JPH0754322B2 - 免疫学的定量法および検査用試薬 - Google Patents

免疫学的定量法および検査用試薬

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JPH0754322B2
JPH0754322B2 JP63280667A JP28066788A JPH0754322B2 JP H0754322 B2 JPH0754322 B2 JP H0754322B2 JP 63280667 A JP63280667 A JP 63280667A JP 28066788 A JP28066788 A JP 28066788A JP H0754322 B2 JPH0754322 B2 JP H0754322B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫学的定量法および検査用試薬に関する。
［従来の技術］ 従来、被測定物質の定量法としては、不溶化された被測
定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）と標識された成分
（Ｂ）または標識された被測定物質（Ａ）をpH7〜８で
反応させ、得られた複合体の標識物量を測定する方法が
知られている（特開昭57−118159公報など）。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、被測定物質のなかには、従来の測定方法
で定量するには濃度が高すぎるものがあること、また各
測定法には、測定範囲があることから被測定物質を希釈
することが必要であり、操作が繁雑であるなどの問題点
がある。
［課題を解決するための手段］ 本発明者等は、濃度が高すぎる為、希釈操作が必要であ
った被測定対象物質を希釈することなしに定量する方法
および検査用試薬について鋭意検討した結果、本発明に
到達した。
すなわち本発明は、下記＜１＞〜＜４＞である。
＜１＞被測定物質（Ａ）と、 被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶化した
ものと、 標識された、被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）
と を反応させてなる複合体における標識物量を測定するこ
とにより、被測定物質（Ａ）を定量する方法において、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
と特異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応
系 のpHを3.5〜4.5にして反応せしめ、被測定物質（Ａ）を
定量することを特徴とする免疫学的定量法。
＜２＞被測定物質（Ａ）と、 被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶化した
ものと、 標識された、被測定物質（Ａ）と を反応させてなる複合体における標識物量を測定するこ
とにより、被測定物質を定量する方法において、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
（Ａ）とを反応させる際の反応系 のpHを3.5〜4.5にして反応せしめ、被測定物質（Ａ）を
定量することを特徴とする免疫学的定量法。
＜３＞被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶
化したものと、 標識された、被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）
と、 ＜１＞項１記載の、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
と特異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応
系 のpHを3.5〜4.5にする緩衝剤を構成成分とする検査用試
薬。
＜４＞被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶
化したものと、 標識された、被測定物質（Ａ）と、 ＜２＞項記載の、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
（Ａ）とを反応させる際の反応系 のpHを3.5〜4.5にする緩衝剤を構成成分とする検査用試
薬。
本発明における被測定物質（Ａ）としては、血清タンパ
ク質（AFP,CEA,IgE,β２マイクログロブリン,TBG,IAP,C
3,C4,C5,CRP,α２マイクログロブリン,IgA,IgM,IgG,Ig
E,IgD,HPL,トランスフェリン，糖タンパク，アルブミン
など）、ホルモン（インシュリン,HCG−β，成長ホルモ
ン,TSH,T3,T4,LH,FSH,プロラクチン，ソマトスタチンな
ど）、または数々の細菌，ウイルス，原虫（真菌，連鎖
球菌，肝炎ウイルス，ヘルペスウイルス，トキソプラズ
