JPH0694716A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 サンドイッチ免疫測定法において、抗原抗体
反応に先立ち、被検試料に、固相抗体と同様の抗体を添
加する。 【効果】 被検試料中の抗原の濃度を希釈により調整す
ることなく、抗原量の測定が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サンドイッチ免疫測定
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応の高い特異性を利用して検
体中に含まれる特定の抗原あるいは抗体を、定性的ある
いは定量的に測定するために種々の免疫学的測定法が用
いられており、代表的なものとして酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）等が知られている。
これらの測定法の測定原理の一つにサンドイッチ法があ
り、これには固相抗体に対し抗原と標識抗体とを同時に
反応させる一段法、あるいは抗原と標識抗体とを順に反
応させる二段法が知られている。こうしたサンドイッチ
法を用いた場合の抗原の測定は、通常、検体を予め希釈
し、抗原の濃度を調整して行われる。サンドイッチ型測
定法は、一般に、低濃度の抗原を測定するのに適してお
り、測定対象である抗原の種類によっては、生体中での
濃度がかなり高いので、高度の希釈を必要とするものも
ある。

【０００３】また、感染症診断、ガン診断を始めとする
成人病等の診断に於いては、血液中の複数の微量成分の
分析によって総合的に判断して診断をすばやく下すこと
が望ましく、我々は、一つの検体中の複数の抗原を同時
に測定できる多抗原同時測定用免疫センサーを先に提案
した（特開昭６３−２２２２５７号公報）。公報の記載
にある様に、同一反応セル内で同時に複数の抗原を測定
する場合、測定対象となる複数の抗原の濃度がそれぞれ
測定可能領域内であれば問題はない。しかし、検体中
に、非常に低濃度に存在する抗原と高濃度に存在する抗
原とを同時に測定する場合、検体を希釈することによっ
て何れの測定可能領域にも適するよう濃度を調整するこ
とはできなかったので、何等かの改善策が望まれてい
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、種々検討
した結果、サンドイッチ法免疫測定時に固相抗体と同様
の抗体を被検試料に添加することにより、前記の問題を
解決できることを見いだし、本発明を完成した。

【０００５】本発明の目的は、検体を希釈して抗原の濃
度を調整することなく測定することができる、更に、複
数の抗原を同時に測定する方法にも適用できる免疫測定
法を提供するにある。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】上記の目的は、サンド
イッチ免疫測定法において、反応に先立ち、被検試料
に、固相抗体と同様の抗体を添加することを特徴とする
免疫測定法によって達成される。

【０００７】本発明の免疫測定法は、標識免疫測定法で
ある酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）等のサンドイッチ法を適用する。また、被検試料に
標識抗体を添加した溶液を反応させるサンドイッチ一段
法、被検試料を固相抗体と反応させ、洗浄後、標識抗体
と反応させるサンドイッチ二段法のどちらの場合にも適
用でき、特に、二段法に好適である。

【０００８】本発明が対象とする被検試料は、１種もし
くは複数の抗原を含む試料であり、抗原としては、例え
ば、以下のようなものが具体例として挙げられる。 （１）インシュリン、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣ
Ｇ）、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン等のポリペ
プチド系ホルモン。 （２）ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、α−フェトプ
ロテイン（ＡＦＰ）、カルシノエンブリオニックアンチ
ゲン、Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）、α１−アシッドグリ
コプロテイン（ＡＧＰ）、ハプトグロビン、等の血清蛋
白。 （３）大腸菌毒素、コレラトキシン、肝炎ウィルス、風
疹ウィルス、インフルエンザウィルス等の毒素あるいは
ウィルス。 （４）エストラジオール、プロゲストロン、テストステ
ロン、フェニトイン、プロカインアミド、カナマイシ
ン、ペニシリン、バルビツール酸等のステロイドホルモ
ンあるいは薬剤。

【０００９】上記抗原を測定するには、夫々に対応する
抗体を固定化した固相抗体を使用する。ここで、固相抗
体としては、吸着法、化学結合法、包括法等によってポ
リスチレン試験管、ビーズ、膜等に固定化されたものが
挙げられる。

【００１０】また、標識抗体としては、酵素、放射性同
位元素、フルオロセイン等で標識された抗体であればよ
く、特に限定されるものではない。

【００１１】本発明の免疫測定法は、従来の測定法に準
じて行えばよく、その際、反応に先立ち、被検試料に、
固相抗体と同様の抗体を添加することが肝要である。添
加する抗体としては、固相抗体として用いる抗体と全く
同一のものでよいが、抗原の同一エピトープに反応する
ものであってもよい。

【００１２】抗体の添加量は、測定する被検試料中の抗
原の濃度と測定可能な濃度領域とにより、適宜、設定す
ればよく、通常、検体中１００μｇ／ml以下での使用が
好ましい。

【００１３】被検試料に、固相抗体と同様の抗体を既知
量添加することにより、被検試料中の抗原濃度が高い場
合に於いても、希釈することなく、その濃度を測定する
ことが可能となる。更には、複数の抗原を含む被検試料
の複数抗原を同時に測定する方法にも適用可能である。

【００１４】本発明の免疫測定法を使用し、複数（２
種）の抗原を同時に測定するには、例えば、図１に示す
ような二抗原同時測定用免疫センサーが使用される。図
１において、１は免疫センサー（Ａ）、２は免疫センサ
ー（Ｂ）、３は反応セル、４ａ，４ｂは抗体固定化膜、
５は酸素透過膜、６はＯ−リング、７は酸素電極を表わ
す。

【００１５】二抗原同時測定用免疫センサーは、抗体固
定化膜４ａをガルバニー型酸素電極７（ＡＮ型、オリエ
ンタル電気（株）製）に装着した免疫センサー（Ａ）１
と、抗体固定化膜４ｂをガルバニー型酸素電極７（ＡＮ
型、オリエンタル電気（株）製）に装着した免疫センサ
ー（Ｂ）２とを、一つの反応セル３に図１に示すように
配置されている。

【００１６】更に、上記の免疫センサーを用いて、例え
ば、免疫反応液、酵素基質液あるいは洗浄液を順次反応
セル中に導入する、図２に示すようなフロー式測定装置
が使用される。図２において、１０は二抗原同時測定用
免疫センサー、１１は記録計、１２はサンプル供給口、
１３ａ，１３ｂ，１３ｃはコック、１４ａ，１４ｂはポ
ンプ、１５は洗浄液、１６は解離液、１７は酵素基質溶
液である。

【００１７】このような装置を使用しての免疫測定は、
一段法であれば、２種の抗原と固定化された抗体と同様
の抗体と標識抗体とを含有する被検試料を反応セル３に
導入して免疫反応を行い、その後、被検試料を除去し
て、過酸化水素を添加し、カタラーゼ等の酵素によって
引き起こされる酸素濃度変化を酸素電極７により検出
し、被測定抗原の濃度を測定することにより行われる。

【００１８】

【発明の効果】以上のように、本発明の免疫測定法は、
被検試料中の抗原の濃度を希釈により調整することな
く、測定することが可能である。更に、それぞれ測定可
能領域と異なる複数の抗原を含有する被検試料中の複数
の抗原を同時に測定することも可能となる。

【００１９】

〔実施例１〕

○ヒトハプトグロビン（Ｈｐ）測定系（一段法）への抗
体添加

【００２０】抗ヒトハプトグロビンヒツジポリクローナ
ル抗体（ＩｇＧ）固定化ポリスチレン試験管の調製 抗ヒトハプトグロビンヒツジポリクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ）を５０μｇ／mlに調整し、０．５mlを内径０．８ml
のポリスチレン試験管に入れ、4 ℃で１６時間放置して
内壁に抗体を吸着固定化した。次に、蒸留水で洗浄後、
０．５％の牛血清アルブミンを含有する０．０１Ｍリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を１ml加えて３７℃で
２時間放置し、抗体固定化ポリスチレン試験管を得た。

【００２１】カタラーゼ標識抗ヒトハプトグロビンマウ
スモノクローナル抗体（ＩｇＡ）の製造 （１）チオール化カタラーゼ カタラーゼ溶液０．３３２ml（含量３０ｍｇ）を０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、６．０mlに希釈
し、窒素曝気を６０ml／分で１０分間行い、次にメチル
−４−メルカプトブチルイミデート１．５ｍｇを加え、
窒素雰囲気下に４℃で２時間反応させた。反応終了後、
窒素雰囲気のままダイアフローメンブラン（アミコン社
製）を用いて限外濾過により濃縮し、これに０．０５Ｍ
リン酸緩衝液３ml（ｐＨ７．０）を加え、再び限外濾過
した。この操作を３回繰り返して未反応のメチル−４−
メルカプトイミデートを除き、濃縮してチオール化カタ
ラーゼ溶液３ml（１０ｍｇ／ml）を得、窒素雰囲気下で
保存した。

【００２２】（２）マレイミド化抗ヒトハプトグロビン
マウスモノクローナル抗体 抗ヒトハプトグロビンマウスモノクローナル抗体溶液
０．７０ml（含量６ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で４．０mlに希釈し、Ｎ−（γ−マレイミド
ブチロキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）０．３４ｍｇ
をジオキサン０．０６８mlに溶かして加えた。４℃で２
時間反応させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１０００mlで透析（２時間）を２回行ってマレイミ
ド化抗ヒトハプトグロビンマウスモノクローナル抗体溶
液４ml（含量６ｍｇ）を得た。

【００２３】（３）カタラーゼ標識抗ヒトハプトグロビ
ンマウスモノクローナル抗体 （１）で製造したチオール化カタラーゼ溶液２．４ml
（含量２４ｍｇ）と（２）で製造したマレイミド化抗ヒ
トハプトグロビンマウスモノクローナル抗体溶液４ml
（含量６ｍｇ）とを窒素雰囲気下で混合し、４℃で１６
時間反応させた。未反応のマレイミド基をブロックする
ためシステイン１ｍｇを加え４℃で３０分間反応後、１
２０００回転、５分間の遠心分離で沈澱物を除去し、高
速液体クロマトグラフィーによって目的物を分離精製し
た。カラムは、Ｓｐｈａｄｅｘ Ｇ−３０００ＳＷ（東
洋ソーダ製）を用い、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で溶出し、最初の分画を集めカタラーゼ標識抗
ヒトハプトグロビンマウスモノクローナル抗体溶液１２
ml（含量５ｍｇ）を得た。

【００２４】ヒトハプトグロビン（以下、Ｈｐと記す）
０〜２×１０⁴ ｎｇ／ml、上記で製造したカタラーゼ標
識抗Ｈｐモノクローナル抗体５．５μｇ／mlを含有する
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清アル
ブミン含有）０．４５mlに、固相抗体に使用したものと
同じ抗Ｈｐポリクローナル抗体１００μｇ／mlあるいは
０μｇ／ml（比較例１）を含有する０．０１Ｍリン酸緩
衝生理食塩水（０．５％牛血清アルブミン含有）０．０
５mlを加え、前記のポリスチレン試験管に入れ、３７℃
で２時間免疫反応を行った。次に、蒸留水３mlで３回洗
浄後、０．０２Ｍ過酸化水素−０．０１Ｍリン酸緩衝生
理食塩水１．０mlを加え、１０分間酵素反応を行った
後、１規定硫酸１．０mlを加えて反応を停止させ、過酸
化水素に基づく２４０ｎｍの吸光度（Ａ２４０）を測定
した。

【００２５】図３に示す通り、固相抗体に使用したもの
と同じ抗体を測定系に添加することにより高濃度側の測
定領域に検量線をシフトでき、高濃度の抗原を含む被検
試料の測定が可能となることがわかる。

【００２６】〔実施例２〕 ○ヒトハプトグロビン（Ｈｐ）測定系（二段法）への抗
体添加 ヒトハプトグロビン（以下Ｈｐと略す）０〜１００μｇ
／mlを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．
５％牛血清アルブミン含有）０．４５mlに、固相抗体に
使用したものと同じ抗Ｈｐポリクローナル抗体１００μ
ｇ／mlあるいは０μｇ／ml（比較例２）を含有する０．
０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清アルブミ
ン含有）０．０５mlを加え、実施例１で調製したポリス
チレン試験管に入れ、３７℃で２時間免疫反応を行っ
た。

【００２７】次に、実施例１で製造したカタラーゼ標識
抗Ｈｐモノクローナル抗体５．５μｇ／mlを含有する
０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（０．５％牛血清アル
ブミン含有）０．５mlを同試験管に入れ、３７℃で２時
間免疫反応を行った。更に、蒸留水３mlで３回洗浄後、
０．０２Ｍ過酸化水素−０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩
水１．０mlを加え、１０分間酵素反応を行った後、１規
定硫酸１．０mlを加えて反応を停止させ、過酸化水素に
基づく２４０ｎｍの吸光度（Ａ２４０）を測定した。

【００２８】図４に示す通り、固相抗体に使用したもの
と同じ抗体を測定系に添加することにより高濃度側の測
定領域に検量線をシフトでき、高濃度の抗原を含む被検
試料の測定が可能となることがわかる。

