JPH0215191B2 - - Google Patents
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- JPH0215191B2 JPH0215191B2 JP57060709A JP6070982A JPH0215191B2 JP H0215191 B2 JPH0215191 B2 JP H0215191B2 JP 57060709 A JP57060709 A JP 57060709A JP 6070982 A JP6070982 A JP 6070982A JP H0215191 B2 JPH0215191 B2 JP H0215191B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規アルデハイド・オキシダーゼおよ
びその製造法に関する。さらに詳しくは、本発明
は含窒素芳香族ヘテロ環化合物、プリン、ハイポ
キサンチンおよびキニンに対して触媒作用を示さ
ない新規アルデハイド・オキシダーゼおよび微生
物による該酵素の製造法に関する。 アルデハイド・オキシダーゼ（EC1.2.3.1）は
これまで豚、兎などの肝臓中に見い出されてお
り、式(1)で示される反応を触媒する酵素として知
られている。 RCHO＋O2＋H2O→RCOOH＋H2O2 ……(1) 従来知られていた動物由来のアルデハイド・オ
キシダーゼはアルデハイドのほかに、種々の含窒
芳香族ヘテロ環化合物（nitrogen−containing
aromatic heterocyclic compounds）およびプ
リン、ハイポキサンチン、キニン類等広範囲に作
用することが報告されている〔J.Biol.Chem.、
237、922（1962）、J.Biol.Chem.、239、2022
（1964）、J.Biol.Chem.、239、2027（1964）〕。従つ
てアルデハイド・オキシダーゼ活性、キニンオキ
シダーゼ活性、N′−メチルニコチンアマイドオ
キシダーゼ活性を示すものは同一の蛋白であると
言われている。〔J.Biol.Chem.、237、922
（1962）〕。 本発明者らは、アルデハイド・オキシダーゼの
工業的供給を行なうために種々研究の結果、上記
したごとき公知のアルデハイド・オキシダーゼと
は基質特異性の異なる新規なアルデハイド・オキ
シダーゼを生産する能力を有する微生物が存在す
ることを見出し本発明を完成するに至つた。 以下本発明について詳細に説明する。 本発明の新規アルデハイド・オキシダーゼの性
質を以下に示す。 酵素力価の測定法 37℃にて酸素の存在下、１分間にアセトアル
デヒドを1μmol分解する酵素量を１単位とす
る。比活性は蛋白mg当りの活性（Unit）で表
示した。また酵素蛋白量は銅−フオーリン
（Folin）試薬を用いるロウリイ（Lowry）の方
法〔O.H.Lowry、N.J.Rosebrough、A.L.Farr
and R.J.Randall、J.Biol.Chem.、193、265
（1951）〕によつて測定した。 (イ) 原理 酵素活性の測定は、酵素によつてアセトア
ルデハイドから発生する過酸化水素をパーオ
キシダーゼの存在下に４−アミノアンチピリ
ンとフエノールとで反応させ、生成するキノ
ンイミンを定量することによつて行なう。反
応式は(1)、(2)で示される。 CH3CHO＋O2＋H2Oアルデハイド・オキシダー
ゼ ――――――――――――――→ CH3COOH＋H2O2 ……(1) 尚、式(2)の反応原理はC.C.AllainらのClin.