マ原虫,,マラリア原虫，赤痢アメーバーなど）などがあ
げられる。これらのうち、好ましくは、特に希釈を必要
とする血清タンパク質（AFP,β２マイクログロブリン,T
BG,IAP,C3,C4,C5,CRP,α２マイクログロブリン,IgA,Ig
M,IgG,IgE,IgD,HPL,トランスフェリンなど）などであ
る。
成分（Ｂ）としては、（Ａ）と特異的に反応する抗体、
抗原などを用いることができる。例えば、（Ａ）がAFP
抗原なら、（Ｂ）としてはAFP抗体，（Ａ）がHBs抗体な
ら、（Ｂ）としてはHBs抗原などである。
不溶化された成分（Ｂ）（以下、不溶化（Ｂ）という）
としては、上記（Ｂ）を不溶化担体に結合させたものを
使用することができる。この不溶化担体としては、ケイ
酸質無機担体［ガラス（ポーラス、ツヤ消しガラスな
ど）、シリカゲル、ベンナイトなど］、磁性体、および
有機担体（プラスチック、デキストラン、ロ紙など）い
ずれも公知のものが使用される。（Ｂ）を不溶化したも
のの具体例としては、不溶化した抗体，抗原などがあ
る。さらに、不溶化担体に（Ｂ）を不溶化（結合）させ
る方法としては、ガラスとタンパク質を化学的に結合さ
せる（シランカップリング剤及び必要により架橋剤を使
用）、または物理吸着させる方法［例えば、米国特許第
4280992号明細書及び同第3652761号明細書］あるいは、
プラスチックに抗体を物理吸着させる方法［例えば、イ
ー．エングバル等．バイオシム．バイオフィズ．アク
タ，（E.Engvall et al.;Biochim.Biophys.Acta）,251
（1971）427〜434］がある。
標識された成分（Ｂ）（以下、標識（Ｂ）という）とし
ては、標識された抗体，抗原など、標識された（Ａ）
（以下、標識（Ａ）という）としては、標識された血清
タンパク質（β２マイクログロブリン,TBG,IAP,C3,C4,C
5,CRP,α２マイクログロブリン,IgA,IgM,IgG,IgE,IgD,H
PL,トランスフェリン，アルブミンなど）などがある。
標識物質としては、アイソトープ、酵素、蛍光物質、発
光物質が、使用されいずれも公知のもの（ラジオアイソ
トープとしては、Ｉ−125など，酵素としては、ペルオ
キシダーゼ・βガラクトシダーゼなど，蛍光物質として
は、ユーロピウム誘導体など，発光試薬としては、Ｎメ
チルアクリジウム誘導体など）が、使用され、例えば、
酵素の標識方法としては、過ヨウ素酸酸化法［ナカネ
等、ジェー．ヒストケム．サイトケム（J.Histochem.Cy
tochem.）,22;:1084,1974］などがある。
複合体は、（Ａ）と不溶化（Ｂ）を反応させB/F分離
後、さらに標識（Ｂ）または標識（Ａ）を結合させるこ
とにより、また（Ａ）と不溶化（Ｂ）と標識（Ｂ）を同
時に反応させ結合させることにより、また（Ａ）と不溶
化（Ｂ）と標識（Ａ）を同時に反応させ結合させること
により得ることができる。また、標識物量を測定し
（Ａ）を免疫学的に定量する方法としては、標識物質と
してアイソトープを用いたRIA法、酵素を用いたEIA法、
蛍光物質を用いたFIA法、発光物質を用いたイムノアッ
セイ法などがありいずれも公知のものが使用される。
また反応系としては、（Ａ）と不溶化（Ｂ）を反応させ
る系のpHを3.5〜4.5にすることが、また（Ａ）と不溶化
（Ｂ）と標識（Ｂ）を同時に反応させる系のpHを3.5〜
4.5にすることが、また（Ａ）と不溶化（Ｂ）と標識
（Ａ）を同時に反応させる系のpHを3.5〜4.5にすること
が有効である。反応系のpHを3.5〜4.5にするためには、
通常緩衝剤が用いられるが、緩衝剤は、固体でも液体
（緩衝液）のいずれを用いても良く、特に限定はない。
緩衝液としては、pH3.5〜4.5に緩衝作用を有する緩衝液
ならいずれでもよい。このようなpHの緩衝液の成分とし
ては、塩基性成分として、酢酸ナトリウム，リン酸２ナ
トリウム，リン酸２カリウム，クエン酸ナトリウム，塩
化カリウム，グリシンなどが、酸性成分としては、酢
酸，塩酸，クエン酸，コハク酸，マレイン酸，バルビタ
ール酸，安息香酸,p−ヒドロキシ安息香酸などの化合物
があげられ、これらの化合物の組み合わせからなる緩衝
液を使用することができる。また、正確な測定値を得る
上では、クエン酸／リン酸２ナトリウム，塩酸／酢酸ナ
トリウム系が、またpHを安定化する上では、緩衝液のモ
ル濃度を0.05M以上にすることが、さらに測定系を安定
化する上では、0.05〜0.2Mの濃度範囲の緩衝液が好まし
い。
（Ａ）を定量する方法としては、（Ａ）と不溶化（Ｂ）
を、pH3.5〜4.5の緩衝液中で５分〜１日間程度反応させ
る。所定時間反応させた後、B/F分離を行い不溶化
（Ｂ）と（Ａ）の複合体を形成させる。次に上記複合体
と標識（Ｂ）または、標識（Ａ）を５分〜１日間程度反
応させ複合体を標識化後、B/F分離を行い複合体の標識
物量よりＡの定量を行う方法と、（Ａ）と不溶化（Ｂ）
と標識（Ｂ）を、pH3.5〜4.5の緩衝液中で５分〜１日間
程度反応させる。所定時間反応させた後、B/F分離を行
い不溶化（Ｂ）と（Ａ）と標識（Ｂ）の複合体を形成さ
せる。次に、B/F分離を行い複合体の標識物量より
（Ａ）の定量を行う方法と、（Ａ）と不溶化（Ｂ）と標
識（Ａ）を、pH3.5〜4.5の緩衝液中で５分〜１時間程度
反応させる。所定時間反応させた後、B/F分離を行い不
溶化（Ｂ）と（Ａ）と標識（Ａ）の複合体を形成させ
る。次に、B/F分離を行い複合体の標識物量より（Ａ）
の定量を行う方法がある。
［作用］ 本発明は、被測定物質を希釈することなしに定量するこ
とが可能な免疫学的定量法および試薬に関するものであ
る。
［実施例］ 以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれに
限定されるものではない。
実施例１ ヒトβ２マイクログロブリン（以下、β2MGという）のE
IAによる定量法 （１）ペルオキシダーゼ（以下、PODという）標識抗ヒ
トβ2MG抗体の作製 POD標識抗ヒトβ2MG抗体の調製は、過ヨウ素酸酸化法
［ナカネ等、ジェー．ヒストケム．サイトケム（J.Hist
ochem.Cytochem.）,22;:1084,1974］に準じた。
（２）抗ヒトβ２−MG抗体結合ガラスビーズの調製固相
としては、ガラスビーズを用い、向島達等の方法［メデ
ィカル テクノロジー（Medical Technology）;7,751,1
979］に準じた。
（３）血中β2MGの測定 （ａ）酵素標識抗体液 （１）で得たPOD標識抗ヒトβ2MG抗体を、0.5％BSA PBS
で希釈し測定に必要な濃度に調製した。
（ｂ）標準液 精製ヒトβ2MGを、0.1％BSA PBSにより10,5,2.5,1,0μg
/mlとなるように希釈調製した。
（ｃ）抗原・抗体反応液 ０〜10μg/mlのヒトβ2MGを希釈することなしに測定で
きるように、１％BSA含有pH4の酢酸ナトリウム／塩酸を
調製した。
（以下、緩衝液Ｉという） （ｄ）測定操作法 試験管に標準液または、検体（血清）を20μｌサンプリ
ングし、緩衝液Ｉを500μl,さらに、抗体結合ガラスビ
ーズを１個加え、充分に撹はんした後、37℃で15分間振
とう反応させた。反応終了後、反応液を吸引除去し、生
理食塩水2mlを加えて再び吸引除去した。この操作を２
回繰り返した後、抗体結合ガラスビーズを別の新しい試
験管に移し、（ａ）の酵素標識抗体液500μｌを加え37
℃で、15分間振とう反応させた。反応終了後、反応液を
吸引除去し、生理食塩水2mlを加えて再び吸引除去し
た。この操作を２回繰り返した後、抗体結合ガラスビー
ズを別の新しい試験管に移し3mg/mlのｏ−フェニレンジ
アミンと0.02％の過酸化水素を基質として含む0.1Mクエ
ン酸緩衝液（pH4.8）を500μｌ加えた。37℃で、15分間
振とう反応させた後、1.5N硫酸を3ml加え反応停止後、4
92nmにおける吸光度を測定した。
（従来法との比較） 第１図に、緩衝液Ｉと従来法（緩衝液pH7）との検量線
の比較例を示した。ここでいう、従来法とは、緩衝液Ｉ
の代わりに、１％BSA含有pH7のリン酸緩衝液を用いた測
定系のことで、他の操作は、実施例１に準ずる。
また、第１図に示したように、本系は、従来法に比べて
希釈なしに高濃度の被対象物質を免疫学的に定量するこ
とが可能であった。
実施例２ TBG（ヒトサイロキシン結合グロブリン）のEIAによる定
量法。
（１）POD標識抗TBG抗体及び抗TBG抗体結合スリガラス
ビーズの調製 実施例１に準じて調製した。
（２）血中TBGの測定 （ａ）酵素標識抗体液 （１）で得たPOD標識抗TBG抗体を、0.5％BSA PBSで希釈
しに測定に必要な濃度に調製した （ｂ）標準液 精製ヒトTBGを、0.1％BSA PBSにより50,25,10,5,0μg/m
lとなるように希釈調製した。
（ｃ）抗原・抗体反応液 ０〜50μg/mlのヒトTBGを希釈することなしに測定でき
るように、0.2％BSAを含有したpH4のリン酸２ナトリウ
ム／クエン酸を調製した。（以下、緩衝液IIという。） （ｄ）測定操作法 試験管に標準液または、検体（血清）を20μｌサンプリ
ングし、緩衝液IIを500μl,さらに、抗体結合ガラスビ
ーズを１個加え、充分に撹はんした後、37℃で15分間振
とう反応させた。反応終了後、反応液を吸引除去し、生
理食塩水2mlを加えて再び吸引除去した。この操作を２
回繰り返した後、抗体結合ガラスビーズを別の新しい試
験管に移し、（ａ）の酵素標識抗体液500μｌを加え37
℃で、15分間振とう反応させた。反応終了後、反応液を
吸引除去し、生理食塩水2mlを加えて再び吸引除去し
た。この操作を２回繰り返した後、抗体結合ガラスビー
ズを別の新しい試験管に移し3mg/mlのｏ−フェニレンジ
アミンと0.02％の過酸化水素を基質として含む0.1Mクエ
ン酸緩衝液（pH4.8）を500μｌ加えた。37℃で、15分間
振とう反応させた後、1.5N硫酸を3ml加え反応停止後、4
92nmにおける吸光度を測定した。
実施例３ TBGを定量する為のEIA試薬 以下の（１）〜（３）の試薬を構成成分とするTBGの検
査用試験のことである。
（１）不溶化抗TBG抗体 抗TBC抗体をガラスビーズに結合したものからなる。
（２）POD標識抗TBG抗体 POD標識抗TBG抗体からなる。
（３）免疫反応用緩衝液（pH4） 抗TBG抗体と、検体または標準TBGの反応系のpHを４にす
る為の緩衝液からなる。
［発明の効果］ 本発明の定量法は、従来希釈操作が必要であった高濃度
の被測定物質を反応系のpHを3.5〜4.5にすることによ
り、被測定物質を希釈することなしに定量することがで
きる免疫学的定量法である。また、測定範囲は、反応系
のpHを変えることにより任意に設定し良好な測定範囲を
有す測定系を組むことができる。例えば、β2MGなら0.1
〜20μg/ml、TBGなら１〜50μg/ml、IgAなら１〜20mg/m
lの範囲が測定できるように測定系を組むことができ
る。すなわち検体希釈が不要なことから従来法より測定
レンジの広い簡便な定量法を提供することができる。
本発明の検査用試薬は、従来希釈操作が必要であったβ
2MG,TBG,IgAなどの検査用試薬において、希釈操作を必
要としない試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、pHを４にした緩衝液Ｉと従来の緩衝液（pH
7）を用いて測定・作製したβ2MG（０〜10μg/ml）の検
量線である。 ・実線：緩衝液Ｉでの検量線 ・破線：従来法（pH7）での検量線

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】被測定物質（Ａ）と、 被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶化した
    ものと、 標識された、被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）
    と を反応させてなる複合体における標識物量を測定するこ
    とにより、被測定物質（Ａ）を定量する方法において、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
    または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
    と特異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応
    系 のpHを3.5〜4.5にして反応せしめ、被測定物質（Ａ）を
    定量することを特徴とする免疫学的定量法。
  2. 【請求項２】被測定物質（Ａ）と、 被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）を不溶化した
    ものと、 標識された、被測定物質（Ａ）と を反応させてなる複合体における標識物量を測定するこ
    とにより、被測定物質を定量する方法において、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
    または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
    （Ａ）とを反応させる際の反応系 のpHを3.5〜4.5にして反応せしめ、被測定物質（Ａ）を
    定量することを特徴とする免疫学的定量法。
  3. 【請求項３】被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）
    を不溶化したものと、 標識された、被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）
    と、 請求項１記載の、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
    または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
    と特異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応
    系 のpHを3.5〜4.5にする緩衝剤を構成成分とする検査用試
    薬。
  4. 【請求項４】被測定物質と特異的に結合する成分（Ｂ）
    を不溶化したものと、 標識された、被測定物質（Ａ）と、 請求項２記載の、 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）とを反応させる際の反応系、
    または 被測定物質（Ａ）と、不溶化された、被測定物質と特
    異的に結合する成分（Ｂ）と、標識された、被測定物質
    （Ａ）とを反応させる際の反応系 のpHを3.5〜4.5にする緩衝剤を構成成分とする検査用試
    薬。
JP63280667A 1988-11-07 1988-11-07 免疫学的定量法および検査用試薬 Expired - Lifetime JPH0754322B2 (ja)

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