JPH02134329A - グラム陰性菌感染の処置および予防用組成物ならびに方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は静脈内に注射可能な免疫グロブリン生成物であ
って、グラム陰性菌起源の疾病の予防および治療に際し
て有用であるものに関する。より詳細に本発明はこの種
の生成物、すなわちグラム陰性菌の抗原に対抗する多ク
ローン性抗体ならびに単クローン性抗体であって、グラ
ム陰性菌のコアリボ多糖に混在するエントド・トシンを
中和することができるものを含有する血漿由来の多クロ
ーン性免疫グロブリンを含んで構成されるものに関する
。

グラム陰性菌は病院の患者にとって致死的な細菌感染の
主要原因となっている。積極的な抗生物質治療にも拘ら
ず、グラム陰性菌血症を患う患者についての死亡率は過
去２０年間に４０％に近付いて来た。これらの細菌は薬
物に対し比較的不浸透性である隔膜により、また全ての
グラム陰性菌により生成され、細胞が死滅した後ですら
致死的な毒性を残留させるエンドトキシンによって識別
される。従って、グラム陰性菌感染の致死性は生活可能
な細菌の非制御の成長およびエンドトキシン性ショック
による死をもたらす生物からのエンドトキシンの解放の
双方に起因するものである。

大きな構造的多様性を有し、かつグラム陰性閑に関して
特存であるエンドトキシンは細菌の外隔股のリポ多糖（
ＬＰＳ）成分と混在している。異なった細菌種からのＬ
ＰＳは一般に３種類の構造的領域、すなわち０特異炭水
化物鎖、コアおよびリピドＡから同様に構成されている
。このリピドＡ部分は外隔膜に着生ずる。リピドΔに結
合しているのは粗コア領域であって、これは順次０糖類
側釦に結合する。Ｏ側鎖はグラム陰性細胞の種ならびに
血清型特異性決定基を有する三乃至五糖類の反復構造か
ら成っている。０抗原の実質的な変化は単一の細菌種内
にある［たとえば、シュードモナス・アエルギノーサ（
緑膿菌）は少なくとも１６個の異なった存在可能な０抗
原を有している］。より少ない変化は共有結合的リピド
Ａ／コア成分中に示され、これはエンドトキシンの毒性
原理を表している。異なった細菌種は化学的に類似のリ
ピドＡ分子を有しており、これが宿主組織内で類似の病
理上の効果を生じせしめる。この理由によってリピドＡ
はまた、エンドトキシンとも称される。○特異性抗原の
除去によって暴露すれば、リピドＡ／コア領域は抗体応
答を刺激することが出来る。

グラム陰性閑疾病の処置における抗生物質の限定された
効果に鑑みて、リポ多糖に対抗する抗体を使用してグラ
ム陰性生物に対する免疫を提供−４るための数多くの努
力が為されて来た。効果的な免疫性には可変性Ｏ抗体（
ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｏａｎｔｉｇｅｎｓ）ならびにリピ
ドＡ分子−Ｌの保護抗原の両者に対する抗体応答が包含
される。研究は、多クロ−ン性１ｇＧの静脈内製剤が日
和見病院グラム陰性菌感染、特に免疫屈従（ｉｍｍｕｎ
ｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）患者におけるそれの発生を
減少させるのに有効で有り得ることを示して来た。多ク
ローン性免疫グロブリンは細菌生物の殺滅には有効であ
るが、この種の製剤は感染に屡々付随するエントドキン
性ショックの処置に際して一般的に不満足であることが
判明していた。典型的に製剤中に含有される抗体力価が
低過ぎてエンドトキシンア（ｅｎｄｏｔｏｘａｍｉａ）
を軽減するための充分な臨床的効力を示さない。

その結果、研究者は細菌エンドトキシンに対抗する単ク
ローン性抗体を研究して来た。単クローン性抗体を得る
ために、骨髄腫（ミエローマ）細胞および抗体生成リン
パ球を互いに融合させて雑種細胞（ハイブリドーマ）を
生成するが、これは特異性（または単クローン性）抗体
を生成するリンパ球の能力と、無限に増殖する骨髄腫細
胞の能力とを結び付けるものである。単クローン性抗体
は均質であるけれども、それは単一特異性ではないかも
しれない。単クローン性抗体は異なった部分と反応する
ことになろうが、この部分は抗原決定基またはキャリー
構造関連決定基に関与するものである。抗原類似性はエ
シエＩＪヒア・コリ　（大腸菌）および他の種の細菌の
リピドＡ／コア領域間に示されている。ＬＰＳ中に存在
する分担抗原決定基は広範な生体内および生体外反応性
を有する交差反応性ハイプリドーマ由来単クローン性抗
体（ｍＡｂ）をもたらす。

数多くの研究者が、ＬＰＳのリピドＡ部分内の決定基を
認識する抗体を育成するハイブリドーマの製剤を報告し
ている。これらの結果は見込みがあるように思われたが
、別の研究は単独で投与したとき、単クローン性抗体製
剤がグラム陰性菌感染を罹患している動物に対し投与さ
れても一般に効果の無いことを示している。この理由は
完全には理解できないが、エンドトキシンに対する低レ
ベルの暴露は同一または他のエントド・トシンあるいは
グラノ、陰性菌のより高い分量に抗して保護の可能であ
ることが知られている。エンドトキシン汚染は非常に一
般的であるので、若干の初期の研究においてはエンドト
キシンに対する単クローン性抗体の投与によるグラム陰
性菌に対抗する明白な動物保護は、抗体製剤のエンドト
キシン混交からもたらされた可能性がある。［ケー・テ
ィー・チョンおよびエム・ヒユーストン（Ｋ、　Ｔ、Ｃ
ｈｏｎｇ　ａｎｄｌ（、ｆｌｕｓｔｏｎ）　、１９３７
年、Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、１５６　　：　７１３−１７
９］ このような訳で、そこにはグラム陰性菌およびエンドト
クセミア（ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ）と戦うための免疫
治療または予防剤の不変かつ再現性を有する供給源を提
供する方法に関するニーズが残存している。従って、本
発明の目的は細菌による成長および／またはそれらの細
菌によって生成されるエンドトキシンの結果であるグラ
ム陰性菌疾病の処置および予防のための組成物および方
法を提供することである。

本発明によれば、グラム陰性菌により惹き起こされる感
染または細菌が生成するエンドトキシンによって惹き起
こされるエンドトキシン性ショックの予防または処置に
際して使用するための組成物が開示され、これはグラム
陰性菌の抗原に対抗する多クローン性抗体を含有するヒ
ト多クローン性免疫グロブリンと、リボ多糖類のリピド
Ａ部分中に含まれる各種のグラム陰性菌に共通であるエ
ピトープについて特異であるハイプリドーマ由来単クロ
ーン性抗体との組合せを特徴とするものである。本発明
は更に、グラム陰性菌の抗原に対抗する抗体を含有する
多クローン性免疫グロブリンと、グラム陰性菌リポ多糖
類のコア／リビドＡ領域に対して共通であるそれらの抗
原と結合可能であるハイプリドーマ由来単クローン性抗
体との組合せを特徴とする組成物の有効量を、この種の
予防または処置のニーズに際して患者に対し投与するこ
とによりグラム陰性菌起源の疾病を予防または処置する
方法に関する。

本発明はグラム陰性菌起源に対する感染性またはエンド
トキシン性薬剤についての予防または処置用の新規な組
成物に関する。グラ１１陰性菌起源の疾病に関連する罹
病率および死亡率が、生物の制御されない成長ならびに
生成されるリポ多糖エンドトキシンの効果双方に起因す
ると考える限りにおいて、有効な処置または予防は少な
くとも細菌感染を実質的に排除し、かつリビドＡエンド
トキシンを中和せねばならない。「中和」は、たとえば
エンドトキシンの致死的な効果に対抗する保護により立
証されるように、リビドＡエンドトキシンの毒性効果を
減少させ、そして好ましくは除去することを意味してい
る。

本発明の新規な組成物は２種類の成分の組合せを特徴と
してる。一方の成分は様々なグラム陰性菌に関して特異
であるＯ抗原を認識し、従ってそれらの細菌に対し有効
な保護を提供する抗体を含有する多クローン性免疫グロ
ブリン静脈内製剤を含んで構成される。第二の成分は、
様々なグラム陰性菌リポ多糖頌のコア／リピドＡ領域に
対して共通である成る抗原を認識する単クローン性抗体
であって、それらのエンドトキシンを中和させるものを
含んで構成される。

本発明の組成物は、１種類以上のグラム陰性菌およびそ
れらが育成するエンドトキシンによる潜在性を有する致
死的な感染に対する生体内保護を提供するために使用す
ることが出来る。本組成物の多クローン性成分は細菌感
染に抗して保護を示すものであるが、−船釣にはエンド
トキシンに抗して適切な保護を与えるものではない。多
クローン性免疫グロブリンと、単クローン性抗エンドト
キシン抗体との組合せは、グラム陰性菌感染ならびにそ
の生物に付随するエンドトキシンによる死亡または疾病
に対する保護を提供する。

単クローン性抗体の調製 抗すピドＡ単クローン性抗体を得るために、組織培養に
際して成長することになり、そして所望の特異性を有す
る抗体を分泌する細胞系が確率される。これはリンパ球
を適切な、不死化した融合パートナ−細胞系に対し融合
し、そして適切な抗体を生成し、かつ培養に際し°Ｃ連
続的に成長する融合生成物ハイブリドーマ細胞系を選択
することにより達成される。リンパ球はＯ多糖側鎖を欠
如する変異体からのコア多糖（ＣＬＰＳ）により免疫性
を与えた供与体から得ることができる。適切な生物には
、たとえばサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）　　Ｒ５９５また１まエシェ
リヒア争コ！Ｊ　　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　　Ｊ　５がある
。その他の適切な生物は当業者により容易に決定するこ
とができる。リンパ球は血液、膵臓またはリンパ腺起源
のものであればよく、そしてこれは従来の技法に従って
得ることが出来る。単核Ｂ−’Ｊンバ球を含有するリン
パ球の単一細胞懸濁液は生体外において、抗原および／
または細胞融合に先立ち、エプスタイン−バールウイル
ス感染により形質転換された抗原によって刺激されるこ
とが出来る。

免疫細胞の不死化は、その細胞を適当なヒト、詔歯類ま
たはヒト／七歯類雑種骨髄腫、Ｂ−リンパ芽球腫あるい
はその他の不死化細胞系であって連続的ハイプリドーマ
成長力よび単クローン性抗体分泌を許容するに足るもの
に対し融合させることによって達成することができる。

適切な細胞系にはマウス骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３−八ｇ
８．６５３　　［エフ・ジグリオッチ他（Ｇｉｇｌｉｏ
ｔｔｉ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　）、ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　　１４９
　　（１）　　：　　（１９８４年）　コ　、ヒト−マ
ウス化骨髄腫ＳＨＭ−０３３［エヌ・テン池（Ｔｅｎｇ
、　　Ｎ、　　ｅｔ　　ａｌ、　）　　ＰＮＡＳ８０　
　：　　７３０８　　（１９８３年）コおよびヒ）　Ｉ
Ｊンバ芽球腫細胞系Ｗｌ−Ｌ２　　ロジエー・ヘイッマ
ナ他　（）Ｉｅｉｔｚｒｎａｎａ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｔ
、）、Ｍｏｌ。

ＢｉｏｌｌＭｅｄ、　　ｌ　：２３５　（１９８３年）
］がある。

融合工程は従来の方法、たとえばカルシウムおよびマグ
ネシウム非含有りん酸塩緩衝化食塩水中のポリエチレン
グリコールによって行うことが出来る。或は電解または
その他の受容可能な細胞融合方法のいずれかを利用する
ことにより細胞を融合させることが出来る。雑種細胞は
選択され、生存可能雑種は従来の方法に従って増加させ
る。

雑種選定は適切な毒性薬物、物理的方法、免疫学的方法
あるいは非融合腫瘍細胞の成長を抑制するその他の如何
なる従来の方法によっても行うことが出来る。上澄みを
採取してＣＬＰＳに対抗する免疫グロブリン特異性に関
して試験する。エンザイム・リンクド・イムノソープシ
ョンアッセイ［ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ　−
エリザ）コであって、ここにおいて単クローン性抗体は
固体表面に結合しているリポ多糖抗原に特異的に結合す
るためのそれら能力によって検出されるというアッセイ
が利用可能である。コア糖脂質領域に付随する抗原のみ
を検出するために、ポリ多糖側鎖を欠＜　ＬＰＳ分子が
使用される。好ましいのは、免疫生物からのＬＰＳを包
含しているかも知れない分子が、交差反応性ｍＡｂを選
択し、かつ保持するために２種類の異なったグラム陰性
微生物から選択されることである。ハイブリドーマ細胞
培養上澄みをＣＬＰＳ抗原で培養し１次いでＣＬＰＳ抗
原に対する抗ＣＬＰＳ抗体の結合が酸素標識抗免疫グロ
ブリン抗体の引き続く添加により決定される。ハイブリ
ドーマ上澄み液が共通コア糖脂質抗原に対する抗体を含
有していれば、その抗体は固体表面に結合し”Ｃいる抗
体に対し特異的に結合することになり、そし”Ｃそれは
、ネガティブ制御容器（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒ
ｏｌ　ｗｅｌｌｓ）上ではなく、それらの抗原を含有す
る微量滴定板の表面上に保持されることになる。抗ＣＬ
ＰＳ抗体の分泌は、エリザ分析によって決定されるよう
に第二ＣＬＰＳ抗原に対抗する上澄みの交差反応性に基
づいて更に特徴づけられ得るものである。生体外アッセ
イはエリザに限定される必要はなく、抗原／抗体相互作
用を検出するＲＩＡまたはその他の従来方法を包含し得
るものである。

次に、選択されたハイブリドーマをクローン化させて、
エリザ・スクリーニングにおいて検出された抗体交差反
応性が単クローン性抗体によって作られたと考え得るこ
とを保証する。クローニングは、限定された希釈液中に
おける細胞のブレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）、半固
体媒質における成長または顕微操作を含む単一細胞単離
および培養に関して当該技術分野で知られた如何なる技
法によっても成就することが出来る。クローンを同定し
、かつ集密的に成長させた後、ハイブリドーマ・コロニ
ーを含んでいる容器からの上澄みを上記したようなエリ
ザを利用して、少なくとも２１１？Ｉｎの異なった共通
コア糖脂質抗原に対抗する抗体の存在に関して試験する
。ＣＬＰＳ抗原はあらゆる野生型グラム陰性菌よりのリ
ポ多糖類から、あらゆる変異体グラム陰性菌株、たとえ
ばエシュリヒア・コリＪ５またはサルモネラ・ミネソタ
Ｒ５９５よりのリポ多糖類から、これら細菌の如何なる
ものよりのリピドＡから、あるいはこれらのあらゆる物
質の無毒化形状のものから選択することが出来る。単ク
ローン性抗体を有する各ハイブリドーマであって、ＬＰ
Ｓ抗原の１種以上と交差反応するものから数種のクロー
ンが保持される。クローニングの工程は安定な細胞系の
選択を保証するために反復されることが必要かも知れな
い。

生体外および生体内双方の単クローン性抗体についての
その上の分析を容易にするため、精製され、かつ濃縮さ
れた形態における単クローン性抗体を保有することが有
利である。外来蛋白質汚染の主要源は通常ハイブリドー
マ成長媒質中に見出される胎児ウシの血清である。この
問題を回避するために、目的の単クローン性抗体を生成
するハイブリドーマを調製して、漸減的に低濃度の胎児
ウシ血清を含有する培養基において細胞を培養すること
によって血清を含まない限定された細胞培養基中で成長
させることができる。より低濃度の血清限定細胞培養基
内への逐次的通過に引き続く単クローン性抗体に対する
適合、成長および分泌の能力に関して、細胞が選択され
る。無血清培養基は、ハイブリドーマの成長および単ク
ローン性抗体の分泌を維持すると共に単クローン性抗体
の精製を容易にするに足る単一成分の混合物から成る如
何なる限定された配合物を含有することも可能である。

典型的にこれらの培養基は、塩類、糖類、ビタミン、ア
ミノ酸、ホルモンおよび緩衝液を含む様々な栄養素なら
びに成長補充物を含有している。培養基中に蛋白質添加
物は典型的にアルブミン、インシュリンおよびトラウス
フェリンに制限されている。

無血清限定培養基内に含まれろ単クローン性抗体の濃度
は、イオン交換樹脂に対し蛋白質成分を結合させる条件
下でその細胞培養上澄み液をしてイオン交換樹脂を横切
らせることによって達成することが出来る。次いで、蛋
白質は適切なｐｔ＋およびイオン強度を有する緩衝液を
使用することにより溶離することが出来る。この溶出液
は培養上澄み液中の全蛋白質を含有しているが、より高
濃度においてである。この種の溶出液中の単クローン性
抗体は出発物質に対して典型的には１００倍濃縮されて
いる。

他の蛋白質成分から全く離れて単クローン性抗体の精製
は、（精製すべき単クローン性抗体免疫グロブリンのク
ラスによって）　ＩｇＧまたはＩｇ！、４とその他の蛋
白質、すなわちアルブミン、トラウスフェリンおよびイ
ンシュリンとの寸法差を利用することによって達成する
ことが出来る。これはイオン交換樹脂溶出液をして適当
な分子寸法の排除ゲル・カラムを横切らせ、そして適切
なピークを選択することによって達成することが出来る
。これらの条件下で精製された単クローン性抗体は典へ
′！的に非常に儂縮されており、そしてそのフラクショ
ン中の大多数の蛋白質を構成するものである。

単クローン性抗体の抗原特異性を更に明確に規定するた
めに、付加的な生体外試験を行うことが可能である。こ
の試験は上記したように、他の突然変異体または野生型
生物からのＬＰＳまたはＬＰＳサブユニットを利用する
エリザの使用を包含し得るものである。たとえば、エリ
ザにおけるＬＰＳサブユニット、たとえばリピドＡを結
合するための単クローン性抗体の能力はエピトープを限
定するが、リピドＡ部分上に表示されるようにこれに抗
して単クローン性抗体を方向づけるものである。

得られた抗すピドＡ単クローン性抗体は、以下に説明す
るようなグラム陰性菌起源の疾病の予防または治療用処
置に関して免疫グロブリン生成物との組合せにおいて使
用可能である。

上で言及したように、得られた単クローン性抗体はＩｇ
ＧまたはＩ　ｇ　！、１のいずれかであってもよい。

本発明の一実施態様において、単クローン性抗体を符号
化するＤＮＡをして杭内または種間（ｉｎｔｒａｓｐｅ
ｃｉｅｓ　ｏｒ　１ｎｔｅｒ−ｓｐｅｃｉｅｓ）の抗Ｃ
ＬＰＳ単クローン性抗体を構成するように工作させるこ
とが出来、および／または選択的原核あるいは真核発現
系（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）中に挿入さ
せることができる。たとえば、抗体による抗原の特異的
な結合は免疫グロブリンのＨ−およびＬ鎮双方の可変領
域の構造によって決定される一方、エフェクター機能は
ｌの一定領域の構造により決定されることが知られてい
る。Ｈ−およびＬ６ｍ双方は多重ＤＮＡセグメント　（
ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ）により
符号化される。１４準の組換え体ＤＮＡセグメント技法
によって、いずれかの可変領域をいずれかのＨ鎖定常的
領域に付着させることが可能である。たとえば、マウス
可変およびヒト定常領域ドメインを有するキメラ遺伝子
が構成され、クローン化され、そして発現されて来た。

この種の雑種遺伝子は、人間における非常に減少された
免疫原性についての単クローン性抗体を発現させるため
に使用することが出来る一方、抗原特異性を保持するも
のである。キメラ単クローン性抗体は、ヒトには注射す
ることが出来ず、あるいは一般に生体内または生体外の
限定された免疫グロブリン生成によって弱い免疫応答を
引き出す免疫原に抗して生成することが出来る。

キメラ分子は、免疫グロブリンの定常的および可変領域
の様々な新規の組合せよりの杭内および種間、または非
免疫グロブリンシーケンスに融合される免疫グロブリン
シーケンスから生成されて来た。トランスフェクション
、原形質体融合およびエレクトロポーレーションを含む
従来の技法を用いることにより、これらの雑種遺伝子は
骨髄腫またはリンパ球に導入されて来たが、あるいはこ
れらの遺伝子を非リンパ球、たとえば細菌または酵母内
で発現させることもできる。［ニス・エル・モリソン（
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　　Ｓ、Ｌ、）　、１９８５、”５ｃ
ｉｅｎｅ”２２９　：　１２０２−１２０７頁（１９８
５年）］、［ニー・ワイ・リニー他（Ｌｉｕ、　　Ａ、
Ｙ、ｅｔ　ａｌ、）　　、”Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳ八へ″８４　：　３４３９−３
４４３頁（１９８７年）］、［ジエーノ・ス他（Ｊａｍ
ｅｓ　ｅｔ　ａｌ、）、“Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈ、
”１００：５頁（１９８７年）］。それから単クり−ン
性抗体が得られる供給源または工程と無関係に、その抗
体は８抽のクラス・陰性菌種からのエンドトキシン上の
エピトープを認識し、かつこれに対し結合し、それによ
ってグラム陰性感染の致死的結果を減少させるものであ
る。

多クローン性抗体含有成分 本発明の組成物および方法において有用である多クロー
ン性抗体は精製１ｇＧ　、　ＩｇＭ　、ＩｇＡまたは免
疫グロブリンのクラスの組合せを含んで構成することが
出来る。ＩｇＧ免疫グロブリンが好ましい、通常または
高レベルの特異性多クローン性抗体を含有する血漿を使
用することが出来る。高レベルの抗体は数種類の方法い
ずれかの一方法により成就することができる。供与体を
免疫性として、１種類以上の特異性抗原、たとえばシュ
ードモナス・アエルギノーサの抗原に対し高力価の抗体
を含有する血漿を得ることが出来る。或いは人間の人口
の可成りの部分はグラム陰性菌に対抗する高レベルの抗
体を天然に有していることが知られている。これについ
ての理由は知られていないけれども、この発生は１種類
以上の問題の抗原に対抗する高力価の天然起源抗体に関
する供与体のスクリーニング・プログラム設定すること
により有利に利用することが出来る。本発明の目的のた
めに、これらの抗体の力価が生体外試験により測定され
たとき、通常の血漿のそれよりも少なくとも５倍大きけ
れば、血漿はグラム陰性菌に対し「高力価」の抗体を含
有しているものと考える。望ましいのは、この種の血漿
から調製される免疫グロブリンがグラム陰性菌に対し抗
体が、通常の血漿プール中の抗体レベルよりも１０倍大
きな力価を有することである。

多クローン性抗体グロブリン濃縮物は、冷エタノール沈
澱、透析、イオン交換吸着および限外濾過による濃縮を
含む当該技術分野において知られた手順を用いて血漿か
ら得ることが出来る。これらに限定されるものではない
、代替的方法にはポリエチレングリコール、ポリプロピ
レングリコール、無機塩（たとえば、硫酸アンモニウノ
・または硫酸す）　ＩＪウノ・）を使用する沈澱法、カ
ーボ・トシメチル、ジエチルアミノエチルまたは第４ア
ミノエチル官能基を含有する培養基を用いるイオン交換
吸着、免疫吸着、親和性吸着、等電沈澱、表面吸着また
はゲル濾過がある。

酸性ｐＨにおけるインキュベーション、酸性ｐｌ＋にお
ける痕跡量ペプシンによるインキュベーション、ペプシ
ンまたはプラスミンによるインキュベーション、還元お
よびアルキル化、スルオン化、Ｂ−プロピオラクトンに
よる処理あるいはヒドロキシエチル澱粉による処置によ
って生成される多クローン性静脈内免疫グロブリンも血
漿由来多クローン性免疫グロブリンの供給源とし使用出
来るが、この免疫グロブリンにはハイプリドーマ由来単
クローン性抗体が添加されるものとする。あるいは多ク
ローン性免疫グロブリンまたは、ポリヒドロキシ化合物
、たとえばマルトースまたはソルビトールの存在下また
は不存在下に低ｐｌ＋　（たとえば、３、５−５．５　
）において調製してもよい。

次いで、多クローン性免疫グロブリン溶液は従来の方法
により滅菌することが出来る。次に、この免疫グロブリ
ンを液体または凍結乾燥条件において安定化させ、かつ
貯蔵することが可能である。

安定な多クローン性免疫グロブリンは一般に約１０ｍｇ
／ｒｎｆ！乃至約２００ｍｇ／−の範囲に及ぶ濃度を有
し、そして筋肉内、腹膣内および静脈内注射に適してい
る。望ましくない副反応はＩｇＧ凝集体、パンアクティ
ブまたは潜在凝固剤、たとえばＰＫＡまたはトロンビン
による汚染ならびに他の非１ｇＧ蛋白質、たとえばＩｇ
ＡおよびＩｇＢを顕著に減少させることにより回避され
る。

多クローン性免疫グロブリン生成物は、本発明の組成物
を生成するための投与に先立って、または投与時に単ク
ローン性抗体と混合することが可能である。或は本発明
組成物の多クローン性抗体成分と単クローン性抗体成分
を別々に投与することもできるが、多クローン性免疫グ
ロブリンと単クローン性抗体とが、投与に先立ってこれ
ら二つの成分を混合したときに得られるような路間−の
治療的に有利な結果を生成せしめることができる期間内
に投与されるものとする。従って、ここで使用される「
組成物」は、本明細書中で説明されるように多クローン
性免疫グロブリンと単クローン性抗体の組合せを称し、
これは別々にあるいは組み合わせて投与されるものとす
る。多クローン性免疫グロブリンおよび単クローン性抗
体を含んで在る組成物は単独で投与される何れの成分よ
り一層の保護性を示している。

この種処置を必要とする患者に対し、本発明の組成物を
グラム陰性菌疾病の予防ふよび／または治療的処置のた
めに投与することが出来る。治療投与に際して、既にグ
ラム陰性菌起源の疾病に罹患している患者に対して、感
染および付随するエンドトキシン・ショックを治癒ある
いは少なくとも部分的に感染およびそのエンドトキシン
・ショックを停止されるに足る量をもって投与される。

これを達成するのに適切な量を治療上有効に投与量と称
する。この目的のための有効なｍは感染のひどさならび
に患者自身の免疫系に左右されて変動するが、一般に体
重のｋｇ当たり単クローン性抗体約０．２５乃至３ｍｇ
および多クローン性静脈内免疫グロブリン（ＩＧＩＶ）
約３００ｍｇ乃至約１ｇの範囲内にある。ｍＡｂ約０．
５乃至約１　ｍｇおよびＩＧＩＶ約５０約５００体 あるいは本発明の組成物を、深刻なグラム陰性菌感染を
受ける危険性があると判断された患者に対し予防投与す
ることもできる。感染のひどさを阻止し、あるいは少な
くとも顕著に減少させるのに適切な量を予防上有効な投
与量と称する。再び、この目的にとって有効な量は変動
するが、−船釣にそれらは体重ｋｇ当たり単クローン性
抗体約０．１乃至１ｍｇおよびＩＧＩＶ約５０ｍｇ乃至
約５００ｍｇの範囲内にある。好ましい投与量はｍＡｂ
約０．２５ｍｇ乃至約０．５ｍｇ　／　ｋｇおよびＩＧ
ＩＶ約２００　−４００　ｍｇ／ｋｇ（７）範囲内！：
及んでいる。

組成物は単一投与または多重投与として、患者を有効に
処置するのに足る抗体の分量を供給するために処置医師
により決定される処置パターンおよび投与量レベルをも
って投与することができる。

以下の実施例は本発明の例示を意図するものであるが、
それらは限定として解釈されるべきではない。

実施例１ ａ）融合 本発明中に記載されたハイブリドーマは当業者に知られ
た様々な技法の何れによっても生成させることが出来る
。たとえば、以下の文献中に記載された技法を参照され
たい。それらの全ては、細胞系分泌抗エンドトキシン単
クローン性抗体を生成するそれらの潜在性に関しては本
質的に均等である。［ケー・ジェームスおよびジー・テ
ィ・べ／ｌ／　（Ｊａｍｅｓ，　Ｋ　ａｎｄ　Ｂｅ１ｌ
，　Ｇ，Ｔ，）、１９８７年、“Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ．”　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１００　：　
５−４０。エム・ボラック、ニー・ニー・ロービチェッ
クおよびジェー・ダブりニー・ラリツク（Ｐｏｌｌａｃ
ｋ，　Ｍ，、　Ｒａｕｂｉｔｓｃ−ｈｅｋ，　Ａ，Ａ．
、　ａｎｄ　Ｌａｒｒｉｃｋ，　Ｊ．Ｗ．）　１９８７
年、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，　７９：１４２１−１４３０
。エヌ・エヌ・エッチ・テン、エッチ・ニス・カブラン
、ジェー・エム＆ハーバー他（Ｔｅｎｇ，　Ｎ，Ｎ，Ｉ
ｔ．、　Ｋａｐｌａｎ，　ｌ（、Ｓ，。

Ｈｅｒｂｅｒ，　Ｊ，Ｍ，、　ｅｔ．ａｌ）　１９３５
年、“Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ　８２　　：１７９０−１７
９４年。コ細胞系が生成された後、所望抗体を生じるそ
れらの細胞系を固定する必要がある。この工程は細胞系
培養が少なくとも部分的に集密的であることが顕微鏡的
に観察されたら直ちに開始してよい。

特異性抗体生成を検出するための便利な方法は、以下に
説明するエリザである。

以下の手順において、ハイブリドーマ細胞は上で参照し
たボラック他の教示に従って実質的に生成させた。リン
パ球はサルモネラ・ミネソタＲ５９５からのＣＬＰＳワ
クチンにより免疫性とされたヒト供与体から得た。この
免疫細胞はヒト・リンパ芽球細胞系Ｗｌ−１２−７２９
−ＨＦ２　（Ｗｌ−Ｌ２）　（７）細胞ニ対し融合され
た。

ｂ）エリザ［Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　１ｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ（ＥＬＩＳ八）　コ ポリスチレン９６−容器（ウェル）微量滴定プレー　）
　　（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　９５−ｗｅｌｌ　ｍ１
ｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐｌａｔｅｓ）から成る全ての容器
（ｗｅｌｌｓ）を蒸留水中５％グルクルアルデヒド０．
１ｍｊ！をもって３７℃で１時間活性化した。次いで、
これらの容器を水で１０回洗浄し、そして空にした。こ
れらのプレートをグルタルアルデヒドでインキュベート
する一方、サルモネラ・ミネソタＲ５９５ＬＰＳ　［リ
スト・バイオロジカル・ラボラトリーズ・インコーホレ
ーテッド（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）］　　５ｍｇを、トリエ
タノールアミン（ＴＥＡ）　５μ！およびエチレンジア
ミンテトラアセテ−）　（ＥＤＴＡ）　１９ｍｇを含有
するりん酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）　５　ｄ中に溶解
した。

次に、この溶液１／１０−をＴ８Ａ　１０μ！を含有す
るＰＢＳ　１０ｄに添加した。次いで、ＬＰＳ含有溶液
０．１−をグルタルアルデヒド活性化ブラートから成る
容器に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートし
た。インキュベーション期間に引き続き、これらの容器
をＰＢＳで５回洗浄し、空にし、そしてグリシン０．Ｉ
Ｍおよびウシの血清アルブミン（［１ＳＡ）を各容器に
添加して未反応結合部位をブロックした。

容器を空にした後、細胞を含まない上澄み液０．１ｍＩ
！を融合プレートから成る各ハイブリドーマ含有容器か
らエリヂ微ｍ滴定プレートから成る個々の容器に移し、
そして３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳおよ
び０．０５％「トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０」でプレ
ートを１０回洗浄し、かつ容器を空にした後、ＰＢＳ中
に希釈したアルカリ性ホスファターゼに共役している、
適切に希釈した抗ヒＮｇ［ザイムド・ラボラトリーズ・
インコーホレーテッド（２ｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、）、カリフォルニア州すウス・
サンフランシスコ］　　０．１ｍｊ’、　１％ＢＳＡ　
。

０．０５％「トゥイーン２０」を各容器に添加した。３
７℃における１時間のインキユベーションに引き続いて
、エリザプレートをＰＢＣ右よび０．０５％「トゥイー
ン２０」で７回洗浄し、容器を空にし、そして１Ｍジェ
タノールアミン中の１ｍｇ／ｍｌ’パラニトロフェニル
オスフェートであって、ｐＨ９，６の溶液０．１ｍＩ！
を各容器に添加した。

４０５ｎｍにおける光学濃度が各容器について２０．４
０および６０分間において測定された。抗ＬＰＳ抗体生
成についてポジティブであるハイブリドーマを対応する
エリザ・プレート容器を同定することにより測定したが
、ここにおいてその０．Ｄ、値は対照容器であって、ハ
イブリドーマ上澄み液を除いて全ての試薬添加剤を収容
したものより高いものとした。

ハイブリドーマ上澄み液の最初のエリザ試験に引き続く
３乃至４日で、サルモネラ・ミネソタＲ５９５ＬＰＳに
対してポジティブであるそれらのハイブリドーマを上記
のエリザ・システムで再試験したが、抗原としてはエシ
エリヒア・コリＪ５　（リスト・バイオロジカル・ラボ
ラトリーズ・インコーホレーテッド）からのＬＰＳを使
用するように変更した。これら２種類の抗体からのＬＰ
Ｓに対抗して反応するそれらのハイブリドーマ抗体を単
クローン性抗体に関する候補として保持したが、この単
クローン性抗体はＬＰＳのコア領域の共通である抗原を
認識するものである。保持した候補の中には、たとえば
ＩＩ　Ｒ７８および１１　Ｒ８９で表される２種類の抗
体があった。ハイブリドーマ生成ＨＲ７８およびＨＲ８
９の試料をブダペスト条約の期間に従ってメリーランド
州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチコア・コ
レクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、そして受入番号ＨＢ
９７６０およびＨＢ９７５９がそれぞれ付与された。

Ｃ）クローニング 上記した２種類のエリザ試験において反応性である抗体
を生成するハイブリドーマを、限定した希釈によってク
ローン化した。各ハイブリドーマについて、成長可能細
胞をフィーダー細胞（ｆｅｅｄ−ｅｒ　ｃｅｌｌｓ）　
　としてＲＰ！Ｊｌ　１６４０１００　ａｌｌ！、−当
たりマウス胸腺細胞２．５　Ｘ　１０’個を含有する２
０％胎児ウシ血清中に懸濁させた。４個の９６−容器培
養プレートの各容器内にこの細胞懸濁液０．２ｒｎＩ！
をピペットで分注し、そしてこれらのプレートを増湿チ
ャンバ内３７℃でインキュベートした。１０日後、これ
らのプレートをハイブリドーマ・コロニーの成長に関し
て顕微鏡的に検査した。各容器は当初約０．３個の細胞
を収容していたので、このハイブリドーマ・コロニーは
単一細胞から由来したものと推定され、従って単クロー
ン性であるとｔα断された。

容器中のコロニーは、培地の半分を新しい培地で置換す
ることにより再供給された。細胞コロニーが部分的に集
密的であったときは、上澄み液を上記したようなエリザ
において試験して、単クローン性抗体がコア等脂質抗原
に対抗する交差反応性を保持していることを確認した。

数種類のクローンが協力なエリザ活性を示しており、そ
してそれぞれの親ハイブリドーマから良好な成長が維持
された。

ｄ）無血清培地における成長 各親ハイブリドーマの４種類のクローンを細胞１０５個
／ｍｆをもって、範囲を限定した培地における４個の７
５ｃａｆ組織培養フラスコ内に播種した。使用した培地
は２０％ＦＣ３を補充した「ハナ・バイオロジカルズ（
ｔｌａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）　ＨＢ１０４　
Ｊであった。４日後、細胞を採取し、計数しそして前の
ように播種した。但し、Ｆｅ２の含ｍを１／２だけ減少
させて１０％とした。細胞は、その都度ＦＣ３を１／２
だけ減少させることによって３乃至４日ごとに同様に継
代した。但し、４個のフラスコ内の平均細胞密度は少な
くとも細胞４Ｘ１０５個／ｍ１とした。もし細胞がその
最低密度に達しなかったときは同一のＦＣ３濃度を用い
て再び培養した。３回の同一継代の後、それらの細胞が
密度細胞４Ｘ１０’個／ｒｄに到達することが出来なか
った場合、そのクローンは無血清条件には不適合である
と推定され、そして中止された。客観のハイブリドーマ
の４種類のクローンを評価することにより、少なくとも
１種類のクローンが無血清培地において成長するであろ
うという限りではチャンスが増加した。

１．２５％のＦｅ２を含有する培地内でハイブリドーマ
が一度上首尾に成長すると、それは無血清限定培地中で
継代された。第三継代後、細胞を含まない上澄み液がサ
ンプリングされ、そしてヒト単クローン性抗体の濃度が
定量的エリザによって測定された。最高の抗体生成を伴
うそれぞれのハイブリドーマからのクローンかスケール
アップ抗体精製および評価のために選択された。

実施例　２ ヒト単クローン性抗ＣＬＰＳ抗体の精製ａ）イソタイプ
の決定 各種試料、たとえば培養上澄み中に含まれた単クローン
性抗体の量を測定するために、エリザが行われる。この
アッセイはいずれかのイソタイプを有する単クローン性
抗体に適合させるためにヒＮｇＧまたはヒＨｇ！、ｌに
ついて特異であるような方法で構成されている。従って
、−炭車クローン性抗体が、共通コアＬＰＳエピトープ
を認識するためのその機能について、また無血清培地を
成長させるためのハイブリドーマの機能について選択さ
れると、この単クローン性抗体のイソタイプだ決定され
る。

単クローン性抗体のイソタイプを決定するために、僅か
な変更をと伴って実施例１、ｂ）の項のエリザが利用さ
れた。具体的には、単クローン性抗体を対の容器内の抗
原に対し結合させた。次いで、抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒ
トＩｇ！Ｊに共役されたアルカリ性ホスファターゼを各
容器に添加した。エリザの残りの部分は上記した手順に
従って実行し、そして単クローン性抗体のイソタイプを
関連するアルカリ性ホスファターゼ共役に関する反応性
によって決定した。

ｂ）定量的エリザ インタイブの決定に引き続いて、定ｍ的エリザを行って
単クローン性抗体含有試料中のＩｇＧまたはＩｇＭの濃
度を測定した。Ｉ　ｇ　！Ｊ抗体に関して、ポリスチレ
ン９６−容器微量滴定プレートから成る各容器を抗ヒト
ＩｇＭ　１０μｇ　／ｍｌを含有する溶液０．１−で充
填した。これらのプレートを３７℃で１時間インキュベ
ートシ、次いでＰＢＳで５回洗浄し、そして容器を空に
した。次に、プレートを容器当たり０．１艷のＰＢＳ　
、　１％ウシ血清アルブミン溶液を添加することにより
ブロックし、そして３７℃で１時間インキュベートした
。単クローン性抗体含有試料を対の容器に対し、０．１
ｍＥの容量をもって添加した。次いで、１ｇＭ供給源、
特にＩｇＭの知られた量を含有するヒト血清を使用して
標準のカーブが生成された。この血清中のＩｇＭの量は
市販されている試験システム、たとえば放射免疫拡散法
またはレーザーネフェロメトリーを利用して測定された
。基準１ｇＭ含量の確認を行うために、１種類以上の測
定方法を利用することが好ましい。ＩｇＭ濃度が０．１
乃至１．０μｇ　／ｍｌの範囲内にあれば、定量的エリ
ザが最も精確である。従って基準１ｇＭを、少なくとも
対の容器４組がその濃度範囲内に収まるようにＰＢＳで
希釈した。単クローン性抗体ＩｇＭを１μｇ　／ｒｄ！
を超えて含有していると予想される試験試料を適切に希
釈して、その試験試料濃度を基準カーブ濃度範囲内のも
のとした。

ＩｇＧ抗体の濃度を測定するために、同一の手順を続け
る。但し、微量滴定プレートから成る容器を抗ヒ）　Ｉ
ｇＧを含有する溶液および知られた量のＩｇＧを含有す
るヒト血清で充填したという例外を採用して基準カーブ
を生成させる。

Ｃ）単クローン性抗体の精製 ハイブリドーマ細胞を限定された培地内で成長させ、そ
して６個の３リツトル攪拌フラストに細胞１０５個／　
ｍｌをもって播種した。この培地は単クローン性抗体の
精製用供給源物質として使用すべきであったので、二つ
の要件を満たすように選択されねばならない。第一に、
単クローン性抗体はその抗細菌活性について試験される
べきであったので、試験すべき単クローン性抗体中には
殺菌剤の存在する可能性が全くあってはならない。従っ
て、抗生物質、たとえばペニシリンまたはストレプトマ
イシンは使用されなかった。第二に、単クローン性抗体
はエンドトキシンに対抗するものであるので、その上澄
み液は発熱物質を含まないものでなければならない。従
って、ｍＡｂと接触する全てのガラス製品およびその他
の物質は発熱物質を排除せねばならず、そして発熱物質
を含まない水の使用も含めて、あらゆる培地は無発熱物
質で調製しなければならなかった。市販のカブトガニ・
アメーバ細胞溶解質（ＬＡＬ）試験を利用して発熱物質
試験を行った。通２：１．の培養を行う前の培地は０．
２５工ンドトキシン単位（ｆＥｔｌ）　／ｍｌを含有し
ており、また培養上澄み液は通常２．ＯＥＵ／ｍｆ未？
１３Ｔｈを含有している。

培養の３乃至５日後、滅菌無発熱物質のグラスファイバ
ー・フィルターを最初通過させてポンプで汲み上げて細
胞および細抱残屑除去することにより上澄み液を採取し
た。次いで、透明にした上澄み液を「ミリパック（Ｍｉ
ｌｌｉｐａｃｋ）　５０　Ｊ　０．２２ＡｔＭフィルタ
ー［ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）コを通過させて粒
状物質を除去した。次に、この１８ｆの上澄み液プール
をして強力なアニオン交換体「ゼータプレツブ（Ｚｅｔ
ａｐｒｅｐ）　Ｊ■［キュノ・インコーホレーテッド（
Ｃｕｎｏ　Ｉｎｃ、）コ　１００カートリツジを流量ｉ
ｆ／時間で横断させた。培養上澄み液をフィルターに装
填した後、このフィルターを、インラインＵｖ検出器に
より検出し、かつ２８０ｎＭにおける吸光度を測定して
、過剰の蛋白質が除去されるまで０．１５Ｎ　ＮａＣｌ
、　ｐＨ７，５の０．０５Ｍ　　トリス緩衝液により洗
浄した。この蛋白質をＱ、５Ｎ　ＮａＣｌ溶液、ｐ（１
７，５の０．０５Ｍ　　）　ＩＩＪス緩衝液を使用して
溶離し、そして蛋白質含有ピークの最初の５０ｍ１を収
集した。

このピークを、０．　Ｅ　ＮａＣｌ　ＳｐＨ７，５の０
．０５Ｍ　　）リスで予ルｊｕ平衡させた「セファクリ
ル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００」［ファーマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　］の５　ｃｍ　Ｘ５０ｃｍカ
ラムに適用し、そして１２０ｍｆ／時間で運転した。最
初の蛋白質ピークはＩｇ！、１を含有するＡ２８０で検
出されるように、容ｆｆ１６０ｄをもって収集された。

精製ｍＡｂは全蛋白質、定量的エリザによる１ｇｊ＋、
およびＬＡＬによるエンドトキシンについて試狭し、そ
してポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に
より分析した。典型的に、この試料の蛋白質含有量は１
００μｇ／ｍＥ乃至２００μｇ　／ｍｆ’であった。

このｍＡｂは試料全蛋白質の約１／２を構成し、他の半
分はＰＡＧＥにより示されるように主としてアルブミン
から構成されていた。この種の製剤は通常１−３ＥＵ／
−を含有している。この方法で調り２された単クローン
性抗体は引き続く生体外および生体内評価に関して適切
なものである。

実施例２において精製されたｍＡｂの試料は、各種のリ
ボ糖類に対する生体外反応性に関してエリザにより試験
した。このｍＡｂを最初に濃度１０μｇ／ｍｌに希釈し
た。これに抗してｍＡｂが試験される抗原は、実施例１
、ｂ）項に記載されるようなサルモネラ・ミネソタＲ５
９５およびエシェリヒア・コリＪ５からのＬＰＳを包含
していた。Ｒ５９５ＬＰＳからのリピドＡならびに野生
型グラム陰性閑から抽出された各種のＬＰＳもまり使用
された。

リビドＡ抗原に対する結合を示すｍＡｂは、エンドトキ
シン性ショックによる死から動物を保護するためのそれ
らの機能に関する生体内外クローン性免疫グロブリンに
よる引き続く評価のために保持された。

実施例　４ グラム陰性菌感染についてヒトのｌ（、末的セツティン
グを最も精確に反映する動物モデルを開発するために、
生活生物およびエンドトキシン双方の致死的な結果を考
慮した。これのための様々な抗体製剤に関し、生活細菌
および同一の生物から精製されたエンドトキシンを含む
致死的攻撃投与量に対して試験動物を保護するそれの機
能について試験した。

ａ）ヒト多クローン性１ｇＧ 以下に記載する実験は下記の一般的協定に従って行われ
た。異系勾配したスイス・ウェブスター（Ｓ胃ｉｓｓ　
Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスに最初多クローン性抗体製剤を
０．３ｒｒｄ！静脈内注射として与えた。１．５時間後
、これらのマウスに滅菌無発熱物質食塩水０．２ｉ中に
溶解したガラクトサミン・ヒドロクロリド１５ｍｇを腹
膣内注射により与えて、エンドトキシンに対するそれら
の感度を増大せしめた。１．５時間後、これらの動物を
中間対数増殖期に成長した生活エシェリヒア・コリ０７
に１生物またはアンドトキシンあるいは生物十エンドト
キシンの組合せの致死投与量をもって攻撃した。

このモデルにおけるヒト多クローン性静脈内免疫グロブ
リンの効力を測定するために実験を行ったが、ここにお
いてそれぞれ体重１６−１８ｇの雌のスイス・ウェブス
ターマウス１１６匹を各２４匹の４つのグループならび
に各１０匹の２つのグループに分割した。全てのマウス
は滅菌無発熱物質食塩水の静脈内（ＩＪ、）注射か、あ
るいはＩＧＩＶ　（静脈内ヒト免疫グロブリン）１０ｍ
ｇの注射を受けた。ＩＧＩＶは「ガンマガード（Ｇａｍ
ｍａｇａｒｄ）　Ｊ■［バクスター・トラヴエノール・
ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（Ｂａｘｔｅｒ
　Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｃ、）　］の凍結乾燥した試料からの粉末の適量を
秤量し、そしてそれを注射用の無発熱物質水中に溶解す
ることにより調製した。蛋白’Ｒ？ａ度は「ギルフォー
ド（Ｇｉｌｆｏｒｄ）　Ｊ分光光度計に対するＡ２８０
の読みを利用して５０ｍｇ／ｍＩ！に調節した。ＩＧＩ
Ｖは滅菌無発熱物質食塩水中で３３１／３　ｍｇ／ｍＩ
！に希釈した。マウスはＩＶｏ、３−またはＩＧＩＶ　
１０ｍｇを受けた。

エンドトキシン感度はガラクトシミンヒドロクロリドを
使用して増加させ、そして全攻！ｌり投与量は腹膣内に
投与した。

４８時間後、生存マウスの数は次の通りであった。

非保護マウス（食塩水をうけたもの）においては、生物
のみで攻撃されたグループ内の生存マウス６２．５％、
エンドトキシンのみにより攻撃されたグループ内の生存
マウス５０％、そして生物＋エンドトキシンの組合せ（
第１表）で攻撃された生存マウス４１．６％であった。

ＩＧＩＶ　１０ｍｇで保護されたマウスにおいては、生
物のみで攻撃された生存マウスは約８３％、エンドトキ
シンのみにより攻撃されたグループ内の生存マウス６０
％、そして生物およびエンドトキシンの組合せく第１表
）で攻撃された生存マウス３７．５％であった。従って
、ＩＧＩＶ細菌感染に抗してマウスを保護したが、付加
的なエンドトキシンを含有する致死的な生物攻撃に対す
る同様な保護を提供することには失敗した。

第１表 ）反：］；ｇ９７．に、１．ｘ、、ｙ：型１１団イ冑潔
牙界憾より）ヒト抗エンドトキシン単クローン性抗体ヒ
ト抗体エンドトキシン単クローン性抗体の効力を測定す
るために、下記の動物モデルを用いた。

試験した抗エンドトキシン単クローン性抗体はｌｌＲ７
８およびＨＲ８９であった。（実施例１　（ｂ）参照）
。

抗体１１ｒ！７８は１ｇＭクラスを含んでおり、またに
Ｌ鎮を有している。それは生体外でサルモネラ・ミネソ
タＲ５９５：　エシェリヒア・コリＪ５からのＬＰＳな
らびにエシェリヒア・コリおよびサルモネラ・ミネソタ
Ｒ５９５からのリピドＡと反応する。それは生体外でサ
ルモネラ・ミネソタおよびエシェリヒア・コリ０１１１
　：　Ｂ４からの野生型ＬＰＳとは弱く反応するのみで
あった（第２表）。しかしながら、野生型リボ多糖類に
対する生体外活性は多糖側鎖の生存に起因して抑制され
る可能性がある。抗体ＨＲ８９は１ｇＭクラスを含んで
おり、またにｌを有している。それは生体外でサルモネ
ラ・ミネソタＲ５９５およびエシェリヒア・コリＪ５か
らのしＰＳならびにサルモネラ・ミネソタおよびエシェ
リヒア・コリからのリピドＡと反応する。ＨＲ７８と同
様に、それは野生型サルモネラ・ミネソタまたはエシェ
リヒア・コリから単離さたＬＰＳとは生体外で強力に反
応することはない。

９０齢で、性整合させた（ｓｅｘ−ｍａｔｃｈｅｄ）ス
イス・ウェブスフ−マウスを各３０匹の３つのグループ
（グループＡ、ＢおよびＣ）に分割した。グループＡは
滅菌食塩水０．３ｍｆ！中のＩＧＩＶ　１０／−１ｇを
受けた。グループＢは滅菌食塩水０．３−中の試験杭エ
ンドトキシンｍへｂ　１０μｇを受（すだ。グル−プＣ
はＩＧＩＶ　１０ｍｇおよびｍＡｂ１０μｇから成る１
、Ｖ、注射０．３ｒｎｌを受けた。！、ｖ、注射１．５
時間後、全てのマウスはガラクトサミン１５ｍｇを腹腔
的に受けた。

１．５時間後、以下の腹腔的な攻撃が施された。すなわ
ち、各グループ内の１０匹のマウスは１０個のエシェリ
ヒア・コリ０７に１生物＋エシエリヒア・コリ０７に１
１Ｊボ多糖１０ナノグラムを受け、１０匹のマウスは１
００個の生物＋ＬＰ３１０ナノグラムを受け、そして１
０匹のマウスは１０００個の生物子ＬＰ３１０ナノグラ
ムを受けた。

４８時間後、グループＡ、ＢおよびＣ中の生存率を測定
した。グループＡおよび已における生存率よりも遥かに
高いグループＣにおける生存率はｍ八すが有効であるこ
とを示している。重要性（ｓｉ−ｇｎｆ　１ｃａｎｃｅ
）は２×２の偶発性試験（ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙｔｅ
ｓｔ）を利用して生成したｐ値により決定した。

単クローン性抗体ＨＲ７８およびＩＩ　Ｒ８９は顕著な
保護活性を示した。

生体内においてＨＲ７８＋ＩＧＩＶの組合せは、エシェ
リヒア・コリ０７に１＋エンドトキシンに抗して抗体あ
るいはＩＧＩＶ単独におけるよりもマウスを良好に保護
した（第３表、実験１参照）。同様に生体内で、ＨＲ８
９＋ＩＧＩＶの組合せは、エシェリヒア・コリ０７に１
生物＋エンドトキシンに抗してＨＲ８９またはＩＧＩＶ
単独におけるよりもマウスを良好に保護したく第３表、
実験２参照）。

第　２ 表 しＰＳ抗原 サルモネラ・ミネソタ野生型 サルモネラ・ミネソタＲ５９５ サルモネラ・ミネソタビドＡ エシェリヒア・コリ　０１１１：８４ エシエリヒア・コリＪ５ エシェリヒア・コリリピドＡ １１　Ｒ７８ ０、１０５ ０、５０９ ０、４０１ ０、００８ ０、４８３ ０、６１８ ＩＩ　Ｒ８９ ０、２０４ ０、５２９ ０、６６６ ０、２６４ ０、６５８ ０、７６２ グループ 第 表 生（ｒ一体１０匹 ＩＪ　　１．３　１．３　　合計生 ＸＩＯ’　ＸＩＯ’　　ＸＩＯ３存体／３０Ｚ） グループし河クルー７巳

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）グラム陰性菌の抗原に対抗する多クローン性抗体
   を含有する多クローン性免疫グロブリンと、各種のグラ
   ム陰性菌リポ多糖菌のエンドトキシン領域に共通する抗
   原と結合可能であり、かつこれを中和し得る単クローン
   性抗体とを含んで構成されることを特徴とする組成物。
2. （２）単クローン性抗体がＩｇＧまたはＩｇＭイソタイ
   プを示す請求項１記載の組成物。
3. （３）多クローン性免疫グロブリンが抗体であって、各
   種のグラム陰性菌についてＯ抗体原特異性を認識するも
   のを含有している請求項１記載の組成物。
4. （４）免疫リンパ球を不死化細胞系融合パートナーに融
   合し、そして融合生成物ハイブリドーマ細胞系を選択す
   ることにより得られるハイブリドーマから単クローン性
   抗体が得られる請求項１記載の組成物。
5. （５）融合に先立って、免疫リンパ球がエプスタイン−
   バールウイルスにより感染している請求項４記載の組成
   物。
6. （６）単クローン性抗体が、２種類のグラム陰性菌属か
   らの少なくとも２個の異なったリポ多糖類に対し交差反
   応性である請求項１記載の組成物。
7. （７）単クローン性抗体が哺乳類である請求項１記載の
   組成物。
8. （８）単クローン性抗体がヒトである請求項７記載の組
   成物。
9. （９）単クローン性抗体がイントラ・スペーシズ・キメ
   ラである請求項１記載の組成物。
10. （１０）単クローン性抗体がインター・スペーシズ・キ
    メラである請求項１記載の組成物。
11. （１１）単クローン生免疫グロブリンがグラム陰性菌の
    １種類以上の抗原に対し、エリザにより測定したときの
    通常の血漿中に見られる値の少なくとも５倍の範囲内の
    抗体の力価を有している請求項１記載の組成物。
12. （１２）多クローン性免疫グロブリンがグラム陰性菌の
    １種類以上の抗原に対し、エリザにより測定したときの
    通常の血漿中に見られる値の少なくとも１０倍の範囲内
    の抗体の力価を有している請求項１記載の組成物。
13. （１３）血漿が、グラム陰性菌抗原ワクチンをもってワ
    クチン接種されたヒト供与体から得られた請求項１１ま
    たは１２記載の組成物。
14. （１４）少なくとも１種類のグラム陰性菌生物に対し天
    然の高い抗体効力を有しているヒト供与体から血漿が得
    られた請求項１１または１２記載の組成物。
15. （１５）治療上有効量の請求項１記載の組成物を投与す
    ることを特徴とするグラム陰性菌起源の疾病に罹患して
    いる患者を処置する方法。
16. （１６）投与に先立ち、請求項１記載の組成物である多
    クローン性免疫グロブリンと、単クローン性抗体とを混
    合する請求項１５記載の方法。
17. （１７）請求項１記載の組成物である多クローン性免疫
    グロブリンと、単クローン性抗体とを投与の部位におい
    て混合する請求項１５記載の方法。
18. （１８）請求項１記載の組成物の多クローン性免疫グロ
    ブリン成分と、単クローン性抗体成分とを別々に投与す
    る請求項１５記載の方法。
19. （１９）予防上有効量の請求項１記載の組成物を投与す
    ることを特徴とするグラム陰性菌起源の疾病に罹患する
    危険を有する患者を処置する方法。
20. （２０）投与に先立ち、請求項１記載の組成物である多
    クローン性免疫グロブリンと、単クローン性抗体とを混
    合する請求項１９記載の方法。
21. （２１）請求項１記載の組成物である多クローン性免疫
    グロブリンと、単クローン性抗体とを投与の部位におい
    て混合する請求項１９記載の方法。
22. （２２）請求項１記載の組成物の多クローン性免疫グロ
    ブリン成分と、単クローン性抗体成分とを別々に投与す
    る請求項１９記載の方法。