【００２９】〔実施例３〕 ○多抗原同時測定用免疫センサーを用いるヒトα−フェ
トプロテイン（ヒトＡＦＰ）、ヒトハプトグロビン（Ｈ
ｐ）の同時測定系への抗体添加フィブロイン水溶液の調製 生糸１００ｇを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
０００ml中に浸漬し、８０℃で３時間精練した。水洗
後、更に０．５重量％のマルセル石けん水溶液５０００
mlに浸漬して８０℃で３時間精練し、セリシン等を実質
的に除去したフィブロイン原料７２ｇを得た。水１００
ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーダー中に塩化
カルシウム１５０ｇを溶解し、７５℃に昇温後、上記の
フィブロイン原料７０ｇを投入し、１時間攪拌下に溶解
した。次いで、１８０ｇの温水（７５℃）を加えて希釈
した。これを冷却した後、ホローファイバー型の透析器
を用いて、流水に対して透析脱塩し、５．７重量％のフ
ィブロイン水溶液１２００mlを得た。塩化カルシウムの
残存量は０．０８％であった。

【００３０】抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体固
定化絹フィブロイン膜の製造 抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を生
理食塩水に溶解し、２５０μｇ／mlの抗体溶液を調製し
た。次に、この溶液を四方を区切ったガラス板上に抗体
量が２０μｇ／ｃｍ² となるように流延し、１５℃で３
時間乾燥した。上記フィブロイン水溶液にグリセリンを
フィブロインに対して３０重量％加え、その溶液を抗体
が塗布されたガラス板に流延し、２０℃で１０時間乾燥
することによって皮膜化させ、はく離した。これを直径
８ｍｍの円形に裁断し、厚さ６０μｍの標記抗ヒトＡＦ
Ｐマウスモノクローナル抗体固定化絹フィブロイン膜を
得た。

【００３１】抗Ｈｐマウスモノクローナル抗体固定化絹
フィブロイン膜の製造 抗Ｈｐマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を生理食塩
水に溶解し、２５０μｇ／mlの抗体溶液を調製した。次
に、この溶液を四方を区切ったガラス板上に抗体量が２
０μｇ／ｃｍ² となるように流延し、１５℃で３時間乾
燥した。上記フィブロイン水溶液にグリセリンをフィブ
ロインに対して３０重量％加え、その溶液を抗体が塗布
されたガラス板に流延し、２０℃で１０時間乾燥するこ
とによって皮膜化させ、はく離した。これを直径８ｍｍ
の円形に裁断し、厚さ６０μｍの標記抗Ｈｐマウスモノ
クローナル抗体固定化絹フィブロイン膜を得た。

【００３２】カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウスモノク
ローナル抗体の製造 （１）チオール化カタラーゼ カタラーゼ溶液０．１６６ml（含量１５ｍｇ）を０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、２．５mlに希釈
し、窒素曝気を６０ml／分で１０分間行い、次にメチル
−４−メルカプトブチルイミデート１ｍｇを加え、窒素
雰囲気下に４℃で２時間反応させた。反応終了後、窒素
雰囲気のままダイアフローメンブラン（アミコン社製）
を用いて限外濾過により濃縮し、これに０．０５Ｍリン
酸緩衝液３ml（ｐＨ７．０）を加え、再び限外濾過し
た。この操作を３回繰り返して未反応のメチル−４−メ
ルカプトイミデートを除き、チオール化カタラーゼ溶液
３mlを得、窒素雰囲気下で保存した。

【００３３】（２）マレイミド化抗ヒトＡＦＰマウスモ
ノクローナル抗体 抗ヒトＡＦＰマウスモノクローナル抗体溶液０．４２ml
（含量１０ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で５．０mlに希釈し、Ｎ−（γ−マレイミドブチロ
キシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）０．５ｍｇをジオキ
サン０．５mlに溶かして加えた。４℃で２時間反応させ
た後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０００
mlで透析（２時間）を２回行ってマレイミド化抗ヒトＡ
ＦＰマウスモノクローナル抗体溶液６ml（含量１０ｍ
ｇ）を得た。

【００３４】（３）カタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウス
モノクローナル抗体 （１）で製造したチオール化カタラーゼ溶液２ml（含量
１０ｍｇ）と（２）で製造したマレイミド化抗ヒトＡＦ
Ｐマウスモノクローナル抗体溶液３ml（含量５ｍｇ）と
を窒素雰囲気下で混合し、４℃で１６時間反応させた。
未反応のマレイミド基をブロックするためシステイン１
ｍｇを加え４℃で３０分間反応後、１２０００回転、５
分間の遠心分離で沈澱物を除去し、高速液体クロマトグ
ラフィーによって目的物を分離精製した。カラムは、Ｓ
ｐｈａｄｅｘ Ｇ−３０００ＳＷ（東洋ソーダ製）を用
い、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出し、
最初の分画を集めカタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰマウスモ
ノクローナル抗体溶液１２ml（含量４ｍｇ）を得た。

【００３５】図１に示す免疫センサーを組み込んだ図２
に示すフロー式測定装置を使用し、表１に示すようなヒ
トＡＦＰ及びＨｐを含む各被検試料について、以下の様
にして繰り返し測定を行い、ヒトＡＦＰ及びＨｐの標準
曲線を作成した。

【００３６】すなわち、反応セル（容量０．２ml）に蒸
留水を満たし、これに表１に示す組み合わせで標準ヒト
ＡＦＰ各々０，２．５，５，１０または２０ｎｇ／ml、
Ｈｐ各々０，５０，１００または２００μｇ／ml、上記
で製造したカタラーゼ標識抗ヒトＡＦＰモノクローナル
抗体５．５μｇ／ml、及び実施例１で製造したカタラー
ゼ標識抗Ｈｐマウスモノクローナル抗体５．５μｇ／ml
を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（１０重量
％馬血清含有）０．４５mlに、固相抗体に使用したもの
と同じ抗Ｈｐマウスモノクローナル抗体１００μｇ／ml
あるいは０μｇ／ml（比較例３）を含有する０．０１Ｍ
リン酸緩衝生理食塩水（１０重量％馬血清含有）０．０
５mlを加えた溶液０．５mlを反応セル（容量０．２ml）
に導入し、７分間静置して免疫反応を行った後、２０ml
／分の流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗浄し
た。

【００３７】次いで、２６．５ｍＭの過酸化水素を含有
する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２mlを反
応セルに導入し、酸素電極の酸素濃度に比例した電流値
を求め、これを電位値に変換し、出力した。続いて、
０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５、食塩２重
量％含有）を２０ml／分の流速で１分間流した後、２分
間静置して結合したヒトＡＦＰとカタラーゼ標識抗ヒト
ＡＦＰマウスモノクローナル抗体を解離させ、更に２０
ml／分の流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗浄し
た。操作はすべて３０℃で行い、酵素反応時以外はすべ
て攪拌を行った。その結果を図５及び図６に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】図５及び図６に示す通り固相抗体に使用し
たものと同じＨｐマウスモノクローナル抗体を測定系に
添加することにより、Ｈｐ高濃度下の測定が可能とな
り、同一希釈において、各々の測定領域でのヒトＡＦＰ
及びＨｐの同時測定が可能となることがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】二抗原同時測定用免疫センサーの概略説明図。

【図２】図３の免疫センサーを組み込んだフロー式測定
装置の概略説明図。

【図３】被検試料に固相抗体と同じ抗体を添加した場合
（○印実施例１）と、添加しなかった場合（●印比較例
１）との一段法におけるＨｐの標準曲線を示す線図であ
り、縦軸は吸光度（Ａ２４０）、横軸はＨｐ濃度（ｎｇ
／ml）である。

【図４】被検試料に固相抗体と同じ抗体を添加した場合
（○印実施例２）と、添加しなかった場合（●印比較例
２）との二段法におけるＨｐの標準曲線を示す線図。

【図５】被検試料に固相抗体の１つと同じ抗Ｈｐマウス
モノクローナル抗体を添加した場合（○印実施例３）
と、添加しなかった場合（●印比較例３）とのセンサー
系におけるヒトＡＦＰの標準曲線を示す線図であり、縦
軸は発生電位（ｍＶ）、横軸はヒトＡＦＰ濃度（ｎｇ／
ml）である。

【図６】実施例３（○印）と比較例３（●印）とのセン
サー系におけるＨｐの標準曲線を示す線図であり、縦軸
は発生電位（ｍＶ）、横軸はＨｐ濃度（μｇ／ml）であ
る。

【符号の説明】

１ 免疫センサー（Ａ） ２ 免疫センサー（Ｂ） ３ 反応セル ４ａ，４ｂ 抗体固定化膜 ５ 酸素透過膜 ６ Ｏ−リング ７ 酸素電極 １０ 二抗原同時測定用免疫センサー １１ 記録計 １２ サンプル供給口 １３ａ，１３ｂ，１３ｃ コック １４ａ，１４ｂ ポンプ １５ 洗浄液 １６ 解離液 １７ 酵素基質溶液

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンドイッチ免疫測定法において、反応
   に先立ち、被検試料に、固相抗体と同様の抗体を添加す
   ることを特徴とする免疫測定法。