JPH02131499A - 細胞毒性薬物コンジュゲートおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、有機化学、免疫学および薬化学の領域に属し
、細胞毒性薬物の投与による治療を必要としている患者
にこの細胞毒性薬物を標的指向的に投与するのに有用な
細胞毒性薬物フンジュゲートに関する。細胞毒性薬物で
処理しようとする細胞に関連する抗原を認識し、したが
ってこの細胞に細胞毒性薬物を運搬する抗体の使用によ
って、薬物コンジュゲートを標的指向性にする。また、
本発明は、このコンジュゲートの合成に使用する中間体
をも提供するものである。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）薬物
による癌の治療は、現在、確立された医学上の一分野で
ある。しかし、使用する薬物は活性な細胞毒性物質であ
り、患者にある種の危険を与える。毒性を制限するため
には、投与量および投与回数を厳密に管理しなければな
らない。本発明は、ビン力（ｖｉｎｃａ）薬物を癌細胞
に指向させるために抗体を使用し、それにより患者の正
常な組織に接触する細胞毒性薬物の量を減少させること
によって毒性の問題を緩和する。また、抗体と薬物を連
結するために本発明で用いるリンカーは、不安定であり
、標的の癌細胞のところで薬物を放出する。

（課題を解決するための手段） 本発明は、薬物を特に良好に放出させるリンカーシステ
ムによって抗体に連結させた、生理学的に活性な形態の
一連のビン力薬物フンジュゲートを提供するものである
。

本発明は、以下の式（Ｉ）で示される細胞毒性薬物コン
ジュゲートを提供するものである：ｔ Ａｂ［ＣＯ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ＝Ｎ−ＨＮ−Ｖ］−　　
（Ｉ）［式中、Ａｂは、望まし《ない細胞関連の抗原を
認識する、生理学的に許容しうる抗体またはその抗原認
識フラグメントであり、 ｍは、１〜約１０の整数であり、 Ｚは、水素原子またはＣ１〜Ｃ３非分技鎖状アルキルで
あり、 ｘは、結合手、０１〜Ｃ４アルキレン、Ｃ，〜Ｃ４アル
ケニレンまたはアミノＣ．〜Ｃ４アルキレンであり、 Ｙは、結合手、カルボニル、一〇−、一Ｓ−またはスル
ホニルであり（ただし、Ｘがアミノアルキレンであると
きにはＹはカルボニルまたはスルホニルであり、Ｘが結
合手であるときにはＹは結合手マたはカルボニルである
）、 Ａｒは、ピロリル、ｍ−フェニルまたはｐ−フエニルで
あり、このフェニル基はプロモ、クロロ、フルオロ、メ
トキシ、ニトロまたはＣ，〜Ｃ，アルキルでモ／一また
はジー置換されていてもよく、Ｖは以下の式（■）で示
されるビン力薬物である：Ｒｌ （式中、Ｒは、Ｈ，ＣＨ，またはＣＨＯであり、Ｒ″と
Ｒ３が独立している場合、Ｒ３はＨであり、ＲｌとＲ′
のうち一方はエチルであり、他方はＩＩまたは０１−１
であり、 Ｒ’とＲ″がそれらが結合している炭素と一緒になって
いる場合、これらはオキシラン環を形成し、この場合、
Ｒ１はエチルであり、Ｒ４はＨ，（Ｃ，〜Ｃ３アルキル
）−Ｃ　ＯまたはクロロＤＩ　換（　Ｃ　＋〜Ｃ，アル
キル＞−Ｃ　Ｏである）］。

また、本発明は、式： Ｒ’−Ｇｏ−Ｘ−Ｙ−Δｒ−Ｃ＝Ｎ−１｛Ｎ−Ｖ［式中
、Ｒ６はヒドロキシ、酸活性化基、塩を完成する部分、
または酸保護基であり、池の可変の甚は前記定義と同じ
である］ で示される、上記コンジュゲートを製造するための新規
中間体をも提供するものである。

さらに、本発明は、患者に本発明のコンジュゲートを非
経口的に投与することによって望まし《ない細胞の増殖
を抑制する方法を提供するものである。本発明の別の態
様は、非紅口投与が可能な媒体に分散させた本発明のコ
ンジュゲートからなる医某治療組成物である。

また、本発明のさらに別の態様は、前記中間体と前記式
において記戦した抗体またはそのフラグメントとを反応
させることからなる前記コンジュゲートの製造法である
。方法の１つは、式：Ｈ，Ｎ　−Ｈ　Ｎ−Ｖで示される
ビン力　ヒドラジドと式；Ｚ 鵞 Ａｂ［ＧＯ−Ｘ−Ｙ−Δｒ−Ｃ　＝Ｏ　Ｊで示される中
間体とを反応させることからなる。

本発明のビン力薬物コンジュゲートは、抗体、リンカー
およびヒドラジド形のビン力薬物からなる。本フンジュ
ゲートの顕著な治療特性は、主として、標的細胞に対す
る薬物の最大毒性が得られるように抗体からピンカ薬物
が放出されるように設計したリンカーの特性から導かれ
る。フンジュゲートの３つの主成分について個々に説明
し、次にコンジュゲートの合成について説明し、最後に
、コンジュゲートの合成例およびその生物学的有効性を
示す。

逸体 本フンジュゲートの抗体部分の必須特性は、望ましくな
い細胞関連の抗原を認識する能力である。

ビン力薬物が多種多様の細胞に対して細胞毒性が高いと
いうことは理解されるであろう。したがって、抗体は、
この薬物によって死滅させるかまたは抑制しようとする
細胞を認識しかつこれと結合する能力の点て選択される
。

抗体の供給源は、本発明を限定するものではない。Ｉｇ
Ｇ，ＩｇＡ，［ｇＭ，ＩｇＥおよびＩｇＤを含む免疫グ
ロブリンのあらゆるクラスまたはサブクラスから選択す
ることができる。同様に、ビン力薬物の作用が有効であ
る細胞を抗体が標的とする限り、供給源の種は限定され
ない。

現在、当分野ではモノクローナル抗体が最もよく薬物コ
ンジ一ゲートにおいて使用されている。

本発明においてもこれらを用いるのが好ましいが、ポリ
クローナル抗体が除外されるわけではない。

比較的新しい型の抗体はキメラ抗体であるが、これは、
所望の抗体の抗原結合領域をコードし、かつ他の所望の
アミノ酸配列をもコードしている修飾ＤＮＡを発現させ
る組換え技術によって実験室内で調製される。すなわち
、ある種由来のある部分と別の種由来の他の部分からな
るキメラ抗体を得ることができ、これを本発明に用いる
ことかできる。

処置すべき細胞を標的とし、許容されないほどコンジュ
ゲートを毒性にしない限り、抗体の供給源および性質は
限定されない。当業者なら本明細書の開示に基づき、容
易に、候補の抗体を用いてコンジュゲートを調製するこ
とができ、それらを評価することができる。便宜のため
、抗体とコンジュゲートを評価する方法を若干説明する
。まず、抗体は、相当量の抗体を調製するに充分な安定
性を有するハイブリドーマによって産生されるべきであ
る。抗体自体は、コンジュゲーシタン反応および精製が
容易なものであるべきであり、特に、相当な濃度で化学
的操作をするに充分な水溶性を有しているべきである。

初めに、候補の抗体を用いて調製したコンジュゲートを
抗原結合能力について評価する。遊離抗体の結合能力か
らのそれほど大きくない減少が予想されるが、これは許
容される。次いで、このコンジュゲートを試験して、抗
原ポジティブな（陽性の）細胞に対するそのインビトロ
の細胞毒性を測定する。有効なコンジュゲートは、同じ
検定において、遊離薬物よりも若干低い細胞毒性を有す
る。この最初の２つの試験において許容性であるコンジ
ュゲートを、ジョンソン等［Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄＬ
ａｇｕｚｚａ，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　４７，　３
１１８−２２　（Ｉ９８７）］が教示しているヌードマ
ウスヒト腫瘍異種移植モデルにおいて評価する。ヌード
マウスにおいて候補のコンジュゲートは、遊離薬物、遊
離薬物と遊離抗体の混合物、およひ標的指向性ではない
免疫グロブリンとのフンジュゲートに対して試験される
べきであり、これらのすべてよりも効果的かつ安全であ
るべきである。投与量および投与時間の試験は、この異
種移植モデルにおいて行われるへきである。

異種移植モデルにおいて効果があったフンジュゲートは
、ヒトで観察されるパターンと同様のパターンで関係の
抗原を発現することが知られている動物において試験を
行う。もし、このような試験においてコンジュゲートが
抗原に対して有意な結合度を生じ、かつ異種移植モデル
から予想される治療性の用量で毒性がそれほどでないな
らば、このＩＡ　補のフンジュケートは治療上の潜在能
力を有すると考えることができる。

現在知られている多数の抗体を本発明において用いるこ
とができる。小要な特異的抗体はＬ／ＩＣ２であり、こ
の抗体はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン［ロックビル、メリーランドコにＩＩ　Ｂ　９　６　
８　２として寄託されているノ＼イブリドーマによって
産生される。

Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃハイプリドーマ、ＨＢ２１由来の抗体５
Ｅ９Ｃ１１は、多数の腫瘍が発現するトランスフェリン
レセブターを認識する。ナショナル・キャンサー・イン
ステイチュート（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＣａｎｃｅｒＩｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ）から入手可能な８７２．３と称される
抗体は、乳癌および結腸癌の両者によって発現される抗
原を認識する。

非腫瘍抗原に対して反応性を有する２つの重要な抗体は
ＯＫＴ３とＯＫＴ４てあり、それぞれ末梢のＴ一細胞お
よびヒトＴ−ヘルパー細胞に結合する。これらはそれぞ
れＣＲ［、８００１およびＣＲＬ８００２としてＡＴＣ
Ｃに寄託されているノ１イブリドーマから得られる。

様々な治療目的に有用な抗体の別の供給源は、以下のと
おりである。免疫転形および腫瘍治療に有用な抗一ヒト
リンパ球および単核細胞抗体は、ＡＴＣＣ培養物ＨＢ２
、Ｈ　Ｂ　２　２、ＨＢ４４、ＨＢ７８およびＨＢ１３
６から得られる。腫瘍治療に有用な抗一トランスフエリ
ンレセブター抗体は、ＡＴＣＣ培養物ＨＢ８４から得ら
れる。ＡＴＣＣ培養物ＨＢ８０５９は、結腸直腸癌モノ
シアロガングリオシドに対する抗体を産生じ、培養物Ｈ
　Ｂ８１３６は、免疫転形およびＴ一細胞白血病治療に
有用な成熟ヒトＴ一細胞表面抗原に対する抗体を産生す
る。

当業者なら、さらに別の候補抗体の入手先を容易に調べ
ることができる。容易に入手可能な抗体に関する特に有
用な情報源は、リンスコノッ・ディレクトリー・オブ・
イム／ロジカル・アンド・バイオロジカル・リージエン
ッ（Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓ　Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ　ｏｆ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｏｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ）［リンスコッツ・ディレ
クトリー（９４９４１カリフォルニア、ミル・バリー、
グレン・ドライブ４０番）か−ら発行］である。１９８
４年版には、６０種以上の腫瘍関連のモノクローナル抗
体が挙げられており、それぞれの市販元が少なくとも１
つ挙げられている。

種々の望ましくない細胞が本発明のコンジュゲートによ
って処置されることは理解されるであろう。ビン力薬物
は様々なタイプの癌に対して効果的であることがよく知
られており、癌細胞が本発明のコンジュゲートによって
標的とされるべき細胞である。

特に、悪性疾患を持続成長させる細胞、およびｂＬｌ）
ｌ瘍免疫性の展開を制御する免疫系の細胞も意図の範囲
内である。標的とされる特異的なタイプの癌一関連細胞
としては、扁平上皮癌細胞、腺癌細胞、小細胞癌細胞、
経膠腫細胞、黒色腫細胞、腎細胞癌細胞、移行上皮癌細
胞、肉腫細胞、血管系！ｌＩＩ！瘍を支持する細胞、な
らびに白血病およびリンパ腫などのリンパ球性腫瘍の細
胞が挙げられる。

しかし、ピン力薬物は、多くの別のタイプの細胞に対し
ても細胞毒性である。したがって、抗体の適切な選択に
よって、例えばウィルス粒子に感染した細胞、種々の有
害物質に感染したＴ細胞、および自己免疫疾患の進行を
促進するかもしくは制御する免疫系の細胞などの望まし
くない細胞を殺すかまたは徹底的に変えるために本コン
ジ一ゲートを用いることができる。

適切に選択した抗体のフラグメントが無傷の抗体と同一
の効果を有することは理解されるであろう。したがって
、本発明の実施において、処置すべき細胞関連の抗体を
認識する抗体フラグメント、好まし《はＦ　（ａｂ”）
，フラグメントはｌ１］（傷の抗体と同様に有用である
。

リンカー基が抗体と反応して結合する正確な機序は式（
Ｉ）においては示されておらず、完全にはわかっていな
い。この反応は、以下に示すように、アシル化であり、
抗体分子上の多数の部位をアシル化する。最も普通には
、抗体のアシル化は、リジン部分の遊離アミノ基上で進
行するものと考えられる。しかし、このアシル化は、ヒ
ドロキシ基、フェノール基、イミタゾール環およびおそ
らくは他の部分をも攻撃するであろう。

式（Ｉ）は、１〜約１０のリンカ一一薬物部分がそれぞ
れの抗体分子に結合することを示している。

勿論、抗体分子あたりのこのような部分の数は平均数で
あるが、これは、あるバッチのコンジュゲートか抗体に
対してある一定割合の薬物−リンカーを有する分子を必
ず含んでいるためである。高価な抗体の最も効率的な利
用が、多数の薬物分子が６抗体分子に結合したときに得
られるのは勿論のことである。しかし、過剰な分子数の
薬物一リンカ一部分の結合は、通常、抗原を認識しこれ
と結合する抗体の能力、および水一溶解性に対して逆効
果を有するので、ｍの妥協値を見つけなければならない
。一般に、ｍの好ましい値は、約４〜約１０である。他
の好ましい値は約３〜約８である。

ビン力薬物 ビンカ薬物は、この数年間、薬学的および医学的研究の
ス・１象であった。極めて多数のものか研究され、文献
に記載され、特許され、そのいくつかはヒト癌の治療用
に認可されている。本発明のコンジュゲートにおいて用
いるビン力薬物は、それ自体は医薬の分野で知られてお
り、当業者なら容易に入手し、用いることができる。便
宜のため、この薬物について若干説明する。

前記式（ＩＩ）において、Ｒがメチルであり、Ｒ１がヒ
ドロキシルであり　Ｒ　ｔがエチルであり、Ｒ３がＨで
あり、Ｒ４がアセチルである場合、ＶＬ，Ｂ（ビンブラ
スチン）を表し；Ｒがホルミルであり、Ｒｌがヒドロキ
シルであり、Ｒ２がエチルであり、Ｒ３がｌ｛であり、
Ｒ４かアセチルである場合、ピンクリスチン（ＶＣＲ）
を表し；Ｒがメチルであり、Ｒ１がエチルであり、Ｒ２
がヒドロキシルであり、Ｒ３がＨであり　Ｒ　４がアセ
チルである場合、ロイロシジンを表し；Ｒがメチルまた
はホルミルであり、Ｒ′がエチルであり、Ｒ８とＲ３が
それらが結合している炭素と一緒になってα一エポキシ
ド環を形成し、Ｒ４がアセチルである場合、各々ロイロ
シンおよびロイロホルミンを表し；Ｒがメチルであり、
Ｒｌがエチルであり、Ｒ−よびＲ３がＨであり、Ｒ４が
アセチルである場合、デオキシＶＬＢ″Ｂ”（４−デオ
キシ口イロシジンまたは４゜一エピデオ牛シＶＬＢ）を
表し；Ｒがメチルであり、Ｒ２がエチルであり、Ｒ１お
よびＲ３がＨであり、Ｒ４がア七チルである場合、デオ
キシＶＬＢ゛八″または４゜−デオキシＶＬＢを表し；
ＲがＣＨＯであり、Ｒ１がエチルであり、Ｒ２およびＲ
３がＨであり　Ｒ　４がアセチルである場合、４゜一エ
ピデオキシピンクリスチン（Ｉ−ホルミルーｌーデスメ
チル−４゛−デオキシ口イロシジン）を表す。

ビンカ薬物は、米国特許第４，　２０３，　８９８号［
第１２欄、第６５行以下、および実施例３、第１８欄］
に記載の方法によって本発明のコンジコゲートにおいて
用いられるヒドラジトに転換される。この方法では、約
６０°Ｃの密封管中、無水ヒドラジンを、エタノール中
、適切なビン力アルカロイドと反応させる。

Ｃ−４のアセトキシ基が塩基性反応条件下で加水分解さ
れるので、この反応の生成物は４−デスアセチル３−カ
ルボキシヒドラジドである。Ｃ４のエステル［式（ＩＩ
）においてＲ′が（Ｃ，〜Ｃ３アルキル）−ＣＯまたは
クロロ（Ｃｌ〜Ｃ，アルキル）一ＣＯである］の製造が
所望である場合には、上記デスアセチルＣ−３カルボキ
シヒドラジドを初めにアセトンと反応させることによっ
て保護し、Ｎ鵞−プロピリデン誘導体を得る。次いで、
アシル化に対して効果的に保護されているヒドラジドの
アシル化可能なＮＨ．基につき、この保護誘導体を常法
によりハロゲン化アシル（例えば、塩化クロロアセチル
）またはアシル無水物（例えハ、無水ブロピオン酸）で
アシル化することができる。

次いで、保護基を酸処理によって除去することができる
。通常起こるようなＣ−３ヒドロキシルのアンル化が起
こった場合でも、このＣ−３アシル基は湿潤シリカゲル
による処理によって優先的に除去することができる［ハ
ーグローブ（Ｉｌａｒｇｒｏｖｅ）の米国特許第３．　
３９２，　１７３号参照］。

以下に、本コンジュゲ−１・において用いることかでき
る式（Ｉｆ）で示されるビン力薬物の好ましい例とそれ
らの当技術分野において知られている慣用名を挙げる： ４−デスアセチルーＶＬＢ−３−カルボキシヒドラジド
（Ｒ　’＝　Ｒ　３＝水素原子、Ｒ＝メチル、Ｒｌ＝ヒ
ドロキシ、Ｒ！一エチル）・ ４−デスアセチルーＶＣＲ−３−カルボキシヒドラジド
（Ｒ　’＝　Ｒ　’＝水素原子、Ｒ＝ＣＨＯ、Ｒ１＝ヒ
ドロキシ、Ｒ２＝エチル） ４−デスアセチル−４′一エピデオキシーＶＬＢ−３−
カルポキシヒドラジド（Ｒ　’＝　Ｒ　２＝　Ｒ　’＝
水素原子、Ｒ−メチル、Ｒｌ−エチル）４−デスアセチ
ルーＶＬＢ−４−プロビオニル＝３−カルボキシヒドラ
ジド（Ｒ’＝ＣＯＣＨ，ＣＩ．、Ｒ−メチル、ＲＩ＝ヒ
ドロキシ、Ｒｔ＝エチル、Ｒ３一水素原子） リンカー リンカー基、Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ（Ｚ）は、一端がカルボ
ニルと、他端がヒドラジドと結合する有機系の基である
。ビン力ヒドラジドへの結合は、アルキリデンヒドラジ
ド結合である。しかし、この結合は溶液中で、特に生理
学的溶液中で、池の形態で存在することができることは
理解されるであろう。二重結合が開裂し、官能基または
プロトンを′γ素原子および炭素原子と結合させること
ができる。したがって、ヒドロキシ基または他の酸素結
合種をこの二重結合の一方に結合させることができ、ア
ミノ結合部分も同様に結合させることができる。水はこ
れら原子の１つに弱く結合することができる。抗体の部
分も、これら原子の１つに対して弱い結合を形成するこ
とができ、１以上のこのような反応が起こって混合物を
形成することもある。しかし、このような生成物は一時
的なものであり、アルヰリデン　ヒドラジドの形態がこ
れら生成物の通常のかつ安定な形態であるので、本明細
書中では、コンジュゲートをアルキリデンヒドラジドの
形態で記載する。

Ｘ基は、単なる結合手であってもよいし；メチレン、エ
チレン、ブチレン、２．２−７’ロビレン、インブチレ
ンもし《は１，２−ジメチルエチレンのようなＣ，〜Ｃ
４アルキレンであってもよいし；ビニル、アリルもしく
は２−メチルアリルのようなＣ，〜Ｃ，アルケニレンで
あってもよいし；また、アミノメチレン、アミンエチレ
ン、アミ７−３−メチルブロビレン、アミノー１．１−
ジメチルエチレンのようなアミノＣｌ〜Ｃ４アルキレン
であってもよい。Ｘがアミノアルキレンである場合、ア
ミノ基はＹ基と閘接している。好ましいＸ基としては、
結合手、ならびにメチレン、エチレン、アミノメチレン
およびアミ／プロピレンのようなＣｌ〜Ｃ，アルキレン
およびアミノーＣＩ〜Ｃ３アル牛レンが挙げられる。

Ｙ基は架橋基であり、単なる結合手、またはカルボニル
、スルホニル、酸素原子または硫黄原子であってよい。

好ましいＹ基は結合手、酸素原子およびカルボニルであ
る。

Ｘ基およびＹ基は相互に関係しており、全てではないが
Ｙ基がある種のＸ基と関連していることもある。Ｘがア
ミノアルキレンである場合には、Ｙはカルボニルまたは
スルホニルだけであり、Ｘが結合手である場合には、Ｙ
は結合手またはカルボニルだけである。

