JPH02128159A

JPH02128159A - 免疫学的定量法および検査用試薬

Info

Publication number: JPH02128159A
Application number: JP63280667A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Amano; 善之天野; Junichiro Kikutake; 菊竹　順一郎; Masakazu Sugiura; 杉浦　正和
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 1988-11-07
Filing date: 1988-11-07
Publication date: 1990-05-16
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: US5073485A; JPH0754322B2; EP0368208A3; EP0368208A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、免疫学的定量法および検査用試薬に関する。

［従来の技術］従来、被測定物質の定量法としては、不溶化された被測
定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）と標識された成分
（Ｂ）または標識された被測定物質（Ａ）をｐＨ７〜８
で反応させ、得られた複合体の標識物量を測定する方法
が知られている（特開昭５７−１１８１５９公報など）
。

［発明が解決しようとする課題］しかしながら、被測定物質のなかには、従来の測定方法
で定量するには濃度が高すぎるものがあること、また各
測定法には、測定範囲があることから被ＫＩＩＩ定物質
を希釈することが必要であり、操作が繁雑であるなどの
問題点がある。

５課題を解決するための手段］本発明者等は、濃度が高すぎる為、希釈操作が必要であ
った被測定対象物質を希釈することなしに定量する方法
および検査用試薬について鋭意検討した結果、本発明に
到達した。

すなわち本発明は、被測定物質（Ａ）と、被測定物質と
特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶化したものと、ａ？
識された成分（Ｂ）とを反応させてなる複合体における
標識物量を測定することにより、被測定物質（Ａ）を定
量する方法において、■被測定物質（Ａ）と不溶化され
た成分（Ｂ）または、■被測定物質（Ａ）と不溶化され
た成分（Ｂ）と標識された成分（Ｂ）とを反応させる際
の反応系のｐＨを２〜４．５にして反応せしめ被測定物
質（Ａ）を定量することを特徴とする免疫学的定量法お
よび、被測定物質（Ａ）と、被測定物質と特異的に結合
する成分（Ｂ）を不溶化したものと、標識された被測定
物質（Ａ）とを反応させてなる複合体における標識物量
を測定することにより、被測定物質を定量する方法にお
いて、■被測定物質（Ａ）と不溶化された成分（Ｂ）ま
たは、■被測定物質（Ａ）と不溶化された成分（Ｂ）と
標識された被測定物質（Ａ）を反応させる際の反応系の
ＰＨを２〜４．５にして反応せしめ被測定物質（Ａ）を
定量することを特徴とする免疫学的定量法、さらに本発
明は、特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶化したものと
、標識された成分（Ｂ）と、請求項１．の（１）または
（２）の反応系のｐＨを２〜４．５にする緩衝剤を構成
成分とする検査用試薬および、特異的に結合する成分（
Ｂ）を不溶化したものと、標識された被測定物質（Ａ）
と、請求項２の（１）または（２）の反応系のｐＨを２
〜４．５にする緩衝剤を構成成分とする検査用試薬であ
る。

本発明における被測定物質（Ａ）としては、血清タンパ
ク質（ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＩｇＥ、　　β２マイクログロ
ブリン、ＴＢＧ、ＩＡＰ、Ｃ３，Ｃ，、Ｃ５ｙ　ＣＲＰ
、α２マイクログロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、
Ｉ　ｇＥ、ＩｇＤ、Ｉ−ＩＰＬ、ｌ−ランスフェリン、
糖タンパク、アルブミンなど）、ホルモン（インシュリ
ン、ＨＣＧ−β、成長ホルモン、ＴＳＨ，Ｔ３．Ｔ４．
ＬＨ，ＦＳＨ，プロラクチン、ソマトスタチンなど）、
または数々の細菌、ウィルス、ＪｒＣ虫（真菌、連鎖球
菌、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、トキソプラズマ
原虫、。

マラリア原虫、赤痢アメーバ−など）などがあげられる
。これらのうち、好ましくは、特に希釈を必要とする血
清タンパク質（Ａ　Ｆ　Ｐ　、β２マイクログロブリン
、ＴＢＧ、ＩＡＰ、Ｃ３，Ｃ４，Ｃｓ、ＣＲＰ、α２マ
イクログロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、
ＩｇＤ、ＨＰＬ、トランスフェリンなど）などである。

