JPH0212063A - 肺腺癌抗原の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト肺腺癌の臨床診断に適用できる＆１ｉ腺
癌抗原の定量法を提供する。

従来の技術 抗ヒト肺繍平」二皮癌モノクロー°ナル抗体ＳＬＣ−４
５４は、本発明者が作製したモノクローナル抗体Ｃ１こ
れを用いる肺癌の陽性率は、２５％で肺腺癌の陽性率は
３０％である（特開昭６３−１９５（ｉｌ）。

発明が解決し、ようとする課題 ＳＬＣ−４５４を用いる肺腺癌の血清診断は、現状にＢ
いて臨床的価値は大きいが、必ずしも肺腺癌特異的とは
いえず、特に肺などの良性疾患での偽陽性率が高いため
、さらに肺腺癌に特Ｗ性の１：５い＋Ｉｉｔ　／＋１診
断法が要望されている。

課題を解決するための手段 本発明者は、抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体Δし、Ｃ
−１’ｌＧ４を第一抗体とし２、酵素あるいは放射線線
、！ｉｌ＆　した抗ヒトＩ）Ｉｉ　Ｑ　承−Ｌ皮癌モノ
クローナル抗体ＳＬＣ−４５４を第二抗体とするサンド
イッチ方式の免疫測定法によれば、ル１７１１！ｉ！癌
に特異性の高い血清診断を行うことができることを見い
出し本発明を完成するに至った。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明によれば、抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体Ａ　
Ｌ　Ｃ−８６４を第一抗体とし、これを固相化し、これ
にヒト血ｌＯ検体を反応させて肺腺癌抗原を結合させ、
ついで酵素標識あるいは放射線標識した抗ヒト肺扁平」
−皮癌千ノクローナル抗体Ｓ＋、Ｃ４５４を第二抗体と
して前記第一抗体に結合した肺腺癌抗原に結合させ、結
合した第二抗体の量を標識した酵素の活性あるいは放射
能を測定することにより血清検体中の肺腺癌抗原を定Ｍ
することができる。

ＳＬＣ−４５４は、本発明者らが先に特開昭６３−１．
９５６１で開示したモノクローナル抗体であり、該モノ
クローナル抗体産生渣を有するバイブリド−７株Ｓし、
Ｃ−４５４（以下ＳＬＣ−４５４株という）を用いてｒ
！Ａ造できる。Ｓｔ、Ｃ−４５４株は、Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ＾ｎ１ｌｌａｌＣｅｌ
ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅにＥＣＡＣＣ８６０７０３０６とし
て寄託しである。

△ＬＣ−８６４は、次の通りにして製造することができ
る。

（１）動物の免疫と抗体産生細１１？！１の調製３〜１
０週令、望ましくは８週令のマウスに、肺腺癌患者真水
の高分子分画を免疫して、その動物の牌、リンパ節、末
梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマウスはヒ
ト正常肺細胞で１１１１処理して免疫寛容にしたマウス
を用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下ある
いは静脈内あるいは腹腔内に、適当ｔエアシュバント〔
例えば、７０インドの完全アジユバント（Ｃｏｍｐｌｅ
ｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ＡｄｊｕｖａｎＬ）または、
水酸化アルミニウドゲルと釘日咳閑ワクチンなど〕とと
もにヒト肺腺癌患者真水の高分子分画（１０〜５００爬
／匹）を投与する。以後、１〜２週問おき１と抗原を２
〜５回投与する。各免疫後３〜７０目に眼底静脈叢より
採血し、その血清がヒト肺腺癌と反応することを以下に
示す酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：
医学書院刊１９７６年］などで調べる。

酵素免疫測定法： ９６穴のＥ　Ｉ　Ａ用プレート〔フロー・ラボラトリー
ズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕に、
正常あるいは腫瘍細胞９組織の膜成分（蛋白量としてｌ
Ｏ〜１，０００μｇ　／ａｌｌ含をする膜断片）を１０
０〜２００μｍ／穴ずつ分注し、４ｔでｌ〜２晩放圃し
て、上清を抜き去った後、レジン水あるいは、ＰＢＳ　
（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸−カリウム０
．２１ｇ、食塩？、０５ｇ。

蒸溜水１ｊ’、ｐＨ７，２）でよく洗浄後、１％口Ｓ＾
（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ溶液（ＩＩＳ＾−Ｐ
ｕｓ）を１００〜２００μｍ／穴分注し、４℃でｌ〜２
晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基を
ブロック（プロフキング）した。

その後、ｌ３ＳＡ−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰ
［３Ｓでよく洗浄した後、第一抗体として、ＢＳＡ−ｒ
’１３ｓで希釈した試料（マウス血清。

バイブリド−７培養上清、精製モノクローナル抗体）を
１００μｌ／穴分注し、４ｔで１晩放置する。レジン水
で１回、２Ｍ　　ＮａＣｊ！溶液で６回洗浄した後、第
二抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリン［ｇＧ
−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ｉ）ＡＫＯ）社製、
販売元協和メデックス〕の１００倍希釈液を１００ｍ／
穴分注し、室温で２時間放置する。

ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液〔２゜２′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）ニアンモニウム５５０１１ｇを０．１Ｍクエンｌ’ｉ
ｉ２緩衝液（ｐＨ４，２＞１１に溶かした溶液に、使用
直前に過酸化水素１　ｄ／ｍｌを加えた溶液〕を用い、
発色をＯＤ　ｓ　＋　Ｓｎ＊の吸光度で測定する。この
とき、肺腺癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に対し
て強く反応するマウスをヒト肺腺癌免疫マウスとしてバ
イブリド−７作製のための抗体産生細胞の供給源として
用いる。

酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　
３０７２プレート中で、標的細胞を培養し、０．２５％
ゲルタールアルデヒド−ＰＢＳを加え、室温に１〜２時
間放置し、　ＰＢＳでよく洗浄後、１％ＢＳΔ−ＰＢＳ
１００〜２１）０μｇを加え、２時間放置し、レジン水
または、　ｌ’ｆｌｓでよく洗浄し、そのプレートを用
いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同様の方
法にて、抗体価の測定を行った。

細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒ）　Ｉ）Ｉｉ　Ｉｌｌｌｌ癌患者胸
高分子分画１０〜４００μｇ／匹を腹腔内に投与し、Ｉ
ＩＱ！臓細胞全細胞し、肺細胞を調製する。

ｆｆ１ｔｌ臓をＭＥＭ　（日永製薬社製）中で細断し、
ビンセットでほぐし、ｌ　２０　Ｏｒｐｍ、５分間遠心
分離し、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩ｌｊ
ｉ液（ｐＨ７，（ｉ５）で１〜２分間処理し赤血球を除
去し、Ｍ　Ｅ　Ｍで３回洗浄して融合用１庫細胞として
提供する。

免疫原として用いる肺腺癌患者真水の高分子分画の調製
は以下の通り行う。

すなわち−８０℃に保存しておいた肺腺癌忠者胸水を融
解後、３．００　Ｏｒｐｍ、　１０分間遠心分離し、固
形分を除いた上清をセルロファインＧＣＬ−２０００Ｓ
Ｆ　（生化学工業社Ｉ！ＪＪ、）カラムに通塔し、分子
ｍ　＋、ｏｏｏ、ｏｏｏ以上の高分子画分を集め、肺腺
癌患者真水の高分子分画とする。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨Ｍｉｌｌ細胞としては、マウスから得られた株化細胞
を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（
ＢＡＬＢ／ｃ山来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３八ｇ８−
Ｕｌ　　（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン
・ミクロバイオロジイ・アンド帝イムノロシイ−１（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　線量　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　−１）］〔ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブーイ１２ノロジ４　（ｆ
ｌｔｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
　６　、　５１１−５１９（１９７６）］　、ＳＰ２１
０−Ａｇ　１４　（ＳＰ−２）〔ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２７６、２６９−２７０　（１９７８））、Ｐ　
３−Ｘ　６３−Ａ　ｇ８６５３　（６５３）　Ｃ’）＋
−ｆ−ル・オブ・イムノロジ４　　（Ｊ、１ｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）　１２３．１５４８−１５５０　（１９７９
）　］　、Ｐ　３−Ｘ　６３−Δｇ８（Ｘ６３）　〔ネ
イチャー　　（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６．４９５−４９
７（１９７５）］などが用いられる。これらの細胞株は
、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６／ｌｏ培地に
グルタミン（１，５ｍＭ）、２メルカプトエタノール（
５Ｘ１０−’Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｌｌ
１）および牛胎児血清（Ｆ’Ｃ３）（Ｃ５Ｌ社製、１０
％）を加えた正常培地に、さらに８−アブグアニン（１
５μｓ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合
の３−４日前に正常培地に継代し、融合当日２Ｘ１０’
以上の細胞数を確保する。

（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜ＩＯ：ｌになるよ
う混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、　　５分）し
た後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、
撹拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−
１，０００（Ｉ’ＥＧ−１，０００）２　ｇ、ＭＥＭ２
ｍｉおよびジメチルスルホキシド０．７０１１の混液０
．２〜１ｍｌ／　Ｉ　Ｏ’抗体産生細胞を加え、１〜２
分間毎にＭＥＭ１〜２１を数回加えた後、ＭＥＭを加え
て全量が５０１になるようにする。遠心分離（９００ｒ
ρｍ、５分）後、上清を橋で、ゆるやかに細胞をほぐし
た後、正常培地（Ｆｅ２　１０％を含むＲＰＭＩ−１６
４０培地）１００＋ｎｌを加え、メスピペットによる吸
込み、吹出しでゆるやかに細胞を懸濁する。

この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００〃／穴ずつ
分注し、５％ＣＯ□インキュベーター中、３７℃で２４
時間培養する。培養プレートに１ｏｏＡＬＩ／穴のＨＡ
　Ｔ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）、
チミジン（１，５Ｘ１０−’Ｍ）およびアミノブチリ７
（４Ｘ１０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え、さらに２４
時間培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１
ｏｏｕ１をゆで、新たに同ｍのＨＡＴ培地を加え、５％
ＣＯｔインキュベーター中、３７℃でｌＯ〜１４日間培
養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清１００ノｔＱを捨て、ｏ　′ｒ　Ｊｒ’；地
（１）Δ１゛培地からアミノプテリンを除いた培地）を
同量加え、以後２日間２４時間毎にト１′Ｆ培地への変
換を行う。

ＩＩＴ培地で３〜４目間培養後、培養上清の一部をとり
上記の酵素免疫測定法又は、免疫組織学的判定法（ＡＢ
Ｃ法）（酵素抗体法、学際企画刊、１０６頁、１９８５
年）により、ヒト肺腺癌に対する抗体価を測定する。こ
のとき、同様の方法で、ヒト正常細胞、組織あるいはそ
の膜成分、などとの反応性も測定し１、ヒト肺腺癌細胞
１組織あるいはその膜成分に特異的に反応するものを選
択する。ヒト肺腺癌細胞１組織あるいはその膜成分に強
く反応し、ヒト正常細胞。

組織あるいはその膜成分などに反応しない穴について、
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し、安定し
てヒト肺腺癌細胞１組織あるいはその膜成分に強い抗体
価の認められたものを抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株として選択する。該ハイプリドー
マ株の具体例としては、ハイプリドーマ株へＬＣ８６４
（以下ＡＬＣ−８６４株という）があげられる。

ΔＬＣ−８６１１株は昭和６３年３月９日付で工業技術
院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＢ　Ｐ　−１７８３
として寄託しである。

（４）　　単クローン性抗体の調製 ブリスタン処理〔２゜６．　１０．　１４−ブトラメチ
ルベンタデカン　（Ｉ’ｒｉｓＬａｎｅ）　０．５　ｍ
ｌを１復腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜ＩＯ週
令のＢΔＬＢ／ｃｆｌマウスに、（３）で得られたΔＬ
Ｃ−８６４株細胞２〜４　Ｘ　１０’細胞／匹を腹腔内
注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化す
る。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，００
Ｏｒρｍ、　　５分）して固形分を除去後、５０％φ酸
アンモニウムにて塩析し、０．０４　Ｍリン酸緩衝液（
ｐ　Ｈ８，０，０，０３Ｍ　　ＮａＣｊ！を含む）で透
析後、Ｄ　Ｅ　５２　（Ｗｈａｔａ＋ａｎ社製；ベット
ポリコーム５０ｏ＋Ｉ）のカラムに流速２０〜３０１１
１１／時で通塔し、ＩｇＧ画分を集め、精製モノタロ・
−ナル抗体ＡＬＣ−８（ｉ４とする。

抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｈｔ
ｅｒ　１ｏｎｙ）法（二重免疫拡散法）　（免疫学実験
入門、生物化学実験法１５、学会出版セン・ター刊、７
４頁、１９８１年）によって行う。

蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度（１，４（ＯＤ２−、）ζイムノグロブリン１ｍｇ
／ｍｌ〕より算出する。

得られたモノクローナル抗体の特異性の決定は複数の検
体から得られたヒトの各種の＆１器山来のｉト常あるい
は腫瘍組織あるいはその膜成分との反応性、８種ヒト正
常あるいは腫瘍細胞１７ζ養株またはヒト胎児細胞培養
株もしくはそれらの膜成分との反応性、従来から知られ
ている癌胎児性抗原（例えばＣＥΔ）との反応性、重心
。

各種患者血清との反応性などを、酵素免疫測定法、蛍光
抗体法、免疫組織′ン的判定法（ＡＢＣ法）などにより
測定することにより行う。

モノクローナル抗体ＳＬＣ−４５４の酵素標識は、酵素
としてペル１゛キシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどを用い、過ヨ
ウ素酸架橋法〔ジャーナル・才ブ・ヒストケミストリイ
・了′ンド・サイトケミストリイ（Ｊ、ＩＩｉｓｔｏｃ
ｈｅｇｌ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）２２．１０８４〜１０
９１．　（１９７１）　）に従って行う。

ペルオキシダーゼを用いる過ヨウ素酸架橋法は、例、え
ば次の通り行う。

ペルオキシダーゼを０．３Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（ｐＨ
８，１）Ｉｎ＋ｌに溶かし、フルオロ−２，４−ジニト
ロベンゼン（ＤＮＰ）エタノール１％溶液０．１ｍｌを
加え、これに０．０６Ｍａヨウ素酸１ｍｌを加え、室温
で３０分＋１１１反応さ「る。これをｐ　Ｈ９，５の０
゜０１Ｍ炭酸緩衝液で透析してＤＮＰ化したアルデヒド
基がついたペルオキシダーゼを含む透析液を（）る。こ
の透析後の溶液に蛋白量として５ｍｇの抗体を加え、室
温で２時間反応させ、ｐＨ７，２の０．０１Ｍ　　リン
酸緩衝液で透析し、透析後の溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　
Ｇ４．１００カラムクロマトグラフイーにかけゲルｐ遇
する。

活性画分を酵素標識抗体として使う。

酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合はΔＢＴＳ基
質液を用い、発色をＯＤ＊＋ｓｎ＋ａの吸光度で測定す
る。ウレアーゼの基質としでは８ｉ＋ｇブロムクレゾー
ルパープル、　　１００　ｍｇｌＲ累オよび０．２ｍＭ
　　ＥＤＴＡを１００ｍ１中に含むｒ＋）（４，８の溶
液を使い、測定はジャーナル・：４゛ブ・イムノロジカ
ル・メソッ゛ゾ（Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ耐ｈ　ｏ
　ｄ　ｓ　）５３　　、１８７〜１９４　（１９８２）
に記載の方法に従って行う。アルカリフォスファターゼ
の基質としては１ｍｇ／ｍｌ　　ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸ヲ０．１Ｍジェタノールアミン緩（Φ１故に溶かし
たものを使う。

酵素’ｔＦＡＪはビオチン−アビジンの結合を介して行
うこともできる。ビオチン４＋Ｗｌは、ジャーナル・オ
ブ・ヒストケミストリイ・アンド・サイトケミストリイ
（Ｊ、　ｌｌｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、
　）２７　、１１．３１〜１１３９　（１９７９）に記
載の方法で行うことができる。

血清診断は次の通り行う。

９６穴ＥｌΔ用プレートに、第一抗体として、ΔＦ、Ｃ
−８６４Ｉｎ〜ｌｏｎμｇ／ｍｌを５０〜２００ｄ／穴
４°つ分注し、４℃〜室温で２時間〜２晩放置する。Ｐ
　１３　Ｓで洗浄後、１％［３５△ＰＢＳ　　２００μ
Ｑ／穴を加え、さらに４″Ｃ〜室温で２時間〜１晩放置
する。このプレートをＰ　Ｂ　Ｓでよく洗浄後、各式に
、血清検体を１〜１００倍希釈で、５０〜１００ρ加え
る。４℃〜室温で２時間〜１晩放置後、Ｐ［３Ｓでよく
洗浄する。次にビオチン化したＳＬＣ−４５４（１０〜
１００　ｑ／ｍｌ）を第二抗体として５０〜１００ｍ／
穴加え、さらに４℃〜室温で２時間〜１晩放置する。プ
レートをＰＢＳでよく洗浄後、アビジン−ビオチン−ペ
ルオキシダーゼ〔ベクトール（Ｖｅｃｔｏｒ）社製）　
　（１０ｍ／ｍｌ）を５０〜１００■／穴加え、室温で
１０〜３０分間放置し、５％ＳＤＳ溶液５０〜１００μ
ｍ／穴加え反応を停止する。各式のＯＤ、、、値を測定
し、その発色度より、血清検体中の抗原量を算出する。

このようにして得られた健常人血清中の抗原量と癌患者
血清中の抗原量を比較することにより、正常値を決定し
、その正常値を超えるものを肺腺癌陽性とする。第一抗
体としてＳＬＣ−１５４、第二抗体としてビオチン化し
たＡＬＣ−８６４を用いても同様に肺腺癌抗原を定量す
ることができる。

以下に本発明の実施例を示１゜ 実施例１゜ ９６穴Ｅ　Ｉへ用プレート〔フロー・ラボラｌリーズ（
Ｆｌｏｗ　ｌ、ａｂｏｒａＬｏｒｉｅｓ）社製〕に、参
考例１．により製造したＡ１．、Ｃ−８６４（Ｉ　ＯＪ
１ｇ／ｍｌ）　１００４／穴を第一抗体として加え、４
℃で１晩放置後、ＰＩ３５′Ｔ！沈浄し、１％Ｔ３　Ｓ
Δ−Ｉ’ＢＳ　　２００＃／穴加え４℃で１晩放置し、
ＰＢＳでよく洗浄したプレートに、健常人血清（１４４
検体）および肺癌患者血清（９２検体）、胃癌患者血清
（３３検体）、乳ＩＦｉＳ忠者血清（２７検体）、人Ｉ
ｌ！癌ＩＩ者血清（２５検体）、膵癌患者血清（ＩＯ検
体）、胆嚢・胆管癌患者血清（５検体）、純良性疾患患
者血清（＋６検体）、胃潰瘍患者血清（ｌ−０検体）、
肝硬変患者血ｌ＃（３検体）、膵炎患者血ｌ？ｊ（３検
体）の１０倍希釈液を５０４／穴加え、４℃で１晩放置
後、Ｐ　Ｂ　Ｓでよく洗浄した。ビオチン化ＳＬＣ−４
５４（１０ｑ／ｍｌ）　　ｌ　００　雇／穴を第二抗体
として加え、４℃で１晩放置し、ＰＢＳでよく洗浄した
後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ（１０に／
１１）を１００パ／穴加え、室温で１時間放置した後、
ＰＢＳでよく洗浄した。

次にＡＢＴＳ基質液１００ｄ／穴を加え、室温で３０分
間反応させ、５％ＳＤＳ溶液１ｏａｄ／穴を加え反応を
停止した。各式の発色を吸光度計（ＯＤ、、Ｓ　）で測
定した。その結果を第１図に示した。

第１図に示したごとく、本血清診断法において、肺腺癌
での陽性率は高く、また抗原量の多いものが多かった。

肺扁平上皮癌、肺大細胞癌、胃癌、大腸癌、膵癌、胆嚢
・胆管癌でも陽性例は散見されたが、抗原量は比較的低
値であった。健常人および肺、胃、肝、膵などの良性疾
患では全く陽性例は認められなかった。

以上の結果は、本発明の血清診断法が、肺癌、特にル１
１腺癌の臨床検査上有効な手段を提供することを示して
いる。

参考例■、　抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体＾ＬＣ−
−８６４の調製 （１）　　免疫原の調製 免疫原としての肺腺癌患者磨水の高分子分画の調製は、
以下の通り行った。

一８０℃に保存しておいた肺腺癌患者磨水を融解後、３
．００Ｏｒｐｍ、　　Ｉ　Ｏ分間遠心分離し、固形分を
除いた上清８ｍｌを０．５Ｍ　　ＮａＣｊ！を含む１０
ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（１１１７，２）で平衡化したベツ
ドボリューム７５０ｍ１のセルロファインＧＣＬ−２０
００ＳＦ　Ｃ生化学工業社製）カラムに通塔し、分子ｆ
ｆｉ　１，０００，０００以上の高分子画分（ボイドフ
ラクション；フラクション番号４１〜５０）を集め、こ
れを肺腺癌患者磨水の高分子分画とした。セルロファイ
ンＧＣＬ−２０００ＳＦの溶出パターンを第２図に示し
た。

（２）抗体産生細胞の調製 ヒト正常肺組ｍ膜成分（１００■蛋白質／匹）を、生後
２４時間以内の新生仔ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内投与
した。８週間経過後のマウスに肺腺癌患者磨水の高分子
分画１００μｇ（蛋白質換算）７匹を水酸化アルミニウ
ムゲル２ｍｇ／匹、百日咳菌死菌ワクチンｌＸｌ０’／
匹とともに腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、同一
抗原１００μｇ（蛋白質換算）７匹で３〜５回免疫した
。これら免疫処理したマウスのうち、その抗血ｉ１１が
、ヒト肺腺癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と
強く反応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスよ
り、牌細ｎ包を調製して、細胞融合に供した。

（３）　　マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕｌを
正常培地でｊ８養し、細胞融合時に２ｘｉｏ’以上の細
胞を（）、細胞融合に親株として供した。

（４）　　ハイブリドーマの作製 （２）と（３）で得られた牌細胞と骨髄腫細胞とを５：
ｌの割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨへＴ培地
で３７℃、１４日間ＣＯ□５％下で培養した。融合細胞
を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養した後、抗ヒト
肺ｌＩｌ癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選
び、さらに正常培地に変え、２回クローニングを繰り返
して、酵素免疫測定法、免疫組織学的判定法（へＢＣ法
）により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌に全く反
応せず、ヒト肺腺癌に特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生ずるハイプリドーマ株ＡＬＣ−８６４を選択
した。

（５）単クローン性抗体の精製 ブリスタン処理した８週令Ｂへ１、Ｂ／ｃ雌マウマウス
イ）で得られたハイプリドーマ株ＡＬＣ−８６４を４×
１０“細胞７匹を腹腔的注射した。

１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜ｌ０ｍ１／
匹ンし、遠心分ＲＩ！　（３，０００ｒｐｍ。

５分）して固形分を除去した。５０％硫酸アンモニウム
にて塩析し、０．０４　Ｍリン酸ｔｊｔ衝液（ｐ　Ｈ８
，０，０，０３Ｍ　　ＮａＣ１を含む）で透析後、ＤＥ
　５２　（Ｗｈａｔｇ＋ａｎ社製）　（ベットポリ５−
Ｌ５０１）０）力５１−ニ流Ｍ２０〜３０１／時で通塔
し、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体式ＬＣ
−８６４とした。このようにして（辱られた八ＬＣ−８
６４は、オクタロニイ法により［ｇＧ、ｌに属すること
が判明した。

（Ｇ）　　ＡＬＣ−８６４の特異性 抗ヒト肺腺癌型クローン性抗体ＡＬ（、−８６４の反応
特異性を第１表に示した。

第　　　１　　　表 子宮癌培養細胞株２株と反応 発明の効果 本発明によればヒトＩｊｌｉ　１１！ｉ１１Ｆ６に特異
的なｌｌ１１清診断を簡便にかつ効率よく行うことがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１の血清診断の結果を示す。 第２図は、参考４９セルロフアインＧ　ＣＬ　−２００
０ＳＦの溶出パターンを示す。 第 図 特許出願人（１（１２）協和醗酵工業株式会社第 図 手続補正Ｓ（方式） 事件の表示 昭和６３年特許願第１６３４３４号 発明の名称 肺腺癌抗原の定量法 補正をする者 事件との関係　　特許出廓人 郵便番号　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁口６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社（社） す０　　　　　　６０　　　　　　ワｏ　　　　　　ｇ
。 フラ７為７香号（９敞／１１鉋ｐ 第１図を十分に濃厚な黒色で鮮明に記載する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体ＡＬＣ−８６４を第一
   抗体とし、これを固相化し、これにヒト血清検体を反応
   させて肺腺癌抗体を結合させ、ついで酵素あるいは放射
   線化合物で標識した抗ヒト肺扁平上皮癌モノクローナル
   抗体ＳＬＣ−４５４を第二抗体として前記第一抗体に結
   合した肺腺抗原に結合させ、結合した第二抗体の量を標
   識した酵素の活性測定あるいは放射線量を測定すること
   により血清検体中の肺腺癌抗原量を定量することを特徴
   とする肺腺癌抗原の定量法。