Ａｒ基はピロリルまたはフエニルである。フェニル基は
メタ位またはパラ位で結合し、このフエニル基は、非置
換であってもよいし、また、前述の基でモノーまたはジ
ー置換されていてもよい。

代表的な置換Ａｒ基としては、２−ブロモーｍ−フェニ
ル、３−クロローｐ−フェニル、２．５１フルオローｐ
−フェニル、３−メトキシ−５−クロロｐ−７エニル、
２．６−ジニトロ一ｍ−フエニル、３−プロビルーｐ−
フエニル、２−メチル−５−フルオローｍ−フエニル等
が挙げられる。好ましいＡｒ基としては、非置換フェニ
ル、特にｐ−フェニル、およびモノ置換フェニル、特に
モノ置換ｐ−フェニル、ならびにピロリルが挙げられる
。

ペンダント基Ｚは水素原子または０１〜Ｃ３直鎖状アル
キルであってよく、メチル、エチルおよびプロビルが含
まれる。好ましいＺ基は水素原子およびメチルである。

本発明のコンジュゲートをさらに詳し《説明するため、
以下に代表的なリンカー基、Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ（Ｚ）の
名称を挙げる。それぞれのリンカー基は、首尾一貫して
基を命名するために、命名法の規則にはとらわれず、リ
ンカーのＣ（Ｚ）末端から始めカルボニル末端に続ける
ことによって命名している。

２−メチリデニルピロールー５−イル、１−（３−メチ
リデニルピロール−４−イル）アセチル、 １−（２−メチリデニルピロールー４−イルオキシ）エ
チレニル、 １−［２−（Ｉ．１−エチリデニル）ビロールー５＝イ
ルチオ］−２−メチルエチレニル、１−（３−メチリデ
ニルフェニル−２−メチルブロピレニル、 １−（２．６−ジクロロー４−メチリデニルフエニルチ
オ）エテニレニル、 １−［２．４−ジメチル−３−（Ｉ．１−プロピリデニ
ル）フェノキシ］−２−プロペニレニル、１−［３−ブ
ロモー１−（Ｉ．１−プチリデニル）フェニル］一３−
ペンテノイル、 ４−メチリデニル−２−ニトロ−４−ペンズアミドメチ
レニル、 １−（４−メチリデニルフエニルスルホンアミド）エチ
レニル、 １−（３−メトキシー４−メチリデニルフェニルスルホ
ンアミド）−３−メチルプロピレニル。

本発明のフンジュゲートに用いられる好ましいリンカー
基は、４−ペンジリデニル、ｌ−（４−メチリデニルベ
ンズアミド）エチレニル、１−（４一メチリデニルフェ
ニル）エテニル、４−メチリデニルフエノキシメチレニ
ル、ｌ−（２−メチリデニルピロールー５−イル）エチ
レニル、および１−［４−（Ｉ．１−エチリデニル）フ
ェノキシ］アセチルである。

（以下、余白） 中間体 本発明の中間体は、抗体と反応させてコンジュゲートを
製造するための反応体である。これらはビン力ヒドラジ
ドとリンカ一部分からなり、その末端はカルボン酸また
は修飾カルボン酸である。

この中間体を構成している可変の基については、末端の
Ｒ５基以外は上に記した。Ｒ５は、ヒドロキシ基であっ
てもよいし（酸を形成）、また、下記の「合成」の項で
説明するように、カルボン酸活性化基であってもよい。

さらに、塩を完成する部分（例えば、アルカリ金属イオ
ン、アルカリ土類金属イオン）、またはアミ７基（例え
ば、シェチルアミノ、ジエタノールアミノ）なとであっ
てもよい。

また、例えばグリーン［Ｇｒｅｅｎｅ，　Ｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　　ｉｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ　
　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　　胃ｉ１ｅｙ，　　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ，　　１９８１，　ｐｐ．１５２−９２］が
教示している酸保護基であってモヨイ。このような保護
基には、エステル類、アミド類、およびヒドラジド類が
含まれ、特に、フェナシルオキシ、トリクロロエ１・キ
シ、ｔ−ブトキシ、トリフエニルメト牛冫、トリメチル
ンリルオキシ、スタニルエステル類、ジメチルアミノな
どのＲ５基が含まれる。

好ましい中間体は、上記の好ましいＸ，Ｙ、およびＡｒ
基を含むものである。反応用に好ましい中間体はＲ５が
酸活性化基であるものであり、Ｒ５が他の形態のものは
活性型製造用の中間体として有用である。

また、この中間体類はそれ自身が抗癌薬として有用であ
り、その目的のためには、この中間体が含有しているビ
ン力薬物と同じ方法および同様の用量で投与される。

合成 本発明のフンジュゲートは、現在当分野で知られている
方法に従ってそれぞれ実施される工程１１ｆによって製
造される。抗体か関与する各工程で第１に配慮すべきこ
とは、勿論、抗体の構造および機能をでき・るだけ保存
すること、並びに中間生成物および最終生成物の精製が
可能であることである。これらの方法の範囲内において
、以下に示す主要な順序のいずれかで反応工程を実施す
ることができる：即ち、リンカーを抗体に結合させ、次
にビン力ヒドラジドをこのリンカーと反応させてもよい
し、また、リンカーとビンカヒドラジドを反応させ、得
られた中間体を第２の工程で抗体に結合させてもよい。

出発化合物（これからリンカー基を誘導する）の製造は
通常の有機化学方法に従って行う。これら化合物の多数
は市販されており、残りの化合物は当業者なら製造する
ことができる。

本発明の中間体およびコンジュゲートの合成を以下の反
応式で示す； 反応弐Ａ Ｚ Ｒ’−Ｃｏ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ＝Ｏ　　＋　　Ｈ，Ｎ−
ＨＮ−ＶＺ −−　→　　　Ｒ’−Ｇｏ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ＝Ｎ−Ｉ
Ｎ−Ｖ［ここで、Ｒ’は酸保護基、ヒドロ牛シ、または
塩を完成する（塩となっている）部分であり、ケトンま
たはアルデヒドはジメチルまたはジェチルアセタールの
形態であってもよいコ Ｒ’−Ｃｏ−Ｘ−Ｙ−Δｒ−Ｃ＝Ｎ−ＨＮ−Ｖ　　＋　
　Ｒ７−ＨＺ −−→　　　Ｒ７−Ｃｏ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ＝Ｎ−ＨＮ
−Ｖ［ここで、Ｒ７は後記の酸活性化基である］Ｚ Ａｂ　　＋　　ｍ［Ｒ’−Ｃｏ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ＝Ｎ
−ＨＮ−Ｖ］　　→　１反応式Ｂ Ｚ Ａｂ　　＋　　ｍ［Ｒ７−Ｃｏ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ・Ｏ
］Ｚ −−→　　　Ａｂ［ＣＯ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ＝Ｏ］ｍに
こで、ケトンまたはアルデヒドはジメチルまたはジエチ
ルアセタールの形態であってもよい］Ｚ Ａｂ［ＣＯ−Ｘ−Ｙ−Ａｒ−Ｃ＝○コｍ　　＋　　ｍ（
　ＦＩ　２Ｎ　−Ｈ　Ｎ−Ｖ）　　→　１ビン力ヒドラ
ジド：Ｖ−ＮＨ−ＮＨ，は、塩基として、またはその酸
付加塩として用いることかできる。硫酸塩が特に好都合
である。しかし、通常の酸付加塩を調製してもよく、こ
れらは後の合成のための都合のよいビンカヒドラジド形
を与える。

例えば、塩酸、臭化水素酸、トルエンスルホン酸、メタ
ンスルホン酸、安息香酸、マレイン酸、硝酸、リン酸な
どの塩類を、特定の反応条件において都合のよいものと
して用いることができる。

Ｒ７基はカルボン酸活性化基であり、アシル化試薬とし
て使用するためにカルボン酸を活性化する際によく用い
られる周知の基に中から選ばれる。

ペプチドの化学で用いられる活性化基が本発明において
特に有用である。例えば、スクシンイミドオキシ、フタ
ルイミドオキシ、メタンスルホニルオキシ、トルエンス
ルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、ベンゾト
リアゾリルオヰシ、クロロ、ブロモ、アジドなどの基が
活性化基として普通に用いられる。好ましいカルボン酸
活性化基は、スクシンイミドオキシ、フタルイミドオキ
シ、およびペンゾトリアゾリルオキシである。

カルボン酸活性化基は、例えば、ジシクロへキシル力ル
ポジイミドあるいはその他の通常のエステル化試薬を使
用することによって、出発化合物ＣＲ”−Ｃｏ−Ｘ−Ｙ
−Ａｒ−（Ｚ）Ｃ＝Ｏ］または中間体のカルボン酸のと
ころに容易に配置される。この反応は、ジオキサン、テ
トラヒド口フラン、塩素化炭化水・素などの不活性有機
溶媒中で行われ、約Ｏ〜５０゜Ｃの中程度の温度で行う
ことができる。活性化したリンカー中間体の製造は、後
記の製造例においてさらに詳しく説明する。

本発明フンジュゲート合成の種々の工程は、本方法を行
う装置の生産効率を最大にするように、および収率を最
大にするように操作することができる。全てではないが
ほとんどの場合、抗体それ自体が本方法中で最もコスト
が高《、従って、本方法の効率化には抗体に基づ《収率
の最大化が必要になる。即ち、最適の操作条件は、使用
する特定の抗体の最大の安定性が得られる条件によるで
あろう。さらに、抗体に基づく収率の最大化は、通常、
本方法の最後の工程は抗体と中間体の反応であるべきで
あるという結論を導く。最適の操作条件は、抗体の利用
率を最大にするため、およびそれよりは若干度合いは低
いが高価なビン力薬物の利用率を最大にするため、実質
的に過剰のリンカー中間体を用いることを必要とするで
あろう。

中間体または活性化リンカー中間体を抗体と反応させる
ための条件を選択する際の第１の平要問題は、抗体の安
定性の維持である。従って、抗体を損なうことのない組
成の水性媒体中で反応を行う。特に適した水性媒体はホ
ウ酸緩衝液であり、ホウ酸イオン濃度が約０．１〜０．
５モルの範囲内である緩衝液である。反応媒体のｐＨは
中性〜わずかに塩基性であるべきであり、例えば約７〜
９の範囲内である。反応媒体は水性であるが、少量の有
機溶媒の存在は有害ではなく、好都合であることもある
。例えば、中間体またはリンカー中間体を少量の有機溶
媒に溶解し、この有機溶液を抗体水溶液に加えるのが有
利であることもある。このような使用に適した有機溶媒
には、例えば、ジメチルホルムアミド、テトラヒド口フ
ラン、ジオキサンまたはグリコールエーテルが含まれる
。

一般に抗体の溶解性は高くないので、低濃度で反応を行
う必要がある。例えば、抗体の濃度は、水性媒体１ｍＱ
あたり約５〜２５ｍｇの範囲内であるのが普通である。

上記のように、１〜約１０モルのリンカーおよび薬物を
１モルの抗体に結合させる。このコンジュゲーション比
を得るために、通常、過剰量のリンカー中間体または中
間体を用いることが必要である。アシル化条件下での抗
体の反応性は幾分変化しやすい傾向にあるが、本方法に
おいては、１モルの抗体に対して約５〜約３゛０モルの
リンカー中間体または中間体を用いるのが普通である。

抗体のアシル化は、数分間〜数時間、約０〜約４０℃の
範囲の温度で進行させる。この反応は本来かなり早いも
のであるので、通常、抗体の安定性が容認されつる比較
的低い温度において本方法の許容しつる生産効率を得る
ことができる。本発明のコンジニゲート、および抗体を
含有する各種中間体産物は常法に従いクロマトグラフィ
ーによって精製するのが好都合である。後記の製造例お
よび実施例には代表的な精製法を示している。抗体が関
与している反応の進行は、抗体一薬物フンジュゲートを
分析する際に一般に用いられる二重波長紫外線分析によ
って追跡することができる。

クロマトグラフィーによる精製は、希釈緩衝水溶液（後
の工程において水性反応媒体として用いられるものと同
じ水性緩衝液であることが多い）で溶離することによっ
て行うことができる。

ビン力ヒドラジドＶ　−Ｎ　Ｈ　−Ｎ　Ｈ　ｔとリンカ
ー中間体の反応は早くかつ容易な反応であり、反応が反
応弐Ｂの第２工程のように行われるときには、上述のよ
うな水性媒体中、ほぼ周囲温度で十分に進行する。特に
有用な媒体は希酢酸緩衝液、とりわけわずかに酸性ｐＨ
（例えば、約５〜７）の０．１モル酢酸ナトリウム緩衝
液である。その他のわずかに酸性の緩衝液、例えばホウ
酸、わずかに酸性のリン酸緩衝液、生理学的緩衝食塩水
なども用いることができる。反応が反応式八の第１工程
のように行われるときには、テｌ・ラヒドロフラン、ジ
オキサン、ジメチルホルムアミドなどの有機溶媒中でさ
らに効率的に行うことができる。ビンカ薬物の反応は暗
所で行われるべきである。

本フンジニゲートの合成を以下の製造例および実施例に
よりさらに詳し《説明する。

製造例ｌ　４−デスアセチル−２３−デスメトヰシピン
ブラスチン・４−カルポキシベンジリデンヒドラジド ４−デスアセチル−２３−デスメトキシビンブラスチン
・ヒドラジド（Ｉ．．３ｇ）をテトラヒド口フラン（５
０ｉ＋２）に溶解し、これに無水硫酸ナトリウム（５９
）および４−カルポキシベンズアルデヒド（２ｇ）を加
えた。この混合物を窒素下、周囲温度で２日間撹拌し、
次いで濾過し、真空下で蒸発乾固した。この残留物をジ
クロ口メタン（５０ｘ＆）に溶解し、水で２回洗浄した
。次いで、この有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、シリ
カゲル力ラムを用い、９５：５の酢酸エチル：メタノー
ルから１：１の酢酸エチル：メタノールまで直線的に変
化する溶媒（８１２）で溶離する高速液体クロマトグラ
フィーで精製した。生成物を含有している分画を合わせ
、真空下で蒸発乾固して４９０ｘｙの標記化合物を得、
これを質量スペクトルで同定すると分子量９００の分子
イオンが示された。

製造例２　４−デスアセチル−２３−デスメトキシビン
ブラスチン・４−（Ｎ−スクシンイミドオキシ）カルボ
ニルベンジリデンヒドラジド製造例１の中間体（２４７
巧）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６３ｇ＋９）に
加え、ジグ口口メタン（８村）を加えた。この混合物を
５分間撹拌し、次にジシクロへキシルカルボジイミド（
Ｉ１３ｍｇ）を加え、続いてＩ）−トルエンスルホン酸
（５２即）を加えた。この混合物を合計１時間撹拌し、
次いで水浴で冷却し、ｐＨ７の０．　０　５Ｍ一塩基性
リン酸カリウム緩衝液３ｍＱずつで２回抽出した。この
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、次にシリカゲルクロ
マトグラフィーにかけ、９５：５のクロロホルム：メタ
ノールで溶離した。生成物含有の分画を合わせ、真空下
で濃縮して２２７ｍｇの所望の中間体を得た。

害涜Ｍｌ　抗体００７Ｂと４−デスアセチル２３−デス
メトキシビンブラスチン・カルボニル一４−ペンジリデ
ンヒドラジドのコンジュゲート抗体００７Ｂは、バルキ
等［Ｖａｒｋｉ　ｅｔ　ａ１、，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ　４４，　６８１−８６　（Ｉ９８４）］
が開示している抗体ＫＳＩ／４を産生するハイブリドー
マから導かれるサブクローンのハイブリドーマによって
産生される。００７Ｂの一部を１　０　．　３　ｙｔ９
／Ｍ（ｉノ濃度で０．３４Ｍホウ酸緩衝液（ｐ｝［８．
６）中へ透析した。この抗体溶液の一部（Ｉ９．４ｆｆ
＆）に、製造例２の中間体（Ｉ３ｏ）をジメチルホルム
アミドの溶液（Ｉ．６ｊ＋のとして滴下した。この混合
物を暗所中、周囲温度で２時間撹拌し、次いで遠心した
。この上清をセファデックスＧ　２　５　（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘＧ２５；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋　Ｐｉｓｃａｔ
ａｖａｙ，　ＮＪ）のゲル濾過にかけ、ｐＨ７．４の生
理的緩衝食塩水で溶離した。

この溶出液を０．２μ肩の多孔膜で濾過し、紫外線分析
法で分析した。得られた生成物溶液（３ＦＭ）は、コン
ジュゲーション比が抗体１モルに対しビンカ薬物４．１
モルであるフンジュゲートを３３６　ｙ９／肩Ｑで含有
していた。

このコンジュゲートを、雌性チャールズ・リバ一ヌード
マウス中のＵＣＬＡ／Ｐ３肺腺癌の異種移植片に対し、
インビボで試験した。この試験は、各マウスに１０’の
ＵＣＬＡ／Ｐ３腫瘍細胞を皮下移植することから始めた
。移植後のそれぞれ２、５、および８日目に、緩衝生理
食塩水中のコンジニゲートまたは製造例２の中間体を各
マウスに注射した。対照のマウスには食塩水だけを注射
した。フンジュゲートの用量またはビン力中間体の用量
（ピン力ヒドラジド含量に基づく）は以下に示す。移植
によって誘導された腫瘍の大きさを、移植の１４、２ｌ
、および２８日後に測定した。

各処理群は５匹のマウスからなり、未処理の対照群は１
０匹のマウスからなっていた。２８日目の結果を以下に
示す。

（以下、余白） 第１表 処理　　　　　　用量肩ｖ／ｋ９　　阻害％実施例１　
　　　　　１．５　　　　　　１　０００．７５　　　
　　１００ ０．３８　　　　　１００ ０．１９　　　　　　７１ ０．１０　　　　　５５ 製造例２　　　　　　１．５　　　　　　　２８０．７
５　　　　　　１１ ０．３８　　　　　　０ ０、１９　　　　　　１９ ０．１０　　　　　　３１ 実施例２抗体００７Ｂと４−デスアセチルー２３−デス
メト牛シビンブラスチン・カルボニルー４−ペンジリデ
ンヒドラジドのコンジュゲート抗体に対する薬物一リン
カーの導入割合を除き、同一条件下で３つのコンジュゲ
ーシ口ン反応を行った。各反応において、抗体は００７
Ｂであり、ｌ２．３巧抗体／ｍＱの濃度のホウ酸緩衝（
ｐＨ　８　．　６　）溶ｉｆｆｌ（０．８ｘ＆）として
供給した。

製造例２の中間体は３０Ｊｙ／村の中間体を含有するジ
メチルホルムアミド溶液として供給した。

この子イ機溶液をそれぞれの抗体溶液に加え、反応混合
物を暗所で２時間撹拌した。次いで実施例１記戦のよう
にして精製し、以下の結果を得た。

Δ，ビンカー薬物中間体の量を０．６５Ｍ９とし、０．
０２ｘｌ２の溶液として供給し、０．０４５＋％Ｄ追加
のジメチルホルムアミドも同様に加えた。生成物はコン
ジュゲーション比が５．７のコンジュゲ−４５．７ｕで
あり、６．５１！Ｃの溶液として得られた。

Ｂ．ピンカ〜り冫カー中間体１．３π９を用い、０．０
４１ＩＱの溶液と０．０２５ｄの追加のジメチルホルム
アミドとした。生成物は５．４酎の溶液中のフンジュゲ
ーション比７．２のコンジュゲート０７ｍ９であった。

Ｃ．中間体１．９５Ｂを０．０６５ｊｌ＆の溶液として
用いた。生成物は得られなかった。

細胞の３Ｈ一ロイシン取込みの阻害を測定することによ
って癌細胞に対する細胞毒性を決定する方法により、実
施例２Ａの生成物を組織培養物中、Ｕ　Ｃ−Ｌ．Ａ／　
Ｐ　３腺癌セルラインに対して試験した。

コンジュゲートの５０％阻害濃度は０．０８μ９ＩＲＱ
であり、製造例１の中間体のＩＣ，。は０．０７μタ／
ｘ（ｌであり、そして４−デスアセチル−２３−デスメ
トキシピンブラスチン・ヒドラジドのＩＣ，。

はｏ．ｏｏｔμｇ／酎であった。

実施例３抗体００７Ｂと４−デスアセチル２３−デスメ
トキシビンブラスチン・カルボニル４−ペンジリデンヒ
ドラジドのコンジュゲート実施例１と同様のコンジュゲ
ーションをかなり大きいスケールで行った。Ｌｘ（ｌあ
たりに抗体ＯＯ７Ｂをｌｏｍｙ含有する抗体溶液（４０
酎）を用い、この溶液に、ジメチルホルムアミド（３．
３ｄ）に製造例２の中間体（６３．８ｍｇ）を加えた中
間体溶液を加えた。追加のジメチルホルムアミド（４，
８ｍａ＞も加えた。この反応混合物を暗所で１．５時間
撹拌し、次いで実施例ｌ記載のように精製し、フンジュ
ゲーション比４．８のコンジュゲート（２７８だ９）を
緩衝生理食塩水の１２０ｉ１２溶液として得た。この生
成物を緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）への真空透析によ
り濃縮し、コンジュゲーション比４．４の７．２ｉ９／
ｄのコンジ二ゲートを含有する溶ｌ夜（Ｉ８酎）を得た
。

このコンジュゲートを、実質的に実施例ｌ記載のように
、雌性ヌードマウスのＵＣＬＡ／Ｐ３誘導の腫瘍に対し
てインビボで試験した。薬物の投与は移植後の１５、１
７、２０、および２３日目に行い、２７、３４、４１、
および４８日目に腫瘍を調べ、その重量をゲラン等［Ｇ
ｅｒａｎ　ｅｔ　ａ１、＋Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈａｍｏｔ
ｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ　３，　　ｌ　（Ｉ９７２）］
の式によって評価した。

１５日目にコンジュゲートの投与を始めたときには、腫
瘍の平均重量は１９であった。未処置の対照動物の腫瘍
は着実に増殖を続け、４８日目には約６９の平均重量に
なった。上記のコンジュゲート形のビン力薬物を０．５
、１、および２　ｍ９／ｋｇの用量で投与すると腫瘍を
後退させた。２７日目に観察すると、全ての処置群の腫
瘍の平均重量は約２５０ｘｙであった。４８日目に、１
および２ｍｔｉ／ｋｇ処置群の腫瘍は、なお２００ｊ１
９またはそれ以下であった。４８日目に、０．５ｚｙＺ
ｋｙ群の腫瘍は処置開始時のｌｇ重量まで増殖した。

別の実験において、同様であるがしかし別のバッチの同
じフンジュゲートを、ＵＣＬＡ／Ｐ３異種移植片を移植
しておいたマウスに対し、移植後の１６、ｌ９、２２、
および２５日目に投与した。

そのときの平均腫瘍重量は約１３００ｏであった。

０．２５＊９／ｋｇの用量（ビン力ヒドラジド含量に基
づく）は腫瘍の増殖を遅くしたが、後退はさせなかった
。０．５、ｌ、または２１９７ｋ９の用量は腫瘍を後退
させ、３種の処置すべての３７日目の平均腫瘍重量は約
３００１１９にすぎなかった。２　ｔｒｙ／ＪＦの処置
は５１日間にわたって平均腫瘍重量をこのレベルに保ち
、０．５および１＋ｇ／ｋ９を投与したマウスの腫瘍は
５１日目には約７００１の平均重量であった。

実施例４抗体Ｌ４ＫＳと４−デスアセチルー２３−デス
メトキシビンブラスチン・カルボニル４−ペンジリデン
ヒドラジドのコンジュゲートスターリング等［Ｓｔａｒ
ｌｉｎｇ　ｅｔ　ａ１、，　Ｊ．Ｃｅｌ１、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．ｓｃ＋ｐｐ．．　ＩＩＢ，　１９８２　（Ｉ９８
７）］が開示している抗体Ｌ４ＫＳを０．３４Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ８、６）中に透析し、Ｉ１．３ｚ９／ｘ（
の濃度にした。この溶液中の抗体（　１　０　ｍｇ）を
用い、これに、製造例２の中間体（０．７８ｍｇ）をジ
メチルホルムアミド（０．０７２Ｍのの溶液として加え
た。この混合物を暗所中、周囲忍度で２時間撹拌し、次
いで遠心した。

このＪ二？−ｆをパイオゲノレＰ　６　（Ｂｉｏｇｅｌ
　Ｐ６　；　Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
，　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ．　ＣＡ　９４８０４）カラムの
クロマトグラフィーにかけ、緩衝生理食塩水で溶離した
。生成物含有の分画を集め、真空下で濃縮し、生成物を
紫外線分析にかけ、２７９および２９３ｎｍでの曲線を
観察して、コンジュゲーション比３２のフンジュゲート
（８．７業ｇ）を１　．　５　ｍ９／酎含有の溶液とし
て得たことを確認した。組織培養物中、ＵＣＬＡ／Ｐ３
細胞に対する細胞毒性を測定することによってこのコン
ジュゲートを評価した。４一デスアセチル−２３−デス
メトキシビンプラスチン・ヒドラジドのＩＣ．。が０．
００１μ９／村であるのに対し、このコンジュゲートの
ＩＣ，。は０．０２４μｇ／村であった。

実施例５抗体１４．９５．５５と４−デスアセチル−２
３−デスメトキシビンブラスチン・カルボニルー４−ペ
ンジリデンヒドラジドのコンジュゲート コルバラン等［Ｃｏｒｖａｌａｎ　ｅｔ　ａ１、＋　Ｐ
ｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆＢｉｏ１、ＦＩｕｉｄｓ　３１．
　９２１−２４　（Ｉ９８４）］が開示している抗体１
４．９５．５５をホウ酸緩衝液（ｐＨ８．６）中に透析
し、８．３２ｍ９の抗体を含む溶液（Ｉ肩のを得た。こ
の溶液に、製造例２の中間体（０．６６ｙ）をジメチル
ホルムアミド（０．０８＊（！）の溶ｉ［：して加えた
。この反応混合物を暗所中、周囲温度で４５分間撹拌し
、次いでこの混合物を上記実施例１記載のように精製し
、コンジ一ゲーション比４。

８のコンジュゲート（３．Ｏｊｌ９）を３．７ｉ（！の
緩衝生理食塩水溶液として得た。

このフンジュゲートの結合能力を放射免疫検定で調べ、
非コンジュゲートの抗体と比較した。コンジニゲートと
抗体の滴定曲線は実質的に類似しており、抗体の結合能
力がコンジュゲーションによって実質的に変化しないこ
とを示した。

実施例６抗体８７２．３と４−デスアセチル２３−デス
メトキシビンブラスチン・カルボニルー４−ペンジリデ
ンヒドラジドのコンジュゲート抗体８７２．３はコルチ
ャ一等［Ｃｏｌｃｈｅｒ　ａｔ　ａ１、，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ１、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．　７８，　１９９
−２０３　（Ｉ９８１）］が開示しており、ナショナル
・キャンサー・インスティチュートから入手できる。こ
の抗体を１０Ｒ９７ｍ（ｌの濃度でホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．６）中に透析した。５ｏの抗体を３種のコンジュゲ
ーションのそれぞれに用いた。各フンジュゲーションの
ピン力中間体は製造例２の中間体であり、３　０　ｍ９
／ｍＯ含有の溶液として供給した。反応は暗所中、周囲
（Ｑｒｆｅで２時間行い、−ｈ記実施例１記戟のように
して混合物を精製した。

Ａ、０．３２ｍｇのピンカーリンカー中間体を０．０１
ｘ＆の溶液として用い、０．０２７！Ｃの追加のジメチ
ルホルムアミドを加えた。生成物はコンジュゲーション
比が３．０のコンジニゲート２．８ｇｇであり、２村の
溶液として得た。

Ｂ．０．６５ｉ９の中間体を０．０２−ｘｌ２の溶液と
して用い、０．０１ｘ＆の追加のジメチルホルムアミド
を加えた。生成物は２酎の溶液中のコンジュゲーション
比４．９のコンジニゲート１、２ｘｙであった。

Ｃ．　０．９７ｊｌ９の中間体を０．０３＋１２の溶液
として用いた。生成物は２．７１１１１２の溶液中のコ
ンジュゲーション比６．６のフンジュゲート０．５ｍ９
であった。

実施例６Ｃの生成物をＬＳｌ７４Ｔ腺癌細胞に対し組織
培養物中で試験した。４−デスアセチル２３−デスメト
キシビンブラスチン・ヒドラジドおよび製造例１の中間
体それぞれの細胞毒性ＩＣ，。が０．０００１μ９／村
であるのに対し、このフンジュゲートのＩＣ，。は０．
０４７μｇ／Ｊ１１２であることがわかった。

実施例７抗体ＫＳＩ／４Ｓ２と４−デスアセチル−２３
−デスメトキシビンブラスチン・カルボニルー４−ペン
ジリデンヒドラジドのコンジュゲート バルキ等［Ｖａｒｋｉ　ｅｔ　ａ１、＋　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４４，６８１−６６　（Ｉ９８４
）］によりＫＳＩ／４と記載されている抗体の抗原結合
部分である抗体ＫＳＩ／４Ｓ２を、１８Ｍｇ／！ＩＱの
濃度で０．３４Ｍホウ酸緩衝液（ｐｉ−１　８　）に溶
解した。抗体溶液をそれぞれ０，５６ｆｆＮづつ用いて
３種類のコンジュゲーションを行った。そのそれぞれに
おいて、製造例２の中間体は、４８．５ｍ９７Ｒ（ｌの
ビン力薬物を含むジメチルホルムアミド溶液として供給
し、この中間体と抗体とをコンジュゲートさせた。それ
ぞれの反応時間は、暗所中、周囲泥度で１．５時間とし
た。反応後、実施例１記載のようにして反応１ｆｌ合物
を精製した。

Ａ．０．０１５ｉ＋２のビン力溶液を０．０３ｔ！の追
加のジメチルホルムアミドと共に用いた。生成物は８．
２ｍｇｍであり、コンジュゲーション比は２ｌであり、
緩衝生理食塩水の溶液４．８２σとして得た。

Ｂ．０．０３ｍｆｆのビン力溶液を０．Ｏｌ５ｍｌ！の
追加のジメチルホルムアミドと共に用いた。生成物は７
．８翼９のコンジュゲートであり、コンジュゲーション
比は３．６であり、これを溶液５．２ｊｌｌ２として得
た。

Ｃ．０．０４５貢（２のビンカ溶液を用い、コンジュゲ
ーシ日ン比が５．４のコンジュゲー｝７．６ｏを５．４
＊（ｌの溶液として得た。

これらコンジュゲートの結合能力を放射免疫検定で調べ
た。生成物Δの相対結合能力は元の抗体の能力の５４％
であり、生成物Ｂのそれは４８％であり、生成物Ｃのそ
れは３７％であった。

（以下、余白） 製造例３　　Ｌ／ＩＣ２抗体の調製 凍結したＬ／　Ｉ　Ｃ　２ハイブリドーマのバイアルを
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから取
得番号Ｈ　Ｂ　９　６　８　２のもとで入手した。

３７℃の水浴でバイアルを回転させながらバイアル内容
物を解凍させて生育可能な細胞を再生した。

次いで、この細胞懸濁液をバランス塩溶液［Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ
　（Ｇ　Ｔ　Ｂ　Ｃ　Ｏ），　３１７５　Ｓｔａｌｅｙ
　Ｒｏａｄ，　Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ．　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ　１４０７２］で１：２希釈し、この懸濁液を
血清下層を通して遠心し、極低温用の培地から細胞を分
画した。この上清をアスビレーターで吸い出し、この細
胞ベレット中の細胞を、５％二酸化炭素および３７℃の
Ｔｌ５０組織培養フラスコ中、ｌＯ％ウシ胎児血清、２
ｍＭＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）および５０μｙ／＊
（ｌ硫酸ゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ）を追加した培養
培地［ベントレックス（Ｖｅｎｔｒｅｘ）Ｈ　Ｌ１　；
　Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｐｏ
ｒｔｌａｎｄ，　ＭＥＩに懸濁させた。ほぼ全面の培養
物から上清を集め、残留する細胞を遠心して除去した。

プロテインＡセファロースカラム［ファーマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ，　Ｕｐｐｓａｌａ＋　Ｓｗｅｄｅｎ）
］に通すことによって、この細胞不含の上清から抗体を
精製した。抗体をカラムに結合させ、０．０１Ｍリン酸
ナトリウム（ｐＨ８．０）で洗浄して培養培地を含まな
いようにした。次いで、Ｏ．ＩＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ３．５）を用いてカラムから抗体を溶離した。

溶出した抗体は、ｐＨ７．４のｌＭトリズマ（Ｔｒｉｚ
ｍａ）緩衝液［シグＴ（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，　ＭＯ）］で直ちに中和し、０．０１Ｍリン酸ナト
リウム（ｐＨ７．４）と０．１　５Ｍ塩化ナトリウムを
入れた真空透析装置［バイオーモレキニラー・ダイナミ
ックス（Ｂｉｏ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃ
ｓ，　Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ＋　ＯＲ）］で透析し、濃縮
した。抗体調製物を０．２μ肩の多孔性膜で濾過して滅
菌し、使用時まで４℃で保存した。

実施例８抗体Ｌ／　Ｉ　Ｃ　２と４−デスアセチル２３
−デスメトキシビンブラスチン・カルボニルー４−ペン
ジリデンヒドラジドのフンジュゲート 抗体Ｌ／ＩＣ２（Ｉ０屑ｇ）を０．３４Ｍホウ酸緩衝ｅ
Ｌ（ｐＨ　８　）ノ１ｉ＆（０．　５　６　ｘＱ＞トＬ
．，テハイ７　ルニ入れた。これに、ジメチルホルムア
ミド（０．０４５Ｒの中の１！２造例２の中間体（０．
６５ｍｇ）を加えた。

この混合物を周囲温度で１．５時間撹拌し、次い−　で
遠心した。この上清をセファデックスＧ２５のクロマト
グラフィーにかけ、緩衝生理食塩水で溶離することによ
って精製した。生成物含有の分画を合わせ、紫外線分析
で測定して、１モルに対し６．２モルのコンジュゲーシ
ョン比を有するコンジュゲート（Ｉ．３ｇｇ）の溶液（
５．４＋＋２）を得た。

この生成物を組繊培養物中のＴ２２２細胞に対して評価
したところ、０．　０　３　２ｒｎｃ９／’ｔ（ｌで４
０％、０　．　３　２　ｍｃ９／　ｔｔｔＱで７０％、
細胞の増殖を阻害した。

対照的に、４−デスアセチル−２３−デスメトキシビン
ブラスチン・ヒドラジドは、０．　０　１　ｍｃ９／ｌ
で４５％、０　．　１　１１ＣＩＦ／　Ｊ！１！で８２
％、細胞の増殖を阻害した。

製造例４３−（４−ホルミルフェニル力ルポニルアミノ
）ブロピオンＩＮ−スクシンイミドエステル ２５０ｊＩＮのフラスコに、４−カルボキシベンズアル
デヒド（３ｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．
３９）およびジオキサン（Ｉ００ＲＩ２）を加えた。

混合物を５〜１０分間撹拌し、次いでジシクロへキシル
カルボジイミド（４．１ｇ）を加えた。この混合物を周
囲温度で１時間撹拌し、次に濾過した。

この濾液を真空下で蒸発させて白色固体（９．４９）を
得、これを熱インプロパノール（２５１１２）から再結
晶した。この中間体生成物をプロパノールでトリチュレ
ートシ、目的の４−カルボキシベンズアルデヒドのＮ−
スクシンイミドエステル（２．１ｇ）を得た。

別バッチの中間体を調製し、合計１０９の上記Ｎ−スク
シンイミドエステルを、ｌＮ水酸化ナトリウム（４０酎
）および水（約１００ｊＩ１２）中のβ−アラニン（３
、６９）の溶液に加えた。ｐＨｓ８以上に保ち、混合物
を１．５時間撹拌した。次いで、混合物を濾過し、濾液
を２Ｎ塩酸でｐＨ１．９の酸性にした。これを酢酸エチ
ル（合計１５０＊ｉ２）で３回抽出し、有機層を合わせ
、そして塩水で洗浄した。

次いで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸
発させて白色固体の３−（４−ホルミルフェニル力ルポ
ニルアミノ）ブロピオン酸（４．６ｇ）を得た。

上記の中間体（Ｉ００ｍｇ）、ジシクロへキシル力ルポ
ジイミド（ｌ　Ｏ３ｏ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（５７．５９）、およびジオキサン（Ｉ０肩Ｑ）を小
さなフラスコに加え、混合物を窒素下、周囲温度で撹拌
した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーで観察し、
追加のジシクロへキシル力ルポジイミド（７５ｏ）およ
び追加のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４５ａｙ）を
加えた。４時間後に反応混合物を濾過し、濾液を真空下
で蒸発乾固した。

約２００Ｒｇの不純な生成物が得られ、これをシリカゲ
ル（３０９）のクロマトグラフィーにかけ、ジクロ口メ
タン中の５％インブロパノールで溶離した。生成物含有
の分画を合わせ、蒸発させ、若干不純な目的の中間体（
８１ｘＩｉ！）を得た。

製造例５抗体Ｌ／ＩＣ２のＦ（ａｂ’）ｔフラグメント 緩衝生理食塩水（２７０酎）中のＬ／　Ｉ　Ｃ　２抗体
（Ｉ．５９）に、１ｚＣあたり１２．６３＋９のペプシ
ンを含むペブシン溶液（２．４ｍｅ）を加えることによ
って、抗体Ｌ／ＩＣ２のＦ　（ａｂ’　）ｔフラグメン
トを調製した。この混合物を２時間２０分、３７゜Ｃに
保ち、次いでトリエタノールアミンの添加によってこの
反応を停止させた。続いて、ファースト・フロウ・セフ
ァロース（ファーマシア）カラムのクロマトグラフィー
にかけ、Ｏ．１５Ｍ酢酸ナトリウムで溶離することによ
って生成物を濃縮した。Ｆ（ａｂ’　）ｔを含有する分
画を合わせ、透析により濃縮して、抗体Ｌ／　Ｉ　Ｃ　
２のＦ（ａｂ’）ｔフラグメント（９９２ｚｙ）を含む
生成物溶液（ｌ００究Ｉ２）を得た。

製造例６抗体Ｌ／　Ｉ　Ｃ　２　　Ｆ　（ａｂ’　）＊
フラグメン｝　　３−（４−ホルミルフェニル力ルポニ
ルアミ／）プロピオニル誘導体 製造例５で調製したＬ／　Ｉ　Ｃ　２　　Ｆ　（ａｂ’
）ｔフラグメントを０．３４Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
６）中に透析し、Ｆ（ａｂ’）ｔフラグメント（２３ｘ
ｙ）を溶液（３．８ｇの中に得た。この溶液を、アセト
ニトリル（Ｉ０２μの中の３−（４−ホルミルフエニル
カルボニルアミノ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミドエ
ステル（０．４４ｉ９）と混合した。この混合物を周囲
温度で１時間撹拌し、次にこの溶液をセファデックスＧ
２５（ｌｌｇ）のカラムクロマトグラフイーにかけ、０
．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）で溶離した。生成
物を含有する分画を合わせ、誘導体化した抗体フラグメ
ント（Ｉ９ｍｇ）をモルあたり２．８モルのコンジュゲ
ーション比で、溶ｉ＆（９．６　１１２）として得た。

実施例９　　Ｌ／　Ｉ　Ｃ　２　　Ｆ　（ａｂ’）ｔフ
ラグメントと４−デスアセチル−２３−デスメトキシビ
ンブラスチン・プロピオニル−３−アミ７カルボニル４
−へ冫ジリデンヒドラジドのコンジュゲ−１・製造例６
で調製した中間体ＣＢ１１９）を固体の４＝デスアセチ
ル−２３−デスメトキシビンブラスチン・ヒドラジド（
６。９ｍｇ）に加えた。希塩酸を加えることによってｐ
ｌ１を５．６に調節し、この混合物を周囲温度で２１時
間撹拌した。次いで、／Ｉ？．合物を遠心し、上浦をセ
ファデックスＧ２５（ｆｌ９）のカラムクロマトグラフ
イーにかけ、緩衝生理食塩水で溶離した。生成物含有の
分画を合わせ、濾過し、４．８ｘｆｆの生成物溶液を得
た。Ｕｖ分析により２８０と３２５ｎｍての曲線を観察
することによって、この溶液は、抗体フラグメント１モ
ルあたりビン力薬物３．５モルのコンジュゲーション比
のコンジュゲートを３．５１ＩＷａんでいることがわか
った。

組織培養物中のＴ２２２細胞に対するこのコンシュゲー
トの細胞毒性を前述のようにして測定した。ビンカヒド
ラジドのｉｆｆｌに基づき、０．１μ９／ｆｆｌ２では
効果はなく、１μ９／ＭＱでは増ｌｉＩαを８５％阻害
した。

ラツ造例７抗体１４．９５．５５・３−（４−ホルミル
フエニル力ルポニルアミノ）プロピオニル誘導体 抗体１４・．９５．５５を０．３４Ｍのホウ酸緩衝液（
ｐＨ８．６）中に透析して１１．６ｘｙ／ｘ（の抗体を
含む溶液を得た。この抗体（４５．２＋９）含有の溶液
（３．９ｍのをｌｏｍａのフラスコに入れ、これにアセ
トニトリルに溶解した製造例４の中間体く０．　５　７
　１Ｒ９＞の溶液（Ｉ３２μｇ）を加えた。この混合物
を周囲温度で１時間撹拌し、次いでセファデックスＧ２
５のカラム（Ｉ０９）でクロマトグラフィーにかけ、０
．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）で溶離した。生成
物含有の分画を濾過し、紫外線分析を行い、２５８およ
び２　８　０　ｎｍでのピークを観察した。４０ｊ！９
の誘導体が２．６！Ｉ９／ｘ（含有の溶液として得られ
た。コンジュゲーション比は、抗体１モルに対しリンカ
ー４．１モルであった。

実施例１０抗体１４．９５．５５と４−デスアセチル−
２３−デスメトキシビンブラスチン・プロピオニル−３
−アミノカルポニルー４−ペンジＪデンヒドラジドのコ
ンジュゲート 鋒飾された抗体（３８．３ｍｇ）を含有する裂造例７の
中間体溶液（Ｉ４．７５！Ｉ（！）をフラスコに入れ、
ＩＭリン酸緩衝液（２．６ｆｆｉの、続いて４−デスア
セチル−２３−デスメトキシビンブラスチン・ヒドラジ
ドスルフェート（２２．２ｍｙ）を加えた。この混合物
を周囲温度で一夜撹拌し、次いで１５分間遠心し、セフ
ァデノクスＧ２５（４５９）のカラムクロマトグラフィ
ーにかけ、緩衝生理食塩水で溶離した。生成物含有の分
画を紫外線分析にかけ、２８０および３２５ｎｍでの曲
線を観察することによって、２１．８ｍｇのコンジュゲ
ートが、抗体１モルに対し薬物３．８モルのコンジュゲ
ーション比で得られていることがわかった。

