JPH02142476A - 新規組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６ - Google Patents
新規組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６Info
- Publication number
- JPH02142476A JPH02142476A JP29420488A JP29420488A JPH02142476A JP H02142476 A JPH02142476 A JP H02142476A JP 29420488 A JP29420488 A JP 29420488A JP 29420488 A JP29420488 A JP 29420488A JP H02142476 A JPH02142476 A JP H02142476A
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- grf
- pgrfm44
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- dhfr
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
木発′：明は、成長ホルモン分泌調節活性を有すること
が知られている牛成長ホルモン放出因子（以下、ＧＲＦ
と略す。）の２７番目のアミノ酸であるメチオニンがイ
ソロイシンに変換した誘導体をカルボキシ末端側に有す
るジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す。）の
生産を可能とする新規■換えプラスミドに関するもので
ある。ｐＧＲＦＭ４４−６は第２図に示されるＤＮＡ配
列を有する。ｐＧＲＦＭ４４−６およびｐＧＲＦＭ４４
−６を含有する大Ｊｉｆ３菌は２発酵工業、医薬品工業
等の分野に好適である。
が知られている牛成長ホルモン放出因子（以下、ＧＲＦ
と略す。）の２７番目のアミノ酸であるメチオニンがイ
ソロイシンに変換した誘導体をカルボキシ末端側に有す
るジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと略す。）の
生産を可能とする新規■換えプラスミドに関するもので
ある。ｐＧＲＦＭ４４−６は第２図に示されるＤＮＡ配
列を有する。ｐＧＲＦＭ４４−６およびｐＧＲＦＭ４４
−６を含有する大Ｊｉｆ３菌は２発酵工業、医薬品工業
等の分野に好適である。
［従来の技術および問題点］
ＧＲＦは生長ホルモンの分泌を促すペプチドである。牛
のＧＲＦは４４個のアミノ酸からなり。
のＧＲＦは４４個のアミノ酸からなり。
その配列はアミノ末端側からチロシン−アラニン−アス
パラギン酸、−アラニン−イソロイシン−フェニルアラ
ニン−トレオニン−アスパラギン−セリン−チロシン−
アルギニン−リジン−バリン−ロイシン−グリシン−グ
ルタミン−ロイシン−セリン−アラニン−アルギニン−
リジン−ロイシン−ロイシン−グルタミン−アスパラギ
ン酸−イソロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−ア
ルギニン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタ
ミン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン−グル
タミン酸−グルタミン−グリシン−アラニン−リジン−
バリン−アルギニン−ロイシンであり、カルボキシ末端
がアミド化されている。
パラギン酸、−アラニン−イソロイシン−フェニルアラ
ニン−トレオニン−アスパラギン−セリン−チロシン−
アルギニン−リジン−バリン−ロイシン−グリシン−グ
ルタミン−ロイシン−セリン−アラニン−アルギニン−
リジン−ロイシン−ロイシン−グルタミン−アスパラギ
ン酸−イソロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−ア
ルギニン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタ
ミン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン−グル
タミン酸−グルタミン−グリシン−アラニン−リジン−
バリン−アルギニン−ロイシンであり、カルボキシ末端
がアミド化されている。
ＧＲＦは、視床下部に存在するが、その含量は少なく、
牛５００頭からせいぜい数ミリグラム程度分離精製でき
ればよい方であり、効率のよい生産方法の開発が期待さ
れている。
牛５００頭からせいぜい数ミリグラム程度分離精製でき
ればよい方であり、効率のよい生産方法の開発が期待さ
れている。
ＧＲＦのアミノ酸配列とその生理活性にとの関係に関し
ては種々の研究成果が報告されている（Ｎ、Ｌｉｎｇ、
ｅｔ ａｌ、 Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ
、、ｖｏｌ、５４．ｐ、４０３（１９８５））。ＧＲＦ
の２７番目のアミノ酸であるメチオニンは生理活性発現
には重要な役割を果しておらず、このアミノ酸をイソロ
イシンとかロイシンに変換しても問題がないことが明ら
かにされている（Ｇ、１１．Ｃ１ｏｒｅ、 ｅｔ ａｔ
、、 ＪＪｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、、ｖｏｌ、１９１゜ｐ、
５５３（！９８６））。
ては種々の研究成果が報告されている（Ｎ、Ｌｉｎｇ、
ｅｔ ａｌ、 Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ
、、ｖｏｌ、５４．ｐ、４０３（１９８５））。ＧＲＦ
の２７番目のアミノ酸であるメチオニンは生理活性発現
には重要な役割を果しておらず、このアミノ酸をイソロ
イシンとかロイシンに変換しても問題がないことが明ら
かにされている（Ｇ、１１．Ｃ１ｏｒｅ、 ｅｔ ａｔ
、、 ＪＪｌｏｌ、Ｂｉｏｌ、、ｖｏｌ、１９１゜ｐ、
５５３（！９８６））。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って興味深い
ポリペプチドを微生物をもちいて生産することが可能に
なった。ポリペプチドに対応する遺伝子であるＤＮＡを
２例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離す
るなどし、その後、これを発現ベクターと呼ばれる適当
なプラスミドなどに糺み込み、その結果得られる新換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入し。
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って興味深い
ポリペプチドを微生物をもちいて生産することが可能に
なった。ポリペプチドに対応する遺伝子であるＤＮＡを
２例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離す
るなどし、その後、これを発現ベクターと呼ばれる適当
なプラスミドなどに糺み込み、その結果得られる新換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入し。
目的遺伝子を微生物中で発現させ、微生物から目的ポリ
ペプチドを分離精製することが行われている。このよう
な状況においては、目的ポリペプチド遺伝子を含み、且
つ効率よく発現させるＮ■換えプラスミドを構築するこ
とが最も重要な課題である。また、目的ポリペプチドが
異なれば自ずからその方法論が異なフており、この点が
解決しなければならない技術課題である。
ペプチドを分離精製することが行われている。このよう
な状況においては、目的ポリペプチド遺伝子を含み、且
つ効率よく発現させるＮ■換えプラスミドを構築するこ
とが最も重要な課題である。また、目的ポリペプチドが
異なれば自ずからその方法論が異なフており、この点が
解決しなければならない技術課題である。
すでに本発明者らは、ＧＲＦの１番目から２９番目まで
のアミノ酸配列を有するＧＲＦ誘導体を暗号化するＤＮ
Ａを絹み込んだ糾換えプラスミドｐＧＲＦ２Ｂ−２９（
時開 昭６２−１１５２８７）、ｐＧＲＦ２−１５ （
特許 昭６２−３０２１５６）およびｐｓＧｌ−１２（
特許出願中）の構築に成功している。しかしながら、４
４個のアミノ酸よりなるＧＲＦの誘導体を組み込んだ絹
換えプラスミドについては知られていない。
のアミノ酸配列を有するＧＲＦ誘導体を暗号化するＤＮ
Ａを絹み込んだ糾換えプラスミドｐＧＲＦ２Ｂ−２９（
時開 昭６２−１１５２８７）、ｐＧＲＦ２−１５ （
特許 昭６２−３０２１５６）およびｐｓＧｌ−１２（
特許出願中）の構築に成功している。しかしながら、４
４個のアミノ酸よりなるＧＲＦの誘導体を組み込んだ絹
換えプラスミドについては知られていない。
［発明の目的］
本発明者らは、４４個の長さよりなるＧＲＦの誘導体の
生産を可能とする組換えプラスミドの開発を目的に行わ
れた。
生産を可能とする組換えプラスミドの開発を目的に行わ
れた。
本発明者らは鋭意研究を行った結果、ＧＲＦの１番目か
ら２９８目までのアミノ酸配列を有するＧＲＦ誘導体と
ＤＨＦＲとの融合タンパク質を大量に発現する上記組換
えプラスミドｐｓＧ１−１２を利用することを考案し、
そのことに基づき本発明を完成させた。
ら２９８目までのアミノ酸配列を有するＧＲＦ誘導体と
ＤＨＦＲとの融合タンパク質を大量に発現する上記組換
えプラスミドｐｓＧ１−１２を利用することを考案し、
そのことに基づき本発明を完成させた。
［発明の構成］
第１図は９本発明の組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−
６がつくる組換えタンパク質であるＤＨＦＲと、４４個
のアミノ酸よりなるＧＲＦの誘導体（以下、、に、ＲＦ
Ｍと略す）との、融合タンパク質（以下、 Ｄ ＨＦ
Ｒ−Ｇ ＲＦと略す）のアミノ酸配列およびそれを暗
号化するＤＮＡ塩基配列を示している。Ｄ ＨＦ Ｒ−
Ｇ ＲＦは、２０６アミノ酸よりなるタンパク質である
。このうちアミノ末端側から数えて、】から１５９８目
までの配列が。
６がつくる組換えタンパク質であるＤＨＦＲと、４４個
のアミノ酸よりなるＧＲＦの誘導体（以下、、に、ＲＦ
Ｍと略す）との、融合タンパク質（以下、 Ｄ ＨＦ
Ｒ−Ｇ ＲＦと略す）のアミノ酸配列およびそれを暗
号化するＤＮＡ塩基配列を示している。Ｄ ＨＦ Ｒ−
Ｇ ＲＦは、２０６アミノ酸よりなるタンパク質である
。このうちアミノ末端側から数えて、】から１５９８目
までの配列が。
大腸菌の野生型ＤＨＦＲに１箇所アミノ酸置換置換が起
こった（Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ） −＋
Ｇｌｕ−１５２）配列であり、１６３から２０６番目
迄がＧＲＦＭの配列である。ＧＲＦＭは牛のＧＲＦの２
７番目のアミノ酸であるメチオニンがイソロイシンに置
換し、かつカルボキシ末端のアミノ酸であるロイシンが
アミド化されていない配列を有するＧＲＦ誘導体である
。１６０６０番目１６２６２番目ＨＦＲとＧ ＲＦＭと
を結合するアミノ酸配列であるが、このうち１６２６２
番目ミノ酸がメチオニンであり、ブロムシアンで処理す
ることによりＧＲＦＭを切り出すことを可能にしている
。 第２図は１本発明のｐＧＲＦＭ４４−６の全塩基配
列を示している。図は、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮ
Ａ鎖配列配列を、５′末端から３′末端の方向に記述し
ている。また、ｐＧＲＦＭ４４−６は環状ＤＮＡである
が記述の都合上、直鎖状で現している。従って、最初と
最後のが隣あって存在することになる。ｐＧＲＦＭ４４
−６は、４７６０塩基対の大きさであり、宿主である大
腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付与す
ることができる。ｐＧＲＦＭ４４−６は、大腸菌に導入
されて安定状態に保たれ、ｐＧＲＦＭ４４−６を含有す
る大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ ＢＰ−２１５１とし
て寄託されている。
こった（Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ） −＋
Ｇｌｕ−１５２）配列であり、１６３から２０６番目
迄がＧＲＦＭの配列である。ＧＲＦＭは牛のＧＲＦの２
７番目のアミノ酸であるメチオニンがイソロイシンに置
換し、かつカルボキシ末端のアミノ酸であるロイシンが
アミド化されていない配列を有するＧＲＦ誘導体である
。１６０６０番目１６２６２番目ＨＦＲとＧ ＲＦＭと
を結合するアミノ酸配列であるが、このうち１６２６２
番目ミノ酸がメチオニンであり、ブロムシアンで処理す
ることによりＧＲＦＭを切り出すことを可能にしている
。 第２図は１本発明のｐＧＲＦＭ４４−６の全塩基配
列を示している。図は、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮ
Ａ鎖配列配列を、５′末端から３′末端の方向に記述し
ている。また、ｐＧＲＦＭ４４−６は環状ＤＮＡである
が記述の都合上、直鎖状で現している。従って、最初と
最後のが隣あって存在することになる。ｐＧＲＦＭ４４
−６は、４７６０塩基対の大きさであり、宿主である大
腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付与す
ることができる。ｐＧＲＦＭ４４−６は、大腸菌に導入
されて安定状態に保たれ、ｐＧＲＦＭ４４−６を含有す
る大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ ＢＰ−２１５１とし
て寄託されている。
ｐＧＲＦＭ４４−６は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦを暗号化する
配列を含む。第２図において、５７番目から６７４番目
迄の配列がＤＨＦＲ−ＧＲＦを暗号化する配列である。
配列を含む。第２図において、５７番目から６７４番目
迄の配列がＤＨＦＲ−ＧＲＦを暗号化する配列である。
ＤＨＦＲ−ＧＲＦを暗号化する配列の上流には、この遺
伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特願昭
６ｌ−３１２８３６）。即ち、４３番目から５０番目ま
での配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良い翻訳
に、また、４７１８番目から４７４６番目までが。
伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特願昭
６ｌ−３１２８３６）。即ち、４３番目から５０番目ま
での配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良い翻訳
に、また、４７１８番目から４７４６番目までが。
コンセシサス転写プロモーターであり、効率の良ＦＲ−
ＧＲＦを作る。作られたＤＨＦＲ−ＧＲＦは菌体内に多
量にＶ積し、その量は菌体タンパク質の１５〜２０％に
いたる。また、蓄積したＤＨＦ Ｒ−Ｇ ＲＩ”はジヒ
ドロ葉酸還元酵素活性を示し。
ＧＲＦを作る。作られたＤＨＦＲ−ＧＲＦは菌体内に多
量にＶ積し、その量は菌体タンパク質の１５〜２０％に
いたる。また、蓄積したＤＨＦ Ｒ−Ｇ ＲＩ”はジヒ
ドロ葉酸還元酵素活性を示し。
このことによって、ｐＧＲＦＭ４４−６を保持する大腸
菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例
ｐＧＲＦＭ４４−６の作成
ｐＧＲＦＭ４４−６は、すてに本発明者らが作製してい
る組換えプラスミドｐｓＧ１−１２と化学合成りＮＡｔ
ｔ用いることにより作製した。
る組換えプラスミドｐｓＧ１−１２と化学合成りＮＡｔ
ｔ用いることにより作製した。
ｐｓＧｌ−１２は、ＤＨＰＲと牛ＧＲＦの１番目から２
９番目までのアミノ酸配列を有するＧＲＦ誘導体との融
合タンパク質を大量に発現する組換えプラスミド（時開
出願中）であり、第２図で示される配列の６３０番目か
ら６７４番目までの４５塩基対の配列が欠落した構造を
している。
９番目までのアミノ酸配列を有するＧＲＦ誘導体との融
合タンパク質を大量に発現する組換えプラスミド（時開
出願中）であり、第２図で示される配列の６３０番目か
ら６７４番目までの４５塩基対の配列が欠落した構造を
している。
化学合成りＮＡとしては、ＧＲＦの２９番目から４４番
目までのアミノ酸配列を暗号化する配列に、ｐｓＧｌ−
１２の制限酵素切断部位を利用できる様にするために必
要な配列を含ませるように以下に示すように設計した。
目までのアミノ酸配列を暗号化する配列に、ｐｓＧｌ−
１２の制限酵素切断部位を利用できる様にするために必
要な配列を含ませるように以下に示すように設計した。
１．５ ’ −ＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧ
ＧＧＴＧ −３’２ 、５ ’ −ＡＡＴＣＴＡＡＣＣ
ＡＧＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＣＴ
ＧＴＡＡＣ−３’３．５’ −ＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧ
ＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＣ−３’
４．５ ’ −ＴＴＧＧＴＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧ
ＣＴＧＡＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴ−３′設計した上記４
本のＤＮＡをホスホアミダイト法に従って化学合成した
く図２の６１８番目から６７８番目までの配列に相当す
る）。
ＧＧＴＧ −３’２ 、５ ’ −ＡＡＴＣＴＡＡＣＣ
ＡＧＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＴＣＴ
ＧＴＡＡＣ−３’３．５’ −ＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧ
ＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＧＴＴＣＣ−３’
４．５ ’ −ＴＴＧＧＴＴＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧ
ＣＴＧＡＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴ−３′設計した上記４
本のＤＮＡをホスホアミダイト法に従って化学合成した
く図２の６１８番目から６７８番目までの配列に相当す
る）。
ｐｓＧｌ−１２を制限酵素ＥｃｏＲＶとＸｈ。
■を用いて切断することによって得られる２本のＤＮＡ
断片のうち長い方のＤＮＡ断片（図２の６１８番目から
６７８番目までの配列を除いた配列に相当する）と、化
学合成した４本のＤＮＡの５′末端をリン酸化した後、
アニールしたものとを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを
利用して結合した。このような操作は、いずれも、 ”
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌｏｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｅ。
断片のうち長い方のＤＮＡ断片（図２の６１８番目から
６７８番目までの配列を除いた配列に相当する）と、化
学合成した４本のＤＮＡの５′末端をリン酸化した後、
アニールしたものとを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを
利用して結合した。このような操作は、いずれも、 ”
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌｏｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｅ。
Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 ｅｄ
ｓ、 Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｎ８１１ａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）、以下２文献１と呼ぶ）
に記載している方法に従って行った。得られた反応物を
、形質転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ、上記文献１に記載）に従って、大腸菌に取り込
ませた。
ｓ、 Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｎ８１１ａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）、以下２文献１と呼ぶ）
に記載している方法に従って行った。得られた反応物を
、形質転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ、上記文献１に記載）に従って、大腸菌に取り込
ませた。
この処理をした菌体を、５０ｍｇ／Ｉのアンピシリンナ
トリウムおよび２ｍｇ／Ｉのトリメトプリムを含む栄養
寒天培地（培地１１中に、２ｇのグルユース。
トリウムおよび２ｍｇ／Ｉのトリメトプリムを含む栄養
寒天培地（培地１１中に、２ｇのグルユース。
Ｉｇのリン酸２カリウム＋５ｇのイーストエキス。
５ｇのポリペプトン、１５ｇの寒天を含む。）上に塗布
し、３７°Ｃで２４時間培養することにより。
し、３７°Ｃで２４時間培養することにより。
１００以上のコロニーを得ることができた。これらのコ
ロニーから適当に２０個選び＋ Ｌ ５ｍｌのＹＴ＋
Ａｐ培地（培地ｌｌ中にｒ５８のＮａＣＩ。
ロニーから適当に２０個選び＋ Ｌ ５ｍｌのＹＴ＋
Ａｐ培地（培地ｌｌ中にｒ５８のＮａＣＩ。
５ｇのイーストエキス、８ｇのトリプトン、５０ｍｇの
アンピシリンナトリウムを含む。）で、３７℃。
アンピシリンナトリウムを含む。）で、３７℃。
１晩、菌体を培養した。培養液を、各々エッペンドルフ
遠心管にとり、 １２，０００回転回転下１０分間遠心
分離し、菌体を沈澱として集めた。これに。
遠心管にとり、 １２，０００回転回転下１０分間遠心
分離し、菌体を沈澱として集めた。これに。
０．１ｍｌの電気泳動用サンプル調製液（０，０６２５
ＨのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ６，Ｌ ２χのラウリル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０χのグリセリン、５χ
の２−メルカプトエタノール、 ０．００１χのブロム
フェノールブルーを含む。）を加え１面体を懸濁し、こ
れを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶かした。この処理
をしたサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法（Ｕ、に、Ｌａｅｎ＋ｍｌｉ； Ｎａｔｕｒｅ、
ｖｏｌ、２２７． ｐ、６８０−６８５（＋９７０）
）に従って分析した。分子量マーカーとしてラクトアル
ブミン（分子ｆｆ１１４，２００）計りプシンインヒビ
ター（分子ｆｆ１２０．１００） 、 ）リブシノー
ゲン（分子ｆｆ１２４，０００） 、カルボニックアン
ヒドラーゼ（分子ｆ１２９，０００） 、グリセロアル
デヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子ｆｆ１３６，
０００） 、卵アルブミン（分子ｆｆ１４５，０００）
、および牛血清アルブミン（分子−ｊｉ１６６．００
０）を含むサンプルをポリアクリルアミドａ１Ｍの１０
から２０％濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、２０個
のコロニーのうち。
ＨのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ６，Ｌ ２χのラウリル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０χのグリセリン、５χ
の２−メルカプトエタノール、 ０．００１χのブロム
フェノールブルーを含む。）を加え１面体を懸濁し、こ
れを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶かした。この処理
をしたサンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法（Ｕ、に、Ｌａｅｎ＋ｍｌｉ； Ｎａｔｕｒｅ、
ｖｏｌ、２２７． ｐ、６８０−６８５（＋９７０）
）に従って分析した。分子量マーカーとしてラクトアル
ブミン（分子ｆｆ１１４，２００）計りプシンインヒビ
ター（分子ｆｆ１２０．１００） 、 ）リブシノー
ゲン（分子ｆｆ１２４，０００） 、カルボニックアン
ヒドラーゼ（分子ｆ１２９，０００） 、グリセロアル
デヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子ｆｆ１３６，
０００） 、卵アルブミン（分子ｆｆ１４５，０００）
、および牛血清アルブミン（分子−ｊｉ１６６．００
０）を含むサンプルをポリアクリルアミドａ１Ｍの１０
から２０％濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、２０個
のコロニーのうち。
２個では分子量が大きくなったタンパク質（分子爪駒２
６，０００と推定される。）を新たに大量に生産してい
ることが明かとなった。デンシトメーターで分析するこ
とにより、新たに現れたタンパク質の量は菌体タンパク
質の約２０％であることが推定された。
６，０００と推定される。）を新たに大量に生産してい
ることが明かとなった。デンシトメーターで分析するこ
とにより、新たに現れたタンパク質の量は菌体タンパク
質の約２０％であることが推定された。
分子量の大きい新たなタンパク質を生産するコロニーの
うちから適当に一つ選び、これをＹＴ＋Ａｐ培地で培貴
し、 ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ。
うちから適当に一つ選び、これをＹＴ＋Ａｐ培地で培貴
し、 ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ。
Ｔａｎａｋａ、 Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ； Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ｖｏｌ、１２１゜ｐ、３５４（
１９７５））に従って、プラスミドを調製した。
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、 ｖｏｌ、１２１゜ｐ、３５４（
１９７５））に従って、プラスミドを調製した。
得られたプラスミドをｐＧＲＦＭ４４−６と名づけた。
得られたプラスミドを再び大腸菌に導入したところ、ｐ
ＧＲＦＭ４４−６とまフたく同じ性質を有する形質転換
株が、１０５〜１０’／μｇプラスミドＤＮＡの頻度で
得られた。このことは。
ＧＲＦＭ４４−６とまフたく同じ性質を有する形質転換
株が、１０５〜１０’／μｇプラスミドＤＮＡの頻度で
得られた。このことは。
ｐＧＲＦＭ４４−６の性質が安定していることを示して
いる。また、ｐＧＲＦＭ４４−６が大腸菌菌体内で安定
に複製されることを示している。
いる。また、ｐＧＲＦＭ４４−６が大腸菌菌体内で安定
に複製されることを示している。
ｐ Ｇ ＲＦ Ｍ ４４−６は、ｐｓＧｌ−１２のＥｃ
ｏＲＶとＸｈｏ１部位との開の配列が合成りＮＡ由来の
配列と置き換わった配列をしているはずである。ｐＧＲ
ＦＭ４４−８をＥｃｏＲＩと５ａＪＩによる切断によっ
て得られる約５００ヌクレオチド長のＤＮＡについて９
Ｍ１３フアージを用いたジデオキシ法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ；Ｍｅｈｔｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ−ｏｇｙ
、 ｖｏｌ、１０１．ｐ、２０（１９８３））に従って
塩基配列を決定した。その結果、第２図に示すｐＧＲＦ
Ｍ４４−６の全塩基配列の４７１番目から９８２番目の
配列が明らかにされた。
ｏＲＶとＸｈｏ１部位との開の配列が合成りＮＡ由来の
配列と置き換わった配列をしているはずである。ｐＧＲ
ＦＭ４４−８をＥｃｏＲＩと５ａＪＩによる切断によっ
て得られる約５００ヌクレオチド長のＤＮＡについて９
Ｍ１３フアージを用いたジデオキシ法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ；Ｍｅｈｔｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ−ｏｇｙ
、 ｖｏｌ、１０１．ｐ、２０（１９８３））に従って
塩基配列を決定した。その結果、第２図に示すｐＧＲＦ
Ｍ４４−６の全塩基配列の４７１番目から９８２番目の
配列が明らかにされた。
また、ｐＧＲＦＭ４４−６のＥｃｏＲＩ−Ｓａ２切断に
よって得られる約４．２キロ塩基刻のＤＮＡは、Ｐｓｔ
ｌ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、１（ｐａｌ、ＡａｔＩＩ、Ｐｖｕ
■、ＢｇｌｌＩ、およびＣ１ａＩを用いた制限酵素によ
る切断実験の結果ｒ ｐｓＧｌ−１２のＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｌｌ切断によって得られる約４．２キロ塩基対のＤＮ
Ａと全く同一であることがポされた。
よって得られる約４．２キロ塩基刻のＤＮＡは、Ｐｓｔ
ｌ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、１（ｐａｌ、ＡａｔＩＩ、Ｐｖｕ
■、ＢｇｌｌＩ、およびＣ１ａＩを用いた制限酵素によ
る切断実験の結果ｒ ｐｓＧｌ−１２のＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｌｌ切断によって得られる約４．２キロ塩基対のＤＮ
Ａと全く同一であることがポされた。
以上の姑！泉から、ｐＧＲＦＭ４４−６の全塩基配列が
第３図に示した配列であることが明らかである。
第３図に示した配列であることが明らかである。
［発明の効果］
上記のように、新規＆ｌ１１９！えプラスミドｐＧＲＦ
Ｍ４４−６は、Ｄｉ−ＩＦＲ−ＧＲＦを暗号化しており
、かつｐＧＲＦＭ４４−６を有する大Ｉｌ！菌は。
Ｍ４４−６は、Ｄｉ−ＩＦＲ−ＧＲＦを暗号化しており
、かつｐＧＲＦＭ４４−６を有する大Ｉｌ！菌は。
ＤＨＦＲ−ＧＲＦを大量に蓄積生産する。さらに。
生成したＤ ＨＦ Ｒ−Ｇ ＲＦは、ＤＨＰＲとＧＲＦ
Ｍとがメチオニンを介して結合した構造をしており、ブ
ロムシアン処理により容易に両者の分離が可能である。
Ｍとがメチオニンを介して結合した構造をしており、ブ
ロムシアン処理により容易に両者の分離が可能である。
このような性質を有することから。
本発明の新規組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６およ
びそれを有する大腸菌は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦの生産、お
よびそれを利用したＧＲＦＭの生産に有益である。
びそれを有する大腸菌は、ＤＨＦＲ−ＧＲＦの生産、お
よびそれを利用したＧＲＦＭの生産に有益である。
第１図は、ｐＧＲＦＭ４４−６中に存在するＤＨＦＲ−
ＧＲＦを暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基お
よびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを
、Ｇはグアニンを。 Ｔはチミンを、 Ａ １ ａはアラニンを、Ａｒｇはア
ルギニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓｐはアスパ
ラギン酸を、Ｃｙｓはシスティンを。 Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を。 Ｇ１５／はグリシンを、Ｈｉｓはヒスチジンを。 １１ｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを。 Ｌｙｓはリジンを、Ｍｅｔはメチオニンを。 Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ｓ
ｅｔはセリンを、Ｔｈｒはトレオニンを。 Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒはチロシンを。 Ｖａｌはバリンを示している。図中番号は、ｌ＠目のア
ミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧコドンの”
Ａ”を１番として数えた番号を示している。 第２図は、ｐＧＲＦＭ４４−６の全塩基配列を示した図
であり、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を
、５°末端から３′末端の方向に記述している。図中符
号は、核酸塩基を表し、ＡＭ４４−［３に２箇所存在す
る制限酵素Ｃ１ａｌ切断認識部位のうち制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌＨ切断部位に近い方のＣ１ａｌ切断認識部位の、５
’ −ＡＴＣＧＡＴ−３’ 、の最初の”Ａ”を１番と
して数えた各号を示している。
ＧＲＦを暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸塩基お
よびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを
、Ｇはグアニンを。 Ｔはチミンを、 Ａ １ ａはアラニンを、Ａｒｇはア
ルギニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓｐはアスパ
ラギン酸を、Ｃｙｓはシスティンを。 Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を。 Ｇ１５／はグリシンを、Ｈｉｓはヒスチジンを。 １１ｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを。 Ｌｙｓはリジンを、Ｍｅｔはメチオニンを。 Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ｓ
ｅｔはセリンを、Ｔｈｒはトレオニンを。 Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒはチロシンを。 Ｖａｌはバリンを示している。図中番号は、ｌ＠目のア
ミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴＧコドンの”
Ａ”を１番として数えた番号を示している。 第２図は、ｐＧＲＦＭ４４−６の全塩基配列を示した図
であり、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を
、５°末端から３′末端の方向に記述している。図中符
号は、核酸塩基を表し、ＡＭ４４−［３に２箇所存在す
る制限酵素Ｃ１ａｌ切断認識部位のうち制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌＨ切断部位に近い方のＣ１ａｌ切断認識部位の、５
’ −ＡＴＣＧＡＴ−３’ 、の最初の”Ａ”を１番と
して数えた各号を示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、第１図において示されるアミノ酸配列を有
する牛成長ホルモン放出因子の誘導体とジヒドロ葉酸還
元酵素との融合タンパク質を暗号化し、第２図において
示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラスミドｐＧ
ＲＦＭ４４−６。 ２、特許請求範囲第１項記載の新規組換えプラスミドｐ
ＧＲＦＭ４４−６を含有する大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29420488A JPH02142476A (ja) | 1988-11-21 | 1988-11-21 | 新規組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29420488A JPH02142476A (ja) | 1988-11-21 | 1988-11-21 | 新規組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02142476A true JPH02142476A (ja) | 1990-05-31 |
| JPH0355113B2 JPH0355113B2 (ja) | 1991-08-22 |
Family
ID=17804671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29420488A Granted JPH02142476A (ja) | 1988-11-21 | 1988-11-21 | 新規組換えプラスミドｐＧＲＦＭ４４−６ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02142476A (ja) |
-
1988
- 1988-11-21 JP JP29420488A patent/JPH02142476A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0355113B2 (ja) | 1991-08-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |