JPH02113884A - ヒラタケとヤナギマツタケの細胞融合株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明はヒラタケとヤナギマツタケとの細胞融合によっ
て得られた細胞融合株、及び、その育種方法並びに育種
増殖方法に関する。

〔従来の技術］ ヒラタケは、市場での商品名を「シメン」と称し、味、
香りが良（美味なきのことして、近年、年間２万も以上
が国内で栽培されている食用きのこである。

従来、ヒラタケを育種、改良する技術は、交配方法また
は突然変異の誘起選択方法のみであったが、最近プロト
プラスト化したヒラタケを細胞融合方法で育種、改良す
る方法が研究されている。

例えば、ヒラタケとトキイロヒラタケのプロトプラスト
をポリ“エチレングリコールで融合させ育種する方法（
Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｉ、Ｃｈｅｍ、５０（１）　、２２
３（１９８６）　）やヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　
ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）とＰ、ｃｏ１ｕａ＋ｂｉｎｕｓ等
の同属内担子凹のプロトプラストを電気的処理により融
合させ育種する方法（日本画学会　第３１回大会１講演
要旨集、９頁（１９８７年））やヒラタケとシイタケの
プロトプラストをポリエチレングリコールで融合させ育
種する方法〔日本菌学会第３１回大会、講演要旨集、１
０頁（１９８７年）〕が報告されている。

一方、ヤナギマツタケは、最近栽培が可能になり、市場
に出るようになり、味、香りが良く、特に菌柄が長く、
テクスチャーにすぐれたきのこであるが、ヤナギマツタ
ケを育種、改良する技術はほとんど報告されていない。

ヒラタケとヤナギマツタケとを細胞融合して新しいきの
こを育種する方法については、ヒラタケのプロトプラス
トとヤナギマツタケのプロトプラストをポリエチレング
リコールで融合処理した報告〔日本醗酵工学今大会　講
演要旨集、７５頁（１９８７年）〕があるのみであり、
該文献にも融合株が得られたという報告は見当らない。

〔発明が解決しようとする課題〕

ヒラタケは生育が速く、味、香りが良く優れた食用菌で
ある。一方ヤナギマツタケは、ヒラタケよりも高温の２
０°Ｃ前後で子実体を作り、夏場の栽培に通した性質を
持ち、また菌柄はすぐれたテクスチャーを持つ、すぐれ
た食用菌である。

両性質を併有する更に美味な新規なきのこが強く望まれ
ているが、ヒラタケとヤナギマツタケの細胞融合により
、未だに融合株は得られていないし、当然両性質を持っ
た子実体もできていない。

本発明はヒラタケとヤナギマツタケの両性質を有する子
実体を再生するための中間体としてのヒラタケとヤナギ
マツタケの細胞融合株を得ること、或いは、ヒラタケ又
はヤナギマツタケの性質を改善するための育種素材を得
ることを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、上記のような目的を達成するために、細胞融
合の手法に着目し、これを利用してヒラタケきヤナギマ
ツタケの細胞融合株を得るものである。

したがって、本発明の細胞融合株は、ヒラタケとヤナギ
マツタケとの両者の性質の少なくとも一部を併せ有する
ことを特徴とするヒラタケとヤナギマツタケとの細胞融
合によって得られた細胞融合株であり、その育種方法は
、ヒラタケの一核菌糸のプロトプラストと、ヤナギマツ
タケの一核菌糸のプロトプラストとを細胞融合せしめ、
これを適宜手段によって選抜して細胞融合株を得ること
を特徴とし、その育種増殖方法は、前記育種方法によっ
て得られた細胞融合株を増殖することを特徴とするもの
である。

本発明の細胞融合法の怒単なフローシートを第１図に示
したので、該フローシートの順に従って詳細な説明を述
べる。

１、菌株の分離と定義 本発明に用いたヒラタケは、市販菌又は天然からの分離
菌にかかわらずヒラタケ南であれば特に限定はないが、
市販の種菌より分離した三核菌糸であり、原色日本新菌
類図ｍ（Ｉ）（■保育社出版、今関六也、木郷次隨曙著
２７頁（１９８７年））によれば、ハラタケ目、ヒラタ
ケ科、ヒラタケ属に属し、学名をＰｌｅｕｒｏｔｕｓ　
ｏｓｔｒｅａｔｕｓ（Ｊａｃｐ、：Ｆｒ）　Ｋｕｍｍｅ
ｒと言う。

本発明に使用するヤナギマツタケは、市販菌又は天然か
らの分離菌にかかわらずヤナギマツタケ菌であれば特に
限定はないが、スーパーマーケットで市販されているヤ
ナギマツタケの子実体より分離した三核菌糸であり、上
記原色日本新菌類図鑑（Ｉ）によれば、ハラタケ目、オ
キナタケ科、フミヅキタケ属に属し、学名をＡｇｒｏｃ
ｙｂｅ　ｃｙｌ：ｎｄｒａｃｅａ（ＤＣ，：Ｆｒ＞ＦＩ
ａｉｒｅと言う。

２、−核菌糸取得 まず−核菌糸を得る方法について述べる。米糠：ブナオ
ガクズ：水＝　１００ｇ　：　３００ｇ　７５００ｇの
組成の培地約５２０ｇのはいったポリプロピレン製の８
００ｃｃ容の栽培ポットをオートクレーブ殺菌し、冷却
後分離した三核菌糸のヒラタケ菌糸を植菌し、２０〜２
３゛Ｃで約２０日培養した後、菌播きを行い、殺菌水で
菌掻きをした部分を湿らせた後、１３〜１５°Ｃ１湿度
９０％以上で子実体を生成させる。

約２０日培養分に生長した子実体の傘のひだ部分より胞
子を分離し、殺菌水で希釈後、ポテト浸出液、グルコー
スを含む寒天培地上に塗布し、２５°Ｃで胞子より菌糸
を発芽、生育させ、ヒラタケの一核菌糸を得ることがで
きる。ヒラタケの場合と同様の方法でヤナギマツタケ菌
糸を培養し１５〜２５°Ｃで子実体を生成させることが
できる。

核子実体の傘のひだ部分より胞子を分離し、菌糸を発芽
生育させて、ヤナギマツタケの一核菌糸を得ることがで
きる。

３、交配型の決定 得られた該ヒラタケー核菌糸３０株を使用してポテト浸
出液、グルコースを含む寒天培地上で総当たりの対峙培
養を行い、接触した対峙部分をスライドカルチャーし、
顕微鏡で観察して菌糸の真性クランプまたは偽クランプ
の有無を観察し、該−核菌糸の交配型を決定する。

同様の方法で分離したヤナギマツタケの一核菌糸５０株
を総あたりで対峙培養し、交配型を決定することができ
る。

４、栄養要求株取得 次に栄養要求株を得る方法について述べる。

マルツエキス２％、イーストエキス０．２％（ｐＨ６）
の組成よりなる培地にヒラタケ−核菌糸を無菌的に植え
、４日間２２８°Ｃで振盪培養する。培養液ごと菌糸を
回転刃の付いたホモゲナイザーで５００Ｏｒｐｍ、　２
分間ホモゲナイズし、再度、上記組成よりなる培地に植
菌し、２８°Ｃ１１８時間振盪培養する。この培養液を
遠沈し、菌糸を分離し、０．０５Ｍのマレイン酸バッフ
ァー（ｐＨ５，８）で２回洗浄する。

■（プロトプラスト化） 上記洗浄の後、キチナーゼ２■／ｍ！、セルラーゼ２５
Ｉ１ｇ／Ｉ＋１／、ザイモリエース１■／１１１／、ソ
ルビトール０．５Ｍを含む０．０５Ｍマレイン酸バッフ
ァー（ｐＨ５，８）を湿菌糸重量の約９倍量、無菌的に
加え３０°Ｃで５〜７時間ゆっくりと振盪反応させ、プ
ロトプラストを含む溶液を得る。続いて、この溶液をガ
ラス繊維と濾紙（アトバンチツク１０１．東洋濾紙株式
会社製）で濾過した後、３０００ｒｐｍ、５分間遠沈し
、残渣を０．５　Ｍソルビトールを含む０．０５Ｍマレ
イン酸バッファーで２回洗浄後、プロトプラスト数がｌ
Ｘｌ０’個／ｄ程度の濃度になるように希釈する。クリ
ーンベンチ中でこのプロトプラストｉ液に紫外線を致死
率９９％になるように１２〜１８分間照射し、変異処理
した後に０．５Ｍソルビトールを含むマルツエキス２％
、イーストエキス０．２％（ｐＨ６）の液体培地中で２
５゛Ｃでプロトプラストを再生させる。

後にマルツエキス２％、イーストエキス０．２％を含む
寒天培地に塗布し、更に２５゛Ｃで４〜７日間培養し、
菌糸を生育させる。

■　栄養要求性の決定及び栄養要求株の取得得られた菌
糸をグルコース２０ｇ／　ｌ　、　　ＫＨｚＰＯａｏ、
４６ｇ＃！、　Ｋ２ＨＰＯ４１，Ｏｇ／４．　（ＮＨａ
）ＪＰＯ４１，５ｇ／ｌ　、　　ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０
０，５ｇ／　ｆ　、チアミン−塩酸塩１２０μｇ／βを
含む寒天培地（以下最少培地）に植菌し、２５°Ｃで培
養し、寒天培地上に生育しない菌株を選定する。

この菌株を、オギザノグラフ法に従い、各種アミノ酸、
ビタミン、核酸を含量する最少培地に培養して生育のを
無から栄養要求性を決定し、ヒラタケの一核菌糸の栄養
要求株を得ることができる。

ヒラタケの場合と同様の方法でヤナギマツタケの一核菌
糸の栄養要求株を得ることができる。

５、細胞融合株取得 ■　プロトプラスト化 次にヒラタケとヤナギマツタケの細胞融合株を得る方法
について説明する。

ヒラタケ−核菌糸（Ｐ−アミノ安息香酸要求性、交配型
Ａ２Ｂ２）　、ヤナギマツタケ−核菌糸（シトシン要求
性、交配型ＡＩ）をそれぞれワルツエキス２％。イース
トエキス０．２％の組成よりなる培地（ｐＨ６）に無菌
的に植え４〜７日間、２８°Ｃで振盪培養する。それぞ
れ培養液ごと菌糸を回転刃の付いたホモゲナイザーで５
０００ｒｐｍ、　２分間ホモゲナイズし、再度上記組成
よりなる培地に植苗し、２８’Ｃ，１８時間振盪培養す
る。この培養液を遠沈し、菌糸を分離し、０．０５Ｍの
マレイン酸バッファー（ｐＨ５，８）で２回洗浄後、ヒ
ラタケ及びヤナギマツタケの菌糸を得る。

これらの菌糸それぞれにキチナーゼ２■／Ｉ１１／セル
ラーゼ２５■／ｍ／、ザイモリエース１ｍｇ／ｍｌ。

ソルビトール０．５Ｍを含む０．０５Ｍマレイン酸バッ
ファー（ｐＨ５，８）を湿苗糸重量の約９倍量を無菌的
に加え、３０°Ｃで５〜７時間ゆっくり振盪反応させ、
ヒラタケ、ヤナギマツタケそれぞれのプロトプラストを
含む溶液を得る。

続いて、この溶液をグラス繊維と濾紙（アトバンチツク
１０１．東洋濾祇株式会社製）で濾過した後、３０００
ｒｐｍ、　５分間遠沈し、上清をすて、残渣を０．５　
Ｍソルビトールを含む０．０５Ｍマレイン酸バッファー
で洗浄し、再び上記の条件で遠沈する。この洗浄操作を
２回繰り返した後、それぞれ０．５　Ｍソルビトールを
含む０．０５Ｍマレイン酸バッファーにプロトプラスｌ
−４度が１〜５Ｘ１．Ｏ’個／ｄになるように再懸濁す
る。

■　細胞融合 このようにして調製したヒラタケ、ヤナギマツタケの一
核菌糸のプロトプラストをｌＸｌ０’個ずつ混合後、３
０００ｒｐｍ、　１０分間遠沈し、上清をすて、残渣を
３０°Ｃに保ったポリエチレングリコール４０００４０
％（Ｗ／Ｖ）　　と０．ＯＩＭ　ＣａＣ］ｚを含む０．
０５Ｍグリシンパンファー（ｐＨ７，５）に再懸濁し、
１０分間放置し、ヒラタケとヤナギマツタケのプロトプ
ラスト同士を融合させる。

■　再生 この懸濁液に０．５Ｍソルビトールを含む０．０５Ｍマ
レイン酸バッファーを十分量加工、３０００ｒｐｍ。

５分間遠沈し、上清をすてる。残渣を０．５Ｍソルビト
ールを含む０．０５Ｍマレイン酸バッファーで洗浄し、
再び上記の条件で遠沈する。この洗浄操作を２回繰り返
した後、残渣を０．５　Ｍソルビトールを含む０．０５
Ｍマレイン酸バッファーに懸濁し、０．５Ｍソルビトー
ルと寒天を含む最少培地上に塗布し、２５゛Ｃで培養し
、再生してきた菌糸を得る。

ヒラタケ及びヤナギマツタケのプロトプラストを得るた
めの方法において、菌糸をプロトプラスト化するための
酵素剤の種類は、セルラーゼ、キチナーゼ、ドリセラー
ゼ（商品名）、　β−グルクロニダーゼ、−＼リカーゼ
（商品名）、キタラーゼ（商品名）、メ・イセラーゼ（
商品名）、ノボザイム（商品名）、　ザイモリエース（
商品名）等が使用でき、キチナーゼを使用した場合にプ
ロトプラスト化の効率が上がり、また、プロトプラスト
の安定化剤としてソルビトール、マンニトール、ＭｇＳ
Ｏ４、ＫＣＩ等が使用でき、ソルビト・−ル、またはＭ
ｇ５Ｏａを使用した場合にプロトプラスト化の効率が上
がるが、本発明は、酵素剤の種類や安定化剤のらがいに
よって限定されるものではない。

ヒラタケのプロトプラストとヤナギマツタケのプロトプ
ラストを細胞融合させる方法において、平行に固定した
電極間にプロトプラスト懸濁液を入れ、交流電場の電極
間でプロトプラスト同士を対合させた後に、直流パルス
を与えて細胞融合させる電気融合法も可能であるが、高
価な電気融合装置を必要とする欠点がある。本発明で用
いたポリエチレングリコールによる細胞融合方法は簡便
で高価な装置を必要としない点でメリットがあるが、細
胞融合法として一般的に利用できるものならば、いずれ
の方法を使用してもよい。

ヒラタケのプロトプラストとヤナギマツタケのプロトプ
ラストを細胞融合させ、ヒラタケとヤナギマツタケの異
種の細胞融合株だけを選抜する方法には本発明で用いた
栄養要求株を用い、最少培地に生育した株だけを得る方
法だけでなく、たとえば２種類の菌株のプラストサイジ
ンＳのような薬剤への耐性の差を利用してヒラタケとヤ
ナギマツタケの異種の細胞融合株だけを選抜する方法や
、不可逆的代謝阻害剤であるヨード酢酸でヤナギマツタ
ケのプロトプラストを処理し、一方、異なる不可逆的代
謝阻害剤であるジエチルピロカーボネートでヒラタケの
プロトプラストを処理した後に融合処理し、再生させて
ヒラタケとヤナギマツタケの異種の細胞融合株だけを選
抜する方法がある。

また、ヒラタケとヤナギマツタケのプロトプラストを２
種類の異なった螢光色素、たとえば４．６−ジアミンノ
ー２−フェニルインドールやフルオレセインイソチオシ
アネートでそれぞれ染色した後、融合処理し、螢光顕微
鏡下、励起波長３３０〜３８０ｎＩ１１で発色し、且つ
励起波長４００〜４９０ｎｍで発色するプロトプラスト
だけをミクロマニュピレータ−で取り出し、再生させて
、ヒラタケとヤナギマツタケの異種の細胞融合株だけを
選抜する方法や、ヒラタケのプロトプラスト１個とヤナ
ギマツタケのプロトプラスト１個を電気的に融合処理し
、顕微鏡下で細胞融合を確認した後にミクロマニピュレ
ーターで取り出し、再生させて、ヒラタケとヤナギマツ
タケの異種の細胞融合株だけを選抜する方法が可能であ
るが、薬剤耐性法により選抜する方法は、菌株の薬剤耐
性の変化によって、細胞融合株以外の株が取得される欠
点があるし、不可逆的代謝阻害剤を使って選抜する方法
は、使用する薬剤が人体にも有毒で操作に危険性がある
ことで問題とされる欠点があるし、また色素で染色した
り、プロトプラスト１個対１個の細胞融合で選抜する方
法は、高価な顕微鏡や電気融合装置や細胞融合したプロ
トプラストを取り出すためのミクロマニュピレータ−等
の装置が必要であり、また、１つ１つ細胞融合したプロ
トプラストをミクロマニュピレータ−で取り出す操作は
熟練を要し、多数の融合プロトプラストを分離するには
多大の労力を要す等の欠点がある。

本発明で用いた栄養要求株を用いる方法は、最も確実で
あり、簡便に効率よく細胞融合株を選抜できる方法であ
るが、本発明は細胞融合株の選抜方法の相異によって限
定されるものではない。

６、細胞融合株の選抜 次に細胞融合後、再生した菌株（以下細胞融合再生菌株
と言う）より、ヒラタケとヤナギマツタケの両方の性質
を持つ株を選抜する方法についてのべる。

（１）形　態 細胞融合再生菌株を顕微鏡下で４００倍〜６００倍程度
の倍率で観察する。三核菌糸特をのクランプコネクショ
ンがあれば、ヒラタケの一核菌糸のプロトプラストとヤ
ナギマツタケの一核菌糸のプロトプラストの細胞融合株
と推定できる。

（２）核染色 ０．２５Ｍのシュクロース、７ｍＭの２−メルカプトエ
タノール、　　０．４ｍＭのフェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド、１ｍＭのＥＤＴＡ、　　１．ｍＭのＩ
’１ｇＣ１，。

０、１＋＋ＭのＣａＣＩｘ＋　０．１ｍＭのＺｎＣ１ｚ
−１ｕ　ｇ／ａｉ／のＤＡＰＩ（４，６−ジアミンノー
２−フェニルインドール）を含むＤＡＰ　Ｉ染色液で細
胞融合再生菌株を染色し、落射螢光装置を備えた顕微鏡
を用い励起波長３３０〜３８０ｎｍで菌糸中の核を観察
する。−細胞中に常に２つの核があれば、ヒラタケの一
核菌糸のプロトプラストとヤナギマツタケの一核菌糸の
プロトプラストの細胞融合株と推定できる。

しかしながら、本染色法を使用してヒラタケの菌糸を染
色した場合、染色がうまくできるが、ヤナギマツタケの
菌糸を染色した場合には、染色ができない特徴がある。

細胞融合再生菌株の菌糸を染色した場合、染色株と非染
色株が存在し、非染色株はヤナギマツタケの性質を持っ
ていると推定できた。

（３）生育速度 細胞融合再生菌株、ヒラタケ−植菌糸、ヤナギマツタケ
−植菌糸をそれぞれポテト浸出液、グルコースを含む寒
天培地上にそれぞれ植菌し、２５゛Ｃで培養し、寒天培
地上に広がるコロニーの直径を測定し、生育の速度を求
める。

ヒラタケ、ヤナギマツタケの両方において、−植菌糸よ
りも三核菌糸の方が著しく生長が速く、また、−植菌糸
であっても核がデイプロイドになっていた場合に著しく
生長が速くなることが知られており、ヒラタケ−植菌糸
及びヤナギマツタケ−植菌糸よりも融合再生株の生育速
度が速い場合には、ヒラタケとヤナギマツタケの融合株
の可能性を示唆できる。本発明の場合１０日程度の培養
を行なえば十分である。

（４）細胞融合再生菌株とヤナギマツタケ−植菌糸との
交配 細胞融合再生菌株とヤナギマツタケ−植菌糸（交配型Ａ
１．）及びヤナギマツタケ−植菌糸（交配型Ａ２）をそ
れぞれマルツエキス２％、イーストエキス０．２％を含
む寒天培地上で対峙培養（寒天培地上に約５ＩｌｌｌＩ
１１隔てて植菌し、２５°Ｃで培養）を行ない、接触し
た対峙部分の菌糸を取り、顕微鏡で観察する。その結果
、菌糸にクランプが’ＲＩＤできたら、その細胞融合再
生菌株は、ヤナギマツタケと交配可能であり、ヤナギマ
ツタケの性質をもっていることが立証される。

（５）細胞融合再生菌株とヒラタケ−植菌糸との交配 上記の細胞融合再生菌株とヤナギマツタケ−植菌糸との
交配と同様の方法で細胞融合再生菌株とヒラタケ−植菌
糸の交配型ＡＩＢＩ、交配型ＡｌＢ２．交配型Ａ２Ｂ１
．及び、交配型Ａ２Ｂ２とそれぞれ対峙培養を行う、接
触した対峙部分の菌糸を取り、顕微鏡で観察し、菌糸に
クランプが確認できたら、その細胞融合再生菌株はヒラ
タケと交配可能であり、ヒラタケの性質を持っているこ
とが立証される。

（６）細胞融合再生菌株のアイソザイム分析細胞融合再
生菌株と融合に使用したヒラタケの一核菌糸及びヤナギ
マツタケの一核菌糸との細胞内酵素の相同性について電
気泳動のパターンを解析する方法について述べる。マル
ツエキス２％、イーストエキス０．２％を含む寒天培地
上で２５°Ｃ１約１週間培養した菌糸を１ｃ１１Ｉ角に
切り取り、マルツエキス２％、イース・トエキス０．２
％を含む液体培地に接種し、１週間振盪培養する。その
後、培養液中の菌糸を遠沈し、上清をすてた後、蒸留水
を加え洗浄する。この操作を３回行った後に再度遠沈し
、上清をすて、菌糸を得る。この菌糸を乳鉢に入れ、液
体窒素を加え凍結し、粉砕する。粉砕物を遠心管に入れ
、少量の蒸留水を加え１５０００ｒｐｍ、　３０分間遠
沈する９上清にプロテアーゼ阻害のため、ＰＭＳＦ　（
フェニルメチルスルホニルフルオライド）ｉ液ヲ１０μ
ｌ／−景加える。このＰＭＳＦ溶液は３１の凹ＳＦを５
％エタノールに２容かしたものをｆ吏う。

さらに上清の０．１倍体積の２％硫酸プロタミン水溶液
を水浴中で加えることにより核酸を沈澱させる。この後
１１００００ｒｐ、　１０分間の遠沈により沈澱物を除
去し、上清を脱イオン水に対して４°Ｃで２〜３回透析
を行なう。再度１１００００ｒｐで１０分間遠沈し、沈
澱物を除去した後、上清を凍結乾燥する。

この凍結乾燥物に少量の蒸留水を加えて溶解し、粗酵素
液とした後、ホーリン・ローリイ法［Ｊａｒｎａｌ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｎ＋、　１９３２６５（１９５１）　）
で蛋白質量を測定する。

次にポリアクリルアミドを支持体とするディスク電気泳
動法〔蛋白質、核酸、酵素１１．７４４（１９６６）　
）により酵素を分離する。すなわち、ポリアクリルアミ
ドゲル１本あたり、タンパク量７００μｇに相当する粗
酵素液を使用し、０．０５％Ｏ１／Ｖ）　ＢＰＢ　（ブ
ロムフェノールブルー）を含む７０％（Ｖ／Ｖ）グリセ
ロール溶液を加え、４°Ｃに冷却した室の中で電気泳動
を行う。

泳動終了後ガラス管よりゲルを取り出し、Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａ
ｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓνｏｌ　６６、　Ｎ
（１３８８２〜８８９　（１９７０）に記載の方法に従
ってＮＡＤＨ−デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ−結合型デヒ
ドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ−デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ
Ｐ−結合型−デヒドロゲナーゼ、エステラーゼ、酸性フ
ォスファターゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ロイシ
ンアミノペクチダーゼ、フェノラーゼ等について活性染
色を行なうことができる。更に詳細な酵素の種類では、
ＮＡＤ−結合型−デヒドロゲナーゼについては、マレー
トデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ジ
ヒドロし一オルニチン酸デヒドロゲナーゼ、し−ヒスチ
ジノールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼについて活性染色を行なうことができる。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ−結合型−デヒドロゲナーゼについては
、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース６リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、ＤＬイソシトレートデヒドロゲナーゼ、
グルタミン酸デヒドロゲナーゼについて活性染色を行う
ことができる。

次に染色終了後ゲルを水洗し、脱色を行い、エステラー
ゼ染色のときは２０％エタノール、その他のときは７．
５％酢酸に浸して保存できる。

細胞融合再生菌株と細胞融合に使用したヒラタケの一核
菌糸及びヤナギマツタケの一核菌糸の任意の酵素につい
てそれぞれＲｆ値を計算し、比較し、相同性について解
析できる。

ＮＡＤ旧デヒドロゲナーゼにおいて、ヒラタケの場合、
活性染色によって検出されず、またヤナギマツタケの場
合は、１本だけ検出されるので細胞融合再生菌株の相同
性を解析する上で非常に明確に判定できるメリットがあ
る。

（７）血清抗原抗体反応による解析 本発明においてＤＡＰＩ染色法によりヒラタケの菌糸は
染色されるがヤナギマツタケの菌糸は染色されないこと
を発見し、ヤナギマツタケの細胞壁を抗原としてマウス
中の抗原抗体反応で抗°体を生成し、この抗体と細胞融
合再生菌株の細胞壁成分との特異的反応を観察すること
で融合再生菌株とヤナギマツタケとの相同性を解析でき
る。

以下、方法について説明する。

■　ヤナギマツタケの細胞壁成分（抗原）調製ヤナギマ
ツタケ−核菌糸をマルツエキス２％、イーストエキス０
．２％からなる培地に無菌的に植菌後、２８°Ｃで約１
週間培養する。得られた培養液を遠沈し、上清をすて、
沈澱した菌糸に水を加え、洗浄し、再び遠沈する。この
洗浄操作を２回繰り返した後、沈澱した菌糸を乳鉢中で
液体窒素を用いて凍らせ、菌糸を粉砕する。この粉砕物
に１％５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を入れ２
０“Ｃでききどき撹拌しながら、３時間放置した後、４
°Ｃで１６時間放置する。その後、１１００００ｒｐ、
　２０分間遠沈し、上清をすて、残渣に加水し、洗浄し
、再び遠沈する。この洗浄操作を２回繰り返した後、沈
澱物に通量水を加え、５０°Ｃで４８時間透析し、凍結
乾燥してヤナギマツタケの細胞壁成分（抗原）とする。

本島は一８５゛Ｃで保存する。

同様にしてヒラタケ−核菌糸の細胞壁成分（抗原）と細
胞融合再生菌株の細胞壁成分（抗原）を得ることができ
る。

■　マウスの抗体の調製 上記で調製したヤナギマツタケの細胞壁成分１■を０．
９％食塩水溶液ｌｆｆ１／に溶かし、免疫増強剤である
市販のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバント
と等量よく混合させた後、マウス１匹当り２００μ２を
注射器で右下腹部に注射する。

この操作を１週間ごとに行なうと、ヤナギマツタケの細
胞壁成分に対する抗体価は約６週間後に上昇するので、
このマウスの血液を分離し、抗体液とする。

■　ＥＬＩＳＡ　（Ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍ
ｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ　］　　（エンザ
イムイムノアッセイ法）による測定 ヤナギマツタケの一核菌糸の細胞壁成分に対する抗体と
、ヒラタケ−核菌糸の細胞壁成分、ヤナギマツタケ−核
菌糸の細胞壁成分、細胞融合再生菌株の細胞壁成分との
抗原抗体反応量をそれぞれ測定する方法はパーオキシダ
ーゼを用いる、ＥＬＩＳＡ法（エイザイムイムノアノセ
イ法）（「単クローン抗体ハイブリドーマとＥＩｊＳＡ
　Ｊｐ１４４〜１４９講談社サイエンティフィク（１９
８３年）記載の方法に従って行った。

すなわち、０．１　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　　１−あたり、
ヒラタケ−核菌糸の細胞壁成分、ヤナギマツタケ−核菌
糸の細胞壁成分、細胞融合再生菌株の細胞壁成分をそれ
ぞれ１００μｇ溶かした溶液を作り、この溶液各々５０
μ２をマイクロプレートの各々の穴に入れ、３７℃で１
〜３時間保つ、その後脱イオン水でそれぞれ２回洗浄し
、１％ＢＳＡ　（小生の血清アルブミン）５０μ！をそ
れぞれに加え、３７゛Ｃで１時間反応させブロッキング
（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行なう、その後洗浄し、ついで
０．１％ＢＳ＾、０．９％ＮａＣｌ、　０．０５％アン
ドナトリウムを含む１０ｍＭのＴｒｊｓ−ＨＣＩパンフ
ァーで５００倍に希釈した抗体液を加え、１〜３時間、
３７°Ｃで反応させる。洗浄後、０．１％ＢＳＡ、０．
９％ＮａＣＩを含むＩＯｍＭＴｒｆｓ−！ＩＣＩバッフ
ァーで１０００倍に希釈した。市販のペルオキシダーゼ
標識の第２抗体液〔プロティンＡ−パーオキシダーゼ（
ザイメット社製）〕５０μｒを加え、３７“Ｃで１時間
反応させる。反応後、Ｏ，１％８ＳＡ、　Ｑ、９％Ｎａ
Ｃ１を含む１０１↑ｒｉｓ−ＨＣ１バッファーで希釈し
て、波長４２０ｎａ＋の吸光度　（ＯＤ４ｔ−）を測定
する。

以上の方法で細胞融合再生菌株がヤナギマツタケ−核菌
糸の細胞壁成分と近い吸光度を示せば、ヤナギマツタケ
と相同性があることが示される。この血清抗原抗体反応
により、細胞融合再生菌株を解析する方法は、本発明に
おいて、新しく開発された方法であり、細胞融合再生菌
株がヤナギマツタケの性質を保有していることを確証す
るものである。

以上のような解析を経て、細胞融合再生菌株よりヒラタ
ケとヤナギマツタケの両者の性質の少なくとも一部を併
せ有することを特徴とするヒラタケとヤナギマツタケの
細胞融合株を選抜することができる。

以上の結果を要約して簡単に表にすると、全体の選抜法
を採用することによって、両方の性質を有する細胞融合
株の選抜が更に高い確率で実施できる。

７、育種増殖方法 さらに得られたヒラタケとヤナギマツタケの細胞融合株
を増殖させる方法について述べる。

使用できる培地は、ヒラタケの培養に一般に使用されて
いるもので十分であり、液体培地または固体培地等、培
地の種類に限定されるものではない。例えば、ポテト浸
出液、グルコースを含む寒天培地や、マルツエキス、イ
ーストエキスよりなる液体培地や米糠、才力クズ、水よ
りなる固体培地に無菌的に細胞融合株を植菌し、２０〜
２８°Ｃで７〜１４日間培養すれば菌糸は十分に増殖す
る。液体培地の場合、静置培養でも振盪培養でもよいが
、大量に増殖させるには、静置培養よりも振盪培養を用
いる方が効率がよい。

こうして、ヒラタケとヤナギマツタケの細胞融合株を確
実に増殖させることができるのである。

〔実施例］ 以下本発明の実施例について説明する。

〈菌株の分離と一核菌糸取得〉 まず市販の菌床用ヒラタケ種菌〔明治製菓昧製〕の一部
を表２の組成よりなる培地に無菌的に植えて２５°Ｃで
培養し、菌糸を生育させる。

次に菌糸が生育した後、表３の組成よりなる固体培地２
００ｇに無菌的に植えて２５゛Ｃで培養する。

次に２０日間培養し、菌糸が培地全体に生育した後、表
３の組成よりなる固体培地５２０ｇのはいった８００ｃ
ｃ容のポリプロピレン製栽培ポットを１２１”Ｃ。

６０分間オートクレーブ殺菌し、無菌的に約２０ｇ植菌
し、２３°Ｃで２０日間培養した後、植かき、給水の操
作を行い、１５°Ｃ１約９０％の湿度で培養し、子実体
を生成させる。約２０ｇ植菌分に生長した子実体の傘の
ひだ部分より胞子を分離し、殺菌水で希釈後、表２の組
成よりなる培地に塗布し、２５゛Ｃで約７日間培養し、
胞子より菌糸を発芽、生育させた後ヒラタケー核菌糸１
００株を分離した。

市販されているヤナギマツタケの子実体の傘の部分より
′Ｍｉ織片を表２の組成よりなる培地に無菌的に植えて
２５°Ｃで培養し、菌糸を生育させる。次に菌糸が生育
した後、上記のヒラタケの場合と同様に固体培地から更
に栽培ポットへと培養を拡大し、２０°Ｃで子実体を十
分に生長させる。この子実体の傘のひだ部分より胞子を
分離し、菌糸を発芽。

生育させた後、ヤナギマツタケの一核菌糸１００株を分
離した。

（注）表の十の意味は、所定の濃度になるように０．０
５Ｍマレイン酸バッファーを加えることである。

〈交配型の決定〉 次に、ヒラタケ−核菌糸３０株を使用して、表２の組成
よりなる培地上で総当たりの対峙培養を行い、接触した
対峙部分をスライドカルチャーし、顕微鏡で観察して菌
糸の真性クランプまたは偽クランプの有無を観察し、交
配型を決めた結果、四極性であり、３０株のうちＡＩＢ
Ｉ型６株、　ＡＩＢＺ型５株。

Ａ２Ｂ１型７株、　Ａ２Ｂ２型７株、未確定５株を得た
。

ついでヤナギマツタケ５０株を上記出回様の方法で交配
型を決めた結果、ヤナギマツタケは二極性であり、Ａｌ
型２２株、　Ａ２型２１株、及び、どの株との交配でも
クランプを形成しない株７株を得た。

くプロトプラスト作成から栄養要求株の取得）次にヒラ
タケ−核菌糸（Ｎα７．交配型Ａ２Ｂ２）を表４の組成
よりなる培地に無菌的に植えて２８°Ｃで４日間振盪培
養し、培養液ごと菌糸をホモゲナイザーへ河−１２（Ｉ
Ｉ日本精機製作所製）で５．００Ｏｒｐｍ。

２分間ホモゲナイズし、再度表４の組成よりなる培地に
植菌し２８’Ｃ，１８時間振盪培養する。この培養液を
４０００ｒｐｍ、　５分間遠沈し、菌糸を分離し、上清
液をすて０．０５Ｍのマレイン酸バッファー（ｐＨ５，
８）を加えて再懸濁し、上記条件にて遠心分離を行い上
清液を捨てる。この洗浄操作を２回繰り返した後、０．
０５Ｍマレイン酸バッファーにン容解した、表５の組成
の酵素液で３０°Ｃ１約６時間処理することにより、ヒ
ラタケのプロトプラストが分離される。

続いて、このプロトプラストを含む酵素液をグラス繊維
と濾紙（アトバンチツク１０１　、東洋濾祇株式会社製
）で濾過して菌糸断片を除いた後、３０００ｒｐｍ、　
５分間遠沈し、上滑をすて、残渣を０．５Ｍソルビトー
ルを含む０．０５Ｍマレイン酸バッファー（ｐＨ５，８
）を加えて再懸濁し、上記条件にて遠沈し上滑を捨てる
。この洗浄操作を２回繰り返した後、プロトプラスト濃
度がｌＸｌ０’個／ゴ程度になるように再懸濁する。

この懸濁液にクリーンベンチ中で１２〜１８分間紫外線
を照射し、変異処理した後、表６の液体着地に分注し、
２５°Ｃ１４０時間プロトプラストを再生させた後、表
７の組成よりなる培地に塗布し、更に２５°Ｃで約６日
間培養し菌糸を生育させ、２００株の再生株を得た。

次にこの再生株をそれぞれ表８の組成よりなる最少培地
に植菌し、２５°Ｃで約５日間培養し、この培地上に生
育しない菌株を選定する。

該菌株を、オギザノグラフ法に従がい、各種アミノ酸、
ビタミン、核酸のはいった合成培地に培養して、生育の
有無を確認し、栄養要求性を決定した。

これらの菌糸培養、プロトプラスト化、変異処理、再生
及び栄養要求性の決定のための一連の操作を５回繰り返
し、約８００株の再生株のうち、栄養要求株１株（ヒラ
タケＮα７−９２．Ｐ−アミノ安息香酸要求性）を得た
。

ヤナギマツタケ−核菌糸（倣１．交配型Ａｔ）において
も上記のヒラタケの場合と同方法で得られた約６００株
の再生株のうち、栄養要求株１株（ヤナギマツタケＮα
１−Ｇｌｏｏ、　　シトシン要求性）を得た。

（本頁以下余白） 〈細胞融合株取得〉 上記のプロトプラスト作成から栄養要求株取得の欄に記
載の方法に従って、ヒラタケＮｏ、　７−９２（Ｐアミ
ノ安息香酸要求株、交配型Ａ２Ｂ２）　、ヤナギマンタ
ケＮα１−Ｇｌｏｏ　（シトシン要求性、交配型Ａ１．
）より、それぞれプロトプラストを調製する。

このようにして調製したヒラタケ、ヤナギマツタケのプ
ロトプラストをＩＸｌ、Ｏ”個ずつ混合後、３０００ｒ
ｐｍ、　１０分間遠沈し、上清をすて、残渣を３０°Ｃ
に保った表９の組成のポリエチレングリコール溶液に再
懸濁し、１０分間放置する。この懸濁液に０．５Ｍソル
ビトールを含む、０．０５Ｍマレイン酸パンファーを十
分量加え、３０００ｒｐｍ、　５分間遠沈し、上清を↑
舎でる。

その後、残渣を同様の操作により２回洗浄した後、残渣
を０．５Ｍソルビトールを含む０．０５Ｍマレイン酸バ
ッファーに懸濁し、表１０の組成の０．５　Ｍソルビト
ールを含む最少培地に塗布し、２５°Ｃで培養する。培
養約７〜ＩＯ日後に細胞融合再生菌株のコロニー形成が
観察された。

上記のプロトプラストの調製、融合処理及び再生の一連
の操作を１０回繰り返し、１５株の細胞融合再生菌株を
得た。

（本頁以下余白） く細胞融合再生菌株よりヒラタケとヤナギマツタケの両
者の性質の少なくとも１部を併せ有することを特徴とす
るヒラタケとヤナギマツタケの細胞融合株の選抜〉 次に細胞融合後再生した細胞融合再生菌株より、ヒラタ
ケとヤナギマツタケの両方の性質を有する株を選抜する
実施例を記載する。

細胞融合再生菌株が１５株得られたが、その中で代表的
なＦｌ、２株について記載すると、■菌糸形態観察 まず、細胞融合株の選抜の（１）に記載の方法に従って
Ｆ１２株菌糸を顕微鏡下で６００倍で観察したが、クラ
ンプコネクションを有していなかった。この方法だけで
は細胞融合株であるとは言えない。

■核染色 細胞融合株の選抜の（２）に記載の染色液をスライドカ
ルチャーしたＦ１２株菌糸に一滴加え、カバーグラスを
かけ、室温で１０分間染色した後、落射螢光装置を備え
た顕微鏡オリンパスＢＨ−２型で、励起波長３３０〜３
８００ｍ、グイクロイックミラー〇Ｍ４００、接眼側吸
収ファルタ−Ｌ２０を用いて観察したがＦ１２株は染色
されなかった。

ヒラタケＮα７−９２　（Ｐ−アミノ安息香酸要求性、
交配型Ａ２Ｂ２）は、青白色に核が染色されて見えるが
ヤナギマツタケＮα１−Ｇｌｏｏ　（シトシン要求性、
交配型ＡＩ）は染色されないので、Ｆ１２株はヤナギマ
ツタケの性質を持っていた。

■生育速度 細胞融合株の選抜の（３）に記載の方法に従って、表２
の組成よりなる培地の中央部にＦ１２株、ヒラタケＮα
７−９２株、ヤナギマツタケＮα１−Ｇ１００株の小片
を植菌し、２５°Ｃで培養し、寒天培地上に生育したコ
ロニーの直径を培養開始後１日目、３日目、６表１１ ■ヤナギマツタケー核閉糸との交配 細胞融合株の選抜の（４）に記載の方法に従って、Ｆ１
２株とヤナギマツタケＮｏ、１−Ｇ１００株（交配型Ａ
Ｉ）、ヤナギマツタケ岡２　（交配型Ａ２）をそれぞれ
表７の組成の培地を用いて、２５°Ｃで対峙培養を行っ
た。

７日間培養後、接触した部分の菌糸を取り、顕微鏡で観
察したがヤナギマツタケＮα１−Ｇｌｏｏ及びヤナギマ
ツタケＮα２のいずれの場合にも菌糸にクランプの形成
はなく、Ｆ１２はヤナギマツタケとの交配の能力はもっ
ていなかった。

日日、８日日１，１０日目に測定した。表１１に示した
ように、Ｆ１２株は、ヒラタケＮα７−９２株及びヤナ
ギマツタケＮα１−Ｇ１００株の両方より、生育が速く
ヒラタケとヤナギマツタケの融合株の可能性が示唆され
た。

（本頁以下余白） ■ヒラタケー核菌糸との交配 細胞融合の選抜の（５）に記載の方法に従って、Ｆ１２
株とヒラフケＮαツー９２株（支配型Ａ２Ｂ２）、ヒラ
タケＮｎ　４株（交配型ＡＩＢＩ）、ヒラタケＮｏ、　
８株（交配型Ａ１．Ｂ２）、ヒラタケＮα１０株（交配
型Ａ２Ｂ１．）をそれぞれ表７の組成の培地を用いて、
２５°Ｃで対峙培養を行った。７日間の培養後、接触し
た部分の菌糸を取り、顕微鏡で観察したところ、Ｆ１２
株とヒラタケＮα４株の交配で真性クランプを、Ｆ１２
株とヒラタケＮα８株との交配で偽クランプを形成した
。

Ｆ１２株とヒラタケＮｏ、７−９２株の交配、及びＦｉ
２株とヒラタケＮｏ、１．０株との交配ではクランプは
形成されなかった。Ｆ１２株はヒラタケとの交配の能力
をもっており、ヒラタケの性質を存することが確証され
た。

■アイソザイム分析 細胞融合株の選抜の（６）に記載の方法に従って、Ｆｌ
Ｚ株とヒラタケに７−９２株、ヤナギマツタケＮα１−
Ｇ１．００株のアイソザイムの分析を行なう。種々の酵
素についてアイソザイム分析ができるが、本実施例では
代表的なＮＡＤＨ−デヒドロゲナーゼについて記載する
。

細胞融合株の選抜の（６）に記載のアイソザイム分析の
方法に従って、Ｆ１２株、ヒラタケＮα７−９２株、ヤ
ナギマツタケＮｏ、１−Ｇ１００株それぞれ、タンパク
質をポリアクリルアミドを支持体とするディスク電気泳
動で分離した後、それぞれのゲルをガラス管より取り出
し、Ｐ−ニトロブルーテトラゾリウム２０ｍｇ、　ＮＡ
ＤＩＩ　２５ｍｇを含んだ０．１　Ｍ　）リスー塩酸バ
ッファー（ｐＨ８，３）５０ｄからなる染色液中に、そ
れぞれのゲルをひたし、３７°Ｃ１１時間染色する。染
色終了後ゲルを水で洗浄し、ついで７．５％酢酸溶液に
浸した後に、染色されたバンドを観察し、Ｒｒ値を計算
する。Ｆ１２株では、訂値０．５２に１本、ヤナギマツ
タケＮαｌ−Ｇ１００ではＲｆ値０．５４に１本、Ｆ１
２株とヤナギマツタケＮα１−Ｇｌｏｏと実質的に同じ
位置にバンドが検出された。しかし、ヒラタケＮα７−
９２株では、バンドは検出されなかった。従ってＦ１２
株は、ヤナギマツタケの性質をもっていることが確証さ
れた。

■血清抗原抗体反応による融合再生株の解析細胞融合株
の選抜の（７）に記載の方法に従って、ヤナギマツタケ
Ｎα１−Ｇ１００株の細胞壁成分（抗原）を調製した後
に、この抗原を市販の免疫増強剤であるフロイント（Ｆ
ｒｅｕｎｄ）の完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）と
等量よく混合させて、マウス　バルブＣ（Ｂａｌｂ／５
Ｉｌａｌｌ　Ｃ）に注射し、抗体を含んだマウスの血清
を得る。

ＥＬＩＳＡ法による測定の欄に記載の方法に従って、上
記の抗体とＦ１２株の細胞壁成分、ヤナギマツタケＮα
１−Ｇ１００株の細胞壁成分、ヒラタケＮα７−９２株
の細胞壁成分とのそれぞれの反応を測定した結果、Ｆ１
２株の細胞壁成分、ヤナギマツタケｋｌ−Ｇ１００株の
細胞壁成分、ヒラタケＮα７−９２株の細胞壁成分の波
長４２０ｎｎ＋における吸光度（ＯＤｇｚ。）は、それ
ぞれ０．６３７．０．７８３．０．３９５であり、Ｆ１
２株はヤナギマツタケＮα１−ｃｉｏｏ株に近い値を示
し、ヒラタケとは大きく異なる値を示し、ヤナギマツタ
ケと相同性があ葛ことが確証された。

以上のような種々の解析により、ヒラタケの一核菌糸と
ヤナギマツタケの一核菌糸のプロトプラストの融合処理
後再生したＦ１２株は、ヒラタケとヤナギマツタケの細
胞融合株であることが確証でき、両者の性質の少なくと
も一部を併せ有するＦ１２株を選抜し得ることができた
。尚本発明の細胞融合株のＦ１２株を微工研に微工研菌
寄第１０３３３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０３３３）として
寄託した。

〈育種増殖〉 更に、表３の組成からなる固体培地を５００ｄ容の三角
フラスコに２００ｇ入れ、３０分間、　　１２１’Ｃ，
加圧１気圧で殺菌、冷却後Ｆ１２株を無菌的に植菌する
。

これを２５゛Ｃで１０日間培養すると菌糸は培地中に十
分に増殖した。

〔発明の効果〕

以上詳細に説明したように、本発明によれば、ヒラタケ
とヤナギマツタケのプロトプラスト融合によって、ヒラ
タケとヤナギマツタケの両方の性質を持った子実体を再
生するための中間体として、或いは、ヒラタケ又はヤナ
ギマツタケの性質を改良するための育種素材として極め
て有用な、ヒラタケとヤナギマツタケの細胞融合株を得
ることができるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプロセスを示す簡単なフローシートで
ある。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒラタケとヤナギマツタケとの両者の性質の少な
   くとも一部を併せ有することを特徴とするヒラタケとヤ
   ナギマツタケとの細胞融合によって得られた細胞融合株
   。
2. （２）ヒラタケと交配可能であり、アイソザイム分析の
   少なくとも１つの分析においてヤナギマツタケと実質的
   に同じ位置にバンドを有することを特徴とする請求項１
   項記載のヒラタケとヤナギマツタケとの細胞融合によっ
   て得られた細胞融合株。
3. （３）ヒラタケの一核菌糸のプロトプラストと、ヤナギ
   マツタケの一核菌糸のプロトプラストとを細胞融合せし
   め、これを適宜選抜手段によって選抜して細胞融合菌株
   を得ることを特徴とするヒラタケとヤナギマツタケとの
   細胞融合株の育種方法。
4. （４）ヒラタケの一核菌糸のプロトプラストと、ヤナギ
   マツタケの一核菌糸のプロトプラストとを細胞融合せし
   め、これを適宜選抜手段によって選抜して上記の細胞融
   合株を得て、該細胞融合株を増殖することを特徴とする
   ヒラタケとヤナギマツタケとの細胞融合株の育種増殖方
   法。