JPH02118437A - Ｄｎａプローブ回折格子分折法及びそのための試剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改良された分析法及びそのための試剤に関する
。特に本発明はプローブとしてＤＮＡシーケンス並びに
高められた感度を提供する試剤を用いる光回折分析法に
関する。

要するに、本発明の分析は試料中の特別なりＮＡクシ−
ンスを検知するために、核酸ハイブリッド形成回折分析
においてＤＮＡシーケンスをプローブとして使用する。

回折分析法は被検体の存在及び量を決定するために適用
される。

本発明は非特異的ハイブリッド形成及び結合を非常に減
するバイオグリド（ｂｉｏｇｒｉｄ）又はバイオ格子（
ｂｉｏｇｒａｔｉｎｇ）用の支持表面の領域における発
見を含む。本発明の好適な方法は光回折分析に用いるた
めのバイオ格子の製造を含み、またヌクレオチド・シー
ケンスを含んでなるハイブリッド形成試剤の均一な層を
滑らかな固体表面上に付着させ、この表面を、ハイブリ
ッド形成試剤を選択的に不活性化させる線の回折格子模
様を有するシャドウマスクを通してＵＶ照射に露呈して
、活性なハイブリッド形成試剤の線の生物学的回折格子
図柄を残すことを含んでなる。滑らかな固体表面は好ま
しくは多珪素（ｐｏｌｙｓｉｌｉｃｏｎ）及び単結晶珪
素表面からなる群から選択される。

水性試料中の被検体の存在又は量を決定するための本発
明の回折ハイブリッド形成分析法は、核酸シーケンス回
折バイオグリッドを、適当な環境下に及び核酸シーケン
スプローブと被検体との間の核酸ハイブリッド形成を可
能にする十分な期間、試料と接触させ、バイオグリッド
を試料から分離し、このバイオグリッドを光源からの光
で照射し、そして回折ハイブリッド形成分析表面によっ
て回折された光を決定することを含んでなる。

多くの固相免疫分析は、その表面の照射及び結果として
表面に付いた分子からの光放射を含む。

一般にこれらの放射はすべての方向へ進む。これらの拡
散した放射は、高価で精密な集光光学系により集めて感
度を達成しなければならず、或いは固有の効率の低い、
結果として低いシグナル対光量比を受は入れなければな
らない。

回折格子は、すべての方向に散乱するのと対比されるよ
うに、光を特別な角度に回折せしめる。

最初の格子は多くの直線の平行な溝を表面に引くことに
よって製造された。入射光は表面の各によって回折され
、基本的には、各溝からの光が他の溝によって散乱され
た光と好ましく干渉し合う方向に進む。この好都合な格
子の光干渉性は光を効果的に集める。また回折格子は光
をそのスペクトル成分に分離するために使用されてきた
。

試料中の被検体濃度を測定するために、試剤の異なる物
理的に測定しうる性質を用いる多くの分析系が開発され
ている。放射線免疫分析（ＲＩＡ）、免疫蛍光分析、化
学発光分析、酵素免疫分析（ＥＩＡ）、遊離基免疫分析
（ＦＲＡＴ）、光散乱ネフエロメトリー　トランスシス
ター・ブリッジ・プローブ、インジウム反射表面法、及
び超音波プローブ法が適用されている。これらの系は１
次結合試剤物質例えば抗体又は抗原及びこれと選択的に
結合する被検体間の非常に選択的な反応を使用する。し
かしながら、感度の限界のために、従来の系は比較的大
きい被検体例えば抗体又は大きい抗原の使用を必要とし
、或いは検知しうる信号を増大させるためにサンドウィ
ッチ分析技術の使用を必要とする。

１９８６年１月８日付けのヨーロッパ特許願第８５３０
４４６９．４号に相当する米国特許第４゜６４７．５４
４号は、光回折系及び方法並びにそのためのバイオ格子
を記述しており、この全内容は本明細書に参考のために
引用される。バイオ格子を製造するために開示されてい
る方法は、活性な抗体のコーティングを平らな表面例え
ばガラス又はプラスチック表面上に生成せしめることを
含んでなる。１つの開示されている方法において、スト
ライブ状の領域を形成せしめるための抗体分子の選択的
な破壊は、水銀ランプのような強力なＵＶ光源を、コー
ティングした表面付近に或し）はこれと接触して配置さ
れたシャドーマスクと共に用いることよって達成される
。被検体の、活性抗体のストリップ（ｓｔｒｉｐ）との
結合は光回折格子を形成する。この技術をサンドウィッ
チ分析及び競争分析に適用する場合、標識された試剤リ
ガンドは結合した物質の情報を高めるために使用するこ
とができる。

フォトレジスト及びレーザー光は自筆の格子を製造する
ために使用されてきた。写真媒体の粗さは溝の間隔を制
限する。半導体材料において正確に配置された形及び線
の生成におけるフォトレジスト・マスクの使用は半導体
デバイスの製造に広く使用されている。このマスクは米
国特許第４゜６４７．５４４号に記述されているように
露光すべき表面上又は表面のごく近くに置くことができ
る。この方法では、最良の線の解像は、マスキング要素
の端での光の反射を最小にするために、マスクを露光す
べき表面に圧着することによって得られる。

ルンドストローム（Ｌ　ｕｎｄｓｔｒｏｍ）らの米国特
許第４．５２１，５２２号は、反射された電磁照射を用
いる抗体−抗原の結合の決定法を呈示している。

従来法のバイオグリッド及びバイオ格子は用いる系の解
像度によって制限されてきた。バイオ格子は一般に抗体
又は比較的大きい抗原の決定を含む分析或いはサンドウ
ィッチ分析の使用に限定されてきた。

生物学的試料中の微小量の物質の分析及び決定は、臨床
及び分析研究室において日常的な作業になった。ＤＮＡ
プローブは核酸ハイブリッド形成に基づく技術（ポリヌ
クレオチド・シーケンスに基づく技術）において使用さ
れる。これらは標識したポリヌクレオチド・シーケンス
又はプローブの、ハイブリッド形成条件下での被検体の
相補的シーケンスへの非共有的ハイブリッド形成を含ん
でなる。そのような方法はＭ、グルンスタインら、ＰＮ
ＡＳ、ＵＳＡ、７２．３９６１〜３９６５　（１９７５
）に記述されている。

ＤＮＡハイブリッド形成は、その場で即ち組織試料内で
、或は試験管内で即ち組織から分離された物質内で起こ
る。本発明はそのような試験管内ＤＮＡハイブリッド形
成、及びその改良された検出に関する。

ハイブリッド形成が試剤ポリヌクレオチド・シーケンス
及び被検体の相補的シーケンス間で起こる時、検出する
のは望ましい。この検出は従来は標識されたプローブ・
シーケンスを用いて行なわれてきた。試験試料は支持体
に結合し、標識したプローブがこれに接触される。ハイ
ブリッド形成に対して十分な時間を使用し、過剰なプロ
ーブを除去する。試料中に存在する標識の存在及び量は
被検体の存在及び量に相当する。別にＤＮＡプローブは
サンドウィッチ分析において１次結合剤として働くこと
ができ、そしてプローブに対する標識された２次結合パ
ートナーを用いてシグナルを増巾する。通常の標識は放
射線標識、酸素標識、及び免疫蛍光又は化学発光標識を
含む。

例示的ＤＮＡ分析は、挿入複合物に対して抗体を用いる
核酸ハイブリッド形成分析を記述する米国特許第４．５
６３，４１７号及びサルモネラに対するＤＮＡプローブ
試験を記述する米国特許第４゜６８９．２９５号に記述
されている。

本発明の改良された分析は、核酸ハイブリッド形成回折
分析においてＤＮＡシーケンスをプローブとして用いて
、試料中の特別なりＮＡシーケンスを検出する。回折分
析の方法論は被検体の存在及び量を決定するために適用
される。

