JPH02145967A - ビオチン架橋および万能固相を利用するイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固相支持体上に固定した種と、液体中に溶解
または懸濁させた種との間の免疫結合を包含した異種イ
ムノアッセイ（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）に関する。よ
り詳細に述べれば、本発明はビオチンと抗ビオチンとの
相互作用においてビオチンを利用する異種イムノアッセ
イに関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕アボッ
ト　ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）は、１９８５年１１月１３日刊行の欧州特
許出願第１６０９００号明細書において、アビジンを使
用しないビオチンを含む生体特異的アッセイを開示して
いる。このアッセイでは、アビジンに関する諸問題（す
なわちアビジンの高度の塩基性や酵素標識に対する破壊
作用、アビジン／ビオチン複合体に関する立体障害等）
に悩まされる事なく、ビオチン架橋の利点（ｂｉｏｔｉ
ｎ　　ｂｒｉｄｇｅ）を活用できる。

上記出願において開示されている方法では、試料リガン
ト（ｌｉｇａｎｄ）とトレーサー保有結合物質（リガン
トに対して特異的である標識抗体よりもむしろ標識を施
された抗ビオチン）との間に、ビオチニル化された抗体
が介在する。ビオチニル化抗体とトレーサー保有結合物
質は共に、アッセイ期間中に固相上に固定される抗リガ
ントと結合する内側とは逆のリガント外側に位置する。

二のアッセイの短所として、対象となるリガントに特異
的な抗体を固定した固相を必要とするため、それぞれの
タイプのリガントについて別個の固相を１作成しなけれ
ばならない点が挙げられる。

更に、こうした方法を用いた直接イムノアッセイでは、
過剰の固相結合部位が必要とされる。抗リガントの作成
費は比較的高価であるため、経済的に固相上に置く事が
できる結合部位の数が制限され、ひいてはアッセイの検
出範囲が限られてしまう事になる。

（課題を解決するための手段〕 本発明は、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）の出願に開示され
ている様なビオチン架橋アッセイの利点を損なう事なく
ビオチン架橋を用いてすべてのリガントに共通する固相
を使った新規のアッセイ法やアッセイ材料を提供するも
のである。本発明のアッセイでは、対象となるリガント
に対する特異的結合親和性を有するビオチニル化された
結合物質を、表面に抗ビオチン抗体を固定した固体支持
体よりなる固相と反応させる。これによってリガントは
結合物質に捕獲される。次にリガントの存在とその量の
検出を目的として、既知の「サンドインチ法」または「
競合結合法」のいずれかに類領した方法によって、標識
された結合物質を導入する。本発明のアッセイでは、ビ
オチン％がリガントの標識側ではなく固相側に位置して
いるため、あらゆるリガントに対してその免疫結合特異
性とは関係なく単一の万能固相を用いる事ができる。更
にビオチン架橋が固相側に位置している事によって、固
相のリガント捕獲部位許容能力が増加し、アッセイ感度
が上昇し、検出範囲が拡大し、かついずれのアッセイ・
キットにおいても必要とされる材料のコストが低減でき
る。

本明細書において使用する「リガント」という語は、そ
れに対する特異的結合物質が存在する分子物質を意味す
る。リガントの例としては、抗原、抗体およびハブテン
、特にホルモンとそのレセプター、その他の抗原、ウィ
ルス、感染症剤、植物蛋白質、その他の蛋白質ならびに
デオキシリボ核酸が挙げられる。本発明の成る種の実施
例においては、少な（とも２個の結合部位を有し、また
これらの結合部位の特異性が明らかに互いに異なってい
るところのリガントが好ましい。

本明細書において使用する「結合部」という語は、他の
種と生体特異的結合、特に免疫結合を形成する事ができ
る種を意味する。「結合部」の例としては、抗原、抗体
、抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦａｂ’）、レセプ
ター、ヘプタン、更にはこれらの種の修飾体、類似体、
接合体等が挙げられる。

「固体支持体ｊという語は、特に非特異的結合または共
有結合によって抗体を固定する事ができる固体物質を意
味する。「固体支持体」の例としては、ビーズ、試験管
、マイクロタイター・プレート、ニトロセルロース・シ
ート、誘導ペーパーおよびガラス、ならびに生体特異的
アッセイに用いられるすべての既知の固相物質が挙げら
れる。

本明細書において使用する「検出可能な標識」という語
は、視覚による観察または機器を用いた技法によって、
その存在がシステム中のその他のすべての種と明確に識
別できるところの分子、分子の一部、または原子を意味
する。この様な標識の例としては、比色活性、蛍光活性
および放射活性を用いて検出できるものが挙げられる。

標識物質自体の例としては、酵素、蛍光種、放射性同位
元素が挙げられる。

本発明の上記以外の利点や好ましい実施例は、以下の記
述によって明らかになるであろう。

本発明において使用するビオチニル化された結合部とは
、ビオチンと上記の結合部との接合体である。この接合
体は、結合部が少なくとも実質的な量の結合親和性を有
し、かつビオチン部分が抗ビオチンに充分に接近して両
者の間に免疫結合が生じる場合に形成される。ビオチニ
ル化結合種は、検出すべきリガントに対して特異的であ
る。リガントが抗原またはハブテンである場合、ビオチ
ニル化結合種はこのリガントに対して特異的な抗体であ
る。一方、リガントが抗体である場合は、ビオチニル化
結合種は、それに対してリガントが特異的である抗原か
、あるいはリガント抗体に対して特異的である抗体のい
ずれかである。

α−およびβ−サブユニットまたは鎖を含有する抗原リ
ガントに対するビオチニル化種は、α−サブユニットま
たはβ−サブユニットのどちらかに対して特異的な抗体
である。この様なサブユニットを両方保有し、そのうち
の１個（特にβ−サブユニット）が異なるホルモンに対
しては、共通のサブユニット（例えばα−サブユニット
）に対して特異的である共通のビオチニル化結合種と、
β−サブユニットに対して特異的であるため個々のホル
モンごとに異なる標識種とを併用すればよい、また逆の
状況も考えられる。すなわち、ビオチニル化結合種がβ
−サブユニットに対して特異的であるため個々のホルモ
ンごとに異なり、標識種がα−サブユニットに対して特
異的であり、すべてのホルモンに共通のものでもよいわ
けである。

α−サブユニットおよびβ−サブユニットを含有するリ
ガントの例としては、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈ
ＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモ
ン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）が挙げられ
る。

同様に、標識種とは抗原、抗体、ハプテン等の検出可能
な標識を有する結合１種である。標識種はリガントおよ
びアッセイの性質に基づいて選択する。直接的アッセイ
またはサンドインチ・アッセイの場合、標識種は生体特
異的様式によってリガントと結合している。一方、間接
的アッセイまたは競合アッセイ（阻害タイプ）の場合は
、標識種はリガントに対する親和性に匹敵する（好まし
くは実質上同等の）ｍ相性でもって生体特異的様式によ
ってビオチニル化結合種と結合している。

アッセイ自体は、サンドインチ法または競合法のいずれ
かの慣用的方法で実施できる。サンドインチ法の場合、
固相上にリガントに対して過剰の結合部位を供給し、リ
ガント自体に対して結合特異性を有する標識種を用いる
。従って、試料中のすべてのリガントがビオチニル化結
合種を介して固相に結合し、こうして結合したリガント
の各分子が更に標識結合部に結合する。このため、抗ビ
オチンおよびビオチニル化結合種を介して固相に結合し
ているリガントの量と正比例する量の標識が固定される
わけである。従って、面相を残存する未固定標識と分離
する際には、固相上の標識量が試料中に元来存在してい
たリガントの量と正比例しているとみなす事ができる。

代表的な競合アッセイ（「間接的」または「阻害型」イ
ムノアッセイとも呼ばれる）においては、限られた数の
結合部位を有する面相を使用し、標識種はリガントの類
似体であり、リガントと共に固相上にはるかに多数の有
効結合部位を有するものとする（固相上に付着した抗ビ
オチンを介して固定されたビオチニル化結合種）。標識
種（すなわちリガント類似体）は試料に由来するリガン
トとは結合しないため、標識種の測定値は試料中に存在
するリガント量の間接的な指標となる。競合的結合によ
って、試料由来のリガントと固相上に固定されたビオチ
ニル化結合種に結合したその標識類似体との相対比は、
系全体における相対比と等しい、従って、あらかじめ選
定された所定量の標識類似体を使用する事によって、固
相中の最終的な比率に基づいて試料中に存在するリガン
トの量を示す値を決定する事ができる。検出を行うには
、結合した種を溶液中に残存する種がら分離し、固相中
に存在する！１！識物質または溶液中に残存する標識物
質のどちらかを定量すればよい０面相中の標識物質量を
測定するほうが好ましい。この量は、試料中に存在する
リガントの量に反比例する。

サンドインチ法の場合、ビオチニル化結合種と標識種の
双方が抗体であってもよい、この様なケースでは、両者
はいずれも検出しようとするリガントに対して特異的で
ある。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ある
いはその両方のいずれも使用可能である。サンドイッチ
・アッセイにおいては、これらの２種の抗体がリガント
上の異なる２種のエピトープまたは結合部位に対して特
異的である事が好ましい。例えば上記α−鎖およびβ−
鎖を含有するリガントのアッセイの場合、ビオチニル化
抗体はα−鎖に対して特異的であり、一方標識抗体はβ
−鎖に対して特異的なものとする。特に好ましいアッセ
イ・システムとしては、ビオチニル化抗体がα−鎖に対
して特異的なポリクローナル抗体であり、標識抗体がβ
−鎖に対して特異的なモノクローナル抗体であるものが
挙げられる。当然ながら、前記ポリクローナル抗体はα
−鎖または免疫結合特異性から見て実質上これと同等の
鎖を含有するすべてのリガントに対して共通して用いら
れ、一方標識抗体は試料アッセイの対象となる特定のホ
ルモンのβ−鎖に対するモノクローナル抗体である。

上記の操作法はいずれもイムノアッセイに従事する者に
とっては周知の慣用の実験手法に従って実施できる。場
合によっては、２種以上の工程を同時に行ってもよい０
例えば、ビオチニル化結合種と試料との反応と標識種を
包含する反応とを同時に実施する事ができる。またこれ
らの２工程を、ビオチニル化結合種と固体支持体上に固
定された抗ビオチン抗体との反応と同時に実施できる場
合もある。こうした組み合わせに適した状況や操作は、
当業者にとって容易に認識できるものと考えられる。

標識物質の検出は、慣用の手法で行う事が可能である。

すなわち使用する標識物質に応じて、当業者にとって周
知の方法の中から適当なものを選べばよい。

アッセイ材料をアッセイ・キットの形式で供給してもよ
い０本発明によるアッセイ・キットには、固相（試験管
、ビーズ、誘導ペーパー等の常用の形式のもの）、固相
表面に固定された抗ビオチン抗体、検出すべきリガント
に対して特異性を有するビオチニル化結合種（ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体、細胞表面レセプター
が好ましい）の溶液、ならびに（ａ）免疫結合種（ポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体が好ましい）
または［有］）所定の操作法において限られた量のビオ
チニル化結合種に対して上記リガントと競合するところ
のリガント類似体のいずれかである標識種が含まれる。

あるいはビオチニル化結合種が抗ビオチン抗体を介して
予め面相に結合されていてもよい。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を挙げ、本発明を更に説明するが
、本発明はこれらに制限されるものではない。

実施例１ ヒト血清試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ
）を下記の方法で検査した。

試料１００μ！およびビオチニル化ポリクローナル抗α
−ｈＣＣ，１００１Ｉｆを過剰量のポリクローナル抗ビ
オチン抗体でコーティングした試験管に入れた。この試
験管を他の同様の試験管と共に水平振とう装！（１９０
ｒｐｍ）で処理した。３０分間振とうを行った後、未結
合部分をデカントし、洗浄用緩衝液’ｌ　ｍｌを加え、
次いでこれをデカントした。洗浄を繰り返した後、試験
管を拭って乾かした０次にＩｔｓ　　１−モノクローナ
ル抗β−ｈＣＧ１００μｌの形でヨード化トレーサーを
添加し、試験管を更に３０分間にわたって振とうした。

試験管をデカントし、前記の洗浄用緩衝液で２度洗浄し
、水切りして拭った。続いてこの試験管を常用のＩｔｓ
　　■−カウンティング法で１分間にわたって検査した
ところ、次の様な結果を得た。

ＣＰＭ　　　％Ｂ／ＴＣ 総置　　　　　　　　１９８，５６８ ０　　ｍｌＵ／ｍｈｃＧ　　　　　２９１　　　　０゜
１５１０　　　　　　　　　　２．３４４　　　　１．
１８２５　　　　　　　　　　５．２６３　　　　２．
６５１００　　　　　　　　　２１．５４２　　　１０
．８５２５０　　　　　　　　　４７．１６４　　　２
３．７５５００　　　　　　　　　８１．１９５　　　
４０．８９１００．０００　　　　　　　１３８，９９
１　　　　６９．９９５００．０００　　　　　　　１
１８，５４２　　　　５９．７０９４０．０００　　　
　　　　１１２．５４３　　　　５６．６７上記の例は
単に説明のために掲げたものである。

当業者には、本発明の精神および範囲を逸脱することな
く、上記の材料や操作法に多数の変更や修正が可能であ
る事が、容易に理解されるであろう。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中のリガントを検出する方法において：（ａ
   ）固体支持体上に固定された抗ビオチン抗体と共に前記
   リガントと免疫結合する事によってリガント特異的結合
   部位を形成すると考えられるビオチニル化結合種を培養
   し； （ｂ）前記固体支持体を前記試料と共に培養し；（ｃ）
   前記固体支持体を、（ｉ）前記リガントと免疫結合する
   と思われる結合種および（ｉｉ）前記リガントの類似体
   のうちから選ばれた検出可能な標識物質を保有する種と
   共に培養し； （ｄ）（ｉ）前記溶液および（ｉｉ）前記固体支持体の
   うちから選ばれた相中に存在する前記標識物質を検出す
   ることを特徴とする方法。
2. （２）前記ビオチニル化結合種および工程（ｃ）（ｉ）
   における前記結合種が抗体である事を特徴とする請求項
   （１）記載の方法。
3. （３）工程（ｂ）において前記試料中に存在する実質上
   すべてのリガントを前記ビオチニル化結合種に結合させ
   、工程（ｃ）において実質上すべてのこうして結合した
   リガントを、前記リガントと免疫結合すると考えられか
   つ検出可能な標識物質を保有するところの結合種に結合
   させ、工程（ｄ）においてこうして前記固体支持体と結
   合したところの前記標識物質の存在を検出する事を特徴
   とする請求項（１）記載の方法。
4. （４）工程（ｃ）において前記固体支持体を前記類似体
   と共に培養し、工程（ａ）においてこうして前記固体支
   持体上に形成されるリガント特異的結合部位の量を、前
   記類似体および前記試料中に存在するリガントが前記の
   量を上回る様に調整し、また前記固体支持体と共に培養
   する前記類似体の量を、こうして結合した前記類似体の
   量が前記試料中に存在するリガントの量と反比例する様
   に調整する事を特徴とする請求項（１）記載の方法。
5. （５）工程（ｄ）においてこうして前記固体支持体と結
   合した標識物質の存在を検出する事を特徴とする請求項
   （４）記載の方法。
6. （６）前記リガントがヒト絨毛性性腺刺激ホルモンであ
   り、前記ビオチニル化結合種がヒト絨毛性性腺刺激ホル
   モンのβ−鎖に対して特異的であるビオチニル化抗体で
   あり、かつ工程（ｃ）（ｉ）における前記結合種がヒト
   絨毛性性腺刺激ホルモンのα−鎖に対して特異的である
   抗体である事を特徴とする請求項（４）記載の方法。
7. （７）前記リガントが、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、
   黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよび卵胞刺激
   ホルモンの中から選択されたホルモンであり、前記ビオ
   チニル化結合種が前記ホルモンのα−鎖に対して特異的
   である抗体であり、かつ工程（ｃ）（ｉ）における前記
   結合種が前記ホルモンのβ−鎖に対して特異的である抗
   体である事を特徴とする請求項（１）記載の方法。
8. （８）工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を同時に実施する
   事を特徴とする請求項（１）記載の方法。
9. （９）試料中のリガントの検出を目的とするアッセイ・
   キットにおいて、 （ａ）表面上に抗ビオチン抗体を固定した固体支持体よ
   りなる固相； （ｂ）前記リガントと免疫結合すると考えられるビオチ
   ニル化結合種の溶液；ならびに （ｃ）（ｉ）前記リガントと免疫結合すると考えられる
   結合種および（ｉｉ）前記ビオチニル化結合種に対して
   、前記リガントと実質上同等の結合特異性を有する前記
   リガントの類似体より選択された標識種を含有する事を
   特徴とするアッセイ・キット。
10. （１０）前記ビオチニル化結合種および前記標識種が抗
    体である事を特徴とする請求項（９）記載のアッセイ・
    キット。