胞の増殖を促進
するので、生体外での抗体産生に応用できる。 本発明物質の諸性質から、本発明物質に類似す
る物質として仔牛胸腺より分画採取したユビキチ
ンがあげられる。本発明物質のＮ末端より30番目
のアミノ酸配列はユビキチンとほぼ同じ配列を示
す。しかしユビキチンは分子量約8500であること
とナマルバ細胞に対して増殖促進作用を示さない
ことから、本発明物質はユビキチンと異なる物質
であることが明らかである。ユビキチンにピスト
ン蛋白の付いた物質、ユビキチンの分子が連なつ
た前駆体などが知られている〔ネイチヤー
（Nature）225，423，1975；ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリイ（JBC），250，
7182，1975：ネイチヤー（Nature）31２，663，
1984〕。これら物質も分子量などにおいて異なり、
またこれら物質の生物活性も明らかにされていな
い。 最近、ユビキチン前駆体の遺伝子が見出された
という報告がある〔JBC260，7609，1985〕が、
これを用いて蛋白質を製造したとの記載はない。
また、この遺伝子でコードされるアミノ酸配列に
は塩基性アミノ酸が多いので、生体内では蛋白質
分解酵素によつて分解されてしまい、蛋白質とし
ては存在しないものと考えられる。 本発明物質は、下記のごとく製造することがで
きる。 本発明物質は、ヒト骨髄性白血病細胞を培地に
培養し、培養物中に蓄積させ、該培養物から採取
することによつて製造することができる。 本発明に用いるヒト骨髄性白血病細胞は、本発
明物質を生産することができるものなら、いかな
る細胞も用いることができる。好適な一例とし
て、骨髄性白血病細胞K562−T1株を用いること
ができる。 K562−T1株は、K562株を胎児子牛血清10％を
含有するハムF10培地から順次血清濃度を低下さ
せ、約１年間の馴化期間を経た後、得られた無蛋
白培地馴化細胞である。K562株は、プロシイー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），
USA.，76，1293（1979），ブラツド（Blood），
45，321（1975），ガン（GANN），73，97（1982）
などに記載されている公知の細胞株で一般的に入
手可能な細胞株である。 培地としては、ハムF10培地、ハムF12培地
（以上フローラボ社製）、ダルベツコMEM培地、
MEM培地、RPMI−1640培地（以上日水製薬社
製）などの無蛋白培地およびそれらの混合培地が
用いられる。培地には、必要により、グルタミン
0.5〜5mM、抗生物質〔ペニシリン（25U／ml）、
ストレプトマイシン（25μｇ／ml）など〕、重曹
（0.01％）などを適量加えてもよい。 培養には、種々の培養ビン、シヤーレ、ローラ
ボトル、スピンナーフラスコ、ジヤーフアーメン
ターなどを用いることができる。培地は、通常種
細胞密度５×104〜１×106細胞／mlとし、30〜40
℃、２〜４日間行うと、各細胞密度に応じ、本発
明物質が主に培養液中に生成する。たとえば、１
×105細胞／mlの種細胞密度、37℃、２日間の培
養では、培養液中に300単位／mlの活性物質が生
成する。 培養物からの本発明物質の採取は次のとおり行
う。すなわち、得られた培養液上清を、凍結乾
燥、限外濾過、強酸性イオン交換樹脂などを用い
て濃縮する。溶出には、弱塩基性の緩衝液または
低濃度のアルカリ溶液を用いる。 濃縮液中には、低分子の塩や不純物が多く含ま
れるので、１％酢酸で透析する。これによつて多
くの不純蛋白が沈澱として除かれる。凍結乾燥に
よつて酢酸を除き、さらに濃縮し、粗精製物とす
る。粗精製物を陽イオン交換樹脂に通塔する。活
性物質は陽イオン交換樹脂に弱い相互作用を有す
るのみで吸着せず溶離してくる。この活性画分を
集め、凍結乾燥などで濃縮後、さらにゲル濾過法
により、培地由来の低分子物質を除く。ゲル濾過
剤としては、セフアデツクス類（フアルマシア・
フアイン・ケミカル社製）、バイオゲル類（バイ
オラツド社製）、コントロール・ポア・グラス
（コーニング・グラス・ワークス社製）、トヨパー
ル（東洋曹達社製）などを用いる。 Bio−Gel Ｐ−60などを用いると、活性画分は
ボイドボリウム（Vo）と塩などの低分子物質と
の間に位置する。 上記操作で得られる濃縮物は、さらに高速液体
クロマトグラフイーを行うことによつて単一成分
として精製することができる。 実施例 １ 骨髄性白血病細胞株K562−T1株を８×105
個／mlの濃度で、８の下記培地を含む20大型
スピンナフラスコに入れ、37℃で３日間培養し
た。培地は、基礎培地として、ハム−F10培地
（フローラボ社製）およびダルベツコらのMEM
培地（日水製薬社製）を３：１の比率で混合した
ものに、ピルビン酸（5mM）、亜セレン酸（1.25
×10-7M）、ガラクトース（１mg／ml）、グルタミ
ン（4mM）、ペニシリン（25U／ml）、ストレプ
トマイシン（25μｇ／ml）および重曹（0.01％）
を加えた無蛋白培地を用いた。培養物上清120
をホローフアイバー（分子量カツト−3000、アミ
コン社製）を用い約100mlに濃縮した。濃縮物約
100mmを１％酢酸を用い、４℃24時間透析した。
生じた沈澱物を遠心分離（12000rpm、10分間）
で除き、上清を酢酸除去のために凍結乾燥した粉
末を得た。これを蒸留水120mlに溶解した。 160ml容量のQAE−Sephadex−A50（フアルマ
シア・フアイン・ケミカル社製）カラムに上記で
得られた溶液を60mlずつ二度に分けて通塔した。
PBS（−）150mlで溶出し、さらに0.1％の酢酸190
mlで溶出し、PBS（−）で溶出した活性画分300
mlを得た。活性回収率は、約8.3％であり、活性
は1.9倍に上昇した。 この活性画分300mlを凍結乾燥し、20mlの蒸留
水に溶解し、Bio−Gel Ｐ−60 400mlを含むカラ
ムにSV5.0で２回に分けて通塔した。PBS（−）
で溶出し、溶出液を６mlずつに分画し、41〜45番
目の画分60mlを得た。活性の回収率は1.7％で、
比活性は13.3倍に上昇した。この活性画分をフア
ルマシア・フアイン・ケミカル社製FPLC（Fast
protein liquid chromatography）Mono Ｓ ５
mlを含むカラムに通塔した。PBS（−）で洗浄
し、０〜0.5M食塩水で溶出した。溶出液を１ml
ずつに分画し、53番目の画分に活性が認められ
た。活性の回収率は0.2％で、比活性は3600倍に
上昇した。本活性物質をLGF−１とよぶ。 上記精製工程の結果は第２表のとおりである。 【表】 実施例 ２ 実施例１で得られた、精製ステツプBio−Gel
Ｐ−60活性画分を用いてNamalva細胞（Ｂ−cell
系）、K562−T1（Erythroleukemia，non Ｔ
non Ｂ系）、CCRF−CEM（Ｔ−cell系）の各細胞
に対する増殖促進活性を前記のとおり測定した。
結果を第３表に示す。 【表】 実施例 ３ 実施例１で得られた精製ステツプBio−Gel Ｐ
−60の活性画分を用いて、KB細胞およびHeLa
細胞のDNA合成促進活性を前記のとおり測定し
た。活性画分無添加時の3H−チミジン取り込み
量を１とし、活性画分を添加したときの3H−チ
ミジン取り込み率を第４表に示した。 【表】 発明の効果 本発明は、動物とくにヒトの細胞における
DNA合成促進作用および細胞増殖促進作用を有
する新規蛋白性物質を提供する。
促進作用を有する新規生理活性蛋白性物質を提供
する。本発明物質は、免疫賦活剤、抗癌剤として
の用途が期待される。 従来技術 従来、DNA合成促進作用および細胞増殖促進
作用を有する物質としては、下記のごとき例が知
られている。 (1) PDGF（Platelet−derived growth factor）
Proc.Natl.Acad.Sci.，76，1809（1979） (2) TGF（Transforming growth factor）J.
Biol.Chem.257，5220（1982） (3) EGF（Epidermal growth factor）Anal.
Biochem.111，195（1981） (4) FGF（Fibroblast growth factor）Ann.Rev.
Biochem.45，531（1976） (5) FSLA（Fibroblast Somatomedin like
activity） J.Cellular Physiology107，317（1981） (6) IGF−（Insulin like growth factor）J.
Endocr.85，267（1980） (7) IGF−（Insulin like growth factor）
Diabetes31，2823（1982） (8) MSA（Multiplication stimulating activity
Nature272（23），776（1978） これらのうちNo.１〜４，６および７の物質につ
いて一次構造が明らかにされているが、本発明物
質とはＮ末端構造において明らかに異なる。他の
物質については、培地成分との分離が困難で実用
的価値を有さない。 特開昭59−181293には、骨髄性白血病細胞が生
産するDNA合成促進活性蛋白性物質の開示があ
るが、分子量その他の性質で本発明物質とは明ら
かに異なる。 発明の解決課題および解決手段 本発明者らは、有用な免疫賦活剤、抗癌剤を得
るために、動物細胞におけるDNA合成促進作用
ならびに細胞増殖促進作用を有する物質の検索を
行つた。その結果、骨髄性白血病細胞を蛋白質を
含まない培地を用いて培養した場合、培養上清中
にバーキツトリンパ腫由来リンパ芽球細胞を顕著
に増殖促進させる新規物質が蓄積することを見出
した。この物質は動物細胞のDNA合成促進作用
および細胞増殖促進作用を持つ蛋白性物質であ
り、その顕著な活性に基づいて免疫賦活剤および
抗癌剤としての用途が期待される。 発明の構成 本発明は、動物細胞のDNA合成促進作用およ
び細胞増殖促進作用を有する新規蛋白性物質を提
供する。 本発明物質は、下記理化学的性質を有する。 (1) 分子量：20000±2000 分子量は、SDS（sodium dodecyl sulfate）−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔SDS−
PAGE法、新実験化学講座（20）生物化学（）
p118，目本化学会編丸善社出版〕によつて測定
した。濃縮ゲル３％および分離ゲル16％アクリル
アミド濃度で分析した結果、流動サンプル量20μl
で単一バンドを示した。なお、染色には、第一化
学薬品社製 銀染色試薬「第一」を用いた。分子
量マーカーとしては、リゾチーム（MW14400）、
大豆トリプシンインヒビター（MW21500）、カー
ボニツク・アンヒドラーゼ（MW31000）、卵白ア
ルブミン（MW45000）、牛血清アルブミン
（MW66200）およびフオスフオリラーゼＢ
（MW92500）を用いた。分子量マーカーはすべて
BIO−RAD Lab.社製。 (2) Ｎ末端側蛋白質一次構造 Met−Gln−Ile−Phe−Val−Lys−Thr−Leu
−Thr−Gly−Lys−Thr−Ile−Thr−Leu−Glu
−Val−Glu−Pro−Ｘ−Asp−Ｘ−ILe−Ｘ−
Asn−Val−Ｘ−Ala−Ｘ−Ile− （Ｘは未同定アミノ酸を示す。） アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステム
ズ（Applied Biosystems）社製470A型シーケン
サーおよびスペクトラ・フイジクス（Spectra
Physics）社製 高速液体クロマトグラフイーと
の組合せによつて決定した。 (3) 熱安定性：PH7.3，50℃，30分間の処理に安
定。 本発明物質（凍結乾燥粉末）を培養上清の20倍
濃度となるようにPH7.3のPBS（−）（NaCl ８
ｇ／、KCl 0.2ｇ／、Na2HPO4 1.15ｇ／、
KH2PO4 0.2ｇ／）に溶かし、50℃の水溶中で
30分間加温後、リンパ芽球細胞ナマルバ株を用
い、下記方法で細胞増殖促進活性を測定した。 (4) PH安定性：４℃，PH２〜３，24時間の処理に
安定。 K562−T1株の培養上清を分子量カツト3000の
ホロフアイバーで200倍に濃縮し、これを0.1％酢
酸を用い４℃で24時間透析を行い、透析液の細胞
増殖促進活性をリンパ芽球細胞ナマルバ株を用
い、下記方法で測定した。 (5) 等電点：6.5±0.5 等電点電気泳動法は、110mlのLKB8100（LKB