このコンジュゲートを、組織培養物中、ＵＣＬＡ／Ｐ３
細胞に対して試験した。その５０％阻害濃度は、ビンカ
ヒドラジド含量に基づいて０．０３５μｇ／酎であった
。

同様であるが、しかし別のバッチの同一コンジュゲート
を、雌性チセールズ・リバーヌードマウスにおいて、Ｌ
Ｓ１７４Ｔ結腸癌細胞の異種移植によって誘導した腫瘍
に対して試験した。コンジュゲートを移植後の９、ＩＬ
１４、および１７日目に静脈内投与した；このとき、平
均の腫瘍重量は約１０００ｕｙであった。０．２５ｍｇ
／ｋｉＦの用ｉｎ（ビンカヒドラジドａｆｆｌに基づい
て）は、この極めて早く増殖する腫瘍の増殖をほんの少
しだけ遅くし？。２８日目の対照マウスの腫瘍は１０９
であった。０．５Ｍｇ／ｋ９を投与したマウスの平均腫
瘍重量は約４．５９であり、Ｉ　Ｎ？／　ｋｇを投与し
たマウスの平均腫瘍重量は約１ｇであり、処置開始のと
きから実質的に変化していなかった。

製造例８　４−デスアセチル−２３−デスメトキシビン
ブラスチン・４−カルポキシメトキシーα−メチルベン
ジリデンヒドラジド ４−デスアセチル−２３−デスメトキシビンブラスチン
・ヒドラジド（Ｉ９）をテトラヒド口フラン（７５ｍ■
に溶解し、４−アセチルフェノキシ酢酸（Ｉ．５２９）
を加えた。ジメチルホルムアミド（Ｉ０ｚｆｆ）および
硫酸ナトリウム（５ｇ）を加え、この反応液を無水の条
件下、周囲温度で一夜撹拌した。

反応混合物を濾過し、濾液を真空下で蒸発させて固体残
留物を得、これをシリカゲルの高速液体クロマトグラフ
ィーにかけ、酢酸エチル中でメタノール５〜５０％に変
化する直線勾配液で溶離して精製した。

生成物含有の分画を濃縮することによって目的の中間体
（４９０ｆｆ９）を得、これを質量スペクトルで同定す
ると、質量９００、９４４、９５７、および９７３の分
子イオンが示された。

製造例９　４−デスアセチル−２３−デスメトキシビン
ブラスチン・４−スクシンイミドオキシカルボニルメト
キシーα−メチルベンジリデンヒドラジド 製造例８の中間体（３００＋９）をジメチルホルムアミ
ド（２５＊Ｃ）に溶解し、この溶液を窒素下、水浴で冷
却した。これにＮ−メチルモルホリン（８６μのを加え
、この混合液を２０分間撹拌した。

次に、クロロギ酸イソブチル（８１μ１２）を加え、さ
らに２０分間撹拌した。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（Ｉ０８ｘｙ）を加え、混合液を徐々に周囲温
度まで暖めながら一夜撹拌した。次に、揮発分を真空下
で除去し、残留物をジクロ口メタンに取り、塩水で洗浄
した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発
させて目的の活性エステル（Ｉ１０１９）を得た。

大施例１　１　抗体００７１３と４−デスアセチル２３
−デスメトキシビンブラスチン・カルボニルメトキシー
α−メチル−４−ペンジリデンヒドラジドのコンジュゲ
ート 抗体００７Ｂを０．３４ＭホウＭ緩衝液（ｐＨ８．６）
中に透析して４．０５１１９抗体／酎の濃度にした。

別の量の製造例９の中間体を用いて２種類のフンジュゲ
ーションを行った。それぞれ抗体量は１２１５ｍｇとし
、３酎の抗体溶液として供給した。抗体との反応は周囲
温度で１時間行い、次いて、反応混合物を遠心し、上清
をセファデックスＧ２５のカラムクａマトグラフィーに
かけ、緩衝生理食塩水で溶離することによって精製した
。生成物含有の分画を紫外線分析にかけ、２７９および
２８５ｎｍでの曲線を観察した。

Ａ．５２造例９の中間体４．２１をジメチルホルムアミ
ド２４０μｇに溶解して用いた。生成物はコンジュゲー
ト６１１９であり、コンジュゲーション比は５．２モル
／モルであり、溶液７．５村としてであった。

Ｂ　−　中間体ｒｌは６．３ｙ＋ｙであり、ジメチルホ
ルムアミド２４０μｇに溶解して用いた。生成物のコン
ジュゲートが１．５６ｉ９得られ、フンジュゲーション
比は１１．４であり、溶液６ｙ！（ｌとしてであった。

コンジュゲーションＡの生成物を、前述の細胞毒・性試
験により、組織培養物中のＵＣＬＡ／Ｐ３腺癌細胞に対
して評価した。このフンジニゲートは、５０ｎ９７ＭＱ
の濃度で２９％、ｌｏＯｎ９／ｉσの濃度で９３％、細
胞の増殖を阻害することがわかった。コンジュゲート化
されていない製造例８の中間体の活性は、この細胞毒性
試験において実質的に同一であった。

製造例１０　　４−デスアセチル−２３−デスメトキシ
ビンブラスチン・４−カルポキシメトキシヘンジリデン
ヒドラジド ４−ホルミルフェノキシ酢酸（９４０ｍｇ）を用い、実
質的に製造例８の方法と同様の方法を行った。

生成物は目的の中間体１７０ｍｇであり、質量スペクト
ルで質量８８６、９４４、および９５８の分子イオンを
示した。

製造例１１　４−デスアセチル−２３−デスメトキシビ
ンブラスチン・４−スクシンイミドオキシカルボニルメ
トキシベンジリデンヒドラジド製造例１０の中間体（５
００ｍｇ）、Ｎ−メチルモルホリン（Ｉ４５μの、クロ
ロギ酸イソブチル（Ｉ３７μｌ２）、およびＮ−ヒドロ
牛シスクシンイミド（ｌ８２ｆｆｇ）を出発原料として
製造例９と同様の方法を行った。生成物は目的の活性エ
ステル１６０ｍｇであった。

実施例ｌ２抗体００７Ｂと４−デスアセチル２３−デス
メトキシピンブラスチン・カルポニルメトキシ−４−ペ
ンジリデンヒドラジドのコンジュゲート 実施例１ｌと同一の条件下、製造例１１の中間体を用い
て２種類のコンジュゲーシコンを行った。

コンシュケーション八の生成物は、溶ｉ（ｆｆｉ５．８
ｘｃ中のフンジュゲート６．６ｘｙであり、フンジュゲ
ーション比は３．５モル／モルであった。コンジュゲー
ションＢの生成物は、溶液７．２１中のコンジュゲート
６、Ｏｍｙであり、コンジュケーション比は４、８モル
／モルであった。

コンジュゲーシコン八の生成物を組織培養物中のＵＣＬ
Ａ／Ｐ３細胞に対して評価し、１００ｎ９／酎で３３％
、２　５　０　ｎ９／　ｔｔｔＯ．で１００％、増殖を
阻害することがわかった。製造例１０の中間体の細胞毒
活性は実質的に同じであった。

製造例１２　　３−（５−ホルミルビロール−２−イル
カルボニルアミノ）プロビオン酸・Ｎ−スクシンイミド
エステル ５−ホルミルピロール−２−イルカルボン酸（Ｉ３９Ｒ
９）、ジシクロへキシルカルボジイミド（２４７　ｍｇ
）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｉ３８ｍｇ）、お
よびジメチルホルムアミド（Ｉ０ｉのをフラスコに入れ
た。この混合物を窒素下、周囲温度で２時間撹拌し、溶
媒を真空下で除去して３　９　ｔｏの粗製の活性エステ
ルを得た。

この残留物をアセトニトリル（　１　３ｌｌ２）に取っ
た。

全てではないが、残留物は溶液となった。この不均一な
混合物を、０．５Ｎ水酸化ナトリウム（．　２　１（２
）中のβ−アラニン（８．９罵９）の溶液に徐々に加え
た。

同時に、ＩＮの水酸化ナトリウムを加えてｐＨを７．５
〜８．０に維持した。次いで、この混合物を周囲温度で
１時間撹拌し、濾過した。この濾液を希塩酸で酸性にし
、塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。次
に、抽出液を乾燥し、濃縮してオレンジ色の油状物を得
、これをシリカゲル力ラムのクロマトグラフィーにかけ
、ジクロロメタン中の１０％メタノールで溶離した。生
成物含有の分画を真空下で濃縮して４９Ｒ９の３−（５
−ホルミルピロール−２−イルカルボニルアミノ）プロ
ビオン酸を得た。

この中間体（３１ｍｙ）をジオキサン（３ｍ＜！）に取
り、これにジシクロへキシル力ルポジイミド（３５ｉｇ
）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（　１　９　ｍ
Ｗ）を加えた。この混合物を窒素下、周囲温度で２時間
撹拌し、次いで濾過し、真空下に濃縮した。この残留物
をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、ジクロ口メタ
ン中の５％メタノールで溶離して、目的の中間体活性エ
ステル（約６Ｒ９）を得た。

製造例１３抗体００７Ｂ・３−（５−ホルミルピロール
ー２−イルカルボニルアミノ）プロビオニル誘導体 抗体００７Ｂ（Ｉ０５漏９）［０．３４Ｍのホウ酸緩衝
液中に１５ｏ／次ａの濃度で含有する溶液として］を、
製造例１２の中間体の溶液（３００ａσ）「アセトニト
リル中に中間体活性エステルを１．２９ｉｙ含む］と混
合した。この混合液を周囲温度で１時間撹拌し、次いで
、セファデックスＧ２５のカラム（ｌｏ９）でクロマト
グラフィーにかけ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５
．６）で溶離した。生成物含有の分画を合わせ、紫外線
スペクトル分析にがけ、２８０および３００ｒ＋ｍでの
曲線を観察した。

この生成物は合計８３．２３ＩＩＦの標記中間体であり
、濃ｔＩＩＩＣ５．７ｍｇ／ｍ｛の溶液１４．６ｉ（！
中に含まれていた。コンジュゲーション比は３．６であ
った。

実施例ｌ３抗体００７Ｂと４−デスアセチル＝２３−デ
スメトキシビンブラスチン・プロピオニル−３−アミノ
カルボニルー２−ピロール−５メチリデンヒドラジドの
コンジュゲート４−デスアセチル−２３−デスメトキシ
ピンブラスチン・ヒドラジドスルフェート（３６Ｒ９）
を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．１５Ｍリン酸イ
オン含有のｐＨ５．６緩衝液（Ｉ２．４ＪＩの中、製造
例ｌ３の中間体（６０ｍｇ）に加えた。この混合物を暗
所で２４時間撹拌し、，遠心した。この上清をセファデ
ックスＧ２５（Ｉ７ｙ）のクロマトグラフィ一にかけ、
生成物含有の分画を合わせ、紫外線スペクトル分析にか
け、３４０および２８０ｒ＋ｎ＋での吸収を測定した。

コンジュゲーション比が５，４モルビンカ薬物／１モル
抗体である４３．８ｕのコンジュゲートが１５．８ＲＩ
２の溶液で得られた。

コンジュゲートを放射免疫検定にかけ、その抗原への結
合能力を遊離抗体の結合能力と比較した。

フンジュゲーションにより抗体の結合能力かわずかしか
減少しないことがわかった。ＵＣＬＡ／Ｐ３細胞に対し
てインビトロで試験すると、その５０％阻害濃度は０．
０００１μｇ／ｗ＆（ビン力ヒドラジド含量に基づいて
）であった。

製造例ｌ４抗体００７Ｂ・３−（４−ホルミルフェニル
カルボニルアミノ）プロピオニル誘導体抗体００７Ｂの
溶液（７．Ｏｆｆの［０．　３　４　Ｍのホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．６）中に１５ｍ９／ｘ（ｌの抗体を含む］を
、製造例４の中間体（Ｉ．３３ｍ９）［アセトニトリル
（０．３１蛙）の溶液として］と混合した。この反応混
合液を周囲温度で１時間撹拌し、次いで、セファデック
スＧ２５（Ｉ０９）でクロマトグラフイーにかけ、０．
１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で溶離した。

生成物含有の分画を集め、紫外線分析にかけ、２５８お
よび２８０ｎｍでの吸収を測定した。この濃縮物が５．
１ｓｑ／ｍ（ｌのコンジュゲートを含み、そのコンジュ
ゲーション比が４．３であることが示された。フンジュ
ゲートの合計収量は９１ｍ９であった。

実施例１４抗体００７Ｂと４−デスアセチル−２３−デ
スメトキシビンブラスチンφプロビオニル−３−アミノ
カルボニルー４−ペンジリデンヒドラジドのコンジュゲ
ート ４−デスアセチル−２３−デスメトキシビンブラスチン
・ヒドラジドスルフエート（３６１９）を、０．１Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液中に製造例１４の中間体（６０１Ｉ
１？）を含む溶液（Ｉ３．８ｊｌ＆）に加えた。

この混合物を周囲温度で２４時間撹拌し、次いで、遠心
し、セファデックスＧ２５（Ｉ７ｇ）のクロマトグラフ
ィーにかけた。生成物含有の分画を集め、０．２２μ肩
の多孔性膜で濾過して２１．９ｘ（！の生成物溶液を得
た。この溶液は、紫外線スペクトルにより２８０および
２９３ｒ＋ｍでの吸収を測定すると、１ｍＱあたり２．
０所のコンジュゲートを含有していた。コンジュゲーシ
ョン比は４．１モルビンカ薬物／１モル抗体であった。

このコンジュゲートを、ＵＣＬＡ／Ｐ３腺癌の異種移植
により雌性ヌードマウスに誘導した腫瘍に対して試験し
た。移植後の１６、１９、２２、および２５日目に０．
５ｏ／ｋ９（ビン力薬物含量に基づいて）のコンジュゲ
ートを注射した。１６日目の、処置動物の平均腫瘍重量
は約５００ｍ９であった。この処置により腫瘍は後退し
、５１日目では平均の腫瘍重量は約５１１にすぎなかっ
た。未処置の対照動物の腫瘍は非常に大きいサイズまで
着実に増殖し、これは、この腫瘍の通常の増殖と一致し
ていた。

組成物および使用法 本発明のコンジュゲートは、望ましくない細胞の増殖を
阻害する方法において有用であり、この方法は本発明の
重要な部分である。従って、本発明は医薬組成物をも含
むものであり、最も好ましいのは患者への注射に適した
非経口組成物である。

このような組成物は、薬化学の分野で通常用いられる方
法によって製剤化される。本発明のコンジェゲートは、
生理学的に許容しつる液、例えば生理食塩水溶液および
安全に非経口投与することができるその他の水性溶液に
可溶性であり、そして許容性である。

非経口投与用の製品は、使用直前に復元される固体、好
ましくは凍結乾燥形で製剤化され、提供されることが多
い。このような製剤は有用な本発明の組成物である。こ
れらの製造は薬化学者によりよく知られている。通常、
これらは等張性を付与するための無機塩と、復元時に乾
燥調製物を素早く溶解させるための分散剤（ラクトース
など冫の混合物を含有している。この製剤を高精製水で
復元して既知の濃度にする。

コンジュゲートおよび上記の医薬組成物を用い、このコ
ンジュゲートに含まれているビンカ薬物の細胞毒性作用
を利用して、望ましくない細胞の増殖を阻害する。従っ
て、コンジュゲートの使用範囲はビン力薬物の細胞毒性
作用によって決められる。本明細書の抗体の項には、い
くつかのタイプの望ましくない細胞が挙げられており、
これらの細胞を標的とする抗体を用いることによって本
発明のコンジュゲートをこれら細胞に対して有効に用い
ることができる。本発明のコンジュゲートおよび組成物
を用いて癌細胞の増殖を阻害するのが好ま【７い。

本発明のコンジュゲートの最適の用量および投与計画は
、患者の状態に照らして、治療を行う医師が決定すべき
てある。勿論、各一連の投与の間に数日あるいは数週間
の間隔をおいて、分割投与により細胞毒性薬物を投与す
るのが普通である。

本発明のコンジュゲートは広い用量範囲にわたって有効
であるが、通常、１週間あたりの用量はコンジュゲート
約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より好まし
くは、約０．２５〜約４ｉ９／ｋ９の範囲であろう。

便宜のため、以下に代表的な非経口用組成物を挙げる。

組成物ｌ 実施例ｌのコンジュゲート　　　　　１　０　０　ｍ９
生理食塩水　　　　　　　　　　　　　１０Ｒ＋２低温
で保存し、静脈内投与する。

組成物２ 実施例ｌのコンジュゲート　　　　　１００ｊ！９分散
剤　　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇ生理食塩水
　　　　　　　　　　　　　１０酎低温で凍結乾燥し、
乾燥産物を室温またはそれ以下の温度で保存する。精製
水で投与用に復元し、静脈内投与する。

組成物３ 実施例４のコンジュゲート　　　　　　　１ｇラクトー
ス　　　　　　　　　　　　　　１０＋ｙ生理食塩水　
　　　　　　　　　　　１　０　０　ｔｔｔ（Ｉ低温で
凍結乾燥し、乾燥産物を室温またはそれ以下の温度で保
存する。精製水で投与用に復元し、静脈内投与する。

組成物４ 実施例９のコンジュゲート　　　　　１００！９生理食
塩水　　　　　　　　　　　　　２０ｘＱ低温で保存し
、静脈内投与する。

組成物５ 実施例１３のコンジュゲート　　　　　　１９分散剤　
　　　　　　　　　　　　１２．５Ｊ！１生理食塩水　
　　　　　　　　　　　１００３！１２低温で凍結乾燥
し、乾燥産物を室温またはそれ以下の温度で保存する。

精製水で投与用に復元し、静脈内投与する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の式（ I ）で示される細胞毒性薬物コンジュ
   ゲート： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ［式中、Ａｂは、望ましくない細胞に関連する抗原を認
   識する、生理学的に許容しうる抗体またはその抗原認識
   フラグメントであり、 ｍは、１〜約１０の整数であり、 Ｚは、水素原子またはＣ＿１〜Ｃ＿３非分枝鎖状アルキ
   ルであり、 Ｘは、結合手、Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルキレン、Ｃ＿２〜Ｃ
   ＿４アルケニレンまたはアミノＣ＿１〜Ｃ＿４アルキレ
   ンであり、 Ｙは、結合手、カルボニル、−Ｏ−、−Ｓ−またはスル
   ホニルであり（ただし、Ｘがアミノアルキレンであると
   きにはＹはカルボニルまたはスルホニルであり、Ｘが結
   合手であるときにはＹは結合手またはカルボニルである
   ）、 Ａｒは、ピロリル、ｍ−フェニルまたはｐ−フェニルで
   あり、このフェニル基はブロモ、クロロ、フルオロ、メ
   トキシ、ニトロまたはＣ＿１〜Ｃ＿３アルキルでモノ−
   またはジ−置換されていてもよく、Ｖは以下の式（II）
   で示されるビンカ薬物である：▲数式、化学式、表等が
   あります▼（II） （式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ＿３またはＣＨＯであり、Ｒ＾
   ２とＲ＾３が独立している場合、Ｒ＾３はＨであり、Ｒ
   ＾１とＲ＾２のうち一方はエチルであり、他方はＨまた
   はＯＨであり、 Ｒ＾２とＲ＾３がそれらが結合している炭素と一緒にな
   っている場合、これらはオキシラン環を形成し、この場
   合、Ｒ＾１はエチルであり、 Ｒ＾４はＨ、（Ｃ＿１〜Ｃ＿３アルキル）−ＣＯまたは
   クロロ置換（Ｃ＿１〜Ｃ＿３アルキル）−ＣＯである）
   ］。 ２、抗体またはそのフラグメントが癌細胞を認識するも
   のである請求項１に記載のコンジュゲート。 ３、抗体がモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体また
   はそれらの抗原認識フラグメントである請求項１または
   ２に記載のコンジュゲート。 ４、Ａｒがフェニル、モノ置換フェニルまたはピロリル
   である請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート
   。 ５、Ｌ／１Ｃ２と４−デスアセチル−２３−デスメトキ
   シビンブラスチン・カルボニル−４−ベンジリデンヒド
   ラジドのコンジュゲートである請求項１に記載のコンジ
   ュゲート。 ６、活性薬物として請求項１〜５のいずれかに記載のコ
   ンジュゲートを含有し、１またはそれ以上の薬学的に許
   容しうる担体または希釈剤を共に含有する医薬製剤。 ７、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾５はヒドロキシ、酸活性化基、塩を完成す
   る部分、または酸保護基であり、Ｘ、Ｙ、Ａｒ、Ｚおよ
   びＶは請求項１の定義と同じである］で示される化合物
   。 ８、Ａｒがピロリルまたはｐ−フェニルである請求項７
   に記載の化合物。 ９、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲートの
   製造法であって、 （Ａ）請求項１で定義した式：Ａｂで示される生理学的
   に許容しうる抗体またはその抗原認識フラグメントと、
   式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾５はヒドロキシ、酸活性化基、塩を完成す
   る部分、または酸保護基であり、Ｘ、Ｙ、Ａｒ、Ｚおよ
   びＶは請求項１の定義と同じである］で示される中間体
   を反応させるか、または （Ｂ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ａｂ、Ｘ、Ｙ、Ａｒ、Ｚ、およびｍは請求項１
   の定義と同じである］ で示される修飾抗体と、当量の式： Ｈ＿２Ｎ−ＮＨ−Ｖ ［式中、Ｖは請求項１の定義と同じである］で示される
   ヒドラジドを反応させること を特徴とする製造法。 １０、請求項９の製造法によって製造した式（ I ）で
   示されるコンジュゲート。