本発明は非特異的ハイブリッド形成及び結合を非常に減
するバイオグリド（ｂｉｏｇｒｉｄ）又はバイオ格子（
ｂｉｏｇｒａｔｉｎｇ）用の支持表面の領域における発
見を含む。本発明の好適な方法は光回折分析に用いるた
めのバイオ格子の製造を含み、またヌクレオチドシーケ
ンスを含んでなるハイブリッド形成試剤の均一な層を滑
らかな固体表面上に付着させ、この表面を、ハイブリッ
ド形成試剤を選択的に不活性化させる線の回折格子模様
を有するンヤドウマスクを通してＵＶ照射に露呈して、
活性なハイブリッド形成試剤の線の生物学的回折格子図
病を′残すことを含んでなる。滑らかな固体表面は好ま
しくは多珪素（ｐｏｌｙｓｉｌｉｃｏｎ）及び単結晶珪
素表面からなる群から選択される。本方法を用いれば、
バイオグリッドの感度は改善され、斯くしてヌクレオチ
ドシーケンスはバイオグリッド表面に適用することかて
ぎ、このバイオグリッドが核酸ハイブリッド形成分析に
使用される。

光回折分析に用いるのに好適な本発明の他のバイオ格子
は、活性なハイブリッド形成剤の線の生物学的回折格子
図柄を表面に有する多珪素及び単結晶珪素表面から好ま
しくは選択される表面を含んでなる。この場合格子図柄
は核酸シーケンスの均一層を滑らかな固体表面上に付着
させ且つこの表面を、回折格子図柄を有するシャドーマ
スクを通してＵＶ照射に露呈し、ハイブリッド形成試剤
核酸シーケンスを選択的に不活性化して活性な核酸シー
ケンスの線の生物学的回折格子図柄を残すという方法の
生成物である。ここに正確に焦点のあてられたシャドー
は、ハイブリッド形成試剤層をシャドーマスクと物理的
に接触させることになしに核酸シーケンス層上に投写さ
れる。

本発明で得られる改良された感度が故に、標識された２
次試剤を用いるシグナル出力の高揚は必要ない。

水性試料中の被検体の存在又は量を決定するための本発
明の回折ハイブリッド形成分析法は、核酸シーケンス回
折バイオグリッドを、適当な環境下に及び核酸シーケン
スプローブと被検体との間の核酸ハイブリッド形成を可
能にする十分な期間、試料と接触させ、バイオグリッド
を試料から分離し、このバイオグリッドを光源からの光
で照射し、そして回折ハイブリッド形成分析表面によっ
て回折された光を決定することを含んでなる。

分析すべき試験試料は興味ある溶媒のいずれであっても
よく、普通医学、獣医学、環境、栄養学、又は工業の重
要な液体試料であるであろう。特に人間及び動物の試料
及び体液、即ち尿、血液（血清又は血漿）、ミルク、骨
髄液、粘液、唾液などを含むものが分析できる。被検体
は正常で健康な状態と係っていてよく、或いは異常又は
病気の状態を表わしてもよい。試験すべき試料が基本的
に細胞に含有されるように二重ストランド核酸を含む場
合、試料は核酸を変性するために、そして必要ならば最
初に核酸を細胞から遊離させるために処理されよう。核
酸の変性は好ましくは沸とう水中での加熱又はアルキリ
処理、そして所望により同時に細胞の溶解によって達成
することができる。

また核酸の遊離は、例えば機械的破壊（凍結／融解、摩
砕、超音波処理）、物理的／化学的破壊（洗剤例えばツ
ウイーン、トリシン、ＳＤＳ処理、アルカリ処理、滲透
圧衝撃、又は熱）、或いは酵素的溶解（リソザイム、プ
ロテイナーゼに１ペグシン）によって得ることができる
。得られる媒体は核酸を単一ストランド形で含有し、こ
れが本発明のハイブリッド形成法によって分析できる。

第１図は本発明の方法における入射及び回折光のデザイ
ンの概略図である。

第２図は本発明の回折分析装置の静置プラットフォーム
の具体例の概略図である。

第３図は本発明の回折分析装置の回転プラットフォーム
の具体例の概略図である。

第４図は核酸シーケンス試剤の回折格子図柄を有する複
数の不溶性支持体が配置された浸漬棒の断面図である。

第５図は核酸シーケンス・ハイブリッド形成試剤を表面
上に回折格子図柄で有する不溶性支持体の部分的拡大図
である。

第６図は第４図の回折格子図柄を有する不溶性支持体の
製造法の概略的表示である。

本発明は光回折を適用する分析の改良である。

ハイブリッド形成された試剤−被検体複合体の格子を不
溶性支持体の表面上に形成されることにより、入射光は
分別した系統の角度に回折でき、この光は高効率で検出
及び測定することができる。

回折の角度は格子の線間隔及び入射光の波長の関数であ
る。

本明細書で用いる［被検体コとは、存在を検出し、所望
により定量化する単独の又は混合物の基質を表わす。被
検体は小さい又は高分子量のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、そ
れらの分子を含む分子複合体、或いは核酸例えばウィル
ス、細胞、又は細胞群を含む生物学的系であってよい。

通常の被検体には、核酸、（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はそ
の断片、単一又は二重ストランドのウィルス、バクテリ
ヤ培養中の細胞などがある。ダラム陽性及びダラム陰性
バクテリヤの双方を含む完全な又は断片のバクテリヤ、
菌、枯菌及び他の微生物例えばマイコプラズマテール、
胞子、寄生体、又はイースト菌、並びに動物（＠乳動物
）及び植物の細胞及び組織も被検体である。この被検体
試料を処理して、プローブの核酸シーケンスにハイブリ
ッド形成しうる単一ストランドのヌクレオチド・シーケ
ンスを得る。

「プローブ」とは、特別な被検体のヌクレオチド・シー
ケンスに相補的であり且つ該被検体ヌクレオチド・・シ
ーケンスにハイブリッド形成しうるヌクレオチド・シー
ケンスに関するものである。

プローブは、核酸シーケンスとして又は適当なプラスミ
ド内に含まれる核酸シーケンスとして単一又は二重スト
ランドＤＮＡ、ＲＮＡに由来してよい。他に核酸プロー
ブは技術的に良く知られた通常の方法で合成しうる。核
酸シーケンスはモノクローナル又はポリクローナルであ
ってよく、そして適当な長さであってよい。好適な長さ
は０．１〜１０Ｋｂ、更に好ましくは０．２〜３．ＯＫ
ｂ、そして特に０．５〜１．ＯＫｂである。ハイブリッ
ド形成の場合、核酸は単一ストランドであることの保証
が必要である。二重ストランドＤＮＡプローブの場合、
これは普通溝とうにより或いはアルカリ中での変性によ
り達成される。プローブは不溶性支持体に結合し、１次
ノ）イプリ・ンド形成試剤として作用する。

本明細書に用いる「ハイブリッド形成分析」又は「結合
分析」とは、ＤＮＡプローブ及びこれとハイブリッド形
成しうる被検体間のいずれかの７’ｔイブリッド形成反
応を用いる分析を示す。

本明細書に用いる如き「光妨害」とは、光の吸収、反射
、散乱、屈折及び相変化を含めて光が影響されるすべて
のものを含むと定義される。

本明細書に用いる如き「回折格子図柄」とは、不活性化
又は変性されたノ・イブリッド形成試剤と交互の活性な
ハイブリッド形成試剤からなるストリップ又は線の模様
を含むと定義される。活性なハイブリッド形成試剤及び
不活性化された／蔦イブリッド形成試剤は、好ましくは
非常に類似の光散乱効率を有し、従って回折格子図柄の
ストリ・ンプ又は線は被検体の不存在下において光回折
に対して本質的に均一であり、即ち被検体が活性なノー
イブリッド形成試剤のストリップ又は線に優先的に結合
するまでは光はそれぞれの種類のストリップから同様に
強く散乱する。回折格子図柄は光妨害被検体のハイブリ
ッド形成と共に回折格子になる。

「バイオグリッド」又は「バイオ格子」とは適当な支持
体材料と合体した回折格子図柄に関するものである。

本明細書に用いる如き「回折格子」とは、１つ又はそれ
以上の段階で形成される反射増巾格子を含むものと定義
される。１段階格子において、回折格子は不溶性表面上
の光妨害しない試剤の被検体との結合により直接形成さ
れて光妨害格子図柄を与える。多段階格子では、不活性
表面上の試剤の被検体との結合生成物は光妨害せず、そ
して次いで光妨害を増大させる残基で好ましくは標識さ
れた第２の結合試剤と結合する。本発明の方法で形成さ
れる１段階及び多段階格子の種類は反射増巾格子、透過
増巾格子、反射相格子、及び透過相格子を含む。■又は
多段階での反射増巾格子の場合、光は格子から反射し、
そして反射光の増巾は格子の空間的に可変の反射によっ
て調節される。

■又は多段階での透過増巾格子の場合、光は格子を通っ
て透過し、そして透過した光の増巾は格子の空間的に可
変の透過によって調節される。１又は多段階での反射相
格子の場合、光は格子から反射し、反射光の相は格子の
空間的に可変の屈折率によって調節される。ｌ又は多段
階での透過相格子の場合、光は格子を通って透過し、そ
して透過光の相は格子の空間的に可変の屈折率によって
調節される。本発明の方法において、回折格子はこれら
の種類の格子の１つ又は同時にそれ以上として機能して
よく、またこれらのすべての格子の種類は本発明の回折
格子に含まれる。

第１図は本発明の方法において回折格子に突き当って入
射光により作られる入射及び回折光の図柄の概略図であ
る。入射光２は不溶性支持体６の表面上の回折格子４に
当たる。反射光８（ｍ＝０）は格子表面４の法線ｌＯに
関して測定して入射角Ａに等しい角度Ｂ０で反射する。

回折光は一連の角度で格子４により回折される。入射角
及び回折角の間の関係は基本的な格子方程式 １式％） ［式中、■は波長λのスペクトルの順序であり、ｄは溝
の間隔であり、モしてＡ及びＢはそれぞれ格子表面の法
線に関する入射及び回折角である１ によって与えられる。１次回折１２（ｍ−−１）及び１
４（ｍ＝１）はそれぞれＢ−寡及びＢ”の角度を有する
。２次回折１６（ｍ＝−２）及び１８（ｍ＝２）は法線
１０に関してそれぞれＢ−２及びＢ＋２の角度を有する
。光は更に高次でも回折される。１及び２次の回折は例
示であって限定するものでなく、かなりの強度を有する
すべての回折が本発明の方法で使用しうる。

第２図は本発明の回折分析装置の静置プラットホームの
具体例の概略図である。光源２０からの光線１９はチョ
ッパー２２及び光線分割装置２４を経る。分割装置を通
過した光はコリメーター２６を通過し、静置支持体２９
に取りつけられた回折格子２８に突き当る。

格子表面２８を離れる回折した光線は法線３０に関して
角度Ｂを有する１本の線３２で表わしである。反射光線
は示してない。光はレンズ３４で集められ、開口３６を
通過し、光センサ−３８に突き当り、電気シグナルを発
生させ、これがケーブル４２により通常のロック−イン
（１ｏｃｋ　−ｉｎ）増巾器及び記録計の系４０に運ば
れる。１次光線１９から分割装置２４で分散された光の
分割光線４３は、他の光検出器４４に向う。この光検出
器４４かもの電気ジクナルは光源に起因するゆっくりし
た変動誤差を補正するだめの参照電流としてケーブル４
６によりロック−イン増巾器４０に供給される。ケーブ
ル４８はロック−イン機能のためにチョッパー２２から
ロック−イン増巾器４０への参照シグナルを与える。こ
の機能はチョッパー速度（チョッパーを通過する光束）
を増巾器フィルターの作動（開放）と同期させ、斯くし
て大気の光ノイズを減少させる。光源、分割装置、チョ
ッパー、コリメーター　レンズ、光検出器及びロック−
イン増巾器を含む系の成分及びその個々の機能は通常の
ものであり、技術的によく知られている。

第２図に概略的に表わされる回折測定装置は、角度Ａ及
びＢを変えるように構成することができる。光源２０、
チョッパー２２、光源分割装置２４及びコリメーター２
６は、回折格子２８の回りの垂直平面内に好適な角度Ａ
まで回転するように取りつけられたアーム上に配置され
ている。角度Ａは好ましくはｌＯ〜８０″、随時２０〜
７０°の範囲内である。更に重要なことには、レンズ３
４、開口３６及び光検出器３８は第１図の反射光線８及
び１２．１４．１６及び■８で表わされる回折光線の通
路内にレンズ及び開口を置く角度Ｂを通して回折格子２
８の周囲の垂直平面内を回転するアームに取りつけるこ
とができる。このようにして、単一の検出系は回転して
反射光及びすべての回折光の所望の順序を検出し且つ測
定することができる。

第３図は本発明の回折免疫分析装置の回転プラットフォ
ームの具体例を示す概略図である。光源５２からの光線
５０は光線分割装置５４を通過する。

分割装置を通過した光はコリメーター５６を通過し、回
転する支持体６０に取りつけられた回折格子５８に突き
当る。

格子表面５８を離れる回折した光線６２は法線６４に関
して角度Ｂを有する。光はレンズ６６で集められ、開口
６８を通過し、光センサ−７０に突き当り、電気シグナ
ルを発生させ、これがケーブル７４により通常のロック
−イン増巾器及び記録計の系７２に運ばれる。１次光線
５０から分割装置５４で分散された光の分割光線７６は
、他の光検出器７８に向う。この光検出器７８からの電
気ジクナルは光源に起因するゆっくりした変動誤差を補
正するための参照電流としてケーブル８０によりロック
−イン増巾器７２に供給される。ケーブル８１はロック
−イン機能のためにプラットフォーム回転系８２からロ
ック−イン増巾器７２ヘシグナルを提供する。この機能
はプラットフォームの速度（格子及び光回折のデザイン
の、レンズ６６及び開口６８との周期的な整列）を、増
巾器フィルターの作動（開放）と同期させ、斯くして大
気の光ノイズを減少させる。光源、分割装置、チョッパ
ー、コリメーター　レンズ、光検出器及びロック−イン
増巾器を含む系の成分及びその個々の機能は通常のもの
であり、技術的によく知られている。

第３図に概略的に表わされる回折測定装置は、角度Ａ及
びＢを変えるように構成することができる。光源５２、
光源分割装置５４及びコリメーター５６は、回折格子５
８の回りの垂直平面内に好適な角度Ａまで回転するよう
に取りつけられたアーム上に配置されている。角度Ａは
好ましくは１０〜８０″、随時２０〜７０＠の範囲内で
ある。更に重要なことには、レンズ６６、開口６８及び
光検出器７０は第１図の反射光線８及び１２．１４、Ｉ
６及びＩ８で表わされる回折光線の通路内にレンズ及び
開口を置く角度Ｂを通して回折格子５８の周囲の垂直平
面内を回転するアームに取りつけることができる。第２
図に示す具体例におけるように、単一検出系は回転して
、反射光及びすべての回折光の所望の順序を検出し且つ
測定することができる。

他にレンズ、開口及び検出器の組の静置配列は、第２及
び３図の系の双方に対する反射及び回折光の通路と一致
するように予じめ決められた角度で位置されることがで
きる。これらの系の多くの簡単な具体例の場合、静置レ
ンズ、開口及び光検出器の組は、１次、２次又は３次回
折光線の通路に配置することができる。他の適当な検出
器の静置及び可動配列の組合せは同業者には明白であり
、これらの順列及び組合せのすべては本発明の範囲内で
あるこ七が意図される。

光源２０（第２図）及び５２（第３図）は白熱電球又は
太陽光かりのフィルター通過光を含むことのできる好ま
しくは狭い波長帯の光源である。

最も好適な光は平行であり且つ最適には偏光である非常
に狭い波長帯の光である。狭い波長帯の周波数はｌＯ〜
８０ｎｍの範囲内の波長帯の巾を有する２００〜１４０
０ｎｍの範囲内にあってよく、最適にはｌＯ〜２０ｎｍ
又はそれ以下の波長帯中を有する４００〜８００ｎｍの
範囲内にある。光源の出力又は出力工不ルギー値は、０
．１ミリワツト及びそれ以上であってよい。一般に出力
が高ければ結果は良好である。

最適な光源は単色光源例えばレーザーである。

最適な単色光源はヘリウム−ネオンレーザ−、ダイオー
ドレーザ−、ダイオード・ポンブト・ソリッドステー七
・レーザー、アルゴンイオンレーザ−ＹＡＧ、ＹＡＧｆ
７）調波、ルビー、イクサイマー及び調和しうる染料レ
ーザーのようなレーザーである。光は偏光でも偏光でな
くてもよい。入射平面における直線的偏光は最適である
。

光チ！ツバ−２２（第２図）は通常の光チョッパーであ
ってよい。これはプレートの回転軸から一定の距離に、
−様に放射的に間隔を置いた窓を規定する回転プレート
を含んでなってよい。

光線の拡大器（ｅｘｐａｎｄｅｒ）は、光線の断面積を
増大させ、且つ光と相互作用して感度を向上させる回折
格子の表面積を増大させるために光路１９及び５０中に
随時配置することができる。好適な光線拡大器は通常の
レンズ又はプリズム系であって、入射の平行光線を、そ
れより大きい寸法の放射平行光線に転換する。

集光レンズ３４（第２図）及び６６（第３図）は、回折
された光線の各を集め、それを、光検出器３８及び７０
の表面積より小さい断面積を有するより小さい光線に集
中させ或いは焦点を当てさせる。所望の縮小の又は焦点
を当てるためには、通常のレンズ系が使用できる。

光検出器３８及び７０は、入射光の強度を定量的に比例
する具合に電圧又は電流に変えることのできるいずれの
装置であってよい。通常の光検出器−例えば光増巾管或
いは半導体に基づく検出器例えば珪素、ゲルマニウム又
はガリウムーヒ素が使用できる。

増巾器及び記録計の系４０及び７２は光検出器からの入
力シグナルを増巾し、そしてそれと機能的に関連する値
を記録するために通常使用されるいずれの系であっても
よい。簡単な系は各光検出器３８及び７０の出力シグナ
ルの増巾を示すように調節されたバイアス・サプライ（
ｂｉａｓ　　５ａｐｐｌｙ）とオツシロスコープを含ん
でいてよい。更なる増感に対しては、チョッパー（第２
図）又は回転部（第３図）からの参照シグナルを用いる
ロック−イン（１ｏｃｋ　−ｉｎ）増巾器が上述の機能
をなす、これらの増巾器は同業者が完全に熟知する標準
的な市販の系であり、本発明の一部を構成しない。

プラットフォーム６（第１図）は、回折格子を、入射光
線２との正確な配列位置に支持するように設計されてい
る。プラットフォーム６の形は回折表面支持体の形によ
り及び１つよりも多い回折表面が回折表面支持体に取り
つけられるかどうかにより決定される。

第４図は試剤の光妨害しない回折格子図柄を表面上に存
する複数の不溶性支持体が配置された浸漬棒の断面図で
ある。浸漬体１３０はコーティングされたハイブリッド
形成試剤の回折格子図柄をもつ不溶性支持体表面１３４
を複数で有する。浸漬棒が作られる材料は分析過程での
非特異的結合を最小にするために非結合性であるべきで
ある。

適当な浸漬棒表面材料はポリオレフィン例えばポリエチ
レン及びポリプロピレン、親水性ポリ珪素及びポリシロ
キサン重合体などを含む。

回折格子支持体のための支持体は回折格子支持体表面が
取り付けられるいずれの製品であってもよい。この浸漬
棒の記述は例示で示したものであり、限定するものでは
ない。他の製品例えばミクロウェル、プレート、キャビ
ティーなども使用しうる。多くの用途に対して浸漬棒は
好適な具体例である。

第５図は本発明の回折格子要素の１つの具体例を示す。

第５図は１次ハイブリッド形成試剤を、光妨害しない回
折格子図柄で滑らかな表面上に有する不溶性支持体の部
分的拡大断面図である。この具体例の不溶性支持体１４
０は回折グリッド図柄又は模様がコーティングされた滑
らかな上表面１４２を有する。回折格子図柄は薄くコー
ティングされ且つ上表面１４２に付着する光妨害しない
活性な１次ハイブリッド形成試剤の線１４４の複数を含
んでなる。線１４４は光妨害しない不活性化された１次
ハイブリッド形成試剤、例えば、紫外線（Ｕ　Ｖ）照射
、他の不活性化照射、又は他の不活性化エネルギーによ
って不活性化された１次ハイブリッド形成試剤の線１４
６によって分離されている。

格子は回折図柄に、結合した被検体の存在下において入
射光波長を与えるいずれかの数の線１４４を有すること
ができる。線１４４の好適な密度は、６００〜８００ｎ
ｍの波長を有する偏光された単色光に対して線２５０〜
ｔｏ、０００本／ｃｍである。線１４４は好適には０．
５〜２０μ、最適には２〜８μの巾（ａ）を有する。隣
る線１４４の中心間の間隔（ｄ）は好ましくは０．５〜
２０μ、最適には１〜１２μである。線［４４及び１４
６は１次ハイブリッド形成試剤の性質に依存して、いず
れか所望の厚さであってよい。吸着又は他の結合法によ
って表面１４２に付着された核酸シーケンスのコーティ
ングの場合、コーティングの厚さは好ましくは薄いコー
ティングであり、光妨害しない層を生成する。回折格子
図柄の光妨害物質との結合に先立っては、格子図柄は回
折性でなく、即ち光に露呈しても回折は起こらない。活
性な１次ハイブリッド形成試剤１４４が光妨害物質と結
合した場合、格子は回折格子となる。回折された光の部
分はコーティング１４４と結合した光妨害物質の濃度又
は量の関数であり、そしてこの値は被検体の存在を証明
するために及び試料中に存在する被検体の濃度を定量化
するために使用することができる。

不溶性支持体の滑らかな上表面１４２は、１次ハイブリ
ッド形成試剤が物理的又は化学的結合によって付着する
ことができる且つハイブリッド形酸反応の存在及び程度
を決定するために使用する反応を妨害しないいずれかの
材料である。天然及び合成の有機及び無機重合体は不溶
性支持体として使用することができる。適当な重合体の
例は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、
ポリ（４−メチルブチレン）、ブチルゴム、含珪素重合
体、ポリエステル、ポリアミド、セルロース及びセルロ
ース誘導体（例えば酢酸セルロース、ニトロセルロース
など）、アクリレート、メタクリレート、ビニル重合体
（例えばポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビ
ニリデン、ポリ弗化ビニルなど）、ポリスチレン及びス
チレングラフト共重合体、レーヨン、ナイロン、ポリビ
ニルブチレート、ポリホルムアルデヒドなどを含む。不
溶性支持体として使用しうる他の材料は珪素ウェファ、
ガラス、滑らかな不溶性表面上の不溶性蛋白質コーティ
ング、金属、メタロイド、金属酸化物、磁性材料、半導
体デバイスに使用される材料、サーメットなどであって
よい。

本発明の好適な診断用支持体は、１次ハイブリッド形成
試剤及び最終コーティングの非特異的結合を減するため
に適用される蛋白質物質を含めて、核酸シーケンスの物
理的で非共有の結合に対して優れた吸着性を有する。本
発明者は、半導体デバイスの製造に従来使用されている
材料がこの点に関して優れた品質を有することを発見し
た。適当な材料は磨いた単結晶珪素、アルミニウム、エ
ピタキシャル珪素コーティング、窒化珪素コーティング
、二酸化珪素コーティング、及び多珪素コーティングを
含む。最適な表面は多珪素コーティングである。最も最
適な支持体１４０は外側の磨いた表面に多珪素コーティ
ングを有する単結晶珪素ウェファである。

多珪素表面は好ましくは、適当な表面好ましくは高度に
磨いた表面例えば単結晶珪素ウェファ上に付着された多
珪素の薄いフィルムである。珪素の格子構造は免疫試剤
支持体として優れた性質を有する非常に均一な表面を提
供する。多珪素フィルムは有用な誘電材料として半導体
工業で開発されたものである。それはＭＯＳデバイスに
おけるゲーＩ・電極として、高価値レジスターに、浅い
接合を形成する拡散源に、導電体として及び結晶珪素に
対するオーミック接触を保証するために使用される。本
明細書で用いる如き「多珪素（ｐｏｌｙｓｉｌｉｃｏｎ
）　Ｊとは「多結晶珪素」と同義語である。

これらのフィルムは簡便には化学的蒸着技術によって製
造される。これらのフィルム及びその製造法はＡ、Ｃ，
アダムス（Ａ　ｄａｍｓ）、「誘電性及び多珪素フィル
ムの付着」、ブルシ・テクノロジー（ＶＬＳ　ｒ　　Ｔ
ＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）［Ｓ、Ｍ、スゼ（Ｓ　ｚｅ）編］
、マツフグロラーヒル（ＭｓＧｒａｗ−Ｈｉｌ１％Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ）　、９３〜ｌ　２９頁（１９８３年）
及びその引用文献に記述されており、これらの全内容は
本明細書に参考のため引用される。

多珪素がコーティングされた表面は多珪素付着温度で安
定ないずれかの材料であってよい。これはシランを部分
的真空中において６００〜６５０°Ｃで熱分解すること
によって製造することができる。

より反応性の珪素源例えばジシランを用いる場合には、
熱分解温度は低い方が適当である。

１次ハイブリッド形成試剤は、吸着、イオン結合、７ア
デア・ワールス吸着、静電結合、又は他の非共存結合に
よって不溶性の支持体に結合させることができ、或いは
それは共有結合によって不溶性支持体に結合させること
ができる。非共有結合法は米国特許第４．５２８，２６
７号に記述されている。抗体及び高原を不溶性支持体に
共有結合する方法は、チバタ・イチロー　「固体化酵素
」、ハルステッド出版（Ｈａｌｓｔｅｄ　　Ｐ　ｒｅｒ
ｓＳＮ　ｅｗ　　Ｙｏｒｋ）　　（１９７８）及びＡ、
クアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）　、Ｊ　、
バイオ・ケム（Ｂ　ｉｏ、　Ｃｈｅｍ、）２５４．３０
５９　（＋９７０）に記述されており、これらの全開示
は本明細書に参考文献として引用される。

第６図は第５図に示した１次ハイブリッド形成試剤の回
折格子図柄を有する不溶性の支持体の製造法を概略的に
表わす。１次ハイブリッド形成試剤に対して必要な高結
合親和性を有する滑らかな表面を本方法では使用する。

明解な説明の目的で及び限定を意味せずに、本方法を多
珪素コーテイングをもつ磨いた表面を有する半導体ウェ
ファに関して説明する。他の高結合性の滑らかな表面を
用いることによる１次ハイブリッド形成試剤をもつ回折
格子図柄に対しても、同一の、同等の、又は同様の方法
が適用しうろことは理解すべきである。

アルミニウム、窒化珪素、二酸化珪素、単結晶珪素、及
び特に多珪素表面の好適な不溶性支持体を用いれば、１
次ハイブリッド形成試剤は簡単な吸着によって適用する
ことができる。１次ハイブリッド形成試剤の、不溶性支
持体表面への非共有的付着の１つの方法では、１次ハイ
ブリッド形成試剤例えば単一又は二重ストランドＤＮＡ
又はＲＮＡに由来する核酸シーケンスを、水性緩衝溶液
１５２において、支持体例えば多珪素表面１５０に適用
する。１次ハイブリッド形成試剤の緩衝溶液を、多珪素
表面を持つ支持体と共に容器中に入れ、吸着が起こるま
で４〜４０°Ｃ１好ましくは２０〜２６℃の温度に例え
ば０．５〜１８、好ましくは１〜３時間保温する。次い
で多珪素表面を緩衝食塩水で洗い、乾燥する。

１次ハイブリッド形成試剤は、検出すべきシーケンスに
実質的に相補性の又はそれと同族性の少くとも１つの単
一ストランド塩基シーケンスを含有しよう。しかしなが
らそのような塩基のシーケンスは単一の連続ポリヌクレ
オチドセグメントである必要がなくて、非同族性シーケ
ンスが介在する２つ又はそれ以上の個々のセグメントか
らなっていてよい。これらの非同族性シーケンスは線状
であってよく、或いはそれは自互相補性でヘアピン・ル
ープを形成してもよい。更にプローブの同族性領域は、
同族性シーケンスが伝播のために挿入されたベクトルの
ＤＮＡ又はＲＮＡを含んでなるもののような非同族性シ
ーケンスにより３′又は５′−末端において接すること
ができる。そのような非同族性領域は好ましくは最小に
される。

線状又は環状の単一ストランドポリヌクレオチドはプロ
ーブ要素として使用することができ、決定的な同族性セ
グメントが単一ストランド形で且つ試料のＤＮＡ又はＲ
ＮＡとハイブリッド形成しうる形で存在するならば大又
は小部分が相補性ポリスクレオチドストランドと二重に
なる。特に好適には本質的に同族性プローブシーケンス
だけが単一ストランド形で存在する線状又は環状のプロ
ーブであろう。

１次ハイブリッド形成試剤の、緩衝溶液中の濃度は多珪
素表面上に所望の試剤を与えるように選択される。１次
ハイブリッド形成試剤溶液は、ｐＨ６，０〜９．５、好
ましくは７．０〜８．５の緩衝溶液中に１次ハイブリッ
ド形成試剤を０．０２−　］、　００　ｐ　ｇ／　ｍＱ
ｓ好ましくは１０〜５０　ｐｇ／ｍＱで含有しうる。

ハイブリッド形成試剤ＤＮＡグローブは試料中の測定す
べき被検体と選択的に結合するように選択される。多く
のそのようなシーケンスは、アデノウィルス、ＨＣＭＶ
、種々の腫瘍、正常及び異常な遺伝子型（例えば成人又
は胎児のクロモソーム）、組換えＤＮＡ法の細胞生成物
、バクテリア、イースト、枯菌などに対するＤＮＡシー
ケンスを含めて単離されてきた。一般にハイブリッド形
成試剤に分析する試料の被検体と特異的に又は選択的に
結合するように選ばれる。

ハイブリッド形成試剤プローブは天然物質に由来するこ
とができ、或いは同業者には良く知られた且つ本発明の
一部を構成しない常法により合成することができる。一
般にそれらはそれぞれ固相法及び液相法を含むトリエス
テル法及びホスファイト法によって合成することができ
る。適当な方法は、テトラヘドロン・レターズ（Ｔ　ｅ
ｔａｒｈｅｄｒｏｎＬ　ｅｔｔｅｒｓ）、１９７９．３
６３５　；ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎ　ｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａ　ｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　
、８．５４７３．５４９Ｌ　５５０７（１９８０）及び
ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ・シンポジウム・シ
リーズ（Ｎ　ｕｃｌｉｃ　　Ａ　ａｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　５ｅｒｉｅｓ）　
、７．２８１（１９８０）に記述されている。

ヌクレオチド・プローブは、ハイブリッド形成試剤の滑
らかな表面１５０への結合を容易にする適当な連結基に
結合せしめうるポリアデニン、ポリシトシン、又はアデ
ニン−シトシン共重合体テ−ルを用いて製造することが
できる。

別の方法において、その連結基はアリールアミン連結ア
ームを通してウリジントリホスフェートのピリミジン塩
基に連結することができ、そして生成物はＰ、ランガー
（Ｉ、　Ｂｎｇｅｒ）ら、バイオケミ　ス　ト　リ　−
（Ｂ　　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　、　　１４　、
　２４４７〜２４５７　（１９７５）の改変された方法
に従い、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼを試験管内で用
いるプローブ合成に対して基質として使用することカー
できる。５−（３−アミン）アリールウリジン及びデオ
キシウリジン５′−トリホスフェートはパラジウム触媒
の存在下におけるオレフィンとの反応によって製造され
る。

１次ハイブリッド形成試剤のコーティング１５６を有す
る表面１５０を、続いて脱イオン水でゆすぎ、乾燥する
。

マスクは半導体製造に通常の写真法で製造される。例え
ば所望の線密度及び線巾を有する複数の回折格子模様を
もつマスクは、写真に同様のフォトレジスト法により石
英ガラス又は他のＵＶに透明な板上で製造することがで
きる。マスクの黒線は最終表面上に期待する活性な１次
ハイブリッド形成試剤に相当する。

第６図の工程Ｃにおいてシャドーマスク１５８は、通常
の投写配列技術を用いることにより、１次ハイブリッド
形成試剤のコーティング１５６を有する表面１５０上に
線の正確な影を投写するために表面１５０から予じめ決
められた距離に位置させる。水銀−キセノン照射機１６
１は強力で均一なＵＶ平行光線をフォトマスク１５８上
に照射する。フォトマスク１５ｇは表面１５６からの所
望の距離にマスク・ホルダー１５９によって機械的に保
持されて、正確な像をコーティング表面上に接触させな
いで投影する。近接のギャップ１６２はコーティング表
面から５〜２０μの範囲であってよい。

上記操作における投影配列装置及び投影法は同業者の良
く知るところであり、本発明の一部を構成しない。オリ
エル（ＯＲＩ　Ｅ　Ｌ”）写真石版法の照射機及びその
付属品［オリニル社（ＯｒｔｅｌＣｏｒｐ、、　５ｔｒ
ａｔｆｏｒｄ、　ＣＴ）　］はこの目的に適当である。

この方法において、コーティング１５６のマスク１５８
との接触は完全に回避され、この決定的な特徴が本発明
の優れた回折グリッドを提供する。

表面は照射に露呈された１次ハイブリッド形成試剤部分
のハイブリッド形成能力が実質的に減ぜられ、又は好ま
しくは除去されるまで正確に焦点のあった紫外線照射に
露呈される。正確な格子図柄を製造するために、照射は
コーティング表面上に鋭い像を形成すべきである。

露呈したコーティングを不活性化させるのに必要とされ
る紫外線の照射量は１次ハイブリッド形成試剤に依存す
る。核酸シーケンス試剤の場合、波長例えば２６０ｎｍ
及び出力８〜２０ミリワツト／ｃｍ”の紫外線照射に対
して５〜６０分、好ましくは１０〜３０分の露呈時間で
十分である。

この処理は線１４６中の核酸シーケンスのハイブリッド
形成性を減じ又は除去し、活性な核酸シーケンスを第５
図の線１４４として回折格子図柄に残こす。

次いで核酸シーケンスを回折格子図柄を有する領域を含
むコーティングされた基材を、より小面積のチップ１６
０に切断する。但し各チップは核酸シーケンス・ハイブ
リッド形成分析を行なうのに十分な寸法を有するものと
する。次いでこれらのチップを適当な診断用支持体例え
ば第４図に示す浸漬棒」ことり付け、ハイブリッド形成
分析に使用する。

多くの目的ｌこ対して、ハイブリッド形成は水溶液中で
又はホルムアルデヒドの存在下に行なうことができる。

ホルムアルデヒドは昇温度がプローブを劣化させる場合
に好適である。ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、及び
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成はホルムアミド中で行
なうことができるが、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成
だけは水溶液中で行なうべきである。担体ＤＮＡ　（例
えば牛の胸腺又は鮭の精子からの変性ＤＮＡ）がハイブ
リッド形成溶液中に含有される。ハイブリッド形成法は
同業者の良く知るところであり、例えば本明細書に参考
文献として引用されるマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｊａｒ　　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）　Ｊ　　（１９８２）　、コールド・スプ
リング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｎｇ　　Ｈ
ａｂｏｒ）研究所（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｂｏｒ、　ＮＹ）に記述されている。

ハイブリッド形成後、洗浄を行なってハイブリッドを形
成してない被検体を除去し、そして不安定なハイブリッ
ドを解離させる。

本発明の改良されたバイオグリッド生成物は光回折を用
いる分析法において改良された感度を提供する。１つの
そのような方法は、ハイブリッド形成試剤の生物学的回
折格子図柄又は模様をもつ不溶性支持体を、ハイブリッ
ド形成試剤と特異的にハイブリッド形成する被検体に関
して分析すべき試料と接触させる第１の工程を含んでな
る不溶性支持体はハイブリッド形成試剤及び被検体の結
合をさせるのに十分な時間試料と接触せしめられる。次
いで試料を適当なゆすぎ緩衝液で不活性支持体から除去
する。この工程は被検体と結合したハイブリッド形成試
剤の回折格子を残す。

光妨害格子は多くの被検体を用いて直接生成される。ハ
イブリッド形成試謂及び被検体の結合はハイブリッド形
成試剤図柄を回折格子に転化する。

ＤＮＡＸＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの核
酸シーケンス、或いは細胞又は組織試料は回折格子模様
で不溶性支持体にハイブリッド形成し且つ付着し、そし
て表面を照射する光が回折される。

ハイブリッド形成試剤−被検体結合生成物が光妨害性で
ないならば、第２工程はハイブリッド形成試剤−被検体
結合生成物と連携して光妨害となる２次結合剤と不溶性
支持体を結合させることを含んでなる。２次結合試剤は
、吸収、反射、散乱、屈折又は相変化によって光妨害グ
リッド模様を生成する結合した物体を増加させる１つ又
はそれ以上の物質で標識されていてよい。特別な標識は
発色団及び他の吸光物質、並びに反射及び光透過性ビー
ズ及び他の光反射及び散乱物質を含む。他にハイブリッ
ド形成試剤−被検体結合生成物又は２次結合試剤は標識
された或いは発色団又は吸光材料で標識された結合剤パ
ートナ−と特異的に結合しうる２次ハイブリッド形成試
剤と結合させることができる。この別の結合は第２工程
における２次結合試剤処理中に又はこれに続いて行なう
ことができる。更に他の具体例において、２次結合試剤
はそれ自体光妨害性でないが、ハイブリッド形成試剤−
被検体−２次結合試剤単位が光妨害物質として働く。

２次結合試剤の選択は分析すべき被検体の種類に依存し
て行なわれる。一般に２次結合試剤は標識の結合した核
酸シーケンスである。また２次結合試剤は被検体と或い
は１次ハイブリッド形成試剤及び被検体のハイブリッド
形成によって生成した２重ストランドのハイブリッド形
成生成物と特異的に結合する選択された種類の抗体であ
ってもよい。

適当な発色団標識は光源の出す波長の光を吸収するいず
れかの吸光顔料又は染料である。ハイブリッド形成試剤
−被検体結合生成物のそのような発色団との結合は光回
折図柄を回折格子に転化する。他に吸光標識は他の種類
の光妨害粒子又は反射物質例えばコロイド状の金又は銀
、或いはラテックスのミクロスフイアであってよい。

本発明の改良されたバイオグリッドを用いることにより
増大した感度を有する別法において、２次結合パートナ
ー標識は適当な光妨害物質で標識された３次結合試剤と
特異的に結合する。いずれかのパートナ−が２次結合パ
ートナー標識として使用しうる結合対の例はアビジン−
ビオチン、ＩｇＧ抗体−蛋白質Ａ１ハプテン−抗ハプテ
ン抗体、などである。２次結合試剤がＩｇＧ抗体である
ならば、例えばそれはそのＦｃ鎖部分が蛋白質Ａ又は抗
１ｇＧ抗体に対する結合パートナ−であるから標識化で
きない。

生物学的回折図柄の回折格子への転化後、不溶性支持体
を蒸留水又は脱イオン水でゆすぐ。次いで第１図に示す
ような適当な光回折装置を用いて光回折の強度を測定す
る。回折した光の相対強度は格子を含んでなる１次ハイ
ブリッド形成試剤−被検体抱合体の量の関数である。あ
る範囲の異なる既知の被検体濃度の予じめ調製しＩ；一
連の溶液を用いて上記工程を繰返すことにより、回折光
の強度と機能的に関連する標識曲線が得られる。被検体
を含む試料について得られた読みを、既知の濃度の被検
体を含む溶液で得られた曲線と比較することにより、試
料中の被検体の濃度が決定できる。１次、２次、３次回
折などの強度を相互に及び反射光の強度と比較すること
により、格子ハイブリッド形成試剤との結合程度の指標
が直接得られる。

本発明の改良されたバイオグリッドを用いる競争分析別
法において、ハイブリッド形成試剤の生物学的回折格子
図柄を有する不溶性支持体は、被検体試料と光妨害性の
標識で標識された試剤被検体の混合物と接触させること
ができる。１次ハイブリッド形成試剤とハイブリッド形
成する試剤被検体の量は試料中の被検体の量の逆関数で
あるであろう。生成する回折格子の密度は結果として試
料中の被検体の濃度との機能機関数を有するであろうし
、この相違は回折光の強度において検出することができ
る。

次の特別な非限定的実施例は本発明を更に例示する。特
に断らない限りパーセントは重量％であり、温度は℃で
ある。実験室で行なった実験は過去時制で示し、そして
実施に移せると思われる方法を示す実施例は現在時制で
示す。

実施例Ｉ 単一ストランド・プローブの調製 ｐＢＲ３２２プラスミドをヒンドセ■レストリクジョン
（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）・酵素で処理し、フェノー
ルとクロロホルムの混合物で処理して、所望の分子量２
．ＯＫｂを有するｐＢＲ３２２二重ストランドＤＮＡフ
ラグメントを得る。このｐＢＲ３２２フラグメントを、
０．００１Ｍ　　ＥＤＴＡを含むトリス緩衝液（０−０
１Ｍ、ｐＨ８，０）に最終濃度０．５μｇ／Ｑまで溶解
する。この溶液を５分間沸とう（１００℃）するまで加
熱し、そして水浴中で迅速に冷却して単一ストランドｐ
Ｂ　Ｒ３２２ＤＮＡを調製する。

実施例２ ＤＮＡグローブのコーティングされたウェファ実施例Ｉ
からの単一ストランドｐＢＲ３２２ＤＮＡを含む溶液に
多珪素ウェファを浸す。コーティングを冷蔵庫内で終夜
進行させる。

鮭の精子ＤＮＡを脱イオン水に溶解し、ｌｏ。

°Ｃで５分間沸とうさせることにより変性し、次いで水
浴中で迅速に冷却して担体ＤＮＡ溶液を得る。

多珪素ウェファをコーティング溶液から取出し、担体Ｄ
ＮＡ溶液に２時間浸す。次いでウェファを担体溶液から
取出し、脱イオン水でゆすぎ、乾燥する。

実施例３ 回折格子図柄 最終のバイオ格子製品に寸法及び形が対応する一連の四
角い且つ線間隔ｌＯμ、線巾５μ、及び線密度１０００
本／ｃｍの回折格子線を有するマスクを、マスク配置固
定具を用いて、実施例１の方法により調製した単一スト
ランドｐＢＲ３２２ＤＮＡのコーティングされたウェフ
ァから５μ離して配置する。このマスクの表面を２６０
ｎｍの波長の紫外線に３０分間露呈する。

次いでウェファを、活性な単一ストランドｐＢＲ３２２
ＤＮＡの線の回折模様を有する四角いチップに切断し、
浸漬棒の取付は凹み部に取付ける。

実施例４ ハイブリッド形成によるｐＢ　Ｒ３２２に対する回折分
析 二重ストランドＩ）ＢＲ３２２ＤＮＡ７ラグメントを、
ＳＳＣ（３，０ＭＮａ、Ｃ１２，０，３Ｍクエン酸三ナ
トリウム、ｐＨ７，０）、ホルムアミド（シグマ）、デ
ンハルト（Ｄ　ｅｎｈａｌｄＬ）溶液［ポリビニルピロ
リドンはい３８０．　　フィコール（Ｆｉｃｏｌυ５０
０（７アーマシア・ファイン・ケミカルズ社（Ｐ　ｈａ
ｒｍａｃｉａ　　Ｆ　ｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、
　　Ｉ　ｎｃ、））、及び牛の血清アルブミンのそれぞ
れ１．Ｏｗ／ｖ］、２０％ドデシル硫酸ナトリウム、鮭
の精子担体ＤＮＡ、及び脱イオン水の混合物（２ｏ：５
０：１０　：　２−５＋　２−５　：　ｌ　Ｏｓ　ｖ／
ｖ）に溶解する。この溶液を１００°Ｃで５分間沸とう
させ、そして氷浴中で迅速に冷却する。この溶液を実施
例２の浸漬棒に適用し、室温に２時間保温する。保温後
、浸漬棒上のバイオ格子を蒸留水で完全にゆすぐ。

次いでヘリウム−ネオンレーザ−からの６３２゜３ｎｍ
の波長を有する偏光単色光を用いて、格子により回折さ
れた光の強度を測定する。

実施例５ サルモネラの決定 本明細書に参考文献して引用される米国特許第４．６８
９．２９５号の方法により、サルモネラＤＮＡプローブ
の試料を得る。単一ストランド・プローブを、実施例２
及び３の方法に従い、珪素ウェファ上に固体化する。次
いでバクテリヤＤＮＡを導入し、ハイブリッド形成を２
〜３時間進行させる。この培養後、バイオ格子を蒸留水
で完全にゆすぎ、そして格子によって回折された光の強
度を、ヘリウム−ネオンレーザ−からの波長６３２゜３
ｎｍの偏光単色光を用いて測定する。

この工程を、既知量のサルモネラＤＮＡを含む一連の陽
性対照物に関して繰返して参照基準を確立し、これと未
知試料で得られた回折光の強度を比較する。

実施例６ ＨＣＭＶグローブの製造 人間のサイトガロウィルス（ＨＣＭＶ）種ＡＤ１６９　
［タマシャイア（Ｔ　ａｍａｓｈｉｒｅ）ら、Ｊ、パイ
ロル（Ｖｉｒｏｌ、）　、５４７〜５５６　（１９８２
）；チョウ（Ｃｈｏｕ）及びメリガン（Ｍｅｒｉｇａｎ
）、ニュー・イングーＪ、メト（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇ、　
Ｊ、　Ｍｅｄ、）、３０８．９２１　（１９８３）］か
らのエコＲＩ　（ＥｃｏＲＩ）レストリクジョン・エン
ドヌクレアーゼの７ラグメント０をｐＢＲ３２２誘導体
ｐＡｃＹｃ１８４中にクローンし、これを用いてタマシ
ャイアらの記述するように大腸菌種ＨＢ１０１　Ｒｅｃ
Ａヲトランスフエクションする。挿入物を担うｐＡｃＹ
ｃ１８４において伝播及び精製後、プラスミドをレスト
リクジョン・エンドヌクレアーゼ・エコＲ１で消化し、
モしてＨＣＭＷの６．８ＫｂＯフラグメントを、標準的
な方法［マニアチス（Ｍ　ａｎ　ｉａｔ　ｉｓ）ら、分
子クローニング、コールド・スプリング・バーバー研究
所（１９８２）］を用い６０．８％アガロース・ゲルで
の合成的電気泳動により精製する。二重ストランドＯフ
ラグメントを脱イオン水に溶解し、そして１００°Ｃで
５分間変性し、次いで水浴中で迅速に冷却して単一スト
ランドＤＮＡを製造する。

実施例７ 尿中のＨＣＭＷの検出 実施例２及び３の方法により、実施例１のＤＮＡプロー
ブの代りに実施例６のＨＣＭＷプローブを用いてバイオ
格子を調製する。

試験すべき臨床の尿試料を、チョウ及びメリガンにニュ
ー・イング・Ｊ、メト、３０８．９２１（１９８２））
の記述するものと同様の方法で調製する。試料の清澄及
びＨＣＭＶファージ粒子の遠心分離による濃縮後、これ
をＱ、５ＭＮａＯＨの最小容量に再懸濁させ、１５分間
放置する。５ＳＣ１ホルムアミド、デンハルト溶液、２
０％５ＤＳ１担体ＤＮＡ、及び脱イオン水（２０：５０
：１０　：　２．５　：　２．５　：　１０、ｖ／ｖ）
での中和後、溶液を実施例２の浸漬棒生成物に適用し、
室温に２〜３時間保温する。保温後、浸漬棒上の生体格
子を蒸留水で完全にゆすぐ。

次いで格子によって回折された光の強度を、へ１゛リウ
ムーネオンレーザーからの波長６３２．８ｎｍの偏光単
色光を用いて測定する。

この工程を、既知量のＨＣＭＶ試料を含む一連の陽性対
照物に関して繰返して参照基準を確立し、これと患者の
血清試料で得られた回折光の強度を比較する。

本発明の特徴及び態様は以下の通りである＝１、活性な
ハイブリッド形成試剤の線の生物学的回折格子図柄を表
面上に有する滑らかな表面を含んでなる光回折分析に用
いるためのバイオ格子。

２、ハイブリッド形成試剤がヌクレオチド・シーケンス
である上記ｌのバイオ格子。

３、滑らかな表面が単結晶珪素、アルミニウム、エピタ
キシャル珪素コーティング、窒化珪素コーティング、二
酸化珪素コーティング、及び多珪素コーティングからな
る群から選択される上記ｌのバイオ格子。

４．滑らかな表面が多珪素及び単結晶珪素表面からなる
群から選択される上記３のバイオ格子。

５、活性なハイブリッド形成試剤の線の生物学的回折格
子図柄が実質的に非光妨害性である上記１のバイオ格子
。

６、線の生物学的回折格子図柄がハイブリッド形成した
被検体の存在下に光妨害性になる上記ｌの方法。

７、ハイブリッド形成試剤の均一な層を平滑な固体の表
面上に付着させ、そしてこの表面を、回折格子線を有す
るシャドウマスクを通してＵＶ照射に露呈して、ハイブ
リッド形成試剤を選択的に不活性化し且つ活性なハイブ
リッド形成試剤の線の生物学的回折格子図柄を残すこと
を含んでなる上記ｌのバイオ格子の製造法。

８、（ａ）ハイブリッド形成試剤の均一な層を滑かな固
体表面上に付着させ；そして （ｂ）この表面を回折格子線のシャドウマスクを通して
ＵＶ照射に露呈して、活性なハイブリッド形成試剤の線
の生物学的回折格子図柄を残す、 を含んでなる光回折分析に用いるためのバイオ格子の製
造法。

９、ハイブリッド形成試剤がヌクレオチド・シーケンス
である上記８のバイオ格子。

ｌＯ１滑らかな表面が単結晶珪素、アルミニウム、エピ
タキシャル珪素コーティング、窒化珪素コーティング、
二酸化珪素コーティング、及び多珪素コーティングから
なる群から選択される上記８のバイオ格子。

１１、滑らかな表面が多珪素及び単結晶珪素表面からな
る群から選択される上記１０のバイオ格子。

１２、活性なハイブリッド形成試剤の線の生物学的回折
格子図柄が実質的に非光妨害性である上記８のバイオ格
子。

１３、線の生物学的回折格子図柄がハイブリッド形成し
た被検体の存在下に光妨害性になる上記８の方法。

１４、ハイブリッド形成試剤の均一な贋を平滑な固体の
表面上に付着させ、そしてこの表面を、回折格子線を有
するシャドウマスクを通してＵＶ照射に露呈して、ハイ
ブリッド形成試剤を選択的に不活性化し且つ活性なノ１
イブリッド形成試剤の線の生物学的回折格子図柄を残す
ことを含んでなる上記８のバイオ格子の製造法。

１５、（ａ）回折ハイブリッド形成分析表面を、ハイブ
リッド形成試剤及び被検体の結合を可能にするのに十分
な時間試料と接触させ、但し該回折ハイブリッド形成分
析表面が、実質的に光妨害しないハイブリッド形成試剤
の光散乱図柄を該表面上に有し、該ハイブリッド形成試
剤を被検体と選択的にハイブリッド形成するように選択
し；及び （ｂ）回折ハイブリッド成形分析表面に、光源からの光
を照射し、そして回折ハイブリッド形成分析表面によっ
て回折された光を決定する、 水性試料中の被検体ヌクレオチド・シーケンスの存在又
は量を決定するための回折ハイブリッド形成分析法。

１６、被検体ヌクレオチド・シーケンスが体組織に由来
する上記１５の回折／％イブリッド形成分析法。

１７、被検体ヌクレオチド・シーケンスが体液中に依存
する上記１５の回折ハイブリッド形成分析法。

１８、被検体ヌクレオチド・シーケンスが尿、血清、血
漿、ミルク、骨髄液、粘液、又は唾液中に存在する上記
１７の回折ハイブリッド形成分析法。

１９、被検体ヌクレオチド・シーケンスがバクテリヤ、
ウィルス、菌、藻、動物又は植物の細胞中に存在する上
記１７の回折ハイブリッド形成分析法。

２０、被検体が胎児の細胞、成人の細胞、バクテリア、
ウィルス、マイコプラズマテール、胞子、藻、寄生体、
又はイースト菌に起源するヌクレオチド・シーケンスで
ある上記１５の回折ハイブリッド形成分析法。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法における入射及び回折光のデザイ
ンの概略図であり； 第２図は本発明の回折分析装置の静置プラットフォーム
の具体例の概略図であり； 第３図は本発明の回折分析装置の回転プラットフォーム
の具体例の概略図であり； 第４図は核酸シーケンス試剤の回折格子図柄を有する複
数の不溶性支持体が配置された浸漬棒の断面図であり； 第５図は核酸シーケンス・ハイブリッド形成試剤を表面
上に回折格子図柄で有する不溶性支持体の部分的拡大図
であり；そして 第６図は第４図の回折格子図柄を有する不溶性支持体の
製造法の概略的表示である。 ＦＩＧ、−２ ＦＩＧ、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、活性なハイブリッド形成試剤の線の生物学的回折格
   子図柄を表面上に有する滑らかな表面を含んでなる光回
   折分析に用いるためのバイオ格子。 ２、ハイブリッド形成試剤の均一な層を平滑な固体の表
   面上に付着させ、そしてこの表面を、回折格子線を有す
   るシャドウマスクを通してＵＶ照射に露呈して、ハイブ
   リッド形成試剤を選択的に不活性化し且つ活性なハイブ
   リッド形成試剤の線の生物学的回折格子図柄を残すこと
   を含んでなる特許請求の範囲第１項記載のバイオ格子の
   製造法。 ３、（ａ）ハイブリッド形成試剤の均一な層を滑かな固
   体表面上に付着させ；そして （ｂ）この表面を回折格子線のシャドウマスクを通して
   ＵＶ照射に露呈して、活性なハイブリッド形成試剤の線
   の生物学的回折格子図柄を残す、 を含んでなる光回折分析に用いるためのバイオ格子の製
   造法。 ４、ハイブリッド形成試剤の均一な層を平滑な固体の一
   表面上に付着させ、そしてこの表面を、回折格子線を有
   するシャドウマスクを通してＵＶ照射に露呈して、ハイ
   ブリッド形成試剤を選択的に不活性化し且つ活性なハイ
   ブリッド形成試剤の線の生物学的回折格子図柄を残すこ
   とを含んでなる特許請求の範囲第３項記載のバイオ格子
   の製造法。 ５、（ａ）回折ハイブリッド形成分析表面を、ハイブリ
   ッド形成試剤及び被検体の結合を可能にするのに十分な
   時間試料と接触させ、但し該回折ハイブリッド形成分析
   表面が、実質的に光妨害しないハイブリッド形成試剤の
   光散乱図柄を該表面上に有し、該ハイブリッド形成試剤
   を被検体と選択的にハイブリッド形成するように選択し
   ；及び （ｂ）回折ハイブリッド成形分析表面に、光源からの光
   を照射し、そして回折ハイブリッド形成分析表面によっ
   て回折された光を決定する、 水性試料中の被検体ヌクレオチド・シーケンスの存在又
   は量を決定するための回折ハイブリッド形成分析法。