社製スウエーデン）カラムを用い、両性電解質ア
ンホライトの濃度を1.9〜0.625％とし、PH３〜10
の勾配を用いる。４℃に冷却し、900V、10mA
で48時間の泳動を行い、終了後、フラクシヨンコ
レクターにて分画し、各フラクシヨンのPHおよび
活性を測定する。 (6) DNA合成促進活性および細胞増殖促進活性
DNA合成促進活性測定法 被検細胞１〜５×105細胞／mlをRPMI−1640
培地（日水製薬社製）にグルタミン（4mM）、ス
トレプトマイシン（25μｇ／ml）、ペニシリン
（25U／ml）、ヘペス（10mM）、重曹（0.01％）お
よび仔牛血清（10％）を加えた培地25mlで２日
間、37℃で培養した。培養物を800×ｇ、５分間
遠心して細胞を集め、５×105細胞／mlの濃度と
なるように、上記培地から仔牛血清を除いた培地
に懸濁し、24穴マルチデイツシユプレートに分注
し、37℃で24時間培養後、新鮮な培地に交換し、
37℃、16時間培養した。再び、新鮮な培地に交換
し、試料0.1ml、培地0.9mlを添加した。37℃、６
時間培養後、トリチウムチミジン0.5μCi／穴にな
るように加え、液体シンチレイシヨンカウンター
により、その取込み活性を測定した。測定値は、
２回以上の実験の平均値を示した。 細胞増殖促進活性 被検細胞株５〜10×105細胞／mlをRPMI−
1640培地（日水製薬社製）にグルタミン
（4mM）、ストレプトマイシン（25μｇ／ml）、ペ
ニシリン（25U／ml）、ヘペス（10mM）、重曹
（0.01％）および仔牛血清（10％）を加えた培地
75mlで37℃で48時間培養した。培養物を800×ｇ、
５分間遠心して細胞を集め、上記の培地から血清
を除いた培地で洗浄し、24穴マルチデイツシユプ
レートに分注し、0.9mlの血清を含まない培地と、
0.1mlの試料液を添加した。37℃、CO2インキユ
ベーターで３日間培養後、細胞数を血球計算板を
用いて測定した。 接着依存性細胞の場合には、測定する直前に、
0.1％トリプシンを加えて、細胞を浮遊化した後
に測定した。活性は、試料液無添加のものを100
とし、試料添加の場合の細胞数を無添加の場合の
細胞数で割つた値をもつて示した。 以上の測定方法で得られた本発明物質の各種細
胞に対するDNA合成促進活性および細胞増殖促
進活性は第１表に示すとおりであつた。第１表中
の細胞は＊印以外はすべてヒト由来細胞である。 【表】 性なしを示す。
本発明物質は上記のとおり各種動物細胞に対し
てDNA合成促進活性および細胞増殖促進活性を
有しており、下記のごとき用途が期待される。 (1) 抗体産生能を有するＢ−cell系細胞の増殖を
促進するので、免疫賦活剤として用いることが
できる。 (2) Erythro leukemia細胞（K562）の増殖を促
進するので、貧血症への応用ができる。 (3) Ｔ−cell系細胞の増殖を促進するので、細胞
性免疫機能を向上させ抗癌剤として用いること
ができる。 (4) 顆粒球（K562）、マクロフアージ細胞
（Monocyte）の増殖を促進するので抗癌剤と
して、また上皮系細胞のDNA合成を高めるの
で創傷などの治療剤として用いることができ
る。 (5) Ｂ−cell系やMyeloma系細胞の増殖を促進
するので、生体外での抗体産生に応用できる。 本発明物質の諸性質から、本発明物質に類似す
る物質として仔牛胸腺より分画採取したユビキチ
ンがあげられる。本発明物質のＮ末端より30番目
のアミノ酸配列はユビキチンとほぼ同じ配列を示
す。しかしユビキチンは分子量約8500であること
とナマルバ細胞に対して増殖促進作用を示さない
ことから、本発明物質はユビキチンと異なる物質
であることが明らかである。ユビキチンにピスト
ン蛋白の付いた物質、ユビキチンの分子が連なつ
た前駆体などが知られている〔ネイチヤー
（Nature）225，423，1975；ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリイ（JBC），250，
7182，1975：ネイチヤー（Nature）31２，663，
1984〕。これら物質も分子量などにおいて異なり、
またこれら物質の生物活性も明らかにされていな
い。 最近、ユビキチン前駆体の遺伝子が見出された
という報告がある〔JBC260，7609，1985〕が、
これを用いて蛋白質を製造したとの記載はない。
また、この遺伝子でコードされるアミノ酸配列に
は塩基性アミノ酸が多いので、生体内では蛋白質
分解酵素によつて分解されてしまい、蛋白質とし
ては存在しないものと考えられる。 本発明物質は、下記のごとく製造することがで
きる。 本発明物質は、ヒト骨髄性白血病細胞を培地に
培養し、培養物中に蓄積させ、該培養物から採取
することによつて製造することができる。 本発明に用いるヒト骨髄性白血病細胞は、本発
明物質を生産することができるものなら、いかな
る細胞も用いることができる。好適な一例とし
て、骨髄性白血病細胞K562−T1株を用いること
ができる。 K562−T1株は、K562株を胎児子牛血清10％を
含有するハムF10培地から順次血清濃度を低下さ
せ、約１年間の馴化期間を経た後、得られた無蛋
白培地馴化細胞である。K562株は、プロシイー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），
USA.，76，1293（1979），ブラツド（Blood），
45，321（1975），ガン（GANN），73，97（1982）
などに記載されている公知の細胞株で一般的に入
手可能な細胞株である。 培地としては、ハムF10培地、ハムF12培地
（以上フローラボ社製）、ダルベツコMEM培地、
MEM培地、RPMI−1640培地（以上日水製薬社
製）などの無蛋白培地およびそれらの混合培地が
用いられる。培地には、必要により、グルタミン
0.5〜5mM、抗生物質〔ペニシリン（25U／ml）、
ストレプトマイシン（25μｇ／ml）など〕、重曹
（0.01％）などを適量加えてもよい。 培養には、種々の培養ビン、シヤーレ、ローラ
ボトル、スピンナーフラスコ、ジヤーフアーメン
ターなどを用いることができる。培地は、通常種
細胞密度５×104〜１×106細胞／mlとし、30〜40
℃、２〜４日間行うと、各細胞密度に応じ、本発
明物質が主に培養液中に生成する。たとえば、１
×105細胞／mlの種細胞密度、37℃、２日間の培
養では、培養液中に300単位／mlの活性物質が生
成する。 培養物からの本発明物質の採取は次のとおり行
う。すなわち、得られた培養液上清を、凍結乾
燥、限外濾過、強酸性イオン交換樹脂などを用い
て濃縮する。溶出には、弱塩基性の緩衝液または
低濃度のアルカリ溶液を用いる。 濃縮液中には、低分子の塩や不純物が多く含ま
れるので、１％酢酸で透析する。これによつて多
くの不純蛋白が沈澱として除かれる。凍結乾燥に
よつて酢酸を除き、さらに濃縮し、粗精製物とす
る。粗精製物を陽イオン交換樹脂に通塔する。活
性物質は陽イオン交換樹脂に弱い相互作用を有す
るのみで吸着せず溶離してくる。この活性画分を
集め、凍結乾燥などで濃縮後、さらにゲル濾過法
により、培地由来の低分子物質を除く。ゲル濾過
剤としては、セフアデツクス類（フアルマシア・
フアイン・ケミカル社製）、バイオゲル類（バイ
オラツド社製）、コントロール・ポア・グラス
（コーニング・グラス・ワークス社製）、トヨパー
ル（東洋曹達社製）などを用いる。 Bio−Gel Ｐ−60などを用いると、活性画分は
ボイドボリウム（Vo）と塩などの低分子物質と
の間に位置する。 上記操作で得られる濃縮物は、さらに高速液体
クロマトグラフイーを行うことによつて単一成分
として精製することができる。 実施例 １ 骨髄性白血病細胞株K562−T1株を８×105
個／mlの濃度で、８の下記培地を含む20大型
スピンナフラスコに入れ、37℃で３日間培養し
た。培地は、基礎培地として、ハム−F10培地
（フローラボ社製）およびダルベツコらのMEM
培地（日水製薬社製）を３：１の比率で混合した
ものに、ピルビン酸（5mM）、亜セレン酸（1.25
×10-7M）、ガラクトース（１mg／ml）、グルタミ
ン（4mM）、ペニシリン（25U／ml）、ストレプ
トマイシン（25μｇ／ml）および重曹（0.01％）
を加えた無蛋白培地を用いた。培養物上清120
をホローフアイバー（分子量カツト−3000、アミ
コン社製）を用い約100mlに濃縮した。濃縮物約
100mmを１％酢酸を用い、４℃24時間透析した。
生じた沈澱物を遠心分離（12000rpm、10分間）
で除き、上清を酢酸除去のために凍結乾燥した粉
末を得た。これを蒸留水120mlに溶解した。 160ml容量のQAE−Sephadex−A50（フアルマ
シア・フアイン・ケミカル社製）カラムに上記で
得られた溶液を60mlずつ二度に分けて通塔した。
PBS（−）150mlで溶出し、さらに0.1％の酢酸190
mlで溶出し、PBS（−）で溶出した活性画分300
mlを得た。活性回収率は、約8.3％であり、活性
は1.9倍に上昇した。 この活性画分300mlを凍結乾燥し、20mlの蒸留
水に溶解し、Bio−Gel Ｐ−60 400mlを含むカラ
ムにSV5.0で２回に分けて通塔した。PBS（−）
で溶出し、溶出液を６mlずつに分画し、41〜45番
目の画分60mlを得た。活性の回収率は1.7％で、
比活性は13.3倍に上昇した。この活性画分をフア
ルマシア・フアイン・ケミカル社製FPLC（Fast
protein liquid chromatography）Mono Ｓ ５
mlを含むカラムに通塔した。PBS（−）で洗浄
し、０〜0.5M食塩水で溶出した。溶出液を１ml
ずつに分画し、53番目の画分に活性が認められ
た。活性の回収率は0.2％で、比活性は3600倍に
上昇した。本活性物質をLGF−１とよぶ。 上記精製工程の結果は第２表のとおりである。 【表】 実施例 ２ 実施例１で得られた、精製ステツプBio−Gel
Ｐ−60活性画分を用いてNamalva細胞（Ｂ−cell
系）、K562−T1（Erythroleukemia，non Ｔ
non Ｂ系）、CCRF−CEM（Ｔ−cell系）の各細胞
に対する増殖促進活性を前記のとおり測定した。
結果を第３表に示す。 【表】 実施例 ３ 実施例１で得られた精製ステツプBio−Gel Ｐ
−60の活性画分を用いて、KB細胞およびHeLa
細胞のDNA合成促進活性を前記のとおり測定し
た。活性画分無添加時の3H−チミジン取り込み
量を１とし、活性画分を添加したときの3H−チ
ミジン取り込み率を第４表に示した。 【表】 発明の効果 本発明は、動物とくにヒトの細胞における
DNA合成促進作用および細胞増殖促進作用を有
する新規蛋白性物質を提供する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記理化学的および生物学的性質を有する新
規蛋白性物質。 (1) 分子量：20000±2000（SDS−PAGE法） (2) Ｎ末端側蛋白質一次構造 Met−Gln−Ile−Phe−Val−Lys−Thr−
Leu−Thr−Gly−Lys−Thr−Ile−Thr−Leu
−Glu−Val−Glu−Pro−Ｘ−Asp−Ｘ−Ile−
Ｘ−Asn−Val−Ｘ−Ala−Ｘ−Ile− （Ｘは未同定アミノ酸を示す。） (3) 熱安定性：PH7.3，50℃，30分間の処理に安
定。 (4) PH安定性：４℃，PH２〜３，24時間の処理に
安定 (5) 等電点：6.5±0.5 (6) 下記細胞に対し増殖促進作用を有する。 ヒトＢリンパ球系細胞 ヒトＴリンパ球系細胞 ヒトMyeloma系細胞 ヒトMonocyte系細胞 ヒト非Ｔ非Ｂ系細胞 (7) 下記細胞に対してDNA合成促進作用を有す
る。 ヒトＢリンパ球系細胞 ヒトＴリンパ球系細胞 ヒトMyeloma系細胞 ヒトMonocyte系細胞 ヒト非Ｔ非Ｂ系細胞 ヒト上皮細胞
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60246241A JPS62108819A (ja) | 1985-11-05 | 1985-11-05 | 新規蛋白性物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60246241A JPS62108819A (ja) | 1985-11-05 | 1985-11-05 | 新規蛋白性物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62108819A JPS62108819A (ja) | 1987-05-20 |
| JPH0262560B2 true JPH0262560B2 (ja) | 1990-12-26 |
Family
ID=17145604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60246241A Granted JPS62108819A (ja) | 1985-11-05 | 1985-11-05 | 新規蛋白性物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62108819A (ja) |
-
1985
- 1985-11-05 JP JP60246241A patent/JPS62108819A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62108819A (ja) | 1987-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Damme et al. | The chemotactic activity for granulocytes produced by virally infected fibroblasts is identical to monocyte‐derived interleukin 8 | |
| D'Amore et al. | Endothelial cell mitogens derived from retina and hypothalamus: biochemical and biological similarities. | |
| Mazzei et al. | Purification and characterization of a 26‐kDa competitive inhibitor of interleukin 1 | |
| JP2667193B2 (ja) | 二機能性タンパク質 | |
| US5008196A (en) | Stimulation of endothelial cell growth | |
| KR100234497B1 (ko) | Tgf-베타 2 및 tgf-베타3의 대형 잠복 복합체 | |
| JPS6322526A (ja) | 肝細胞増殖因子 | |
| EP0061141B1 (en) | Chemokinesins and chemotaxins of leukocytes and inflamed tissues: natural mediator proteins for reversible promotion of random and directional locomotion (chemokinesis and chemotaxis) for accumulation of specific leukocyte types, process of their biotechnical preparation and pharmaceutical compositions | |
| Miyazono et al. | Platelet-derived endothelial cell growth factor | |
| CA1341026C (en) | Il-1 inhibitors process for producing il-1 inhibitors and for using such inhibitors in therapy | |
| JPH02502825A (ja) | 好中球活性化因子 | |
| KR970009890B1 (ko) | 혈소판감소증치료제 | |
| WO1992018537A1 (en) | Interleukin 6 composition and production thereof | |
| JPH0262560B2 (ja) | ||
| JP2003504378A (ja) | 顆粒球コロニー刺激因子の精製方法 | |
| JPH0328198B2 (ja) | ||
| EP0672684A1 (en) | Novel megakaryocyte colony stimulating factor and production thereof | |
| JPS61233694A (ja) | ウシ脾臓中に含まれる成長因子及びその単離方法 | |
| JPH0148759B2 (ja) | ||
| JPH0473995B2 (ja) | ||
| WO1984003887A1 (fr) | Nouvelle substance proteique physiologiquement active | |
| RU2060274C1 (ru) | Способ получения очищенного димера рибонуклеазы | |
| RU2048521C1 (ru) | Способ получения полипептида со свойствами лимфотоксина человека | |
| Sieber | Chromatography of human urinary erythropoietin and granulocyte colony-stimulating factor on insolubilized phytohaemagglutinin | |
| JP2551424B2 (ja) | ＴＧＦ−β制御糖タンパク質サブユニツト |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |