JPH1129598A - 精製した毛様体神経栄養因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な坐骨神経毛様体神経栄養因子（ＳＮ−
ＣＮＴＦ）の提供。 【解決手段】 下記の性質：（１）ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において約２４，０００の分子量
を示す；（２）２×１０⁸ TU／mg以上の比活性を有す
る；及び（３）生物活性がＳＤＳ及び還元剤に対して抵
抗性である；を有することを特徴とするタンパク質を含
んで成る、実質的に精製されたタンパク質坐骨神経毛様
体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は神経栄養因子、特に
毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、並びにＣＮＴＦの精
製方法および組み換えＣＮＴＦの生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】重症の精神的および肉体的無能力は神経
系の神経細胞またはグリア細胞の死から生じる。神経細
胞またはグリア細胞の死はアルツハイマー病、パーキン
ソン病、多発性硬化症のような神経変性疾患によるか、
脳卒中が原因の虚血によるか、外傷性の傷害によるか、
または自然の老齢化により引き起こされる。神経栄養因
子は神経細胞またはグリア細胞の生存および機能的活性
を促進する一群の分子である。先に列挙した症状から生
じる神経細胞またはグリア細胞の死または機能不全を阻
止する治療剤として神経栄養因子が有用であろうことを
示唆する証拠がある。Appel, 1981, Ann. Neurology 1
0:499。

【０００３】このような神経栄養因子のうちで最も詳し
く特性決定がなされているものは神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）である。ＮＧＦはアルツハイマー病期間中および年
齢の増加に伴い死滅する前脳コリン作動性神経細胞にと
っての神経栄養因子であることが証明されている。これ
らの神経細胞の喪失は一般にアルツハイマー病および加
齢と関連した多くの認識欠損の原因であると考えられて
いる。動物実験では、ＮＧＦが外傷性傷害後の前脳コリ
ン作動性神経細胞の死を阻止し、さらにＮＧＦが加令と
共に起こる認識喪失を逆転しうることが立証されてい
る。Hefti およびWeiner, 1986, Ann. Neurology 20:27
5; Fischerら、1987, Nature, 329:65。これらの結果
は、この神経栄養因子がヒトにおける病気、傷害または
老化による前脳コリン作動性神経細胞の死から生じる認
識喪失の治療に臨床上有用でありうることを示唆してい
る。

【０００４】神経栄養因子の使用の複雑さは、正しいメ
ンブランレセプターを保有する神経細胞のサブ集団のみ
に対するそれらの特異性にある。身体の大部分の神経細
胞はＮＧＦレセプターを欠いており、明らかにこの神経
栄養因子に応答しない。従って、種々の型の神経細胞ま
たはグリア細胞の生存をＮＧＦ以上に支持しうる新しい
神経栄養因子を発見することが臨床上重要である。新し
い神経栄養因子がＮＧＦ非応答性神経細胞培養物の生存
を支持するそれらの能力により検索されている。１つの
広く用いられるスクリーニングアッセイが、骨格筋およ
び平滑筋を神経支配する毛様体神経節運動ニューロンの
生存を促進する因子を発見するために設計される。これ
らの毛様体神経節神経細胞は副交感神経系に属し、それ
らの生存はＮＧＦによって支持されない。

【０００５】毛様体神経節神経細胞の生存を促進する因
子の存在はいろいろな組織および種から報告されてい
る。これらは毛様体神経節神経栄養活性の多くは次のよ
うな類似した化学的および生物学的性質をもっている：
すなわち（１）その活性は坐骨神経に高濃度で存在す
る；（２）その神経栄養活性はドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド還元型ゲルでの電気泳動
中にイオン性界面活性剤ＳＤＳに対してまたは還元剤β
−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）またはジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）に対して露出されても残存する；およ
び（３）このようなゲル上をその活性は２４−２８kdの
見掛け分子量で移動する。Collins, 1985,Development
al Biology, 109:255-258； Manthorpeら、1986, Brain
Research,367:282-286 。

【０００６】これらの類似した性質に基づいて、代表的
には“毛様体神経栄養因子”または“ＣＮＴＦ”と呼ば
れる、同一のまたは密接に関連した分子が、毛様体神経
節神経栄養活性の原因をなすことが提案されている。こ
うして、用語ＣＮＴＦは培養下の毛様体神経節神経細胞
の生存を促進する上記性質を有する物質のことを指す作
用上の定義である。これらの活性の原因をなすタンパク
質が同一であることを確立するに充分なデータがなけれ
ば、ＣＮＴＦはそれらの起源である組織および種によっ
て区別されよう。従って、その起源の種がウサギである
ならば、命名はウサギ坐骨神経ＣＮＴＦ（ウサギＳＮ−
ＣＮＴＦ）である。

【０００７】坐骨神経ＣＮＴＦは明らかに坐骨神経のよ
うな末梢神経に最大濃度で見出される。それは外傷の際
にその神経の細胞から放出される。ＳＮ−ＣＮＴＦは知
覚神経、交感神経、および副交感神経の細胞を含めた試
験したすべての末梢神経系神経細胞の生存と成長を支持
する。従って、ＳＮ−ＣＮＴＦはＮＧＦよりも広い範囲
の反応性神経細胞を有する。ラットＳＮ−ＣＮＴＦは中
枢神経系の特殊種類のなグリア細胞の形成を調節するこ
とが最近示されている（Hughesら、1988, Nature 335:7
0 ）。

【０００８】上記の証拠に基づいた最も理にかなう仮説
は、坐骨神経ＣＮＴＦが外傷に対する神経系の応答成分
であるということである。損傷神経の細胞から放出され
たＳＮ−ＣＮＴＦは、損傷神経細胞の生存および再増殖
を促進し、かつ再生に必要なグリア細胞の機能的活性化
を調節することが予期されよう。これらの考察はＳＮ−
ＣＮＴＦが病気または外傷によって生じた神経系に対す
る損傷を軽減するのに治療上有効であろうことを示して
いる。

【０００９】ＳＮ−ＣＮＴＦにおける広範な科学的興味
にもかかわらず、天然源から実質的な量を精製すること
の困難性とヒトＳＮ−ＣＮＴＦを入手することの困難性
のために、病気中のまたは損傷後の神経細胞の生存能力
を持続させるその価値を証明する試みが妨げられてい
る。ラットＳＮ−ＣＮＴＦを精製する従来の試みにより
粗製神経抽出物と比べて比活性の点で８００倍の濃縮が
もたらされている。Manthorpe ら、1986, Brain Resear
ch 367:282-286。

【００１０】しかしながら、比活性の８００倍の増加は
単一のタンパク種を得るのに不十分であった。従って、
Manthorpe らの方法から得られた活性増大を示す生成物
は、それが複数のタンパク種を包含するので不十分であ
る。適当な生物学的活性を有する単一のタンパク種が得
られるようなＳＮ−ＣＮＴＦの精製を達成することが望
ましいであろう。ひとたび単一のタンパク種が得られる
と、その配列決定データはより正確なものとなろう。
“単一のタンパク種”とは、以後本明細書と添付の請求
の範囲でこの用語を用いる場合、それらの活性部位を通
して同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは一連
のポリペプチドを意味する。言い換えれば、アミノ酸配
列の機能的部分が２以上のポリペプチド間で同一である
ならば、たとえ長さや電荷に関して少しの不均質性が存
在しても、それらはここで定義される“単一のタンパク
種”である。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＳＮ
−ＣＮＴＦを精製するための改良方法を提供することで
ある。本発明の別の目的は、単一タンパク種が得られる
ように、今までに達成されたものより高度に精製された
ＳＮ−ＣＮＴＦを提供することである。本発明の更なる
目的は、ＳＮ−ＣＮＴＦをコードする動物およびヒト遺
伝子をクローニングするためにｃＤＮＡおよびゲノムラ
イブラリーのスクリーニングを容易にするプローブを提
供することである。本発明の他の目的は、動物およびヒ
トＣＮＴＦの核酸および対応するアミノ酸配列を提供す
ることである。本発明の他の目的は、ヒトまたは動物Ｃ
ＮＴＦの核酸配列をヒトまたは動物ＣＮＴＦタンパク質
の生産に使用できる組み換え発現系を提供することであ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】これらおよび他の目的
は、比活性が粗製抽出物から精製ＳＮ−ＣＮＴＦへ２
５，０００倍以上増加するようなＳＮ−ＣＮＴＦの精製
方法を提供することにより達成される。２５，０００倍
以上に精製されたＳＮ−ＣＮＴＦも提供される。本発明
のいくつかの好ましい実施態様の他の好適な特徴によれ
ば、ＳＮ−ＣＮＴＦプローブがＳＮ−ＣＮＴＦのｃＤＮ
Ａおよびゲノムライブラリーをスクリーニングするため
に提供される。

【００１３】本発明のいくつかの好ましい実施態様の他
の好適な特徴によれば、ウサギおよびヒトアミノ酸およ
び核酸ＣＮＴＦ配列が提供される。本発明のいくつかの
好ましい実施態様の他の好適な特徴によれば、生物学的
に活性な動物またはヒトＣＮＴＦを生産するための組み
換え発現系が提供される。本発明のいくつかの好ましい
実施態様の他の有利な特徴によれば、酸処理、硫酸アン
モニウム分画化、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルでの調製物の泳動および逆相ＨＰＬＣからな
る工程を含むＳＮ−ＣＮＴＦの精製方法が提供される。

【００１４】本発明のいくつかの好ましい実施態様の他
の好適な特徴によれば、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーがクロマトフォーカシングの直前と直後に用いられ
る付加的な精製工程が提供される。以上の一般的説明と
以下の詳細な説明は両方とも例示と説明にすぎず、特許
請求される本発明を制限するものでないことを理解すべ
きである。本明細書に組み込まれてその一部を構成する
添付図面は本発明のいろいろな実施態様を示し、以下の
説明と合わせて、本発明の原理を説明するのに役立つだ
ろう。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の現在好ましい実施態様に
ついて詳細に説明する。これらは以下の実施例と合わせ
て本発明の原理を説明するのに役立つ。上で述べたよう
に、本発明は粗製抽出物から少なくとも２５，０００倍
に精製されたＳＮ−ＣＮＴＦに関する。このＳＮ−ＣＮ
ＴＦは本明細書中で定義した通りの単一タンパク種であ
る。単一タンパク種として、ＳＮ−ＣＮＴＦのアミノ酸
配列を決定でき、これはＳＮ−ＣＮＴＦの組み換え生産
に使用するためのゲノムクローンまたはｃＤＮＡクロー
ンを得るためのＤＮＡプローブを設計するのに使用でき
る。単一タンパク種のＳＮ−ＣＮＴＦのアミノ酸配列が
部分的に決定されている。その配列は次の通りである：

【００１６】

【化５】

【００１７】付加的なアミノ酸配列が精製ウサギＳＮ−
ＣＮＴＦから決定されており、これを実施例２に示す。
この付加的配列により、上に示したアミノ酸配列の一部
を単一の大きいペプチド内に位置づけできる（実施例
２）。この単一ペプチドの配列は３種類の縮重オリゴヌ
クレオチドプローブ（実施例４の＃１，１３および７）
を作製するために使用され、これらのプローブは互いに
対する位置が知られているので、ポリメラーゼ連鎖反応
を開始させるのに非常に有用である。ウサギおよびヒト
ＣＮＴＦをコードする核酸（ｍＲＮＡ均等）配列が決定
されており、そして図１１と１２に示してある。生物学
的に活性なＣＮＴＦを一時的に発現する組み換え系が開
発されており、実施例５に記載される。

【００１８】さらに、本発明はＳＮ−ＣＮＴＦを精製す
るための改良方法に関する。本発明は任意の供給源から
のＳＮ−ＣＮＴＦに関するが、以下の記述はウサギから
単離されたものに関する。簡単に述べると、本方法の好
ましい一実施態様はウサギ坐骨神経材料を粉砕すること
を包含する。次に粗製抽出物を遠心分離にかける。上清
を酸性となし、生成する沈殿を遠心により除去する。次
に上清をＮａＯＨで滴定し、生成した沈殿物を遠心によ
り再び除去する。ｐＨ沈殿後、飽和硫酸アンモニウム溶
液を上清に加え、沈殿を遠心により除去する。この上清
に硫酸アンモニウムをさらに加えると、大部分のＳＮ−
ＣＮＴＦ活性を含有するタンパク質フラクションが沈殿
してくる。

【００１９】上記の調製物を次にＭｏｎｏＰクロマトフ
ォーカシングＦＰＬＣカラムにかける。次にカラムフラ
クションを集め、ｐＨおよびＣＮＴＦ活性について分析
する。ピークＳＮ−ＣＮＴＦ活性を含有し図１に棒線で
示したフラクションを以下で詳しく論ずるとおりさらに
処理する。ＭｏｎｏＰカラムでの数回のクロマトフォー
カシングにより分離されたフラクションをＳＤＳポリア
クリルアミドスラブゲルで電気泳動する。２２−２７kd
の分子量に相当するゲルの領域をゲル幅を横切って切り
出し、複数のゲル片を得る。個々のゲル片をさらに小さ
く切り、タンパク質を電気泳動により溶出する。溶出さ
れたタンパク質を集め、最大活性を有するフラクション
を逆相ＨＰＬＣを用いてさらに精製する。この操作は以
下の実施例でより詳しく述べることにする。

【００２０】さらに、本発明は、より多くの出発物質を
都合よく処理できるようにするために、上記の精製操作
にとり込むことができる追加工程に関する。これらの追
加工程の好ましい実施態様では、フェニル−セファロー
スでの疎水性相互作用クロマトグラフィーが硫酸アンモ
ニウム分画化とクロマトフォーカシングの間に挿入さ
れ、そしてＦＰＬＣアルキル−スペロースカラムでの疎
水性相互作用クロマトグラフィーがクロマトフォーカシ
ングと調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に挿入される（実施
例１）。

【００２１】本発明によって提供された方法は、粗製抽
出物から比活性が２５，０００倍以上増大したＳＮ−Ｃ
ＮＴＦを精製された形で生ずる。その上に、得られた最
終産物は単一のタンパク種である。これは、先に論じた
Manthorpe らで精製したと報告された、多数のタンパク
種を含むＳＮ−ＣＮＴＦと比べて３０倍以上の増大であ
る。ＳＮ−ＣＮＴＦは逆相ＨＰＬＣで部分的に不活性化
されるので、本発明による少なくとも２５，０００倍精
製の計算は最小限の精製を表し、実際の精製は１００，
０００倍またはそれ以上でさえありうる。この精製の高
まりにより、ＳＮ−ＣＮＴＦのアミノ酸配列の決定が容
易となろう。ＳＮ−ＣＮＴＦをコードする動物およびヒ
ト遺伝子をクローニングするために、本発明に従って、
ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーのスクリーニングを
容易にするオリゴヌクレオチドプローブを作製するのに
十分なアミノ酸配列が得られている。

【００２２】本発明によって提供された方法は、ウサギ
およびヒトＣＮＴＦのコード（ｍＲＮＡ均等）配列の決
定をもたらした。以下でさらに詳しく論ずるように、こ
れらの遺伝子は、（１）神経系の損傷の動物モデルを治
療するその能力についての研究に適した動物ＳＮ−ＣＮ
ＴＦ、および（３）ヒト神経系への損傷を治療するのに
有用な医薬組成物への配合に適したヒトＳＮ−ＣＮＴ
Ｆ、の大規模生産を可能にしよう。本発明によって提供
された方法は、組み換え発現系における生物学的に活性
な動物ＣＮＴＦの生産をもたらした。

【００２３】これらの精製タンパク質を使って、突出し
たペプチドのアミノ酸配列を決定できる。タンパク質を
最初エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテアー
ゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ、または
キモトリプシンで処理する。消化後Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ気相タンパク質シークエンサーを用
いて突出ペプチドのアミノ酸配列を決定できる。精製Ｓ
Ｎ−ＣＮＴＦと反応する抗体は、ＳＮ−ＣＮＴＦをコー
ドする遺伝子を得るために、発現ライブラリーをスクリ
ーニングするのに使用できる。ＳＮ−ＣＮＴＦの配列の
領域に相当する合成ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ自動タンパク質合成機を用いて合成で
きる。この種のタンパク質は抗体の調製に使用できる。
合成ペプチドに対する抗体が生産されており、これはウ
ェスタンブロット分析により精製ＣＮＴＦと反応するこ
とが示されている（図１０）。

【００２４】以上の操作から、最終目的はヒト医薬製剤
に使用するのに適した物質を調製するためにヒトＳＮ−
ＣＮＴＦ遺伝子をクローニングして発現させることであ
る。ひとたびゲノム配列が解明されると、ＳＮ−ＣＮＴ
Ｆをコードする遺伝子を次に動物または細菌細胞で発現
させることができる。ＣＮＴＦをコードするウサギおよ
びヒト遺伝子配列が決定されている。生物学的に活性な
ＣＮＴＦを生産するための一時的発現系が開発されてい
る。ＣＮＴＦを製造するための組み換えＤＮＡ法をここ
で開示する。本発明の一実施態様では、その活性部位は
ヒトから単離した天然ＣＮＴＦの活性部位と生物学的に
等しい方法で機能する。天然または合成ＤＮＡ配列をＣ
ＮＴＦの直接生産に使用できる。

【００２５】この方法は次の工程： （ａ）宿主細胞にＣＮＴＦ活性を有するタンパク質の生
産を指示できるＤＮＡ配列を調製し； （ｂ）宿主細胞への移入とその中での複製が可能なベク
ター中に前記ＤＮＡ配列をクローニングし（前記ベクタ
ーは該ＤＮＡ配列の発現に必要なオペレーションエレメ
ントを含有）； （ｃ）前記合成ＤＮＡ配列およびオペレーションエレメ
ントを含有するベクターを、ＣＮＴＦをコードするＤＮ
Ａを発現しうる宿主細胞へ移入し； （ｄ）ベクターの増幅とＣＮＴＦの発現に適する条件下
で宿主細胞を培養し； （ｅ）ＣＮＴＦを回収し；そして （ｆ）ＣＮＴＦに活性三次構造をとらせ、それによりＣ
ＮＴＦ活性をもたせる；ことを包含する。

【００２６】一実施態様においては、組み換えＣＮＴＦ
の生産に使用される、部分合成または全合成ＤＮＡ配列
は天然ＤＮＡ配列と異なるヌクレオチドを含有しうる。
好適な実施態様では、異なるヌクレオチドを含有するＤ
ＮＡ配列は、それでもなお、動物またはヒトＣＮＴＦ遺
伝子によりコードされるＣＮＴＦと同じ一次構造を有す
るポリペプチドをコードしていよう。別の好適な実施態
様では、異なるヌクレオチドを含有するＤＮＡ配列は、
天然ＣＮＴＦに関連した一次構造をもち、しかもここに
記載するＣＮＴＦの生物学的活性の少なくとも１つを有
するポリペプチドをコードしていよう。本発明の一実施
態様においては、ＣＮＴＦをコードする天然ＤＮＡ配列
は宿主生物または細胞での発現を促進するように修飾さ
れる。このような修飾には次のものが包含できる。

【００２７】（ａ）天然ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡであ
り、微生物での発現が意図される場合は、介在する非コ
ード配列（イントロン）を除去できる； （ｂ）連結、クローニングおよび突然変異誘発の後続工
程を容易にするために、種々の制限酵素により認識され
る配列を含むように核酸配列を変更する； （ｃ）組み換えタンパク質の生産のために使用される宿
主生物または細胞によって好まれるコドンを生成される
ように核酸配列を変更する； （ｄ）宿主生物または細胞中でのＤＮＡの維持および発
現に必要なオペレーションエレメントに核酸配列を結合
させる。 本発明の一実施態様においては、発現させようとするＤ
ＮＡ配列は上記のようにして調製され、そして宿主生物
または細胞内に保持されてＣＮＴＦの発現を指示できる
発現ベクター中に挿入される。このようなベクターは特
定の宿主生物または細胞内での発現に適したいくつかの
好適な特徴を備えている：

【００２８】（ａ）微生物、特にイー・コリ（E.coli） 本発明での使用が意図されるベクターには、上記ＤＮＡ
配列を任意の好適なまたは必要なオペレーションエレメ
ントと共に挿入できる任意のベクターが包含され、この
ベクターは次に宿主細胞へ移入して、その中で複製させ
ることができる。好適なベクターはその制限部位が十分
に証明されていて、ＤＮＡ配列の転写に好適なまたは必
要なオペレーションエレメントを含有するものである。
しかしながら、ここに記載されるＤＮＡ配列を１つ以上
含む現在未発見のベクターを使用する本発明の実施態様
も考えられる。

【００２９】特に、これらのベクターのすべては次の特
徴：（１）最小数の宿主生物配列を有する；（２）所望
の宿主中に安定して保持され、その中で増殖できる；
（３）所望の宿主に高コピー数で存在できる；（４）対
象となる遺伝子の転写を促進するように位置した調節可
能なプロモーターを有する；（５）ＤＮＡ配列が挿入さ
れる場所から離れたプラスミドの部分に存在する選択可
能な特徴をコードする少なくとも１つのマーカーＤＮＡ
配列を有する；および（６）転写を終止しうるＤＮＡ配
列を含有する；のいくつかまたは全部を有することが好
適である。

【００３０】種々の好適な実施態様においては、本発明
のＤＮＡ配列を含有しそれを発現できるクローニングベ
クターは種々のオペレーションエレメントを含有する。
ここで論じるこれらの“オペレーションエレメント”に
は少なくとも１つのプロモーター、少なくとも１つのシ
ャイン・ダルガルノ配列およびイニシエーターコドン、
および少なくとも１つのターミネーターコドンが含まれ
る。好ましくは、これらの“オペレーションエレメン
ト”はさらに１つまたはそれ以上の次のもの：少なくと
も１つのオペレーター、タンパク質を細胞内空間から外
へ出すための少なくとも１つのリーダー配列、少なくと
も１つの調節タンパク質の遺伝子、およびベクターＤＮ
Ａの適切な転写とその後の翻訳に必要なまたは好適な任
意の他のＤＮＡ配列；を含有できる。

【００３１】これらのオペレーションエレメントのいく
つかは本発明の好適なベクターのそれぞれに存在でき
る。必要とされうる任意の付加的なオペレーションエレ
メントは当業者に知られた方法を使って、特に本明細書
の教示に照らして、これらのベクターに挿入できると考
えられる。実際に、ベクターの分離、構築、および相互
交換が簡単にできるやり方でこれらのベクターのそれぞ
れを作製することが可能である。これにより、これらの
エレメントとＤＮＡ配列のコード領域の組合わせから多
数の機能遺伝子の構築が容易になる。さらに、これらエ
レメントの多くは２種以上の宿主において適用されよ
う。また、いくつかの好適な実施態様では、ベクターは
調節遺伝子（“オペレーター”）として機能しうるＤＮ
Ａ配列および調節タンパク質をコードしうる他のＤＮＡ
配列をさらに含有しようことが考えられる。

【００３２】（ｉ）調節遺伝子 これらの調節遺伝子は、一実施態様においては、ある環
境条件の下でＤＮＡ配列の発現を阻止するのに役立ち、
そして他の環境条件の下ではＤＮＡ配列によりコードさ
れるタンパク質の転写および続く発現を可能にしよう。
特に、ＤＮＡ配列の発現が、例えばイソプロピルチオ−
β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の非存在下で起こら
ないか、さもなくば非常に低い程度にしか起こらないよ
うに調節セグメントをベクターに挿入することが好適で
ある。この状況では、ＤＮＡ配列含有形質転換微生物は
ＣＮＴＦ発現の開始に先立って所望の密度まで増殖させ
ることができる。この実施態様では、所望の密度が達成
された後に、ＤＮＡ配列の発現を起こすことができる微
生物環境にある物質を加えることにより、目的とするタ
ンパク質の発現が誘導される。

【００３３】（ii）プロモーター 発現ベクターは宿主生物がそれ自体のタンパク質の発現
のために使用できるプロモーターを含有しなければなら
ない。ラクトースプロモーター系が普通に使われるが、
他の微生物プロモーターも単離されて特性決定されてお
り、当分野で習熟した者は組み換えＣＮＴＦの発現にそ
れらを使用できる。 （iii)転写ターミネーター ここで意図する転写ターミネーターはベクターの安定化
に役立つ。とりわけ、Rosenberg, M. およびCourt, D.,
Ann. Rev. Genet. 13:319-353 (1979）（参考文献とし
て詳細にここにとり込まれる）に記載される配列を本発
明に使用することが考えられる。

【００３４】（iv）非翻訳配列 好適な実施態様では、遺伝子転写物への３′または５′
非翻訳配列の組込みを可能にするように、コード領域の
３′または５′末端を構築することも望ましいことに注
目されたい。これらの非翻訳配列にはｍＲＮＡを安定化
させるものが含まれ、それらはSchmeissner, U., McKen
ney, K., Rosenberg, M.およびCourt, D., J. Mol. Bio
l. 176:39-53(1984）（参考文献としてここに詳細にと
り込まれる）ににって確認されている。

【００３５】（ｖ）リボソーム結合部位 外来性タンパク質の微生物発現は、リボソーム結合部位
を含むがそれに限定されないある種のオペレーションエ
レメントを必要とする。リボソーム結合部位は、Gold,
L. ら、Ann. Rev. Microbio. 35: 557-580 ；またはMa
rquis, D.M. ら、Gene 42:175-183 (1986)（両方とも参
考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載される
ように、タンパク質合成の開始時にリボソームが認識し
て結合する配列である。好適なリボソーム結合部位はＧ
ＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡＡ（ＡＴＧ）である。

【００３６】（vi）リーダー配列および翻訳カプラー さらに、タンパク質を細胞質から排出させる場合には、
Watson, M.E., Nucleic Acids Res. 12:5145-5163 （参
考文献としてここに詳細に取り込まれる）に示されるよ
うに、ＤＮＡ配列の５′末端に適当な分泌リーダー（シ
グナル）配列をコードするＤＮＡが存在することが好適
である。リーダー配列のＤＮＡは融合タンパク質（リー
ダー配列がＣＮＴＦに隣接して共有結合で結合されてい
る）の生産を可能にする位置になくてはならず、すなわ
ち２つのＤＮＡコード配列間に転写または翻訳シグナル
が存在してはならない。リーダー配列の存在は部分的に
は１以上の次の理由のために望ましい。第一に、リーダ
ー配列の存在はＣＮＴＦの宿主プロセッシングを容易に
しうる。特に、リーダー配列はリーダーペプチダーゼに
よる初期翻訳産物の切断を指示でき、これによりリーダ
ー配列を除去して潜在的なタンパク質活性を有するアミ
ノ酸配列のポリペプチドが残る。

【００３７】第二に、リーダー配列の存在はタンパク質
を細胞質の外へ指示することによってＣＮＴＦの精製を
容易にしうる。宿主微生物のいくつかの種では、適当な
リーダー配列の存在により、一部のイー・コリの場合の
ように、細胞周辺腔への完成タンパク質の輸送が可能と
なろう。ある種のイー・コリ、サッカロミセス、バチル
ス株およびシュードモナス株の場合には、適当なリーダ
ー配列により、タンパク質を細胞膜を通って細胞外培地
に輸送できよう。この場合、タンパク質は細胞外タンパ
ク質から精製されよう。第三に、本発明により調製され
た一部のタンパク質の場合には、完成したタンパク質が
再生されてその活性構造（この構造は適当なタンパク質
活性をもつ）をとりうる環境にそのタンパク質を配置す
るのにリーダー配列の存在が必要でありうる。

【００３８】本発明の好適な一実施態様では、付加的な
ＤＮＡ配列がＣＮＴＦをコードするＤＮＡ配列のすぐ前
に置かれる。この付加的なＤＮＡ配列は翻訳カプラーと
して機能することができ、すなわちそれはリボソーム
を、それが連続するインヒビターＲＮＡのリボソーム結
合部位に隣接して配置するのに役立つＲＮＡをコードす
るＤＮＡ配列である。本発明の一実施態様では、翻訳カ
プラーはＤＮＡ配列：ＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＡＡ
ＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣ
ＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＧおよび翻訳カプ
ラーに関係した分野で習熟した者に現在知られている方
法を使って誘導できる。

【００３９】（vii)翻訳ターミネーター ここで意図する翻訳ターミネーターはｍＲＮＡの翻訳を
停止させるのに役立つ。それらは、Kohli, J., Mol. Ge
n. Genet. 182:430-439 に記載されるような天然のもの
であっても、Pettersson, R.F., Gene 24:15-27 (1983)
に記載されるような合成物であってもよい（両文献は参
考文献としてここに詳細にとり込まれる）。

【００４０】（viii）選択マーカー さらに、クローニングベクターは薬剤耐性マーカーまた
は宿主微生物に選択可能な特徴を発現させる他のマーカ
ーのような選択マーカーを含むことが好適である。本発
明の一実施態様では、アンピシリン耐性遺伝子がベクタ
ーに包含されるが、他のプラスミドでは、テトラサイク
リン耐性遺伝子またはクロラムフェニコール耐性遺伝子
が包含される。このような薬剤耐性マーカーまたは他の
選択マーカーは形質転換体の選択を容易にすることが一
部意図される。さらに、クローニングベクターにこの種
の選択マーカーが存在すると、汚染微生物が培地で増殖
するのを防ぐことができる。この実施態様では、その生
存にとって誘導された表現型を必要とする条件下で微生
物を培養することにより、形質転換された宿主微生物の
純粋培養物が得られよう。

【００４１】ここで述べたオペレーションエレメント
は、従来の文献およびここに含まれる教示内容に照らし
て当業者により日常的に選ばれる。これらのオペレーシ
ョンエレメントの一般例はB. Lewin, Genes, Wiley & S
ons, New York (1983)（参考文献としてここに詳細にと
り込まれる）に記載されている。適当なオペレーション
エレメントの種々の例は先に論じたベクターに見いださ
れ、前記ベクターの基本的特徴を論じる刊行物を調べる
ことにより解明できる。

【００４２】先に論じたベクターの必要かつ所望のすべ
ての構成部分が合成および単離されると、ベクターは当
分野で通常の知識を有する者に一般的に知られた方法に
より構築される。このようなベクターの構築は当分野で
通常の知識を有する者が実施する職務の範囲内であると
考えられ、過度の実験作業なしに行うことができる。例
えば類似したＤＮＡ配列が、Maniatisら、Molecular Cl
oning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984）（参
考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載される
ように、適当なクローニングベクターに連結されてい
る。

【００４３】本発明のクローニングベクターの構築で
は、複数コピーのＤＮＡ配列とその付随するオペレーシ
ョンエレメントがそれぞれのベクターに挿入できる点に
さらに注目されたい。このような実施態様において、宿
主生物はベクターあたりより多量の目的ＣＮＴＦを生産
しよう。ベクターに挿入できる複数コピーのＤＮＡ配列
の数は、その大きさに起因する、生成するベクターが適
当な宿主細胞へ移入され、その中で複製および転写され
る能力によってのみ制限される。

【００４４】（ｂ）その他の微生物 Ｅ．コリ以外の微生物で使用に適するベクターも本発明
の意図するものである。このようなベクターは表１に示
してある。さらに、いくつかの好適なベクターも以下で
論ずる。

【００４５】

【表１】

【００４６】１． Backman, K., Ptashne, M. and Gil
bert, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 , 4174-4178
(1976). ２． de Boer, H.A., Comstock, L.J., and Vasser,
M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 , 21-25 (1983). ３． Shimatake, H. and Rosenberg, M. Nature 292,
128-132 (1981). ４． Derom, C., Gheysen, D. and Fiers, W. Gene 17
, 45-54 (1982). ５． Hallewell, R.A. and Emtage, S. Gene 9 , 27-4
7 (1980). ６． Brosius, J., Dull, T.J., Sleeter, D.D. and N
oller, H.F. J. Mol. Biol. 148 107-127 (1981). ７． Normanly, J., Ogden, R.C., Horvath, S.J. and
Abelson, J. Nature 32 1 , 213-219 (1986). ８． Belasco, J.G., Nilsson, G., von Gabain, A. a
nd Cohen, S.N. Cell 46, 245-251 (1986).

【００４７】９． Schmeissner, U., McKenney, K., R
osenberg M. and Court, D. J. Mol.Biol. 176 , 39-53
(1984). 10． Mott, J.E., Galloway, J.L. and Platt, T. EMB
O J. 4, 1887-1891 (1985). 11． Koshland, D. and Botstein, D. Cell 20 , 749-
760 (1980). 12． Morva, N.R., Kakamura, K. and Inouye, M. J.
Mol. Biol. 143, 317-328 (1980). 13． Surin, B.P., Jans, D.A., Fimmel, A.L., Shaw,
D.C., Cox, G.B. and Rosenberg, H. J. Bacteriol. 1
57, 772-778 (1984). 14． Sutcliffe, J.G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
5 , 3737-3741 (1978). 15． Peden, K.W.C. Gene 22 , 277-280 (1983). 16． Alton, N.K. and Vapnek, D. Nature 282 , 864-
869 (1979).

【００４８】17． Yang, M., Galizzi, A., and Henne
r, D. Nuc. Acids Res. 11(2) , 237-248 (1983). 18． Wong, S.-L., Price, C.W., Goldfarb, D.S., an
d Doi, R.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 , 1184-1
188 (1984). 19． Wang, P.-Z., and Doi, R.H. J. Biol. Chem. 25
1 , 8619-8625, (1984). 20． Lin, C.-K., Quinn, L.A. Rodriguez, R.L. J. C
ell Biochem. Suppl. (9 B), p. 198 (1985). 21． Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Ba
nner, C., Nagle, J., and Filpula, D. J. Bact. 159
(3), 881-819 (1984). 22． Palva, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibaz
kov, M., and Kaariainen, L. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79 , 5582-5586 (1982). 23． Wong. S.-L., Pricee, C.W., Goldfarb, D.S., a
nd Doi, R.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1
188 (1984).

【００４９】24． Sullivan, M.A., Yasbin, R.E., an
d Young, F.E. Gene 29 , 21-46 (1984). 25． Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Ba
nner, C. Nagle, J., and Filula, D. J. Bact. 159
(3), 811-819 (1984). 26． Yansura, D.G. and Henner, D.J. PNAS 81, 439-
443 (1984). 27． Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Se
eburg, P.H. and Heyneker, H.L. Biotechnology, 161-
165 (1984). 28． Lory, S., and Tai, P.C. Gene 22 , 95-101 (19
83). 29． Liu, P.V. J. Infect. Dis. 130 (suppl), 594-5
99 (1974). 30． Wood, D.G., Hollinger, M.F., nd Tindol, M.B.
J. Bact. 145 , 1448-1451 (1981). 31． St. John, T.P. and Davis, R.W. J. Mol. Biol.
152, 285-315 (1981).

【００５０】32． Hopper, J.E., and Rowe, L.B. J.
Biol. Chem. 253 , 7566-7569 (1978). 33． Denis, C.L., Ferguson, J. and Young, E.T. J.
Biol. Chem. 258, 1165-1171 (1983). 34． Lutsdorf, L. and Megnet, R. Archs. Biochem.
Biophys. 126, 933-944(1968). 35． Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, H. and Hinn
en, A. EMBO. J. 6 , 675-680 (1982). 36． Watson, M.E. Nucleic Acid Research 12 , 5145
-5164 (1984). 37． Gerband, C. and Guerineau, M. Curr. Genet.
1, 219-228 (1980). 38． Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R. P:ro
c. Natl. Acad. Sci. USA75 , 1929-1933 (1978). 39． Jabbar, M.A., Sivasubramanian, N. and Nayak,
D.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 , 2019-2023 (1
985).

【００５１】（ｉ）シュードモナスベクター 広い範囲のグラム陰性細菌の中で自律複製する数種のベ
クタープラスミドは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）属宿主におけるクローニングベヒクルとして
使用するのに好適である。これらのうちのいくつかは、
Trait, R.C., Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya,
M., Rodriguez, R.L., およびKado, C.I., Biotechnol
ogy, May, 1983, p.269-275; Panopoulos, N.J., Genet
ic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publ
ishers, New York, New York, p.163-185 (1981)；およ
びSakagucki, K., Current Topic in Microbiology and
Immunology 96:31-45 (1982) （それぞれ参考文献とし
てここに詳細にとり込まれる）に記載されている。

【００５２】特に好適な構築の一つは、Bagdasarian,
M., Bagdasarian, M.M., Coleman, S.,およびTimmis,
K.N., Plasmids of Medical, Environmental and Comme
rcialImportance, Timmis, K.N.およびPuhler, A.編Els
evier/North Holland Biomedical Press (1979)（参考
文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるよ
うな、プラスミドＲＳＦ１０１０およびその誘導体を使
用しよう。ＲＳＦ１０１０の利点は、それがＥ．コリと
シュードモナス種の両方を容易に形質転換して、その中
で安定に保持される、比較的小型の高コピー数プラスミ
ドであるということである。この系では、エシエリヒア
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に関して記載したようなＴ
ａｃ発現系の使用が好適であろう。

【００５３】そのわけは、Ｅ．コリｔｒｐプロモーター
が、Sakagucki, K., Current Topics in Microbiology
and Immunology 96 :31-45 (1982）およびGray, G.L.,
McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H., およ
びHeyneker, H.L., Biotechnology, Feb. 1984, p.161-
165 （両方とも参考文献としてここに詳細にとり込まれ
る）に記載されるように、シュードモナスＲＮＡポリメ
ラーゼにより容易に認識されると思われるからである。
転写活性はそのプロモーターを、例えばＥ．コリまたは
Ｐ．アエルギノザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｔｒｐ
プロモーターと交換することによりさらに最大限に高め
ることができる。さらに、Ｅ．コリのｌａｃＩ遺伝子も
調節を行うためにこのプラスミド中に包含されよう。翻
訳は任意のシュードモナスタンパク質の翻訳開始と、お
よびインヒビターの細胞内発現を引き起こすように選ば
れた種類の任意の高度発現タンパク質の開始部位と連結
できる。

【００５４】宿主シュードモナス種の制限マイナス株を
利用できない場合は、Ｅ．コリから単離したプラスミド
構築物による形質転換効率が低い。従って、Bagdasaria
n, M. らPlasmids of Medical, Environmental and Com
mercial Importance, p.411-422, Timmis and Puhler
編、Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)
（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載さ
れるように、所望の宿主の形質転換に先立って、別の種
のｒ^- ｍ⁺ 株にシュードモナスクローニングベクターを
移入することが望ましい。

【００５５】（ii）バチルスベクター バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属宿主における好適な発
現系には、クローニングベヒクルとしてのプラスミドｐ
ＵＢ１１０の使用が包含される。他の宿主ベクター系に
おけるように、バチルス属においても本発明のＣＮＴＦ
を細胞内タンパク質または分泌タンパク質として発現可
能である。本実施態様は両方の系を包含する。

【００５６】バチルスとＥ．コリの両方で複製するシャ
トルベクターは、Dubnau, D., Gryczan, T., Contente,
S.,およびShivakumar, A.G., Genetic Engineering, V
ol.2, Setlow およびHollander 編、Plenum Press, New
York, New York, p.115-131 (1980)（参考文献として
ここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、いろ
いろな遺伝子を構築して試験するために利用できる。
Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からＣＮＴＦ
を発現および分泌させるには、好ましくはα−アミラー
ゼのシグナル配列がこのタンパク質のコード領域に連結
される。細胞内ＣＮＴＦを合成するには、移動可能なＤ
ＮＡ配列がα−アミラーゼリーダー配列のリボソーム結
合部位に翻訳性連結されよう。

【００５７】これらの構築物のどちらの転写も好ましく
はα−アミラーゼプロモーターまたはその誘導体によっ
て指示される。この誘導体は天然α−アミラーゼプロモ
ーターのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有するが、さ
らにｌａｃオペレーター領域も含有する。ペニシリナー
ゼ遺伝子プロモーターおよびｌａｃオペレーターから構
築された同様のハイブリッドプロモーターは、Yansura,
D.G. およびHenner,Geneticsand Biotechnology of Ba
cilli, Ganesan, A.T. およびHoch, J.A.編、Academic
Press, p.249-263 (1984)（参考文献としてここに詳細
にとり込まれる）に記載されるように、調節可能な様式
でバチルス宿主内で機能することが示されている。Ｅ．
コリのｌａｃＩ遺伝子も調節を行うためにこのプラスミ
ドに包含されよう。

【００５８】（iii)クロストリジウムベクター クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）における
発現に好適な構築の一つはSquires, C.H. ら、J. Bacte
riol. 159 :465-471 (1984）（参考文献としてここに詳
細にとり込まれる）に記載されるプラスミドｐＪＵ１２
を使って行われ、これはJ. Bacteriol. 159:460-464 (1
984)（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記
載されるHeefner, D.L. らの方法によりＣ．ペルフリン
ゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）中に形質転換さ
れる。転写はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモータ
ーにより指示される。翻訳は他の宿主で使うのに適した
ベクターについて上述した方法と正確に類似した方法で
この同じｔｅｔ^r 遺伝子のシャイン・ダルガルノ配列に
連結される。

【００５９】（iv）酵母ベクター 酵母に導入された外来ＤＮＡの維持は、Botstein, D.お
よびDavis, R.W., TheMolecular Biology of the Yeast
Saccharomyces , Cold Spring Harbor Laboratory, St
rather, JonesおよびBroach, 編、p.607-636 (1982)
（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載さ
れるように、いくつかの方法で行うことができる。サッ
カロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の宿主生
物で使用するのに好ましい発現系は２ミクロンプラスミ
ド上にＣＮＴＦ遺伝子を担持する。２ミクロンの利点に
はｃｉｒ′株に導入した場合の比較的高いコピー数と安
定性が包含される。

【００６０】これらのベクターは好ましくはＥ．コリで
の複製および選択を可能にするｐＢＲ３２２由来の複製
起点および少なくとも１つの抗生物質耐性マーカーを組
み込んでいる。さらに、このプラスミドは好ましくは酵
母のＬＥＵ２欠損変異株において同じ目的に役立つよう
に、２ミクロン配列および酵母ＬＥＵ２遺伝子を有しよ
う。組み換えＣＮＴＦを最終的に酵母で発現させようと
する場合、クローニングベクターを初めにＥ．コリに移
入することが好適であり、そこでベクターは複製され、
増幅後にそこから回収して精製されよう。次にベクター
はＣＮＴＦの最終発現のために酵母に移入されよう。

【００６１】（ｃ）哺乳動物細胞 ＣＮＴＦをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは哺
乳動物細胞でＣＮＴＦを発現するための遺伝子として役
立つだろう。それはKozak, Nucleic Acids Research 15
:8125-8132 （1987）（参考文献としてここに詳細にと
り込まれる）に記載されるような、結合リボソームで有
効である配列を有するべきである。ＣＮＴＦをコードす
るＤＮＡ配列を保有するＤＮＡ制限フラグメントは、Gu
arente,L., Cell 52:303-305 (1988)およびKadonaga,
J.T.ら、Cell 51 :1079-1090（1987）（両方とも参考文
献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるよう
な、転写プロモーターおよび転写エンハンサーを有する
発現ベクターに挿入できる。

【００６２】このプロモーターは、インヒビターの構成
的発現が細胞の増殖に有害であるならば、プラスミドｐ
ＭＳＧ（Pharmacia Cat. No. 27450601 ）におけるよう
に調節可能であることができる。このベクターはAusube
l, F.M. ら、Current Protocols in Molecular Biolog
y, Wiley （1987）（参考文献としてここに詳細にとり
込まれる）に記載されるような完全なポリアデニル化シ
グナルをもつべきであり、これによりこのベクターから
転写されたｍＲＮＡが適正にプロセッシングされる。最
後に、ベクターはＥ．コリにおける複製および選択がで
きるように、ｐＢＲ３２２由来の複製起点と少なくとも
１つの抗生物質耐性マーカーを有しよう。

【００６３】ＣＮＴＦを生産する安定した細胞系を選択
するためには、発現ベクターは薬剤耐性マーカーのよう
な選択マーカーの遺伝子、あるいはAusubel ら、前出に
記載されるようなｄｈｆｒ^- 細胞系を形質転換するため
のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子のよう
な、欠損細胞株のための補足遺伝子を担持できる。ま
た、選択マーカーを担持する別のプラスミドを発現ベク
ターと共に同時形質転換させることもできる。

【００６４】宿主細胞／形質転換 このようにして得られたベクターは適当な宿主細胞に移
入される。これらの宿主細胞は微生物または哺乳動物細
胞でありうる。 （ａ）微生物 外因性ＤＮＡを取り込んで、それらの遺伝子および付随
するオペレーションエレメントを発現する能力を備えた
任意の微生物を選択できると考えられる。宿主生物が選
ばれた後、ベクターは当分野で通常の知識を有する者に
一般的に知られた方法を用いて宿主生物に移入される。
このような方法の例はR.W. Davisら、Advanced Bacteri
al Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor,New York,（1980）（参考文献としてここに詳
細にとり込まれる）に見いだせる。

【００６５】一実施態様では、温度の調節が上記のオペ
レーションエレメントの使用による遺伝子発現調節手段
として考えられるので、形質転換が低温で起こることが
好ましい。別の実施態様では、ベクターに浸透圧調節遺
伝子が挿入されている場合、外来遺伝子の適切な制御を
確保するために、形質転換中の塩濃度の調節が必要とな
ろう。宿主微生物は通性嫌気性生物または好気性生物で
あることが好ましい。この方法で使用するのに好ましい
特定の宿主には酵母および細菌が包含される。特定の酵
母にはサッカロミセス属のもの、特にサッカロミセス・
セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）が包含される。特定の細菌にはバチルス
属、エシエリヒア属およびシュードモナス属のもの、特
にバチルス・スブチリスおよびＥ．コリが包含される。
他の宿主細胞は前記表１に示してある。

【００６６】（ｂ）哺乳動物細胞 ベクターはリン酸カルシウム：ＤＮＡ共沈、エレクトロ
ポレーションまたはプロトプラスト融合のようないくつ
かの技法により、培養下の哺乳動物細胞に導入できる。
好適な方法はAusubel ら、前出、に記載されるリン酸カ
ルシウムとの共沈である。形質転換可能であり、そして
ＤＮＡ配列の転写、プロセッシングおよび翻訳、並びに
ＣＮＴＦタンパク質の生産が可能である、安定した細胞
型がたくさん存在する。しかしながら、もしあれば、細
胞型はタンパク質のグリコシル化およびアミノ酸残基の
翻訳後修飾に関して変動可能であろう。従って、理想的
な細胞型は天然分子と同じ組み換えＣＮＴＦを生産する
ものである。

【００６７】宿主細胞はＣＮＴＦの発現に適した条件下
で培養される。これらの条件は一般に宿主細胞に特有で
あり、この種の細胞の増殖条件に関する刊行文献および
ここに含まれる教示内容に照らして、当分野で通常の知
識を有する者により容易に決定される。例えば、Berge
y's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed.,
Williams & Wilkins Company, Baltimore Maryland
（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）は細菌を
培養するための条件に関する情報を含有する。酵母およ
び哺乳動物細胞の培養に関する同様の情報は、Pollack,
R., Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor La
boratories（1975）（参考文献としてここに詳細にとり
込まれる）から得ることができる。

【００６８】ベクターに挿入されるか又はその中に存在
する任意のオペレーションエレメントの如何に応じ、Ｄ
ＮＡ配列の発現調節に必要な任意の条件が形質転換およ
び培養段階で実施されよう。一実施態様では、ＤＮＡ配
列の発現を抑制する適当な調節条件のもとで細胞を高密
度まで増殖させる。最適細胞密度に達したところで、環
境条件をＤＮＡ配列の発現に適したものに変える。こう
して、ＣＮＴＦの生産は宿主細胞がほぼ最適密度まで増
殖した後のある期間にわたって起こり、生産物はその発
現に必要な調節条件が誘導された後のある時期に収穫さ
れようことが意図される。

【００６９】本発明の一実施態様においては、組み換え
ＣＮＴＦは宿主細胞または生物での発現後に精製されよ
う。好適な実施態様では、組み換えＣＮＴＦは微生物、
特にＥ．コリでの発現後に精製されよう。本発明の好適
な実施態様では、ＣＮＴＦは細菌培養物からの回収時に
その生物学的に活性な状態で存在する。別の好適な実施
態様では、ＣＮＴＦは精製過程のある段階で再生されて
その活性構造をとることができる。組み換えタンパク質
の精製には、好ましくは次の工程の組合わせが用いられ
る：アニオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ−Ｑ，
Ｍｏｎｏ−Ｓ、および／またはＤＥＡＥ−セファロー
ス）、ゲル浸透クロマトグラフィー（スペロース）、ク
ロマトフォーカシング（Ｍｏｎｏ−Ｐ）、および疎水性
相互作用クロマトグラフィー（オクチ−および／または
フェニル−セファロース）。

【００７０】特定の問題または環境への本発明の教示内
容の応用は、ここに含まれる教示に照らして、当分野で
通常の技術を有する者の能力の範囲内であることを理解
すべきである。以下の実施例は本発明のある好適な実施
態様を例示するものであり、特許請求された本発明を制
限するものではない。これらの実施例で示したすべての
文献は本明細書に詳細にとり込まれるものとする。

【００７１】実施例１．タンパク質の調製 Ａ．材料 成熟ウサギ坐骨神経をＡｒｋａｎｓａｓ州Ｒｏｇｅｒｓ
のPel-Freez Biologicals から入手した。硫酸アンモニ
ウム（超高純度）はＯｈｉｏ州ＣｌｅｖｅｌａｎｄのSc
hwartz/Mann Biotech から購入した。フェニルメチルス
ルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ε−アミノカプロ
ン酸、ベンズアミジン、ペプスタチン、ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）、ポリ−Ｌオルニチン（Ｐ３６５５）、
および３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イル〕
−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴ
Ｔ）はＭｉｓｓｏｕｒｉ州Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのSigma Ch
emical社から得た。

【００７２】Ｍｏｎｏ ＰクロマトフォーカシングＦＰ
ＬＣカラムはＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ州Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙのPharmacia 社から得た。Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラム
はＩｎｄｉａｎａ州ＬａｆａｙｅｔｔｅのSynchrom社か
ら得た。アセトニトリルはＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ州Ｐｈ
ｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇのJ.T.Baker Chemical社から購入
した。トリフルオロ酢酸はＩｌｌｉｎｏｉｓ州Ｒｏｃｋ
ｆｏｒｄのPierce Chemicalsから得た。エンドプロテア
ーゼＡｓｐ−ＮおよびＬｙｓ−ＣはＩｎｄｉａｎａ州Ｉ
ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓのBoehringer Mannheim Bioche
micalsから得た。ウシ胎児血清はＵｔａｈ州Ｌｏｇａｎ
のHyclone Laboratoriesから購入した。培地および塩溶
液はＣａｌｉｆｏｒｎｉａ州Ｓａｎｔａ ＡｎａのIrvi
ne Scientific から得た。培養皿はＭａｓｓａｃｈｕｓ
ｅｔｔｓ州ＣａｍｂｒｉｄｇｅのCostarから得た。実用
級の病原体不含受精ニワトリ胚卵はＩｌｌｉｎｏｉｓ州
ＲｏａｎｏａｋｅのSpafasから入手した。

【００７３】Ｂ．ＳＮ−ＣＮＴＦのアッセイ 初期ニワトリ胚毛様体神経節の培養物は以前に記載され
た通りに調製した（Collins, 1978, Develop. Biol. 6
5:50; Manthorpeら、1986, Develop. Brain Res. 25:19
1）。簡単に述べると、毛様体神経節は湿潤雰囲気下に
３８℃で９−１０日間インキュベートした病原体不含ニ
ワトリ受精卵から取り出した。神経節は初めに２価カチ
オンを含まず１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）
を含有するハンクス平衡塩類溶液に３７℃で１０分間さ
らし、次の上記のように改良したハンクス平衡塩類溶液
中の０．１２５％バクトトリプシン１：２５０（Difco,
Detroit, Michigan）の溶液に３７℃で１２分間さらす
ことにより、化学的に解離させた。トリプシン処理はウ
シ胎児血清を最終濃度１０％まで添加することにより停
止させた。

【００７４】この処理の後、神経節は重炭酸塩を含まず
１０％ウシ胎児血清および１０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．
２）含有ダルベッコ高グルコース改良イーグル培地から
成る溶液に移し、ガラス製のパスツールピペット（その
開口部は火炎研磨し、ピペットを満たすのに２秒かかる
ような直径に狭めてある）を通して約１０回つき砕くこ
とにより機械的に解離させた。

【００７５】解離した神経節を次に直径１００mmの組織
培養皿中の培地（１０％ウシ胎児血清、４mMグルタミ
ン、６０mg／Ｌ ペニシリン−Ｇ、２５mM ＨＥＰＥ
Ｓ、ｐＨ７．２を補給したダルベッコ改良イーグル培
地）で３時間培養した（４０解離神経節／皿）。この予
備培養は皿に付着する非ニューロン細胞を付着しない神
経細胞から分離するために行った。３時間後、非付着神
経細胞を遠心により集め、培地に再度浮遊させ、そして
９６ウェルマイクロタイター組織培養プレートの半面に
５０μｌ／ウェルの容量で１５００神経細胞／ウェルの
密度でまいた。このマイクロタイターウェルは前もって
１０mMホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．４）中のポリ−Ｌ−
オルニチンの１mg／ml溶液に４℃で一晩さらし、蒸留水
で洗って風乾させておいた。

【００７６】神経栄養活性についてアッセイしようとす
るサンプルの連続希釈物１０μｌを各ウェルに加え、
７．５％ＣＯ₂ 含有湿潤雰囲気下に３７℃で２０時間イ
ンキュベートした。１８時間後、重炭酸塩を含まず１０
mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有するダルベッコ高
グルコース改良イーグル培地中のテトラゾリウム染料Ｍ
ＴＴの１．５mg／ml溶液を１５μｌ／ウェルで加え、こ
の培養物を３７℃インキュベーターに戻して４時間イン
キュベートした。次に、イソプロパノール１リットルあ
たり６．７mlの１２Ｍ ＨＣｌの溶液７５μｌを加え、
各ウェルの内容物を３０回つき砕いて細胞を破壊し、染
料を懸濁させた。

【００７７】自動マイクロタイタープレート読取機（Dy
natech, Chantilly, Virginia ）を使って各ウェルにつ
いて６９０nm基準に対する５７０nmでの吸光度を測定し
た。神経栄養物質を加えなかったウェル（陰性対照）の
吸光度をサンプル含有ウェルの吸光度から差し引いた。
得られた吸光度は各ウェル中の生存細胞の数に比例し、
染料を還元できる神経細胞として定義される。神経栄養
活性の栄養単位の数は神経細胞の最大生存の５０％を生
ずる希釈度の逆数として定義された。mlあたりの栄養単
位の栄養活性濃度は全栄養単位をアッセイ容量（６０μ
ｌ）で割ることにより得られた。比活性は栄養単位の数
をサンプル中に存在するタンパク質の量で割ることによ
り決定された。

【００７８】Ｃ．ＳＮ−ＣＮＴＦの精製 次の各工程の終わりに、調製物は直ちに処理するか、ま
たは使用するまで最高１週間の間−７０℃で貯蔵した。工程１．粗製抽出物の調製 １００ｇ（湿潤重量）のウサギ坐骨神経（約３００神
経）を解凍し、ポリトロン回転ホモジナイザー（Kinema
tica, Switzerland ）を用い１０mM ＥＤＴＡ、１mM
ε−アミノカプロン酸、１mMベンズアミジン、および
０．１mM ＰＭＳＦを含有する１０倍容量（wt／vol ）
の水中で１分間粉砕し、１４０，０００ｘｇ、４℃で３
０分間遠心した。浮遊する脂質を除くために、上清をガ
ラスウールを通して濾過した。

【００７９】工程２．酸処理および硫酸アンモニウム分
画化 以下の遠心工程は１７，０００ｘｇで２０分間行い、特
に特定しない限りすべての操作を４℃で実施した。粗製
抽出物を遠心した。上清を５Ｎ ＨＣｌでｐＨ３．６に
酸性化し、生じた沈殿を遠心により除いた。上清を１Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ６．３に滴定し、生成する沈殿を遠心
により再び除いた。この上清に飽和硫酸アンモニウム溶
液を加えて３０％飽和となし、沈殿を遠心により除去し
た。上清に硫酸アンモニウムをさらに加えて６０％飽和
となすと、大部分のＳＮ−ＣＮＴＦ活性を含有するタン
パク質フラクションの沈殿が生じた。この沈殿物を１mM
ＥＤＴＡ、０．１mM ＰＭＳＦおよび０．１μＭペプス
タチンを含有する２０mMナトリウム（ｐＨ６．７）に溶
解し、８−１３mg／mlのタンパク質濃度となした。

【００８０】工程３．クロマトフォーカシング 上記調製物を５００倍以上の容量の１０mMリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．７）で一晩透析を行い、その間緩衝液を
１回交換し、１４０，０００ｘｇで３０分間遠心した。
上清は孔径０．２２μｍのナイロンフィルターを通し、
２５mMビス−トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．８）で平
衡化したＭｏｎｏ ＰクロマトフォーカシングＦＰＬＣ
カラム（ベッド容量４ml）に２mlずつ３回注入して負荷
した。流出液の２８０nmでの吸光度がベースラインに戻
るまで同じ緩衝液でカラムを洗った。次にサンプルをポ
リバッファー（ｐＨ４．０）（Pharmacia 社からのＰＢ
７４の１−１０倍希釈物）を用いてクロマトグラフィー
した。

【００８１】カラムフラクションを集めてｐＨおよびＣ
ＮＴＦ活性について分析した。図１はＭｏｎｏ Ｐでの
クロマトグラフィーの結果を示す。溶出したタンパク質
のプロフィールを２８０nmでの光学濃度（ＯＤ）として
プロットしてある。それぞれのフラクションにおいて測
定されたｐＨおよびＣＮＴＦ活性のプロットを重ねて示
してある。ピークＳＮ−ＣＮＴＦ活性を有する棒線で示
したフラクション（約ｐＨ５）をプールし、固体硫酸ア
ンモニウムで処理して９５％飽和となし、このペレット
を遠心により集め、飽和硫酸アンモニウム溶液に再懸濁
し、再度遠心してポリバッファーを除いた。この沈殿物
を十分量の１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
７）に溶解して３−５mg／mlの最終タンパク質濃度を得
た（“フォーカシングフラクション”と呼ぶ）。一般
に、もとの粗製抽出物１リットルがＭｏｎｏ Ｐカラム
で別々に８回で処理された。

【００８２】工程４．調製用ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）ゲル電気泳動 Ｍｏｎｏ Ｐカラムの多数操作フォーカシング分離フラ
クションを合わせて、１００倍以上の容量の１０mMリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）で８時間透析を行い
その間緩衝液を１回交換し、次にＬａｅｍｍｌｉ，１９
７０の方法に従って１５％還元型ＳＤＳポリアクリルア
ミドスラブゲルで泳動させた。それぞれの分離用ゲルは
厚さが０．３cm、高さが１４cm、幅が１１．５cmであっ
た。各ゲルに５．５mgのタンパク質を負荷した。電気泳
動は２０kdの予め染色した分子量標準物が分離用ゲルの
底に達するまで１５℃、４０mA／ゲルで行った。

【００８３】スラブゲルの幅を横切る個々のタンパク質
バンドの曲率を明らかにするために、ゲルに１枚の予め
水で湿らせておいたニトロセルロース（孔径０．４５μ
ｍ、ロール形、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ州Ｂｅｄｆ
ｏｒｄのMillipore Corporation から得た）、２枚の湿
潤および２枚の乾燥クロマトグラフィーペーパー（Ｏｒ
ｅｇｏｎ州ＨｉｌｌｓｂｏｒｏのWhatman から得た３Ｍ
Ｍ Ｃｈｒ）、１枚のガラス板、さらにおもしとしての
５００mlガラス瓶を載せた。３０−４５分後、水不溶性
マーカーを用いてニトロセルロースペーパーにゲルの輪
郭を写し取った。

【００８４】このペーパーを０．１５ ＮａＣｌおよび
０．３％ＮＰ−４０界面活性剤を含有する１０mmトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗い、次に上記緩
衝液中のＫｏｈｉｎｕｏｒ Ｒａｐｉｄｏｇｒａｐｈ
Ｉｎｋ（常設の供給店で入手可能）の１：１０００希釈
物で１５−３０分間染色した。もとのゲルをガラス板の
上に置き、ガラスの下の染色ニトロセルロースペーパー
に書かれたその輪郭と整合させた。各ゲルの両端で狭い
レーンで泳動させた染色済の分子量標準物（BRL, Beeth
esda, MD）を参考にして、２２−２７の分子量に対応す
るゲルの領域を定めた。この領域を、染色ニトロセルロ
ースペーパーにより明らかになったバンド形成曲率を用
いて、ゲル幅を横切って切り出し、７つの２．５mm平行
ゲル片を得た。

【００８５】それぞれのゲル片はさらに小片（２．５×
２mm）に切り、電気泳動コンセントレーター（ISCO, li
ncoln, Nebraska ）を用いて、タンパク質をＬａｅｍｍ
ｌｉ泳動用緩衝液の１：１希釈物中６時間電気泳動溶出
した。溶出タンパク質を０．２mlの量で集めた。図２に
は７つのゲル片のそれぞれからの溶出物中の神経栄養活
性の分布をプロットしてある（減少する分子量の順にａ
−ｇで表す）。最大活性をもつフラクション（ゲル片
ｄ）は逆相ＨＰＬＣを用いてさらに精製した。

【００８６】工程５．逆相ＨＰＬＣ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および１０％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）をゲル溶出物に加えて最終濃度をそれ
ぞれ２％および０．３％とした。このサンプルを０．２
２μｍナイロンフィルターを通して濾過し、Ｃ８逆相Ｈ
ＰＬＣカラムに負荷し、Ｈ₂ Ｏ／０．１％ＴＦＡ：アセ
トニトリル／０．１％ＴＦＡの勾配で溶出した。フラク
ションを０．４％トゥイーン２０界面活性剤５μｌを含
有するシリコーン処理チューブに集めた。各フラクショ
ンからの部分を神経栄養活性についてアッセイした。タ
ンパク質濃度は２１５nmでの吸光度で示し、神経栄養活
性の分布をそれに重ねてある。ピークＳＮ−ＣＮＴＦ活
性を有するフラクション（図３、フラクション３７−４
０）を実施例２に記載する配列決定用にプールした。別
の調製法では、ピークＣＮＴＦ活性を含むフラクション
とその隣接フラクション（図３のフラクション３６−４
４に等しい）を銀染色還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも分析
した（図４）。

【００８７】２つの付加的なクロマトグラフィー工程も
行われた。これらの工程により上記ＣＮＴＦ調製物の純
度が確認された。２つの付加的なクロマトグラフィー工
程は両方とも疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ
Ｃ）の原理を用いる。第一のＨＩＣ工程は、工程２：ｐ
Ｈおよび硫酸アンモニウム分画化の後に挿入される慣用
のカラムクロマトグラフィー法である。硫酸アンモニウ
ム沈殿後の溶解物質を、イオン強度（電導度計で測定）
が０．３Ｍ硫酸アンモニウムおよび５％イソプロパノー
ル含有緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ）のそれに等しくなるまで１
０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７）（緩衝液
Ｂ）を用いてさらに希釈した。

【００８８】次に希釈したサンプルにイソプロパノール
を最終濃度５％となるまで加え、この混合物を緩衝液Ａ
で平衡化したフェニル−セファロースＣＬ４Ｂ（Pharma
cia,Inc., Piscataway, New Jersey ）カラムに加え
た。サンプルタンパク質はカラムのベッド容量１mlあた
り３mg未満しか加えなかった。代表的には、１リットル
の粗製坐骨神経抽出物が５０mlの再溶解硫酸アンモニウ
ムペレットを生じ、これを次に上記のように７０−１０
０mlに希釈しそして１１０mlのフェニル−セファロース
カラムに加えた。カラムは３ベッド容量の緩衝液Ａから
出発して段階的に３ベッド容量の緩衝液Ｂ、続いて２ベ
ッド容量の５０％エチレングリコール含有緩衝液Ｂ（緩
衝液Ｃ）で溶出し、次に５ベッド容量の水で洗った。溶
出物質１８mlずつのフラクションを集めた。

【００８９】図７にこのようなクロマトグラフィー操作
の結果を示してある。溶出タンパク質のプロフィールは
ＯＤ２８０で連続して追跡した（実線）。各フラクショ
ン中の溶出ＳＮ−ＣＮＴＦ生物活性のプロフィール（ｘ
をつなぐ線）を原特許明細書に記載の毛様体神経節生存
アッセイにより測定して、ＯＤ追跡に重ねてある。ＳＮ
−ＣＮＴＦ生物活性は緩衝液Ｃで溶出した際にカラムか
ら現れた。大部分の生物活性を含有するカラムフラクシ
ョン（図７に棒線で示してある）をプールし、Ａｍｉｃ
ｏｎ ＹＭ−１０メンブラン（Amicon Division, W.R.
Grce & Co., Danvers, MA ）を用いる加圧透析によりも
との容量の約１／１０に濃縮した。

【００９０】これにより代表的には２．５−３．０mg／
mlの最終タンパク質濃度を生じた。この濃縮物を５５倍
以上の容量のＢで３回、合計６時間透析した。透析され
た物質を孔径０．２μｍのアクロディスク（Ａｃｒｏｄ
ｉｓｃ）フィルター（GelmanSciences, Inc., Ann Arbo
r, MI）に通し、原特許明細書に記載のＭｏｎｏ−Ｐク
ロマトフォーカシングカラムに２mlずつ数回注入するこ
とにより負荷した。このＨＩＣカラム工程を行わない
と、粗製坐骨神経抽出物１リットルは、最初の特許明細
書に記載したようにＭｏｎｏ−Ｐクロマトフォーカシン
グカラムで８回の別個の操作を要した。なぜならこのカ
ラムのタンパク質負荷能力が限定されているからであ
る。ＨＩＣカラム工程を加えると、１リットルの粗製抽
出物を１回のクロマトフォーカシング操作で処理でき
た。

【００９１】第二のＨＩＣ工程はもとの工程３：Ｍｏｎ
ｏ−Ｐでのクロマトフォーカシングの後に挿入された。
フォーカシング分離した物質（３−５mg／mlのタンパク
質）１mlごとに、１５Ｍ硫酸アンモニウム含有５０mMリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ６．７）（緩衝液Ｄ）２mlを加え
た。この混合物を次に孔径０．２μｍのアクロディスク
フィルターに通し、そして緩衝液Ｄで平衡化したアルキ
ル−スペロースＨＲ１０／１０ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）に２mlずつ数回注入により負荷した。カ
ラムをＯＤ２８０での流出物の吸光度がベースラインに
戻るまで緩衝液Ｄで洗った。次に緩衝液Ｄから緩衝液Ｅ
（５０mMリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．７）までの直線勾配
６０mlでカラムを溶出し、１mlフラクションを集めた。

【００９２】図８にこのようなＦＰＬＣ−ＨＩＣカラム
の操作の結果を示してある。連続線はＯＤ２８０により
測定された溶出タンパク質のプロフィールを表す。それ
ぞれの勾配フラクションにおけるＳＮ−ＣＮＴＦ生物活
性のプロットをその上に重ねてある。生物活性を含有す
るフラクション（図８に棒線で示してある）をプール
し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０濃縮機（Amicon社製）で
０．５mlとなるまで濃縮した。このサンプルを上部溜め
に２mlの緩衝液Ｂを加えて希釈し、遠心により再濃縮し
て最終容量０．５mlとした。希釈および再濃縮をさらに
２回繰り返し、最終濃縮サンプルを上記のような還元型
ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミド調製用スラブゲルで
泳動した。ただし、前の透析は必要でなかった。

【００９３】図９には、最初の精製法の場合（上のパネ
ル）および２回のＨＩＣ工程を加えた後の精製法の場合
（下のパネル）の逆相ＨＰＬＣでの最終精製工程を比較
してある。各パネルは溶出タンパク質のプロフィール
（実線がＯＤ２８０である）とそれに重ねられたＳＮ−
ＣＮＴＦ生物活性（ｘをつなぐ線）を示す。この図面か
ら、新しい精製法で逆相ＨＰＬＣにかけられたサンプル
には存在する汚染タンパク質がずっと少ないことが明ら
かである。この新しい方法により得られたＣＮＴＦの比
活性は、以前の方法により得られたＣＮＴＦの比活性
（表１）と実験誤差の範囲内で同一であることに注意す
ることが重要であり、このことは上記の最初の方法によ
り得られたＣＮＴＦが均質となるまで精製されたことを
示している。新しい精製法の利点は、最初の方法で１リ
ットルの出発物質を使った場合と同じくらい便利に８リ
ットルの出発物質を処理できる点にある。

【００９４】実施例２．精製神経栄養因子の配列決定 ピークＳＮ−ＣＮＴＦ活性（図３、＃３７−４０）を有
するフラクションをプールし、真空蒸発遠心分離機で５
０μｌとなるまで濃縮した。この濃縮サンプルは０．１
４％のトゥイーン２０を含有した。これを１％炭酸水素
アンモニウムを用いて最終容量３５０μｌとなるまで希
釈し、そしてエンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎまたはエン
ドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを用いて３７℃で一晩処理し
た。この混合物を真空蒸発遠心分離機で約５０−１００
μｌとなるまで濃縮し、細口のＡｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ
−３００ Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラム、（Ｂｒｏｗｎｌｅ
ｅＬａｂｓ）、２．１×２２０mm、に１mlサンプルルー
プから負荷し、Ｈ₂ Ｏ／０．１％ＴＦＡ：アセトニトリ
ル／０．１％ＴＦＡの勾配で溶出した。

【００９５】ペプチド含有フラクションを２１５nmでの
吸光度に基づいてエッペンドルフチューブに手動で集め
た。図５には、２１５nmでの吸光度により測定された、
エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎで消化後の溶出ペプチド
のプロフィールを示してある。図６には、エンドプロテ
アーゼＬｙｓ−Ｃでの消化に続いて還元およびカルボキ
シメチル化を行った後の溶出ペプチドのプロフィールを
示してある。突出ペプチドのアミノ酸配列をＡｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ気相タンパク質シークエン
サーを用いて決定した。

【００９６】付加的なアミノ酸配列が切断酵素キモトリ
プシンおよびエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（Boehring
er Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN）を用い
て得られた。この付加的なタンパク質配列により、上で
報じたアミノ酸配列の一部を、重なり合うアミノ酸の広
がりから、より大きいペプチドへと接ぎ合すことができ
た。新しいアミノ酸配列および以前の配列と連結された
ものを以下に示す：

【００９７】

【化６】

【００９８】実施例３．神経栄養因子に対する抗体の調
製 精製ウサギＳＮ−ＣＮＴＦと反応する抗体は、ウサギＳ
Ｎ−ＣＮＴＦをコードする遺伝子を得るために発現ライ
ブラリーをスクリーニングするのに有用であろう。さら
に、その生物学的活性を中和する抗体は、この神経栄養
因子の生物学的役割を調べるために無傷の動物で使用さ
れよう。

【００９９】このような抗体を調製するために、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動タンパク質合成機
を用いてＳＮ−ＣＮＴＦ配列の領域に相当する合成ペプ
チドが合成されよう。この種の合成ペプチドはキャリア
ータンパク質キーホール リンペット ヘモシアニンに
共有結合されよう。この接合ペプチドを完全フロインド
アジュバント中でモルモットに注射し、３週目と６週目
に不完全アジュバント中で追加免疫されよう。それぞれ
のモルモットから血清サンプルを採取し、そして血清中
の抗体が精製ＳＮ−ＣＮＴＦと反応するかどうか調べる
ために、この精製タンパク質に対するウェスタンブロッ
トに用いられよう。ウェスタンアッセイで陽性の血清
は、精製に用いたバイオアッセイで神経栄養活性を中和
する能力についてさらに試験されよう。

【０１００】ウェスタンまたは中和アッセイで陽性の血
清は、次のようにしてさらに精製されよう：（１）この
タンパク質に対する抗体を取り出すために、キャリアー
タンパク質キーホール リンペット ヘモシアニンで血
清を吸収し、次にこの血清が上記アッセイで再試験され
よう；（２）標準方法により血清からＩｇＧ抗体フラク
ションが精製され、これが上記アッセイで再試験されよ
う。これらの工程は両方とも、ＳＮ−ＣＮＴＦのメッセ
ンジャーＲＮＡと遺伝子をクローニングするための発現
ライブラリーのスクリーニングに使用するに足る純度の
ポリクローナル抗体を生じよう。

【０１０１】ウサギにおいて、実施例２で示されたウサ
ギＳＮ−ＣＮＴＦのアミノ酸配列の一部（Ｅ−Ｓ−Ｙ−
Ｖ−Ｋ−Ｈ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｎ−Ｋ−Ｎ）に相当する合成
ペプチド“Ａ”に対する抗体が生成された。本実施例で
この方法を以下に詳しく説明する。合成ペプチドＡに対
するアフィニティ精製抗体（抗−ペプチドＡ抗体）は、
免疫化したウサギの抗血清を合成ペプチドＡを共有結合
させたアフィニティカラムに通し、結合された抗体を溶
出することにより得られた。非分画化免疫抗血清はペプ
チドＡ被覆ウェルを使用したＥＬＩＺＡアッセイで約１
０⁵ の力価を示した；これを１：５０の最終希釈度でウ
ェスタンブロット分析に使用した。以下に記載するよう
にして調製したアフィニティ精製抗−ペプチドＡ抗体は
８０μｇ／mlの最終濃度でウェスタンブロット分析に使
用された。

【０１０２】抗−ペプチドＡ抗血清およびアフィニティ
精製抗体は両方とも、精製ＣＮＴＦの還元型ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド−ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
のウェスタンブロット分析により、精製ウサギＳＮ−Ｃ
ＮＴＦと相互作用することが立証された。同一ウサギか
らの免疫前血清はこれらの条件下でＳＮ−ＣＮＴＦと反
応しなかった。最終逆相ＨＰＬＣ精製工程からのピーク
ＣＮＴＦフラクション（図９、パネルＢのフラクション
＃４６）の一部分を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つ
の別々のレーンで泳動させた。

【０１０３】分子量マーカータンパク質を含有するレー
ンが精製ＣＮＴＦの各レーンに隣接していた。ゲルを２
枚のパネルに切断し、各パネルは精製ＣＮＴＦの１つの
レーンとマーカータンパク質の隣接レーンを含んでい
た。１枚のパネルはタンパク質の位置を定めるために銀
染色を施し（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）、
他方はウェスタンブロット分析（Towbinら、１９７９，
Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:4350 ）によりアフィ
ニティ精製抗−ペプチドＡ抗体と反応するタンパク質に
ついて調べた。

【０１０４】図１０の左側のパネルのレーンは、逆相精
製ＣＮＴＦのピークフラクションが還元型ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上を約２５，０００ダルトンで泳動し、約５００ダ
ルトンだけ互いに離れた２本の接近したタンパク質バン
ドを含有することを示している。銀染色ゲルが精製ＣＮ
ＴＦで過剰負荷されると、往々にして図４のように２本
のバンドを分離することができない。

【０１０５】図１０の右側のパネルのレーンは、両バン
ドがアフィニティ精製抗−ペプチドＡ抗体により認識さ
れて染色されることを示している。右側パネルの一番左
のレーンの無関係のマーカータンパク質は左側の銀染色
レーンから明らかなように高濃度で存在するけれども抗
−ペプチドＡ抗体により認識されないので（図１０）、
この認識は特異的である。同一ウサギからの免疫前血清
も精製ＣＮＴＦの２本のバンドを認識しない。これらの
結果は還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量が約５０
０ダルトンだけ異なる少なくとも２種類の異なる形のＣ
ＮＴＦが存在することを示している。

【０１０６】抗−ペプチドＡ抗体を調製するには、合成
ペプチドＡをキーホール リンペット ヘモシアニン
（ＫＬＨ）に接合させてその抗原性を高めた。この接合
には、５０％グルセロール中のペプチドＡ １mgおよび
ＫＬＨ（Calbiochem, La Jolla, CA）１mgを０．５mlの
ＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する２０mMリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）に溶解した。１０％グ
ルタルアルデヒドを混合しながら滴下して最終濃度１％
となし、この反応混合物を混合しながら室温で一晩放置
し、次にＰＢＳで５mlに希釈した。

【０１０７】この接合混合物を完全フロインドアジュバ
ントで１：２に乳化し、２匹のニュージーランド白ウサ
ギの背側の数個所に約１００μｇペプチドＡ／ウサギの
量で皮下注射した。３週間後、それぞれのウサギに不完
全フロインドアジュバント中の接合ペプチドＡ５０μｇ
の追加免疫量を投与した。その後、抗血清がペプチドＡ
被覆ウェルを用いたＥＬＩＺＡアッセイ（Tainerら、１
９８４ Ｎａｔｕｒｅ３１２：１２７）で少なくとも１
００，０００の力価を生ずるまで、同様の追加免疫注射
を２週間の間隔で行った。最初の注射の５週間後とその
後隔週毎に耳静脈より採取した血液から血清を調製し
た。血清は−７０℃で貯蔵した。

【０１０８】ペプチドアフィニティーカラムを調製する
には、ペプチドＡをクロマトグラフィーカラムマトリッ
クスに次のようにして共有結合させた：４Ｍグアニジン
塩酸塩含有ＰＢＳ ０．４mlに溶解した８mgのペプチド
Ａに、４．５mlの０．１ＭＮａＨＣＯ₃ （ｐＨ８．０）
および０．５Ｍ ＮａＣｌを加えた。１ｇの凍結乾燥し
た活性化ＣＨセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を２００mlの１mMＨＣｌで洗って膨潤させ、すぐにペプ
チドＡの溶液に移した。この混合物を４℃で一晩揺動さ
せた。次に、臨床遠心分離機でゲルを沈降させ、上清は
マトリックスに結合されたペプチドＡの量を測定するた
めに取っておいた。

【０１０９】このゲルペレットに１５mlの０．１Ｍ Ｔ
ＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、室温で２時間イン
キュベートして、ゲルマトリックス上の未反応カップリ
ング基をブロックした。次にゲルをカラム（３mlベッ
ド）に充填し、下記緩衝液の順で３回洗浄した：（１）
０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ
４．０）１０ベッド容量；（２）０．５Ｍ ＮａＣｌ含
有０．１Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０）。最後に、
このカラムを０．０２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＶＳ
で平衡化した。もとのペプチドＡ溶液と接合後の上清の
遊離アミノ基の濃度の差を、フルオレサミンを使って
（Chenら、1978, Arch. Biochem. Biophys. 189:241; N
owicki, 1979, Anal. Letters 12:1019 ）測定した。こ
の分析から、９２−９５％のペプチドが溶液から失われ
て、セファロースゲルマトリックスに接合されたことが
分かった。

【０１１０】抗−ペプチドＡ抗体のアフィニティー精製
に先立って、８mlの免疫化ウサギ血清を２リットルのＰ
ＢＳで対して一晩透析した。ペプチドＡ−セファロース
カラムをそれぞれ１０ベッド容量の下記のもので順に洗
浄した：０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）；Ｐ
ＢＳ；０．１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）；最
後にＰＢＳ。透析血清をこのカラムに３回通して抗−ペ
プチドＡ抗体を完全に結合させた。このカラムを２０ベ
ッド容量のＰＢＳで洗い、次にそれぞれ４ベッド容量の
以下のもので順に溶出した：０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ
（ｐＨ２．５）；ＰＢＳ；０．１Ｍトリエチルアミン
（ｐＨ１１．５）；最後にＰＢＳ。１mlずつのフラクシ
ョンを集めた。

【０１１１】グリシンおよびトリエチルアミン洗浄から
の溶出物をそれぞれ１Ｍ ＴＲＩＳ、ｐＨ９および７で
すぐに中和し、そして一部分をペプチドＡ被覆ウェルを
用いたＥＬＩＺＡアッセイにより抗−ペプチドＡ抗体に
ついてアッセイした。最高力価フラクション（代表的に
はグリシンとトリエチルアミン溶出の最初の３ベッド容
量内）をプールし、ＰＢＳで透析した。短時間の遠心に
より粒状物質を除いた後、アフィニティー精製抗−ペプ
チドＡ抗体上清を−７０℃で貯蔵した。

【０１１２】実施例４．ＳＮ−ＣＮＴＦ遺伝子のクロー
ニング この研究の最終目的は、ヒトの医薬製剤において使用す
るのに適した物質をつくるために、ヒトＳＮ−ＣＮＴＦ
遺伝子をクローニングして発現させることである。得ら
れたペプチド配列はウサギＳＮ−ＣＮＴＦのものであ
り、ウサギとヒトの配列は同一でないかもしれないの
で、初めにこのタンパク質配列に基づく合成オリゴヌク
レオチドとのハイブリダイゼーションによりウサギ遺伝
子のクローンを得、そしてこのウサギクローンをヒト遺
伝子をスクリーニングする際のハイブリダイゼーション
プローブとして使用することが賢明である。

【０１１３】ウサギおよびヒトＳＮ−ＣＮＴＦをコード
するゲノム配列とメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配
列の両方が得られよう。ｍＲＮＡ配列はこのタンパク質
の発現に有用であろうし、一方ゲノム配列はＳＮ−ＣＮ
ＴＦ遺伝子の構造および調節を理解する上で不可欠であ
ろう。これらの配列を得るために、ウサギとヒトのゲノ
ムライブラリーおよび坐骨神経から単離したｍＲＮＡよ
り作製されたウサギおよびヒトのｃＤＮＡライブラリー
がスクリーニングされよう。ウサギまたはヒトＳＮ−Ｃ
ＮＴＦの配列に対応する遺伝子を得る過程で、この神経
栄養因子ファミリーの別の構成員でありうる構造的に密
接に関連した遺伝子についてもスクリーニングすること
が可能である。

【０１１４】Ａ．ＳＮ−ＣＮＴＦ遺伝子 ＳＮ−ＣＮＴＦをコードするウサギゲノム配列を単離す
るには、ウサギゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）をＥ．コリｎｍ５３８細菌株に塗布し、約１，００
０，０００個の組み換えクローンがスクリーニングされ
よう。最少数のコドンで表されうるウサギＳＮ−ＣＮＴ
Ｆのタンパク質配列の領域を逆翻訳して、対応する縮重
オリゴヌクレオチドプローブを合成する。ウサギオリゴ
ヌクレオチドをManiatisら、（1982, Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat
ory ）の標準プロトコールに従ってキナーゼ処理するこ
とにより標識する。ＤＮＡキナーゼはUS Biochemical C
orp.から得られ、ガンマ標識ＡＴＰはＩＣＮから得られ
る。オリゴヌクレオチドは少なくとも１，０００，００
０ｃｍｐ／ピコモルの比活性となるまで標識されよう。

【０１１５】ゲノムライブラリーの塗布後、約１００万
個のプラークを２通りのニトロセルロースフィルターに
移行させる。次にフィルターをManiatis, ら（１９８
２、同上）の方法に従って処理し、放射性標識オリゴヌ
クレオチドプローブと一晩ハイブリダイズさせる。ハイ
ブリダイゼーションカクテルは６×ＳＳＣＰ、２×Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、１mM
ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ酵母ｔＲＮＡ
（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ８．０を包含しよう。

【０１１６】ハイブリダイゼーション温度はオリゴヌク
レオチドの計算Ｔｍより数度低いだろう。タンパク質配
列の異なる領域に基づく数種類のプローブとハイブリダ
イズするクローンをプラーク精製し、そしてハイブリダ
イゼーション領域はＳＮ−ＣＮＴＦタンパク質配列をコ
ードするクローンを同定するためにシークエナーゼ（Se
quenase; US Bio-chemicals Corp. ）を用いるジデオキ
シターミネーション法（Sangerら、1977, Proc. Natl.
Acad. Sci. 74:5463）により配列決定する。

【０１１７】Ｂ．ＳＮ−ＣＮＴＦ ｍＲＡＮ配列 全細胞ＲＮＡはウサギおよびヒトの坐骨神経から得られ
よう。この組織をグアニジニウムチオシアネート／β−
メルカプトエタノール溶液中でホモジナイズし、ＲＮＡ
を塩化セシウム勾配からの沈降により精製する（Gliso
n, ら、1974, Biochemistry 13:2633）。オリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースでのクロマトグラフィーによりポリアデ
ニル化ＲＮＡを選択する（AvidおよびLeder, 1972, Pro
c. Natl. Acad. Sci. 69:408）。

【０１１８】各ＲＮＡ調製物におけるＳＮ−ＣＮＴＦ配
列の存在を見積もり、それにより独立クローンの数を概
算するために、“アンチセンス”オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いる定量的ＲＮＡブロットハイブリダイゼー
ション分析を実施する。ＣＮＴＦクローンを得る確率が
少なくとも９９％となるようにスクリーニングする必要
がある。十分な二本鎖相補ＤＮＡをGublerおよびHoffma
n, 1983, Gene 25:263に記載されるようにして合成をし
て、Palazzolo およびMeyerowitz, 1987, Gene52:197
に従いラムダｇｅｍ２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ）に挿入する。

【０１１９】ウサギＳＮ−ＣＮＴＦをコードするクロー
ンは上記のような組み換えファージクローンのハイブリ
ダイゼーションにより同定されよう。クローンの同一性
は全既知タンパク質配列との一致を判定するためにヌク
レオチド配列を決定することにより証明されよう。ヒト
坐骨神経ｃＤＮＡプローブ（FeinbergおよびVogelstei
n, 1983, Anal. Biochem. 132:6）のスクリーニング
は、ウサギｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用
いられる比較的小さいオリゴヌクレオチドの使用に比
べ、交差種ハイブリダイゼーションの検出にとってより
信頼できる方法である。

【０１２０】ウサギＣＮＴＦアミノ酸配列に対応するＤ
ＮＡフラグメントを増幅するのにポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）（Saiki,ら、1988, Science 239:487 ）が用
いられた。このようなＤＮＡフラグメントはヒトおよび
ウサギのゲノムＤＮＡおよびウサギの坐骨神経および交
感神経神経節ｃＤＮＡから増幅された。増幅ＤＮＡフラ
グメントは標準方法（Maniatis, ら、1982, Molecular
Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor,
New York）を用いてサブクローニングおよび配列決定さ
れた。

【０１２１】ＰＣＲにより得られたＤＮＡフラグメント
はウサギ坐骨神経ｃＤＮＡライブラリーおよびヒトゲノ
ムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプロ
ーブとしても使用された。陽性ウサギｃＤＮＡクローン
および陽性ヒトゲノムクローンを精製して、部分的に配
列決定した。ウサギまたはヒトＣＮＴＦのコード（ｍＲ
ＮＡ均等）配列に対応する読み取り枠の配列により、Ｐ
ＣＲを用いて得られたコード領域のＤＮＡフラグメント
の配列が確認された。得られるウサギおよびヒトＣＮＴ
Ｆのコード配列をそれぞれ図１１および１２に示す。ウ
サギＳＮ−ＣＮＴＦから得られたアミノ酸配列の部分を
縮重オリゴヌクレオチド＃１，１３，７および１２およ
びそれらの相補鎖＃３，１４，８および１７に逆翻訳し
た。アミノ酸配列（上）および対応するセンスおよびア
ンチセンス縮重オリゴヌクレオチドの位置および番号
（下）を以下に示す：

【０１２２】

【化７】

【０１２３】それぞれの縮重オリゴヌクレオチドのセン
ス鎖のヌクレオチド配列を以下に示す（ここでＮはいず
れかのヌクレオチドに相当する）：

【０１２４】

【化８】

【０１２５】鋳型としてヒトまたはウサギＤＮＡを、そ
してプライマーとしてオリゴヌクレオチド＃１と８また
は＃１と１７を用いてヒトおよびウサギＣＮＴＦ遺伝子
の相当する領域を増幅するために、別々にポリメラーゼ
連鎖反応を行った。反応生成物のサザンブロット（放射
性標識オリゴヌクレオチド＃１３で検索）により約６６
塩基対（＃１と８）および約３６６塩基対（＃１と１
７）の寸法の標識バンドの存在が示された。

【０１２６】上記と同じＰＣＲ反応をウサギ坐骨神経ま
たはウサギ交感神経神経節ｍＲＮＡから調製したｃＤＮ
Ａを用いて実施した。ＲＮＡをウサギ坐骨神経または交
感神経神経節から調製し、上記のようにしてメッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を選択するためにオリゴ−ｄＴ
カラムに通した。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、鋳型とし
てｍＲＮＡを、そしてプライマーとしてオリゴ−ｄＴを
用いて逆転写酵素により調製した。鋳型としてｃＤＮＡ
を、プライマーとしてオリゴヌクレオチド＃１と８また
は＃１と１７を用いてＰＣＲを行った場合、ウサギゲノ
ムＤＮＡから増幅されたものと同じ配列を有するフラグ
メントが増幅された（図１１）。このことはオリゴヌク
レオチド＃１と１７の間のＣＮＴＦ遺伝子のタンパク質
コード領域に何ら介在配列（イントロン）が存在しない
ことを示している。

【０１２７】さらに多くのウサギＣＮＴＦコード（ｍＲ
ＮＡ均等）配列を得るために別の戦略が用いられた：鋳
型としてウサギ坐骨神経ｍＲＮＡを、プライマーとして
オリゴ−ｄＴ／ＮｏｔＩリンカーを用いて、二本鎖ｃＤ
ＮＡを調製した。次に、二本鎖ｃＤＮＡの５′末端に平
滑末端連結（Maniatis, ら、同上）によりＥｃｏＲＩ／
ＸｍｎＩリンカーアダプター（５′−ＡＡＴＴＣＧＡＡ
ＣＣＣＣＴＴＣＧ−３′）を付加した。鋳型としてこの
ｃＤＮＡを、プライマーとしてオリゴヌクレオチド＃８
とＥｃｏＲＩ／ＸｍｎＩリンカーアダプターを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応を行った。反応生成物のサザンブロ
ット（放射性標識オリゴヌクレオチド＃１３を用いて検
索）により約２００塩基対の寸法の標識バンドの存在が
明らかになった。

【０１２８】ウサギＣＮＴＦのｃＤＮＡクローンを得る
には、上記方法により（ただし、ラムダｇｅｍ２の代わ
りにラムダｇｔ１０ベクター（Ｓｔｒａｔｉｇｅｎｅ）
を使用）ウサギ坐骨神経ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーの約４
×１０⁶ 個のプラークを、鋳型としてのウサギ交感神経
神経節ｃＤＮＡおよびプライマーとしてのオリゴ＃８と
ＥｃｏＲＩ／ＸｍｎＩリンカーアダプターから得られた
ＰＣＲフラグメントのＭ１３サブクローンをランダムに
標識することにより作られたプローブを用いてスクリー
ニングした（上記参照）。

【０１２９】１個の一次陽性物を三次スクリーンにより
プラーク精製した。ＥｃｏＲＩで消化すると、このクロ
ーンからのＤＮＡはラムダアームのほかに長さが約２．
０、１．５および０．６kbの３つのフラグメントを生成
した。サザンブロット分析により、１．５kbフラグメン
トは他のＣＮＴＦ特異的オリゴヌクレオチドおよび上記
のＰＣＲフラグメントとハイブリダイズすることが示さ
れた。この１．５kbのｃＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配
列により、それがウサギＣＮＴＦの全コード配列を含有
することが確立された（図１１）。

【０１３０】ヒトＣＮＴＦのゲノムＤＮＡクローンを得
るには、ベクターラムダＥＭＢＬ３中のヒトゲノムＤＮ
Ａライブラリーの約３×１０⁶ 個のプラークを、鋳型と
してのヒトゲノムＤＮＡおよびプライマーとしてのオリ
ゴ＃１と＃１７から得られたＰＣＲフラグメントのＭ１
３サブクローンをランダムに標識することにより作られ
たプローブを用いてスクリーニングした（上記参照）。
一次陽性物の６個を後続のスクリーニングによりプラー
ク精製し、他のＣＮＴＦ特異的オリゴヌクレオチドおよ
びＰＣＲフラグメントとハイブリダイズすることが判明
した。オリゴ＃１３とハイブリダイズするクローンの１
個からの０．６kb ＢａｍＨＩ制限フラグメントをＢａ
ｍＨＩ切断Ｍ１３ｍｐ１９中にサブクローニングし、配
列決定した。

【０１３１】ウサギｃＤＮＡクローン由来のウサギ物質
からＰＣＲにより得られたフラグメントのＤＮＡ配列を
重複配列の領域に基づいて組み合わせると、図１１に示
されるウサギＳＮ−ＣＮＴＦのクローニング（ｍＲＮＡ
均等）配列が得られた。ヒトゲノムＤＮＡおよびヒトゲ
ノムクローンからＰＣＲにより得られたフラグメントの
ＤＮＡ配列を重複配列の領域に基づいて組み合わせる
と、図１２に示されるヒトＳＮ−ＣＮＴＦのコード配列
が得られた。ウサギおよびヒトのＣＮＴＦ核酸配列は約
８９％同一であり（図１２）、このことはウサギおよび
ヒト配列がＣＮＴＦをコードする相同遺伝子に由来する
ことを示している。図１１に示されるように、ウサギＣ
ＮＴＦの核酸配列の部分は精製ＳＮ−ＣＮＴＦから得ら
れたアミノ酸配列により確認され、前の実施例で報告し
た。

【０１３２】ポリメラーゼ連鎖反応を上記の鋳型および
プライマーを用いて実施した。この反応のプログラムは
次のとおりであった：変性サイクル、９５℃で１分；ア
ニーリングサイクル、４０℃で１．５分；および伸長サ
イクル、７２℃で４分。反応は３０サイクル行われた。
反応生成物は２％アガロースゲルで電気泳動し、Ｚｅｔ
ａ−Ｂｉｎｄメンブラン（BioRad, Richmond, CA）に移
行させてサザンブロッティングした。

【０１３３】ＣＮＴＦコード配列の増幅部分を同定する
ために、この反応を開始させるのに使用されたオリゴヌ
クレオチド間に存在することがＣＮＴＦタンパク質配列
から知られている放射性標識オリゴヌクレオチド＃１３
を用いてサザンブロットを検索した。サザンブロッティ
ング後に得られた標識バンドをもとのゲルから切り出
し、４種すべてのｄＮＴＰの存在下にＤＮＡポリメラー
ゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント（New England Biolabs,
Beverly, MA）で両末端を修復しそしてこのＤＮＡをＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（US Biochemical Corp.,
Cleveland, OH ）およびＡＴＰを用いてキナーゼ処理す
ることにより、クローニング用に調製した。

【０１３４】次に適当なＤＮＡ片をＭ１３ｍｐ１０ Ｓ
ｍａＩ切断ベクター（脱リン酸化したもの；Amersham C
orp., Arlington Heights, IL,から商業的に入手しう
る）中にサブクローニングした。対象のフラグメントを
含有する組み換えファージは、プローブとして放射性標
識オリゴヌクレオチド＃１３を用いるBenton & Davis
（１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０）のスク
リーニング法により同定した。これらの組み換えクロー
ンを増殖させて配列決定用の一本鎖ＤＮＡを十分量用意
し、次にジデオキシ・チェイン・ターミネーション法
（Sanger, ら、同上）により配列決定した。

【０１３５】長いランダム標識ＤＮＡプローブが用いら
れた場合のハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＣ
Ｐ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、２mM ＥＤＴＡ、０．０５
％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、２５０μｇ／mlのニシン精子ＤＮＡ
（非特異的拮抗物質）、ｐＨ８．０であった。ハイブリ
ダイゼーションは６５℃で実施し、ブロットまたはフィ
ルターは０．１×ＳＳＣＰおよび０．１％ ＳＤＳ中６
５℃で洗った。比較的短いオリゴヌクレオチドプローブ
を用いた場合のハイブリダイゼーション条件は、６×Ｓ
ＳＣＰ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、２mM ＥＤＴＡ、０．
０５％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１００
μｇ／mlの酵母ｔＲＮＡ（非特異的拮抗物質）、ｐＨ
８．０であった。ハイブリダイゼーション温度およびブ
ロットやフィルターの洗浄条件は、各オリゴヌクレオチ
ドのＧＣ含量を考慮してそれぞれに調整された（Maniat
isら、同上）。

【０１３６】実施例５．ＳＮ−ＣＮＴＦをコードする遺
伝子の動物細胞における発現 ＳＮ−ＣＮＴＦの動物細胞発現は下記工程を必要とす
る： ａ．発現ベクターの構築； ｂ．宿主細胞系の選択； ｃ．発現ベクターの宿主細胞への導入；および ｄ．ＳＮ−ＣＮＴＦの発現レベルを増大させるための組
換え宿主細胞の操作。

【０１３７】（ａ）動物細胞中で用いるために設計され
たＳＮ−ＣＮＴＦ発現ベクターは、強力な構成的発現構
築物、誘導可能な遺伝子構築物ならびに特定の細胞型中
での発現のために設計された構築物を包含するいくつか
の種類であることができる。全ての場合において、プロ
モーターおよび他の遺伝子調節領域例えばエンハンサー
（誘導可能または不可）およびポリアデニル化シグナル
がプラスミドに基づくベクター中ｃＤＮＡ配列に関連し
て適切な位置に置かれる。かかる構築物のふたつの例は
次のとおりである：

【０１３８】（１）強力な構成的プロモーター領域を用
いる構築物は、Gormanら、Mol. Cel. Biol. 2 :1044-10
51, 1982, （参考文献としてここに詳細にとり込まれ
る）に記載されるプラスミドｐＳＶ２ＣＡＴにみられる
ような配置でシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）遺伝子
制御シグナルを用いて作製されるべきである。このプラ
スミドは標準分子生物学技法（Maniatisら、上記）を用
いてＳＮ−ＣＮＴＦ ｃＤＮＡをクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）コード配列と置
換するような方法で操作されるべきである。

【０１３９】（２）誘導可能な遺伝子構築物はマウスメ
タロチオネイン（ＭＴ−１）プロモーター領域を含有す
るプラスミドＰＭＫ（Brinsterら、Ｃｅｌｌ ２７：２
２８−２３１，１９８１）を利用して作製されるべきで
ある。このプラスミドは出発物質として使用でき、金属
誘導可能な遺伝子構築物を生じるように操作されるべき
である。

【０１４０】（ｂ）数多くの動物細胞系を、活性タンパ
ク質を生産するために上記ベクターを用いるＳＮ−ＣＮ
ＴＦの発現に用いるべきである。外来遺伝子発現を促進
する能力についてよく特性決定されているふたつの可能
な細胞系はマウスＬｔｋ^- およびチャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）ｄｈｆｒ^- 細胞であるが、ＳＮ−ＣＮ
ＴＦの発現はこれら細胞系に限定されない。上記のもの
に加えて発現に使用できる動物細胞系には、一過性発現
に有用なサル腎臓細胞ＣＯＳ−７およびヒト胚腎臓細胞
２９３が包含される。

【０１４１】（ｃ）ベクターＤＮＡは数多くの遺伝子移
入法の任意のものを用いてこれらの細胞系に導入される
べきである。ここで使用される方法にはS. L. Grahamお
よびA. S. van der Eb (Virology 52 :456-467, 1973）
により記載されるリン酸カルシウムＤＮＡ沈澱法が包含
され、そこにおいてはＳＮ−ＣＮＴＦの発現ベクターは
選択可能なマーカーをコードする第２の発現ベクターと
共沈される。Ｌｔｋ^-細胞トランスフェクションの場
合、選択可能なマーカーはチミジンキナーゼ遺伝子であ
りその選択はWiglerらＣｅｌｌ １６：Ｌ７７７−７８
５，１９７９に記載されるとおりであり、ＣＨＯ ｄｈ
ｆｒ^- 細胞の場合、選択可能なマーカーはジヒドロ葉酸
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）であり、その選択はRingold
ら、J. Mol. Appl. Genet. 1:165-175, 1981に記載され
ている。

【０１４２】（ｄ）ＳＮ−ＣＮＴＦ遺伝子構築物を発現
する細胞は次にＳＮ−ＣＮＴＦ生産レベルを増大させる
条件下で増殖されるべきである。メタロチオネインプロ
モーター構築物を担持する細胞は、今やＭＴ−１プロモ
ーターの５倍増の利用をもたらし（Mayoら、Ｃｅｌｌ
２９：９９−１０８）それが続いてＳＮ−ＣＮＴＦタン
パク質レベルのほぼ等しい増大をもたらすカドミウムの
ような重金属の存在下で増殖できる。ＤＨＦＲ発現ベク
ターとともにＳＮ−ＣＮＴＦ発現ベクター（ＳＶ４０ま
たはＭＴ−１に基づく）を含有する細胞は、ＤＨＦＲの
競合的拮抗体であるメトトレキセートを用いて、Ringol
d ら、in J. Mol. Apl. Genet. 1:165:175, 1981に記載
の遺伝子増幅プロトコールにより採取できる。これは細
胞中により多くのＤＨＦＲ遺伝子コピーの存在をもたら
しそして同時にＳＮ−ＣＮＴＦ遺伝子コピーの増大をも
たらし、このことが次にはさらに多くのＳＮ−ＣＮＴＦ
タンパク質の細胞による生産をもたらしうる。

【０１４３】もうひとつの発現ベクターｐＣＭＶＸＶＰ
Ｌ２をウサギＣＮＴＦのコード配列をＣＯＳ−７細胞中
で一過性に発現させるのに利用した。このプラスミドベ
クターはBoshart ら、（Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３
０，１９８５）に記載されるようにサイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）の極初期プロモーターおよびエンハンサー
を含有する。このプラスミドは図１３に示されているよ
うにして構築できる。ポリアデニル化シグナルはシミア
ンウイルス４０（ＳＭＶ４０）配列により提供される
（地図で２５８９−２４５２に配位；Reddy ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２００：４９４−５０２，１９７８参照）。
ＳＶ４０の複製開始点をこのプラスミドに包含させるの
は、ＣＯＳ細胞でのその使用を容易にして一過性発現を
アッセイするためである。

【０１４４】ウサギＳＮ−ＣＮＴＦはＣＯＳ−７細胞中
で以下のように一過性発現される：ウサギＳＮ−ＣＮＴ
Ｆの全コード領域を含有するウサギ坐骨神経ｃＤＮＡク
ローンの１．５kb ＥｃｏＲＩ制限フラグメント（実施
例４）をＥｃｏＲＩ切断発現ベクターｐＣＭＶＸＶＰＬ
２中にサブクローンした。ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで
消化後に、ベクターにＣＮＴＦ発現にとって正しい方向
で１．５kbフラグメントを挿入した場合に予測される寸
法を有する制限フラグメントを生ずる１個のクローンを
選択した。この構築物からのプラスミドＤＮＡをアルカ
リ溶解法に続いてＣｓＣｌ密度遠心を行うことにより調
製した（Maniatisら、同上）。このＤＮＡをＳｏｍｐａ
ｙｒａｃおよびＤａｎｎａ（Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A. 78 :7575-7578, 1981）の方法によりＣＯＳ−７
細胞に移入した。対照として、同じＣＯＳ細胞培養物を
挿入物を有さないプラスミドベクターＤＮＡでトランス
フェクトした。

【０１４５】トランスフェクション４８時間後に、培地
および細胞ペレットを収穫した。細胞ペレットを、１mM
ＥＤＴＡ、０．１mM ＰＭＳＦ、および０．１μＭペ
プスタチンを含有する２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ
６．７中、氷の上で短時間の音波処理により抽出した。
各培養物からの細胞抽出物および培地の両方の連続希釈
物を毛様体神経節生存アッセイで活性についてアッセイ
した。

【０１４６】ＣＮＴＦ ｃＤＮＡフラグメントを含有す
るベクターでトランスフェクトした培養物からの細胞抽
出物はバイオアッセイでは約１５，０００TU／mlの力
価、そしてウエスタンブロット分析による測定では、約
５０ng／mlのＣＮＴＦを有していた。ベクターのみでト
ランスフェクトした培養物からの細胞抽出物もまた任意
の培養物からの培地もウエスタンブロット分析では何ら
検出できる程の生物活性もＣＮＴＦタンパク質も示さな
かった。この結果は、我々がクローンしたＣＮＴＦ ｃ
ＤＮＡが真正ＳＮ−ＣＮＴＦの予想される生物活性を有
するタンパク質をコードすることを明らかに示してい
る。

【０１４７】実施例６．組換え動物細胞からのＳＮ−Ｃ
ＮＴＦの精製 ＳＮ−ＣＮＴＦは天然物質のように細胞により合成され
ることが予想されるので、天然タンパク質の精製のため
の上記方法により同様に組換えタンパク質の精製および
特性決定ができることが予想される。種々の改変および
変形が本発明の方法および産物になされうることは当業
者には明らかであろう。したがって、本発明は、この発
明の改変および変形が添付の請求の範囲およびそれらの
均等物の範囲内にあるならば、それら改変および変形を
包含することが意図される。また、ＳＮ−ＣＮＴＦなる
用語はその用語が特定の起源の種の直後にあるのでなけ
れば全ての起源の種を包含することが意図される。

【０１４８】実施例７．組換えヒトＣＮＴＦの生産 本発明のひとつの実施態様として、組換えヒトＣＮＴＦ
を生産する系を細菌Ｅ．コリ中に確立した。発現予定の
ＤＮＡを構築するためのふたつの代替方法および２個の
異なる発現ベクターが用いられた。これら変形発現系の
全ては細菌細胞抽出物中で生物学的に活性な溶性ＣＮＴ
Ｆタンパク質を高い収量で生産する。これらの生産系を
確立する方法を以下に記載する。次のものの中で注目し
ていただきたいのはカッコ内で示される特徴の位置（例
えば［２３３］）は、ＣＮＴＦのヒトコード配列中のＡ
ＴＧ開始コドン中のＡ［１］の下流でその特徴が始まる
塩基の番号であることを意味する（図１２）。

【０１４９】１．ＣＮＴＦ発現のためのＤＮＡ調製 ５′末端を構築するための方法１（図１４）：実施例４
のファージラムダＥＭＢＬ３中におけるＣＮＴＦのヒト
ゲノムＤＮＡクローンを制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎ
ｄ IIIで消化し、そしてＨｉｎｄ III部位［２３３］の
上流にあるＣＮＴＦコード配列を含有する４．３kbフラ
グメントをゲル精製した。この４．３kbフラグメントは
コード配列中に１個の約１．３kbイントロン［１１４−
１１５］をも含有する。細菌細胞中での発現を可能にす
るために、イントロンをJ. A. McClary, F. Whitney,
J. Geisselsoder (1989) Biotechniques 7:282-289 に
記載される合成オリゴヌクレオチドを用いてインビトロ
の特定部位の突然変異誘発により除去した。

【０１５０】Ａ．ファージミドベクターを用いる特定部
位の突然変異誘発によるイントロン欠失および遺伝子選
択 ファージミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＭ１
３（−）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）にサブクローンされ
た４．３kb ＳａｌＩ／Ｈｉｎｄ III ＤＮＡフラグメ
ント中の約１．３kbイントロンを欠失させるために特定
部位の突然変異誘発を行った。このベクターを選択した
のはそれが大きな寸法のＳａｌＩ／Ｈｉｎｄ III挿入物
（約４．３kb）を受容できるからであった。ファージミ
ドベクターは、一本鎖ＤＮＡとしての救出を可能にする
バクテリオファージｆ１遺伝子間領域を含有するプラス
ミドベクターである。

【０１５１】さらに、ファージミドベクターは一本鎖Ｍ
１３バクテリオファージベクターに比較して多数の利点
を有する。ファージミドは約２．３kb以下の寸法の挿入
物を好むＭ１３ベクターの寸法の半分以下なので、より
大きな挿入物がより簡単にファージミドにサブクローン
でき、自然欠失の機会が低下する。ファージミドのもう
ひとつの利点は、挿入物を二本鎖スーパーコイルＤＮＡ
から直接配列決定でき、それにより特性決定が簡素化で
きることである。

【０１５２】BioRadのMuta-Gene in Vitro Mutagenesis
キットを用いて突然変異誘発を行った。突然変異誘発用
鋳型調製物のための宿主細胞はＥ．コリ株ＣＪ２３６
（遺伝子型：ｄｕｔ，ｕｎｇ，ｔｈｉ，ｒｅｌ Ａｌ，
ｐＣＪ１０５［ｃａｐ^r ］）である。ＣＪ２３６はクロ
ラムフェニコールにより選択可能なＦ′ファクターを担
持しており、それにより本作業で用いられる適切なヘル
パーファージＲ４０８を用いて一本鎖ファージミドＤＮ
Ａの救出が可能となる。救出された一本鎖ファージミド
ＤＮＡはＣＪ２３６中のｄｕｔ（ｄＵＴＰアーゼ）およ
びｕｎｇ（ウラシルＮ−グリコシラーゼ）突然変異によ
りウラシルに部分的に置換される。ウラシルと置換され
突然変異誘発に用いられる鋳型ＤＮＡは、野生型ｕｎｇ
座を含有する宿主細胞、例えばこの場合ＤＨ５α、中に
形質転換された場合に選択的に破壊され、したがって新
しく合成された突然変異ＤＮＡの選択的複製が可能とな
る。

【０１５３】突然変異を行うためには、ゲル精製４．３
kb ＳａｌＩ／Ｈｉｎｄ IIIフラグメントを、ＳａｌＩ
／Ｈｉｎｄ III消化しゲル精製したＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫ Ｍ１３（−）に連結した。連結されたＤＮＡを
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７（１９８３）記
載のＨａｎａｈａｎの方法によりコンピテントとなした
ＣＪ２３６に導入した。形質転換体を５０ug／mlアンピ
シリン（ファージミドを選択するために）および３０ug
／mlクロラムフェニコール（Ｆ′−ファクター保持を選
択するために）を含有するプレートで選択した。形質転
換体ＤＮＡの制限酵素分析により、形質転換体を正しい
挿入物の存在に関して調べた。正しい挿入物を担持する
形質転換体（ｐＳＨＭ−Ｄ１９）を続く突然変異誘発実
験で用いた。

【０１５４】ｐＳＨＭ−Ｄ１９からの一本鎖鋳型はファ
ージＲ４０８をヘルパーファージとして用いて救出され
た。ｐＳＨＭ−Ｄ１９を含有するＣＪ２３６をアンピシ
リン（５０ug／ml）およびクロラムフェニコール（３０
μｇ／ml）を含有するＬｕｒｉａブロス中でＡ₆₀₀ が約
０．３となるまで増殖させた。細胞に感染多重度２０で
Ｒ４０８ヘルパーファージを感染させ、続いて３７℃で
８−１４時間振盪した。一本鎖鋳型を救出ファージミド
から抽出した。特定部位のイントロン欠失突然変異誘発
を７１塩基オリゴヌクレオチド（図１６のオリゴヌクレ
オチド１）を用いて行った。オリゴヌクレオチド１は、
ＣＮＴＦゲノムＤＮＡから欠失される予定のイントロン
のすぐ下流（３′）のコード鎖に相補的な塩基１−３０
およびすぐ上流（５′）のコード鎖に相補的な塩基３１
−７１を有する。

【０１５５】突然変異誘発反応で用いるためには、オリ
ゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てリン酸化した。BioRad MutaGene キットを用いる突然
変異誘発反応は製造業者の仕様書に従い行ったが、ただ
し突然変異誘発反応からのＤＮＡはＥ．コリ株ＤＨ５α
を形質転換するのに用いた。欠失変異株をＤＮＡの制限
酵素マッピングおよび適切な制限地図を有する変異株か
らの二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ配列決定により特性決定し
た。ｐＭＣＮ−２１はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミ
ド中で正確に欠失した、イントロンなしの突然変異体で
あった。

【０１５６】Ｂ．発現のためのＣＮＴＦ遺伝子の５′末
端の再構築 ＣＮＴＦコード配列の５′末端を、コードされるアミノ
酸配列を変化させないが細菌中での発現効率を増大させ
る可能性のあるいくつかの変化を起こさせるために再構
築した。一部分重複した相補的オリゴヌクレオチド２お
よび３（図１６）を合成し、ゲル精製しそして共にアニ
ールさせた。オリゴヌクレオチド２はＮｈｅＩ部位［６
６］の上流にあるヒトＣＮＴＦ中に存在するアミノ酸を
コードする。

【０１５７】オリゴヌクレオチド２のコード配列はヒト
遺伝子中に存在するものと異なるいくつかの塩基を含有
する（図１２および図１６を比較）。これらの変化はヒ
トコドン使用をＥ．コリに優先的に用いられるそれに変
える（deBoerおよびKastelein From Gene to Protein:
Steps Dictating the Maximal Level of Gene Expressi
on (1986) Davis およびReznikoff,編、pp.225-283, Bu
tterworths, NY、による）か、またはＢｇｌII部位（図
１６）を生成させて後続の遺伝子操作を容易にする配列
となすために行われた。

【０１５８】オリゴヌクレオチド２はまた効果的翻訳を
促進するために５′末端（図１６）の方向への翻訳カプ
ラーをコードする。アニールされたオリゴヌクレオチド
２および３は、続く連結およびクローニングを容易にす
るために５′末端のＢａｍＨＩオーバーハングおよび
３′末端のＮｈｅＩオーバーハングを有する（図１４お
よび図１６）。ヒトＣＮＴＦ遺伝子のＤＮＡ配列を制限
酵素調査すると、唯一のＮｈｅＩ認識配列［６６］が示
された（図１２）。したがって、オリゴヌクレオチド２
および３は、それらがＮｈｅＩで消化後、遺伝子の残留
３′フラグメントに結合できるようにＮｈｅＩオーバー
ハングを有するように設計された。

【０１５９】Ｃ．オリゴヌクレオチド２および３のイン
トロン欠失コード配列への結合 ＣＮＴＦ遺伝子の再構築アミノ末端を含有するオリゴヌ
クレオチド２および３を共にアニールしＮｈｅＩ切断ｐ
ＭＣＮ−２ａに連結させた。連結されたＤＮＡを次にＢ
ａｍＨＩおよびＨｉｎｄ IIIで消化して、Ｅ．コリでの
発現に好適でしかもＨｉｎｄ III部位［２３３］の上流
にヒトＣＮＴＦをコードするＤＮＡ配列を含有する、Ｃ
ＮＴＦ−Ｓｙｎ１と呼ばれるＤＮＡフラグメントを放出
させた。

【０１６０】５′末端構築のための方法２（図１５）：
イントロンが特定部位の突然変異誘発により除かれてお
らずむしろＨｉｎｄ III部位［２３３］の上流のＣＮＴ
Ｆをイントロンなしでコードする全合成ＤＮＡ配列が調
製される代替法を実施した。この合成ＤＮＡ構築物を形
成するために、図１７のオリゴヌクレオチド５−１０を
合成した。下記オリゴヌクレオチドは一部分が重複する
二本鎖対：５および６，７および８，９および１０を形
成するために設計された。各二本鎖対は５＆６−７＆８
−９＆１０の順序での連結を可能にするよう設計された
一本鎖オーバーハングを含有する。

【０１６１】オリゴヌクレオチドをゲル精製し、アニー
ルさせ、共に連結させて、ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２と称する
ひとつの２６１塩基対二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
となした。この合成ＤＮＡはまた（１）Ｅ．コリのコド
ン使用優先に合せるために変えたコドン（図１２および
１７を比較）、（２）先に用いられた５′翻訳カプラー
（図１６および１７）、および（３）連結およびクロー
ニングを容易にするための５′ＢａｍＨＩオーバーハン
グおよび３′Ｈｉｎｄ IIIオーバーハング（図１７）、
を含有した。

【０１６２】発現構築物の３′末端の調製（図１４また
は１５）：実施例４からのファージラムダＥＭＢＬ３中
のヒトゲノムＤＮＡ ＣＮＴＦクローンを制限酵素Ｈｉ
ｎｄ IIIで切断しそしてＨｉｎｄ III部位［２３３］下
流のＣＮＴＦコード配列を含有する２．１kbフラグメン
トをゲル精製した。この２．１kbフラグメントをＨｉｎ
ｄ III切断プラスミドｐＥＭＢＬ８（Dente ら、1983,
Nucleic Acids Res. 11:1645）中にクローン化した。Ｓ
ｐｅＩ部位［６１３］を、合成オリゴヌクレオチド４
（図１６）を用いるオリゴヌクレオチド指向突然変異誘
発により、２．１kb挿入ＤＮＡ中にＣＮＴＦ配列を終ら
せる終止コドンの１３塩基対下流に挿入した。突然変異
したプラスミドをＨｉｎｄ IIIおよびＳｐｅＩで切断し
て下流のコードフラグメントを放出させ、これをゲル精
製しそしてＣＮＴＦ Ｓｙｎ３と称した（Ｈｉｎｄ III
部位［２３３］の下流にヒトＣＮＴＦコード配列を含
有）。

【０１６３】完全な発現構築物の調製 それぞれがヒトＣＮＴＦをコードしておりそしてＥ．コ
リ中での効率的発現を促進する好適なＤＮＡ配列の修飾
を有するふたつの選択できるＤＮＡフラグメントを構築
するために、ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１をＣＮＴＦ−Ｓｙｎ３
に連結してＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３（図１４）を生成さ
せそしてＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２をＣＮＴＦ−Ｓｙｎ３に連
結してＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２／３（図１５）を生成させ
た。次にこれらのＤＮＡフラグメントを（Ａ）Ｔ７ファ
ージプロモーターに基づく細菌発現ベクターｐＴ５Ｔ；
または（Ｂ）ハイブリッドラクトースおよびトリプトフ
ァンオペロンプロモーター（‘Ｔａｃ’）に基づく細菌
発現ベクターｐＴ３ＸＩ−２；にサブクローン後、Ｅ．
コリ中で発現させた。

【０１６４】２．“Ｔ７プロモーター”系に基づく発現
ベクターを用いるＣＮＴＦの発現（このベクターの特徴
については図１７参照） Ａ．ｐＴ５Ｔの説明 Ｔ７プロモーターに基づく発現ベクターｐＴ５ＴはSqui
res ら、J. Biol. Chem. (1988) 263:16297-16302 記載
のｐＪＵ１００３と本質的に同じであるが、ただしＴ７
プロモーターの５′側の特有のＢｇｌII部位とテトラサ
イクリン耐性遺伝子中のＣｌａＩ部位との間に短いＤＮ
Ａ配列が存在する。このＤＮＡ配列は

【０１６５】

【化９】 である。

【０１６６】Ｂ．完全な発現ベクターの構築 ゲル精製ベクターをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ制限酵素
を用いて線状となした。ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３をこの
線状化したベクターと混合連結して発現構築物ｐＴ５
Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３を形成させた（ベクター構
築の一般的概略については図１４参照）。

【０１６７】Ｃ．Ｅ．コリでの組換えヒトＣＮＴＦの発
現 ｐＴ５Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３をＥ．コリ株ＢＬ２
１（ＤＥ３）中に形質転換して発現させた。Studier お
よびMoffat J. Mol. Biol. (1986) 189: 113-130 記載
のこの株は切出しできない溶原性ラムダバクテリオファ
ージ上のＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの制御下に
あるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する。スクリ
ーンした１０個の形質転換体のうち、２個のクローンが
ＣＮＴＦ（約２４KD）に適する範囲内の分子量で移動す
る、ＩＰＴＧ誘導性タンパク質を発現することがわかっ
た。これらの２クローンをｐＴ５Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ
１／／３−５ａおよび５ｃと称した。ｐＴ５Ｔ：ＣＮＴ
Ｆ−Ｓｙｎ１／３−５ａおよび５ｃのＤＮＡ配列決定に
より、組換え体の配列が正しいことが確認された。

【０１６８】組換えＣＮＴＦの高レベル発現は、細胞を
Ａ₆₀₀ ０．５−０．８に相当する細胞密度となるまで１
５μｇ／mlテトラサイクリン含有Ｌｕｒｉａブロス中で
増殖させることにより達成された。細胞をＩＰＴＧなし
（誘導なし）またはＩＰＴＧを最終濃度１．０mMとなる
まで加えて（誘導あり）１．５−４時間増殖させた。Ｉ
ＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）はｌａｃオペロンのインデューサーであり、その存
在により発現ベクターＴ７ポリメラーゼの間接的活性化
およびＣＮＴＦ発現レベルの増大を生じる筈である。

【０１６９】Ｄ．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動とそれに続くクーマシー染色またはイムノブロットに
よる発現タンパク質の分析 細胞を短時間の遠心により収穫しそしてＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル試料緩衝液（０．０２５％ブロモフェ
ノールブルー、１０％グリセロール、１％β−メルカプ
トエタノール、２％ＳＤＳ、０．０６２５Ｍ トリス−
ＨＣｌ、ｐＨ６．８）中に直接溶解させそして２分間煮
沸した（図２０および２１）。ｐＴ５Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓ
ｙｎ１，３−５ａで形質転換しＩＰＴＧで２時間誘導し
た細胞において（図２０、レーン５）、ＣＮＴＦ（約２
４KD）と予想される位置で移動する、クーマシー染色で
濃く染色された１本のバンドがある。

【０１７０】細胞をＩＰＴＧなしで増殖させた場合（図
２０、レーン４）、タンパク質の発現はｌａｃオペロン
の制御下にあるタンパク質について予想されるように、
このバンドはずっとうすい。ＣＮＴＦ挿入物なしのｐＴ
５Ｔベクターで形質転換された細胞は誘導されても（図
２０、レーン３）または誘導なしでも（図２０、レーン
２）、このバンドを示さない。レーン１は分子量標準物
を含有する。

【０１７１】同一のＳＤＳポリアクリルアミドゲルをニ
トロセルロースに移しそしてＣＮＴＦペプチドＡ（Ｅ−
Ｓ−Ｙ−Ｖ−Ｋ−Ｈ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｎ−Ｋ−Ｎ）に対す
るアフィニティ精製抗体でイムノブロットした。ｐＴ５
Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１，３−５ａで形質転換しＩＰＴ
Ｇで２時間誘導した細胞においては（図２１、レーン
５）、ＣＮＴＦペプチドＡに対するアフィニティ精製抗
体により認識されかつＣＮＴＦ（約２４KD）で予想され
る位置で移動する１本の濃いバンドがある。細胞をＩＰ
ＴＧなしで増殖させる場合（図２１、レーン４）、この
バンドはずっとうすい。ＣＮＴＦ挿入物なしのｐＴ５Ｔ
ベクターで形質転換した細胞は誘導されても（図２０、
レーン３）または誘導なしでも（図２０、レーン２）も
このバンドを示さない。レーン１は分子量標準物を含有
する。

【０１７２】さらに、ｐＴ５Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１，
３−５ａで形質転換しＩＰＴＧで２時間誘導した細胞を
フレンチ受圧セルに３回通すことにより破壊した。粗製
細胞溶解物の一部分をＪＡ−２０ロータ（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）中２０，０００rpm で１５分間遠心することにより
上清とペレットフラクションに分離した。同量の出発細
胞懸濁物を表わす粗製溶解物の一部分、上清およびペレ
ットフラクションも同じＳＤＳポリアクリルアミドゲル
上で泳動し、ニトロセルロースに移行させそしてアフィ
ニティ精製抗−ペプチドＡ抗体でイムノブロットした。
溶解物上清（図２１、レーン８）は溶解物ペレット（図
２１、レーン９）よりもはるかに多くの免疫反応性ＣＮ
ＴＦを含有した。上清ＣＮＴＦレベルは分別されていな
い溶解物（図２１、レーン７）中のそれと同等であっ
た。

【０１７３】Ｅ．発現ＣＮＴＦの生物活性 短時間の遠心により収穫された細胞を、初めの細胞懸濁
物容量の１／３５で２０mMトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．２
中に再懸濁し、フレンチ受圧セルに３回通すことにより
破壊し、そして粗製細胞溶解物をＪＡ−２０ローター中
（Ｂｅｃｋｍａｎ）２０，０００rpm で１５分間遠心す
ることにより上清およびペレットフラクションに分離し
た。細胞上清フラクションの連続希釈物を毛様体神経節
細胞の生存を促進する能力についてアッセイした（実施
例１記載）。上清は１：１，０００，０００の希釈度ま
で有意な生物活性を示した（図２２）。組換えヒトＣＮ
ＴＦの比活性は生物活性およびイムノブロットから概算
されたＣＮＴＦタンパク質の量に基づき、約２７５／TU
／ngであると概算された。

【０１７４】この比活性は精製ウサギＣＮＴＦタンパク
質の約２倍であり、このことは組換えＣＮＴＦが細菌細
胞抽出物中で生物学的に活性であることを示している。
ＣＮＴＦ挿入物なしのｐＴ５Ｔで形質転換した細胞の溶
解物は検出できる程の生物活性を全く示さなかった。上
清はまた、１５％ポリアクリルアミド還元型ＳＤＳゲル
上で電気泳動しそして１mm幅スライスにうすく切り、こ
れらスライス片を揺動しながら４℃で細胞培養培地中で
一夜抽出しそして実施例１に記載されるようにしてバイ
オアッセイした。図２２の挿入図は、ＣＮＴＦについて
予想される２４KDに相当するフラクションでひとつの生
物活性ピークがあることを示す。

【０１７５】Ｆ．発現ＣＮＴＦのアミノ酸配列 ２４KD近くの領域をクーマシー染色なしで図２０で行っ
たと同様のＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切り出し
た。この物質をApplied Biosystems Protein Sequencer
（実施例２に記載）でエドマン分解により配列決定し
た。下記アミノ酸配列が得られた：ＡＦＴＥＨＳＰＬＴ
ＰＨＲＲＤＬ［？］Ｓ．．．．クェスチョンマークはヒ
ト配列中でＣに相当し（図１２）この方法では検出でき
ない。

【０１７６】この配列はヒトＣＮＴＦから予想されるそ
れに相当し（図１２）そしてＣＮＴＦが適切に発現され
ているというもうひとつの証拠を提供する。またアミノ
末端メチオニンが発現中に取り除かれ、発現されたタン
パク質中でアミノ末端アミノ酸としてアラニンが残るこ
とも示している。上記結果は、免疫学的に交差反応性で
あるＣＮＴＦが生物学的に活性な形態で高レベルで発現
され、その大部分が細菌細胞の溶菌後可溶性であること
を示している。

【０１７７】３．ハイブリッドラクトースおよびトリプ
トファンオペロンプロモーター（‘Ｔａｃ’）系に基づ
く発現ベクターを用いるＣＮＴＦの発現（ベクターの特
徴については図１９参照） Ａ．ｐＴ３ＸＩ−２の説明（ｐＫＫ２２３−３の改変） この構築物のための出発プラスミドはPharmacia から購
入したプラスミドｐＫＫ２２３−３であった。プラスミ
ドｐＫＫ２２３−３はテトラサイクリン耐性遺伝子の一
部を担持している。機能しないこの遺伝子をプラスミド
ｐＢＲ３２２が担持する完全なテトラサイクリン耐性遺
伝子と取り替えた。プラスミドｐＫＫ２２３−３をＳｐ
ｈＩで完全にそしてＢａｍＨＩで部分的に消化した。
４．４キロ塩基対フラグメントをゲル精製し、そして配
列：

【０１７８】

【化１０】

【０１７９】を有する合成アダプター、およびｐＢＲ３
２２（PL Biochemicals, 27-4891-01）のテトラサイク
リン耐性遺伝子のＣｌａＩ，ＳｐｈＩ消化物からのＤＮ
Ａの５３９塩基対フラグメントと結合させた。生成する
プラスミドをｐＣＪ１と称した。次にNew England Biol
abs から購入したＸｈｏＩリンカーをプラスミドｐＣＪ
１のＰｖｕII部位に挿入してプラスミドｐＣＪＸ−１を
形成させた。この挿入によりプラスミドコピー数を制御
するｒｏｐ遺伝子が破壊される。ｌａｃＩ遺伝子を含有
するＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドｐＭＣ９［Ca
los ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 80:3015
-3019 ］から精製し、続いて配列：

【０１８０】

【化１１】 を有するＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩアダプターを用いてＸｈ
ｏＩ部位に挿入した。次にプラスミドｐＫＫ２２３−３
のＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ部位間のポリリンカー配列を以
下に示すポリリンカー配列：

【０１８１】

【化１２】 で置換した。このようにして得られたプラスミドベクタ
ーをｐＣＪＸＩ−１と呼ぶ。

【０１８２】最後にテトラサイクリン耐性遺伝子を、制
限酵素Ｈｉｎｄ III、ＢａｍＨＩ、およびＳａｌＩの認
識部位を重亜硫酸塩突然変異誘発により破壊した同様の
遺伝子と置換した。次の操作を用いてｐＢＲ３２２のテ
トラサイクリン耐性遺伝子を突然変異させた。プラスミ
ドｐＢＲ３２２をＨｉｎｄ IIIで切断し、続いて重亜硫
酸ナトリウムで突然変異誘発した［Shortle およびNath
ans, Proc. Natl. Acad. USA (1978) 5:2170-2174 ］。
突然変異したＤＮＡを連結して環状ＤＮＡを形成させ、
次にＨｉｎｄ IIIで切断して突然変異誘発をのがれたす
べてのプラスミドを線状にした。Ｅ．コリＪＭ１０９
［Yanisch-Perronら、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０
３−１１９］をこのプラスミドで形質転換し、次に選択
培地に塗布した。

【０１８３】プラスミドをテトラサイクリン耐性コロニ
ーから単離し、そしてテトラサイクリン耐性遺伝子中の
Ｈｉｎｄ III部位がなくなっているか調べた。うまく突
然変異したプラスミドをｐＴ１と命名した。次に同様の
操作を行ってｐＴ１のＢａｍＨＩ部位を突然変異誘発さ
せ、プラスミドｐＴ２を生成させた。プラスミドｐＴ２
を次に突然変異させてＳａｌＩ部位を取り除き、プラス
ミドｐＴ３を形成させた。突然変異したテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を担持するｐＴ３のＣｌａＩ／ＢｓｍＩフ
ラグメントを単離し、そしてｐＣＪＸＩ−１の相同フラ
グメントと置き代えてｐＴ３ＸＩ−２を形成させた。突
然変異したテトラサイクリン耐性遺伝子はなお機能性タ
ンパク質をコードしている。

【０１８４】Ｃ．ｐＴ３ＸＩ−２φ１０ＴＣ３ＦＧＦｓ
ｙｎの形成（ＣＮＴＦ用のｔａｃプロモーターベクター
の調製） 最初に塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）“遺伝
子”を合成した。この“遺伝子”はSommerら、（1987 B
iochem. Biophys. Res. Commun. 141:67）によりＦＧＦ
について報告されたと同じ配列をコードするがＥ．コリ
中で高度に発現される遺伝子中に優先的に見出されるコ
ドンを用いる。この遺伝子の構造はコード部分が翻訳の
効率的開始を確実なものとするために後に来るようにな
っている（Squires ら、１９８８、同上）。ＦＧＦ合成
遺伝子をはじめにＭ１３mp１８のＥｃｏＲＩおよびＨｉ
ｎｄ III部位の間に挿入しそして配列決定した。この遺
伝子の構造は

【０１８５】

【化１３】

【０１８６】

【化１４】 であった。遺伝子の関連する特徴を強調してある。

【０１８７】それを次にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ III
で消化することにより単離しそしてＢａｍＨＩ／Ｈｉｎ
ｄ III切断ｐＪＵ１００３に挿入して（Squires ら、１
９８８、同上）ｐＪＵ１００１００３−ｓｙｎＦＧＦを
生成させた。このプラスミドをＸｂａＩおよびＨｉｎｄ
IIIで切断し、ＦＧＦ遺伝子を担持するＸｂａＩ／Ｈｉ
ｎｄ IIIフラグメントを単離した。このフラグメントを
ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩリンカー：

【０１８８】

【化１５】 を用い、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ IIIで切断したｐＴ
３ＸＩ−２中に連結した。新しいプラスミドをｐＴ３Ｘ
Ｉ−２φ１０ＴＣ３ＦＧＦｓｙｎと命名した。

【０１８９】Ｄ．ＣＮＴＦ発現構築物のＴａｃプロモー
ターベクターへの挿入 ｐＴ３ＸＩ−２φ１０ＴＣ３ＦＧＦｓｙｎをＢａｍＨＩ
およびＳｐｅＩで切断すると、７．４kb発現ベクターの
線状化および約０．５kb ＦＧＦ ＤＮＡフラグメント
が放出された。別の反応で、ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３お
よびＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２／３を、ゲル精製ＢａｍＨＩ／
ＳｐｅＩ切断ベクターＤＮＡフラグメント中に挿入して
プラスミドｐＴ３ＸＩ−２：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３お
よびｐＴ３ＸＩ−２：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２／３を生成さ
せた。

【０１９０】Ｅ．Ｅ．コリ中での発現 ｐＴ３ＸＩ−２：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３をファージ耐
性Ｅ．コリＫ株ＪＭ１０７中に形質転換した。１４個の
形質転換体を増殖させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動およびクーマシーブリリアントブルーでの染色
によりＣＮＴＦ発現について分析した。４形質転換体が
ほぼＣＮＴＦの位置で濃く染色されたバンドを示した。
組換えＣＮＴＦの高レベル発現は、Ａ₆₀₀ ０．８に相当
する細胞密度まで１５μｇ／mlテトラサイクリン含有Ｌ
ｕｒｉａブロス中で細胞を増殖させることにより達成さ
れた。ＩＰＴＧを最終濃度１．０mMになるまで添加しそ
して細胞を２時間増殖させた。これら４形質転換体全て
がクーマシー染色およびイムノブロットゲルの両方でほ
ぼ同じＣＮＴＦ密度を示した。

【０１９１】これらのゲルに基づいた、これら形質転換
体中のＣＮＴＦ発現のみかけ上のレベルは、前にテトラ
サイクリン中で増殖させたｐＴ５Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ
１／３−５ａにより示されるレベルの約１／４であっ
た。この細胞懸濁物の７mlを、大きなフラスコ中のＬｕ
ｒｉａブロス５０ml当り加えそしてＡ₆₀₀ が約０．５に
達するまで振盪しながら３７℃で増殖させた。次に０．
５mMの最終ＩＰＴＧを加えてＣＮＴＦの発現を誘導し、
Ａ₆₀₀ が約１．２に達するまで（通常４−６時間）増殖
を続けた。細胞をＪＡ−２０ローター、７０００rpm 、
４℃で５分間の遠心により収穫し、４℃にて５０mMリン
酸塩緩衝液、ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）中で遠心すること
によりもう一回洗浄した。上清を取り除き、細胞ペレッ
トをペーストとして−２０℃で凍結する。

【０１９２】細胞ペーストを緩衝液Ｂ［１mM ＥＧＴＡ
（エチレングリコール−ビス（−アミノエチルエチルエ
ーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸）および１mM
ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を含有する
緩衝液Ａ］中に０．５gmペースト／ml緩衝液で４℃で懸
濁しそしてフレンチ受圧セル中に３回通すことにより細
菌を破壊する。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を最終濃
度０．２５％となるまで加え、４℃で３０分間振盪す
る。沈澱は微量遠心管中でトップスピードで１５分間遠
心することにより除去する。この工程はＡ₂₆₀ ／Ａ₂₈₀
の比率により測定して核酸含量を約２５％から５％以下
に通常減少させる。

【０１９３】試料を次に緩衝液Ｂで平衡化したＱセファ
ロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムに注いだ。ＣＮ
ＴＦはフレンチプレスされた細胞溶解物の主要成分なの
で、クロマトグラフィー期間中に、カラムフラクション
のクーマシーブリリアントブルー染色ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルを行うことができる。ＣＮＴＦは約２４KD
の主要なクーマシー染色バンドである。このアッセイを
用いて、ＣＮＴＦは緩衝液Ｂ中でＱセファロースカラム
から洗い落とされる。

【０１９４】ＣＮＴＦタンパク質の大部分を含有する洗
浄フラクションをプールし、緩衝液Ｃ（１mM ＥＧＴＡ
および１mM ＥＤＴＡを含有する５mMリン酸塩緩衝液、
ｐＨ８．０）で透析しそして緩衝液Ｃで平衡化したＱセ
ファロースカラムに注いだ。カラムをＡ₂₈₀ がベースラ
インに戻るまで緩衝液Ｃで洗う、このことは非吸着性タ
ンパク質がカラムから洗い出されたことを示す。緩衝液
Ｃ中で、ＣＮＴＦはＱセファロースカラムに結合し次に
緩衝液Ｃ中の０−０．１Ｍ ＮａＣｌグラジェントで溶
出された。ＣＮＴＦは約４０mM ＮａＣｌでカラムから
現われ、そしてピークＣＮＴＦフラクションのクーマシ
ー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから判断して９０
％以上の純度である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｍｏｎｏ Ｐカラムによるクロマトグ
ラフィーの代表的な結果を示す。

【図２】図２は、電気泳動後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルか
ら切り出した７つのゲル片のそれぞれからの溶出物中の
神経栄養活性の分布のプロットを例示する。

【図３】図３は、逆相クロマトグラフィーの代表的な結
果を示す。

【図４】図４は、図３に示した神経栄養活性のピークを
含めてそれに隣接したフラクションに等しいフラクショ
ンに対する銀染色した還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動
の代表的な結果を示す。

【図５】図５は、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎで消化
後の溶出ペプチドのプロフィールを示す。

【図６】図６は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃで消化
後の溶出ペプチドのプロフィールを示す。

【図７】図７は、フェニルセファロースＨＩＣカラムで
の硫酸アンモニウムフラクションのクロマトグラフィー
の代表的な結果を示す。

【図８】図８は、アルキル−スペロース（Ｓｕｐｅｒｏ
ｓｅ）ＦＰＬＣ−ＨＩＣカラムでのＭｏｎｏ Ｐクロマ
トフォーカシングフラクションのクロマトグラフィーの
代表的な結果を示す。

【図９】図９は、Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムでの調整用Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥフラクションのクロマトグラフィーの代
表的な結果を示す。パネル（Ａ）もとの精製方法の結果
を示す。パネル（Ｂ）は２つのＨＩＣクロマトグラフィ
ー工程を加えた後の現在の精製方法の結果を示す。

【図１０】図１０は、逆相精製したＳＮ−ＣＮＴＦのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析の代表的
な結果を示す。２つのパネルのそれぞれのレーン１は分
子量標準タンパク質（ＳＩＧＭＡ ＳＤＳ−７）を含有
する。レーン２は精製ＳＮ−ＣＮＴＦを含有する。パネ
ル（Ａ）は銀染色の結果を示す。パネル（Ｂ）はアフィ
ニティ精製抗−ペプチドＡ抗体を用いるウェスタンブロ
ット分析の結果を示す。

【図１１】図１１は、ウサギＳＮ−ＣＮＴＦをコードす
る核酸配列を示す。この核酸配列の翻訳は一文字表記で
下に示した対応アミノ酸配列を生ずる。下線が引いてあ
る配列はＳＮ−ＣＮＴＦタンパク質から得られたアミノ
酸配列により確認された。

【図１２】図１２は、ヒトＣＮＴＦをコードする核酸配
列および対応するアミノ酸配列（三文字表記）を示す。
ヒト配列は線と線の間に示してある。ウサギ核酸または
アミノ酸配列がヒトと異なる場合、それらはそれぞれ線
の上と下に示される。

【図１３】図１３は、ｐＣＭＶＸＶＰＬ２発現ベクター
の構築を示す。

【図１４】図１４は、ＣＮＴＦ発現用のＣＮＴＦ−Ｓｙ
ｎ１／３を構築するために使用した方法を示す。図面は
描写的であり、一定の比率で描かれていない。実験の細
部については実施例７を参照されたい。

【図１５】図１５は、ＣＮＴＦ発現用のＣＮＴＦ−Ｓｙ
ｎ２／３を構築するために使用した方法を示す。図面は
描写的であり、一定の比率で描かれていない。実験の細
部については実施例７を参照されたい。

【図１６】図１６は、ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３およびＣ
ＮＴＦ−Ｓｙｎ２／３の構築に用いた合成オリゴヌクレ
オチド１−４を示す。

【図１７】図１７は、ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２／３の構築に
用いた合成オリゴヌクレオチド５−１０を示す。

【図１８】図１８は、ＣＮＴＦの発現に適したＤＮＡ挿
入物を含有するｐＴ５Ｔ細菌発現ベクターのいくつかの
特徴を示す。図面は描写的であり、一定の比率で描かれ
ていない。実験の細部については実施例７を参照された
い。

【図１９】図１９は、ＣＮＴＦの発現に適したＤＮＡ挿
入物を含有するｐＴ３ＸＩ−２細菌発現ベクターのいく
つかの特徴を示す。図面は描写的であり、一定の比率で
描かれていない。実験の細部については実施例７を参照
されたい。

【図２０】図２０は、種々の発現構築物で形質転換した
細胞の抽出物を電気泳動にかけ、クーマシーブリリアン
トブルーで染色した還元型ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルを示す。

【図２１】図２１は、種々の発現構築物で形質転換した
細胞の抽出物を電気泳動にかけ、アフィニティ精製抗−
ＣＮＴＦペプチドＡ抗体でイムノブロットした還元型Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。

【図２２】図２２は、ｐＴ５Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／
３またはｐＴ３ＸＩ−２：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ２／３を発
現する細菌細胞からの上清の連続希釈物のバイオアッセ
イを示す。挿入図は２４KDのすぐ上と下のゲル領域にお
けるｐＴ５Ｔ：ＣＮＴＦ−Ｓｙｎ１／３上清の還元型Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲルからの抽出切片のバイオア
ッセイを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/30 15/00 ＺＮＡＡ 38/22 ＡＡＢ Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＡＢ ＡＡＭ ＡＡＭ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ミスマー，ドルジスラヴ アメリカ合衆国 コロラド州 80303，ボ ウルダー，ベントハヴェン 76 (72)発明者 コ，クリスティーヌ アメリカ合衆国 コロラド州 80303，ボ ウルダー，カッド パークウェイ 3880

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質 （１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい
   て約２４，０００の分子量を示す； （２）２×１０⁸ ＴＵ／mg以上の比活性を有する；及び （３）生物活性がＳＤＳ及び還元剤に対して抵抗性であ
   る；を有することを特徴とするタンパク質を含んで成
   る、実質的に精製されたタンパク質坐骨神経毛様体神経
   栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）。
2. 【請求項２】 天然坐骨神経抽出物の比活性よりも２
   ５，０００倍以上高い比活性を有する実質的に精製され
   た請求項１に記載の坐骨神経毛様体神経栄養因子（ＳＮ
   −ＣＮＴＦ）。
3. 【請求項３】 単一タンパク質種を含んでなる、実質的
   に精製された請求項１に記載の坐骨神経毛様体神経栄養
   因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）。
4. 【請求項４】 ヒト由来の、請求項１〜３のいずれか１
   項に記載の坐骨神経毛様体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴ
   Ｆ）。
5. 【請求項５】 ウサギ由来の、請求項１〜３のいずれか
   １項に記載の坐骨神経毛様体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮ
   ＴＦ）。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の坐
   骨神経毛様体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）の製造方
   法において、該因子を含有する生物材料から該因子を単
   離・精製することを特徴とする方法。
7. 【請求項７】 次のアミノ酸配列： 【化１】 から実質上成るアミノ酸配列を有するヒト坐骨神経毛様
   体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）、又は次のアミノ酸
   配列： 【化２】 から実質上成るアミノ酸配列を有するウサギ坐骨神経毛
   様体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）、の製造方法にお
   いて、該因子をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベク
   ターにより形質転換された細菌を培養し、そして生物活
   性を有する坐骨神経毛様体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴ
   Ｆ）を得ることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 前記細菌がＥ．コリである請求項７記載
   の方法。
9. 【請求項９】 神経抽出調製物から坐骨神経毛様体神経
   栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）を精製する方法において、 （１）神経抽出調製物を酸処理および硫酸アンモニウム
   分画化にかけ； （２）酸処理および硫酸アンモニウム分画化した調製物
   をクロマトフォーカシングし； （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで調製物を泳動させ；そし
   て （４）逆相ＨＰＬＣを行う；ことを含んでなる方法。
10. 【請求項１０】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで調製物を泳動
    させる工程に先立ち、硫酸アンモニウム分画化とクロマ
    トフォーカシングの間の疎水性相互作用クロマトグラフ
    ィー；およびクロマトフォーカシングと調製用ＳＤＳ−
    ＰＡＧＥの間のＦＰＬＣ疎水性相互作用クロマトグラフ
    ィー；をさらに行う精製工程を包含する請求項９に記載
    の方法。
11. 【請求項１１】 次のアミノ酸配列： 【化３】 から実質上成るアミノ酸配列を有するヒト坐骨神経毛様
    体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）をコードする核酸の
    導入により形質転換された、ヒト坐骨神経毛様体神経栄
    養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）を生産することができる組換
    え細菌。
12. 【請求項１２】 次のアミノ酸配列： 【化４】 から実質上成るアミノ酸配列を有するウサギ坐骨神経毛
    様体神経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）をコードする核酸
    の導入により形質転換された、ウサギ坐骨神経毛様体神
    経栄養因子（ＳＮ−ＣＮＴＦ）を生産することができる
    組換え細菌。
13. 【請求項１３】 前記細菌がＥ．コリである請求項１１
    又は１２に記載の細菌。