成分（Ｂ）としては、（Ａ）と特異的に反応する抗体、
抗原などを用いることができる。例えば、（Ａ）がＡＦ
Ｐ抗原なら、　（Ｂ）としてはＡＦＰ抗体、（Ａ）がＨ
Ｂｓ抗体なら、（Ｂ）としてはＨＢｓ抗原などである。

不溶化された成分（Ｂ）（以下、不溶化（Ｂ）という）
としては、上記（Ｂ）を不溶化担体に結合させたものを
使用することができる。この不溶化担体としては、ケイ
酸質無機担体［ガラス（ポーラス、ツヤ消しガラスなど
）、シリカゲル、ペンナイトなどコ、磁性体、および有
機担体（プラスチック、デキストラン、口紙など）いず
れも公知のものが使用される。（Ｂ）を不溶化したもの
の具体例としては、不溶化した抗体、抗原などがある。

さらに、不溶化担体に（Ｂ）を不溶化（結合）させる方
法としては、ガラスとタンパク質を化学的に結合させる
（シランカップリング剤及び必要により架橋剤を使用）
、または物理吸着させる方法［例えば、米国特許第４２
８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書］
あるいは、プラスチックに抗体を物理吸着させる方法［
例えば、イー、エングツτル等、バ付シム、バイ４フィ
ス、７クタ、（Ｅ、Ｅｎｇｖａｌｌ　　Ｃｔ　　ａｌ、
；Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔ、ａ）　、２５１（１９７１）４２７〜４３４］
がある。

標識された成分（Ｂ）（以下、標識（Ｂ）という）とし
ては、標識された抗体、抗原など、標識された　（Ａ）
（以下、標識（Ａ）という）としては、標識された血清
タンパク質（β２マイクログロブリン、ＴＢＧ、ＩＡＰ
、Ｃ３，Ｃ４，ｃ５．ＣＲＰ。

α２マイクログロブリン、　Ｉ　ｇＡ、　Ｉ　ｇＭ、　
Ｉ　ｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＨＰＬ、トランスフェリン
、アルブミンなど）などがある。標識物質としては、ア
イソトープ、酵素、蛍光物質、発光物質が、使用されい
ずれも公知のもの（ラジオアイソトープとしては、ｌ−
１２５など、酵素としては、ペルオキシダーゼ・βガラ
クトシダーゼなど、蛍光物質としては、ユーロピウム誘
導体など２発光試薬としては、Ｎメチルアクリジウム誘
導体など）が、使用され、例えば、酵素の標識方法とし
ては、過ヨウ素Ｍ酸化法　［ナカネ等、　ジェー、ヒス
トケム、サイトケム　（Ｊ。

ｔｌｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）、２２；
　：１０８４．１９７４］などがある。

複合体は、（Ａ）と不溶化（Ｂ）を反応させＢ／Ｆ分離
後、さらに標識（Ｂ）または標識（Ａ）を結合させるこ
とにより、また（Ａ）と不溶化（Ｂ）と標識（Ｂ）を同
時に反応させ結合させることにより、また（Ａ）と不溶
化（Ｂ）と標識（Ａ）を同時に反応させ結合させること
により得ることができる。また、標識物量を測定しくＡ
）を免疫学的に定量する方法としては、標識物質として
アイソトープを用いたＲＩＡ法、酵素を用いたＥＩＡ法
、蛍光物質を用いたＦＩＡ法、発光物質を用いたイムノ
アッセイ法などがありいずれも公知のものが使用される
。

また反応系としては、（Ａ）と不溶化（Ｂ）を反応させ
る系のｐＨを２〜４．５好ましくは３．５〜４．５にす
ることが、また（Ａ）と不溶化（Ｂ）と標ｍ（Ｂ）を同
時に反応させる系のｐＨを２〜４．５好ましくは３．５
〜４．５にすることが、また（Ａ）と不溶化ＣＢ）と標
識（Ａ）を同時に反応させる系のｐＨを２〜４．５好ま
しくは３．５〜４．５にすることが有効である。

反応系のｐＨを２〜４．５にするためには、通常緩衝剤
が用いられるが、緩衝剤は、固体でも液体（緩衝液）の
いずれを用いても良く、特に限定はない。緩衝液として
は、ＰＨ２〜４．５、特に３．５〜４．５に緩衝作用を
有する緩衝液ならいずれでもよい。

このようなｐＨの緩衝液の成分としては、塩基性成分と
して、酢′酸ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸
２カリウム、クエン酸す１ヘリウム、塩化カリウム、グ
リシンなどが、酸性成分としては、酢酸、塩酸、クエン
酸、コハク酸、マレイン酸、バルビタール酸、安息香酸
、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸な、どの化合物があげられ、
これらの化合物の組み合わせからなる緩衝液を使用する
ことができる。また、正確な測定値を得る上では、クエ
ン酸／リン酸２ナトリウム、塩酸／酢酸ナトリウム系が
、またｐ　Ｉ−Ｉを安定化する上では、緩衝液のモル濃
度を０．０５Ｍ以上にすることが、さらに測定系を安定
化する上では、０．０５〜０．２Ｍの濃度範囲の緩衝液
が好ましい。

（Ａ）を定量する方法としては、　（Ａ）と不溶化（Ｂ
）を、ｐＨ２〜４．５の緩衝液中で５分〜１日間程度反
応させる。所定時間反応させた後、Ｂ／Ｆ分雛を行い不
溶化（Ｂ）と（Ａ）の複合体を形成させる。次に上記複
合体と標識（Ｂ）または、標識（Ａ）を５分〜１日間程
度反応させ複合体を標識化後、Ｂ／Ｆ分離を行い複合体
の標識物量よりＡの定量を行う方法と、（Ａ）と不溶化
（Ｂ）と標識（Ｂ）を、ＰＨ２〜４．５の緩衝液中で５
分〜１日間程度反応させる。所定時間反応させた後、Ｂ
／Ｆ分離を行い不溶化（Ｂ）と（Ａ）と標ｍ（Ｂ）の複
合体を形成させる、次に、Ｂ／Ｆ分離を行い複合体の標
識物量より（Ａ）の定量を行う方法と、（Ａ）と不溶化
（Ｂ）と標識（Ａ）を、ｐＨ２〜４．５の緩衝液中で５
分〜１時間程度反応させる。所定時間反応させた後、Ｂ
／Ｆ分離を行い不溶化（Ｂ）と（Ａ）と標識（Ａ）の複
合体を形成させる。次に、Ｂ／Ｆ分離を行い複合体の標
識物量より（Ａ）の定量を行う方法がある。

［作用］本発明は、被測定物質を希釈することなしに定量するこ
とが可能な免疫学的定量法および試薬に関するものであ
る。

［実施例］以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれに
限定されるものではない。

実施例１ヒトβ２マイクログロブリン（以下、β２ＭＧという）
のＥＩＡによる定量法＋１１ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤという）標識抗
ヒＩ〜β２ＭＧ抗体の作製ＰＯＤ標識標識抗ヒトβ２抗Ｇ抗調製は、過ヨウ素酸酸
化法　［ナカネ等、　ジェー、ヒストケム、す什ケム　
（Ｊ、ＩＩｉｓｔｏｃｈｅｍ、ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）
、　２２；：１０８４．１９７４］に準じた。

（２）抗ヒトβ２−ＭＧ抗体結合ガラスピーズの調製固
相としては、ガラスピーズを用い、向島達等の方法　［
メディカル　テグノ■ジー　（ＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）　　；７゜７５１．１９７９］に準じた
。

（３）血中β２ＭＧの測定（ａ）酵素標識抗体液＋１）１’得たＰＯＤ標識標識抗ヒトβ２抗Ｇ抗、０．
５ｘＢＳＡ　ＰＩＩＳで希釈し測定に必要な濃度に調製
した。

（ｂ）標準液精製ヒトβ２ＭＧを、０，１％　ＢＳＡ　ＰＢＳにより
１０，５，２゜５．１，０μｇ／ｍｌとなるように希釈
調製した。

（ｃ）抗原・抗体反応液０〜１０μｇ／ｍｌのヒトβ２ＭＧを希釈することなし
に測定できるように、１％ＢＳＡ含有ｐＨ４の酢酸ナト
リウム／塩酸を調製した。

（以下、緩衝液Ｉという）（ｄ）測定操作法試験管に標準液または、検体（血清）を２０μｍサンプ
リングし、緩衝液Ｉを５００μｍ、さらに、抗体結合ガ
ラスピーズを１個加え、充分に攪はんした後、３７℃で
１５分間振どう反応させた。反応終了後、反応液を吸引
除去し、生理食塩水２ｍｌを加えて再び吸引除去した。

この操作を２回繰り返した後、抗体結合ガラスピーズを
別の新しい試験管に移し、（ａ）の酵素標識抗体液５０
０μｍを加え３７℃で、１５分間振どう反応させた。反
応終了後、反応液を吸引除去し、生理食塩水２ｍｌを加
えて再び吸引除去した。この操作を２回繰り返した後、
抗体結合ガラスピーズを別の新しい試験管に移し３　ｍ
ｇ／ｍ■の０−フェニレンジアミンと０．０２％の過酸
化水素を基質として含むＯ，１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
４，８）を５００μｍ加えた。３７℃で、１５分間振ど
う反応させた後、１．５Ｎ硫酸を３　ｍｌ加え反応停止
後、４９２　ｎｍにおける吸光度を測定した。

（従来法との比較）第１図に、緩衝液Ｉと従来法（緩衝液ｐＨ７）との検量
線の比較例を示した。ここでいう、従来法とは、緩衝液
■の代わりに、１％ＢＳＡ含有ｐ　Ｈ７のリン酸緩衝液
を用いた測定系のことで、他の操作は、実施例１に準す
る。

また、第１図に示したように、水系は、従来法に比べて
希釈なしに高濃度の被対象物質を免疫学的に定量するこ
とが可能であった。

実施例２ＴＢＧ　（ヒトサイロキシン結合グロブリン）のＥＩＡ
による定量法。

＋１）　Ｐ　ＯＤ標識抗ＴＢＧ抗体及び抗ＴＢＧ抗体結
合スリガラスビーズの調製実施例１に準じて調製した。

（２）血中ＴＢＧの測定（ａ）酵素標識抗体液（１）テ得たＰＯＤｅｉＡ識抗ＴＢＧ抗体ヲ、０．５ｘ
ＢＳＡ　ＰＢＳで希釈し測定に必要な濃度に調製した（ｂ）標準液精製ヒトＴＢＧを、０．１％　ＢＳＡ　ＰＢＳニヨリ５
０，２５，１０．５，０μｇ／ｍｌとなるように希釈調
製した。

（ｃ）抗原・抗体反応液０〜５０μｇ／ｍｌのヒトＴＢＧを希釈することなしに
測定できるように、０．２％Ｂ　Ｓ　Ａを含有したｐＨ
４のリン酸２ナトリウム／クエン酸を調製した。

（以下、緩衝液■という。）（ｄ）測定操作法試験管に標準液または、検体（血清）を２０μｍサンプ
リングし、緩衝液■を５００μｍ、さらに、抗体結合ガ
ラスピーズを１個加え、充分に攪はんした後、３７℃で
１５分間振どう反応させた。反応終了後、反応液を吸引
除去し、生理食塩水２ｍｌを加えて再び吸引除去した。

この操作を２回繰り返した後、抗体結合ガラスピーズを
別の新しい試験管に移し、（ａ）の酵素櫟識抗体液５０
０μ］を加え３７℃で、１５分間振どう反応させた。反
応終了後、反応液を吸引除去し、生理食塩水２ｍｌを加
えて再び吸引除去した。この操作を２回繰り返した後、
抗体結合ガラスピーズを別の新しい試験管に移し３　ｍ
ｇ／ｍｌの０−フェニレンジアミンと０．０２％の過酸
化水素を基質として含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
４，８）を５００μｍ加えた。３７℃で、１５分間振ど
う反応させた後、１．５Ｎ硫酸を３　ｍｌ加え反応停止
後、４９２　ｎｍにおける吸光度を測定した。

実施例３ＴＢＧを定量する為のＥＩＡ試薬以下の［１）〜（３）の試薬を構成成分とするＴＢＧの
検査用試薬のことである。

（１）不溶化抗ＴＢＧ抗体抗ＴＢＧ抗体をガラスピーズに結合したものからなる。

（２）　Ｐ　ＯＤ標識抗ＴＢＧ抗体ＰＯＤ標識抗ＴＢＧ抗体からなる。

（３）免疫反応用緩衝液（ｐ　Ｉ−Ｉ　４　）抗’ｆ’
ＢＧ抗体と、検体または標準ＴＢＧの反応系のｐＨを４
にする為の緩衝液からなる。

［発明の効果］本発明の定量法は、従来希釈操作が必要であった高濃度
の被測定物質を反応系のｐＨを２．０〜４．５にするこ
とにより、被測定物質を希釈することなしに定量するこ
とができる免疫学的定量法である。また、測定範囲は、
反応系のｐＨを変えることにより任意に設定し良好な測
定範囲を有す測定系を組むことができる。例えば、β２
ＭＧなら０．１〜２０　ｐ　ｇ／ｍｌ、ＴＢＧなら１〜
５０μｇ／ｍｌ、ＩｇＡなら１〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲
が測定できるように測定系を組むことができる。すなわ
ち検体希釈が不要なことから従来法より測定レンジの広
い前便な定量法を提供することができる。

本発明の検査用試薬は、従来希釈操作が必要であったβ
２ＭＧ、ＴＢＧ、ＩｇＡなどの検査用試薬において、希
釈操作を必要としない試薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＨを４にした緩衝液Ｉと従来の緩衝液（ｐ
Ｈ７）を用いて測定・作製したβ２Ｍ０（Ｏ〜１０μｇ
／ｍｌ）の検量線である。・実線：緩衝液Ｉでの検量線・破線：従来法（ｐ　Ｉ（７）での検量線第１回 β２ＭＧ検量線（緩衝液Ｉの効果）２．５ β２ＭＧ（μｇ／＋ｎｌ）

Claims

【特許請求の範囲】１、被測定物質（Ａ）と、被測定物質と特異的に結合す
る成分（Ｂ）を不溶化したものと、標識された成分（Ｂ
）とを反応させてなる複合体における標識物量を測定す
ることにより、被測定物質（Ａ）を定量する方法におい
て、（１）被測定物質（Ａ）と不溶化された成分（Ｂ）
または、（２）被測定物質（Ａ）と不溶化された成分（
Ｂ）と標識された成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系
のｐＨを２〜４．５にして反応せしめ被測定物質（Ａ）
を定量することを特徴とする免疫学的定量法。２、被測定物質（Ａ）と、被測定物質と特異的に結合す
る成分（Ｂ）を不溶化したものと、標識された被測定物
質（Ａ）とを反応させてなる複合体における標識物量を
測定することにより、被測定物質を定量する方法におい
て、（１）被測定物質（Ａ）と不溶化された成分（Ｂ）
または、（２）被測定物質（Ａ）と不溶化された成分（
Ｂ）と標識された被測定物質（Ａ）を反応させる際の反
応系のｐＨを２〜４．５にして反応せしめ被測定物質（
Ａ）を定量することを特徴とする免疫学的定量法。３、被測定物質（Ａ）と特異的に結合する成分（Ｂ）を
不溶化したものと、標識された成分（Ｂ）と、請求項１
、の（１）または（２）の反応系のｐＨを２〜４．５に
する緩衝剤を構成成分とする検査用試薬。４、被測定物質（Ａ）と特異的に結合する成分（Ｂ）を
不溶化したものと、標識された被測定物質（Ａ）と、請
求項２、の（１）または（２）の反応系のｐＨを２〜４
．５にする緩衝剤を構成成分とする検査用試薬。