Chem.、20、470（1974）に示されている。 (ロ) 試薬 基質：0.1Mアセトアルデヒド 0.5ml 緩衝液：0.1Mリン酸緩衝液（リン酸２
ナトリウムとリン酸１カリウムとからな
る）（PH７） 1.0ml ４−アミノアンチピリン：2.4ｍＭ水溶
液 0.5ml フエノール：42ｍＭ水溶液 0.5ml パーオキシダーゼ水溶液：（蛋白質２
mg／ml、比活性100） 0.1ml 水 0.3ml 酵素水溶液 0.1ml (ハ) 操作 上記試薬〜を試験管に入れ、よく振と
うし、37℃で５分間放置する。次いで酵素液
を加えて溶液を全量で３mlとし、37℃で10
分間振とうして反応させる。一方コントロー
ルとして基質の代りに、水を用いたものを同
様に行なう。500nｍに於ける反応液の吸収
値およびコントロールの吸収値を測定し、そ
の差を求め△O.D.とする。 (ニ) 力価の計算法 アルデハイド・オキシダーゼの１単位は37
℃で１分間にアセトアルデハイドを1μmol分
解する酵素量である。 一方、１ｍＭのキノンイミンの吸光係数は
5.33と報告されている〔Clin.Chem.、20、
470（1974）〕から、(ハ)の操作で求められた反
応液３mlの500nｍの吸収（△O.D.）をａと
表示すると、求める酵素溶液１ml当りの力価
(A)は Ａ＝ａ×１／5.33×３×１／10 ＝ａ×0.056（unit／ml） より求められる。 次に本発明によるアルデハイド・オキシダー
ゼ（以下本酵素という場合もある）の理化学的
性質を述べる。なおアルデハイド・オキシダー
ゼは実施例１で得られた精製酵素標品を用い
た。 (1) 作用および基質特異性 本酵素は式(1)の酸化反応を触媒し、基質ア
ルデヒドに対応する酸を生成する。 RCHO＋O2＋H2O→RCOOH＋H2O2
……(1) 例えばホルムアルデハイド、アセトアルデ
ハイド、グリセルアルデハイドを酸化してそ
れぞれ、ギ酸、酢酸、グリセリン酸にする。
本酵素の作用するアルデヒドはホルムアルデ
ハイド、アセトアルデハイド、プロピオンア
ルデハイド、ｎ−バレルアルデハイド、ｎ−
ヘキシルアルデハイド、ヘプチルアルデハイ
ド等の飽和脂肪族アルデハイド、クロトンア
ルデハイド、シトラール等の不飽和脂肪族ア
ルデハイド、ベンズアルデハイド等の芳香族
アルデハイド、Ｄ−またはＬ−グリセルアル
デハイド等広い範囲にわたる。しかし、本酵
素はメタノール、エタノール等のアルコー
ル、N′−メチルニコチンアマイド、キノリ
ン、キニン等には作用しない（第１表参照）。 【表】 (2) 至適PH、温度および安定PH、温度範囲 本酵素の至適PHは6.5附近にある。本酵素
の安定PH領域は70℃、30分間の処理でPH5.5
からPH８にある。本酵素の最適温度は50℃附
近にある。また本酵素はPH7.0、30分間の処
理で80℃まで安定である。本酵素のPH作用曲
線を第１図に、PH7.0に於ける温度活性曲線
を第２図に、70℃、30分間後のPH安定曲線を
第３図に、PH7.0に於ける熱安定曲線を第４
図に示す。 (3) 各種金属イオン、阻害剤の影響 本酵素は塩化第２水銀、ｐ−クロロマーキ
ユリフエニルスルホン酸によつて阻害される
ので、SH基が反応に関与しているものと思
われる。第２表に本酵素に対する各種金属イ
オン、阻害剤の影響を示す。 【表】 【表】 ＊ 動物由来のアルデハイド・オキシダ
ーゼの場合
(4) 分子量 セフアクリル（Sephacryl）Ｓ−300Super
Pine（フアルマシアフアインケミカルズ社
製、スウエーデン）を用いたゲル過法によ
り測定した本酵素の分子量は約11万であつ
た。 (5) 均一性 本酵素の超遠心（最高回転55430rpm）像
は単一の沈降パターンを示す。 上記の性質を従来公知の動物由来アルデハイ
ド・オキシダーゼと比較すると、(1)公知のアルデ
ハイド・オキシダーゼが種々の含窒素芳香族ヘテ
ロ環化合物、プリン、ハイポキサンチン、キニン
類など広範囲の基質に作用するのに対し、本酵素
はアルデハイドに特異的に作用し、他の含窒素化
合物には作用しないこと、および(2)公知のアルデ
ハイド・オキシダーゼがアンテイマイシンＡおよ
びKCNによつて強く阻害されるのに対し、本酵
素は強く阻害されないなどの差異があることか
ら、本酵素は新規なアルデハイド・オキシダーゼ
であると同定できる。 本酵素は臨床診断薬の分野で、種々アルデハイ
ドの定量に使用でき、また食品工業の分野で大豆
臭の脱臭等に使用できる。 本酵素は微生物の培養によつて製造される。用
いる微生物はシユードモナス属、バチルス属、ミ
クロバクテリウム属、エシエリヒア属、サイトフ
アーガ属またはスポロラクトバチルス属に属し、
本発明のアルデハイド・オキシダーゼを生産する
能力を有する微生物である。このような微生物と
しては具体的に好適なものとして次のごとき菌株
を一例として挙げることができる。 【表】 【表】 シユードモナス・エスピーと同定したNo.6233菌
株は本発明者らが新たに分離した菌株で、その菌
学的性質および同定の準拠について以下に示す。
同定のための実験方法は主に長谷川武治編著「微
生物の分類と同定」学会出版センター（1975）に
よつた。また、分類、同定の基準として、バージ
ーズ・マニユアル 第８版（1974）およびR.Y.
StanierらのThe Aerobic Pseudomonads：Ａ
Taxonomic Study（J.Gen.Microbiol.、43；159
−271、1966）などを参考にした。 菌学的性質 Ａ 細胞形態 肉汁寒天培地30℃、24時間培養細胞：（0.7
〜0.8μ）×（2.0〜3.0μ）の桿状菌、主に単独稀
に２連で存在、１本の極べん毛をもち運動性
がある。グラム陰性、無胞子、細胞内にポ
リ・ベーターヒドロキシ酪酸の顆粒の存在を
認める。 Ｂ 培養的性質 １ 肉汁寒天平板培養30℃、48時間：直径２
〜３mmの円形、隆起状、表面は平滑で光沢
がある。コロニー周縁は全縁、コロニーは
均質、不透明で黄色、可溶性色素は生成し
ない。 ２ 肉汁寒天斜面培養30℃、24時間：糸状、
良好な生育を示す。コロニーは黄色でバタ
ー質である。 ３ 肉汁寒天穿刺培養30℃、48時間：表面に
のみ生育する。 ４ 肉汁液体培養30℃、48時間：やゝ濁る程
度の生育で粉状ないし毛房状の沈渣を生じ
る。皮膜は形成しない。 ５ 肉汁ゼラチン培養30℃；ゼラチンをやゝ
遅く（５日目以後）液化する。 ６ リトマスミルク：リトマスを脱色する
が、ペプトン化および凝固は起らない。 Ｃ 生理学的性質 １ 生育温度：範囲15〜42℃、至適25〜33℃ ２ 生育PH：範囲5.5〜9.0、至適6.5〜7.5 ３ 酸素の要求性：絶対好気性 ４ Ｏ−Ｆテスト：グルコースから好気的に
のみ酸を生成、ガスは生成しない。 ５ 硝酸塩の還元：陰性 ６ 脱窒反応：陰性 ７ MRテスト：陰性 ８ VPテスト：陰性 ９ インドールの生成：陰性 10 でん粉の加水分解：陰性 11 カゼインの分解：陰性 12 多糖類の生成：陰性 13 オキシダーゼ：陰性 14 ウレアーゼ：弱陽性 15 カタラーゼ：陽性 16 セルラーゼ：陰性 17 アルギニン・デヒドラーゼ・陰性 18 リジン脱炭酸酵素：陽性 19 オルニチン脱炭酸酵素：陰性 20 卵黄テスト：陰性 21 食塩抵抗性：３％で生育、７％で非生育 22 0.1％トリフエニル・テトラゾリウム クロライドに対する耐性：あり 23 栄養要求性：なし 24 炭水化物から酸の生成 陽性のもの：グルコース、フラクトース、
Ｌ−アラビノース、トレハロース 弱陽性のもの：キシロース、ガラクトー
ス、マルトース、ラクトース、イノシツ
ト 陰性のもの：シユクロース、セロビオー
ス、メリビオース、ラフイノース、グリ
セリン、マンニツト、ソルビツト、ズル
シツト、サリシン 25 炭素化合物の資化性 資化性のあるもの：リボース、キシロー
ス、Ｌ−アラビノース、グルコース、フ
ラクトース、マルトース、トレハロー
ス、セロビオース、グルコン酸、２−ケ
ト−グルコン酸、糖酸、グリセリン、マ
ンニツト、イノシツト、酢酸、ピルビン
酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、フマー
ル酸、リンゴ酸、マロン酸、酒石酸、グ
リコール酸、β−ヒドロキシ酪酸、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸、エタノールDL−
アルギニン、セリン、ヒスチジン、バリ
ン、アスパラギン、ベタイン、ザルコシ
ン 資化性のないもの：Ｌ−ラムノース、シユ
クロース、エリスリツト、アドニツト、
エチレングリコール、プロピレングリコ
ール、レブリン酸、ｍ−ヒドロキシ安息
香酸、メタノール、、ゲラニオール、β
−アラニン、アセトアルデヒド（0.1
％）、パラアルデヒド（0.2％） Ｄ DNAのＧ−Ｃ含量：63.8モル．パーセン
ト 同定の準拠 上記の菌株は以下に記す根拠からシユードモ
ナス属に属するものと同定できる。 グラム陰性、無胞子の桿菌で、極べん毛を有
し運動性がある。絶対好気性でグルコースから
酸を生成するがガスを生成せずカタラーゼ陽性
である。インドールの生成、MRテスト、VP
テストいずれも陰性である。多種類の炭素化合
物を資化し、かつ栄養要求性がない。PH4.5で
非生育、37℃で生育できる。DNAのGC比が
63.8モルパーセントである。なお、シユードモ
ナス属菌は一般にオキシダーゼが陽性である
が、少数ではあるが、オキシダーゼ陰性の種や
株も含まれている。バージーズ・マニユアル８
版にシユードモナス属の菌種として記載されて
いるものは29種である。これら29種中、該バー
ジーズ・マニユアルおよび上記の文献の記載か
ら見て本菌株と相違点が比較的少ないものとし
てシユードモナス・セパシア（Pseudomonas
cepacia）およびシユードモナス・マルギナタ
（Pseudomonas marginata）の２種、また本
明細書にアルデヒド酸化酵素生産菌として記載
したシユードモナス・ステユツエリ
（Pseudomonas stutzeri）およびその近縁種で
かつ黄色のシユードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）の以上４株をと
り上げ、No.6233菌株との菌学的性質の相違点を
まとめ第３表に示した。 【表】 【表】 P.marginataはオキシダーゼを含めて最も多
くの点でNo.6233と類似しているが、かなり基本
的な種の性質と考えられるＧ−Ｃ比やべん毛の
数を異にしている。P.cepaciaもかなり類似性
が高いがオキシダーゼ陽性であり、またＧ−Ｃ
比、べん毛の点でも異なつている。P.stutzeri
とP.mendocinaはＧ−Ｃ比、べん毛、さらに後
者は黄色の色素を有する点を含めてNo.6233と一
致しているが、オキシダーゼ、脱窒反応、アル
ギニンデヒドラーゼが異なり、さらに炭素化合
物の資化性の点でもかなりの相違が見られる。 なお本明細書に記載されている
Pseudomonas pavonaceaはバージーズ・マニ
ユアル８版には菌種名の記載しかなく詳細は判
らない。 バージーズ・マニユアル７版の記載（p.105）
を参照するとNo.6233と以下の点で異なつてい
る。 １ 細胞は0.5μ×4.5μで単独および連鎖状。 ２ コロニーは緑色である。 ３ 培地を褐色にする。 ４ 液体培養における沈渣は粘稠である。 ５ グルコースから酸を生成しない。 ６ 通性好気性である。 ７ 生育適温が27℃で、37℃では生育が悪い。 上記比較によりNo.6233株はシユウドモナス属
に属するが上記４菌種を含めてバージーズ・マ
ニユアル８版に記載されている29種のいずれに
も属さない新しいタイプの細菌であると同定し
た。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
Pseudomonas sp.No.6233FERM BP−267とし
て寄託されている。 本発明で使用する培地としては炭素源、窒素
源、無機物、その他の栄養素を程よく含有する
培地ならば合成培地または天然培地のいずれも
使用可能である。 炭素源としてはグルコース、シユクロース、
可溶性でんぷん、廃糖蜜などの糖類、グリセロ
ール、ソルビトール、マンニトールなどの糖ア
ルコール類が使用できる。 窒素源としてはアンモニア水、塩化アンモニ
ア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等の各種無
機および有機のアンモニウム化合物、尿素など
の窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆あるいはその液化物な
どの窒素性有機物などが使用できる。 無機物としてはナトリウム、カリウム、マン
ガン、マグネシウム、カルシユウム、コバル
ト、ニツケル、亜鉛、銅等の金属の塩類、クロ
ム、硫酸、燐酸、硝酸、塩酸などの塩類が使用
できる。 本発明方法においては酵素の誘導物質として
ザルコシン、ベタイン、ジメチルグリシン、コ
リン、ベタインアルデヒド、トリメチルアミ
ン、エチルアルコール、メチルアルコール等ま
たはこれらの混合物、これらを含有する物質を
培地に添加すればより多量のアルデハイド・オ
キシダーゼを生成させることができる。 培養温度は通常15〜45℃の範囲で、好適には
28〜35℃で行なわれる。培養時のPHは通常6.0
〜8.5の範囲で好適には6.5〜8.0で行なわれる。
このような条件下で20〜30時間振とうもしくは
深部撹拌培養すれば培養液および／または菌体
中にアルデハイド・オキシダーゼが多量生成す
るのでそれを次のごとき方法で採取する。 アルデハイド・オキシダーゼは通常菌体中に
存在するので菌体中の酵素の採取法について述
べる。培養終了後、培養液を遠心分離して得ら
れる菌体を水または緩衝液でよく洗浄する。得
られた菌体を適量の緩衝液に懸濁し菌体を破砕
する。破砕には機械的破砕（例えば、乳鉢、ダ
イノミル、マントンガウリン、フレンチプレ
ス、フユーズプレス、超音波破砕機その他によ
る）によつて行なわれる。 かくして得られた菌体の破砕液中より、固形
物を遠心分離もしくは過によつて除去し、次
いで破砕液中のアルデハイド・オキシダーゼは
酵素単離の常法によつて採取される。 例えば(1)硫安による分画沈殿、(2)DEAE−セ
ルロース塔によるカラムクロマト、(3)セフアテ
ツクスによる篩別分画、(4)ハイドロキシアパタ
イト塔によるカラムクロマト、(5)活性区分の凍
結乾燥の工程に従つて酵素粉末を得ることがで
きる。勿論同一操作をくり返すこと、他の常法
の精製手段を必要に応じ組み合わせて用いるこ
ともできる。 菌体外の培養液中に蓄積する酵素について
は、菌体分離および菌体破砕の操作を省略する
以外は上記と同様に行い、取得できる。 次に実施例を挙げて本発明酵素の製造を具体的
に説明する。 実施例 １ シユードモナス・エスピーNo.6233をクレアチニ
ン２ｇ／dl、（NH4）2SO40.1ｇ／dl、
K2HPO40.05ｇ／dl、MgSO40.05ｇ／dl、KCl
ｇ／dl、酵母エキス0.2ｇ／dl、麦芽エキス0.1
ｇ／dl、ペプトン0.3ｇ／dlの組成（PH7.0）を有
する培地0.3を含む２容三角フラスコ14本に
植菌し、28℃で24時間通気撹拌培養した。培養液
4.2を連続遠心分離機で処理し、菌体約20ｇを
集めた。この菌体を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）
0.84に懸濁した。この懸濁液を磨砕機ダイノミ
ルKD−Ｌ（ウイリーエンバツコーフエン社製）
にかけ菌体を磨砕した。 次いで冷凍遠心分離機にて遠心分離（11000×
ｇ、20分）し上清液を採取した。得られた上清液
の硫酸アンモニウム０〜80％飽和沈殿区分は
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）95mlに溶解し、透
析膜としてセロフアンチユーブを使い、８時間毎
に透析外液を取りかえながら、40の同緩衝液で
24時間透析した。本透析液の活性収率は95％であ
つた。 次いで、本透析液を70℃に30分間保つた後、生
じた沈殿を遠心分離法（11000×ｇ、20分）で除
去した。上清液の活性回収率は、100％であつた。 次に得られた上清液に硫酸アンモニウムを加
え、硫酸アンモニウム30〜60％飽和で沈殿する区
分をとり、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）9.4mlに
溶解した。この溶液をセロフアンチユーブを透析
膜とし、12時間毎に透析外液を取りかえながら、
16の同緩衝液で24時間透析した。本透析液の活
性収率は50％であつた。 透析した酵素液を予め0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で平衡化しておいた100mlのハイドロキシア
パタイトを含むカラムに通した。この操作で、ア
ルデハイド・オキシダーゼは吸着された。さらに
同緩衝液で不純蛋白質を洗い流した。 次に、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）から0.4M
リン酸緩衝液（PH7.0）までの濃度勾配をつくり、
通筒し、溶出液を分画回収した比活性の高い分画
を集め、これに70％飽和量の硫酸アンモニウムを
加えて沈殿させた。沈殿を遠心分離法（11000×
ｇ、20分）で集め、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
1.5mlに溶解し、透析膜としてセロフアンチユー
ブを用い、透析外液として同緩衝液を用いて透析
した。 本透析液の活性回収率は約10％であつた。 次に得られた上清液を0.1M NaClを含む0.05M
リン酸緩衝液（PH7.0）で予め平衡化しておいた
230mlのセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−150（フ
アルマシア フアインケミカルス社製）を含むカ
ラムに通した。同緩衝液を流して溶出液を分画し
た。 この結果、活性画分は単一のピークとして溶出
された。比活性の高い分画を集め、コロジオンバ
ツク（ザルトリウス社製）を用いて濃縮し、アル
デハイド・オキシダーゼの精製酵素標品2.3mg
（比活性2.88U／mg）を得た。 全体の活性収率は2.2％であり、比活性は100倍
に達した。
びその製造法に関する。さらに詳しくは、本発明
は含窒素芳香族ヘテロ環化合物、プリン、ハイポ
キサンチンおよびキニンに対して触媒作用を示さ
ない新規アルデハイド・オキシダーゼおよび微生
物による該酵素の製造法に関する。 アルデハイド・オキシダーゼ（EC1.2.3.1）は
これまで豚、兎などの肝臓中に見い出されてお
り、式(1)で示される反応を触媒する酵素として知
られている。 RCHO＋O2＋H2O→RCOOH＋H2O2 ……(1) 従来知られていた動物由来のアルデハイド・オ
キシダーゼはアルデハイドのほかに、種々の含窒
芳香族ヘテロ環化合物（nitrogen−containing
aromatic heterocyclic compounds）およびプ
リン、ハイポキサンチン、キニン類等広範囲に作
用することが報告されている〔J.Biol.Chem.、
237、922（1962）、J.Biol.Chem.、239、2022
（1964）、J.Biol.Chem.、239、2027（1964）〕。従つ
てアルデハイド・オキシダーゼ活性、キニンオキ
シダーゼ活性、N′−メチルニコチンアマイドオ
キシダーゼ活性を示すものは同一の蛋白であると
言われている。〔J.Biol.Chem.、237、922
（1962）〕。 本発明者らは、アルデハイド・オキシダーゼの
工業的供給を行なうために種々研究の結果、上記
したごとき公知のアルデハイド・オキシダーゼと
は基質特異性の異なる新規なアルデハイド・オキ
シダーゼを生産する能力を有する微生物が存在す
ることを見出し本発明を完成するに至つた。 以下本発明について詳細に説明する。 本発明の新規アルデハイド・オキシダーゼの性
質を以下に示す。 酵素力価の測定法 37℃にて酸素の存在下、１分間にアセトアル
デヒドを1μmol分解する酵素量を１単位とす
る。比活性は蛋白mg当りの活性（Unit）で表
示した。また酵素蛋白量は銅−フオーリン
（Folin）試薬を用いるロウリイ（Lowry）の方
法〔O.H.Lowry、N.J.Rosebrough、A.L.Farr
and R.J.Randall、J.Biol.Chem.、193、265
（1951）〕によつて測定した。 (イ) 原理 酵素活性の測定は、酵素によつてアセトア
ルデハイドから発生する過酸化水素をパーオ
キシダーゼの存在下に４−アミノアンチピリ
ンとフエノールとで反応させ、生成するキノ
ンイミンを定量することによつて行なう。反
応式は(1)、(2)で示される。 CH3CHO＋O2＋H2Oアルデハイド・オキシダー
ゼ ――――――――――――――→ CH3COOH＋H2O2 ……(1) 尚、式(2)の反応原理はC.C.AllainらのClin.
Chem.、20、470（1974）に示されている。 (ロ) 試薬 基質：0.1Mアセトアルデヒド 0.5ml 緩衝液：0.1Mリン酸緩衝液（リン酸２
ナトリウムとリン酸１カリウムとからな
る）（PH７） 1.0ml ４−アミノアンチピリン：2.4ｍＭ水溶
液 0.5ml フエノール：42ｍＭ水溶液 0.5ml パーオキシダーゼ水溶液：（蛋白質２
mg／ml、比活性100） 0.1ml 水 0.3ml 酵素水溶液 0.1ml (ハ) 操作 上記試薬〜を試験管に入れ、よく振と
うし、37℃で５分間放置する。次いで酵素液
を加えて溶液を全量で３mlとし、37℃で10
分間振とうして反応させる。一方コントロー
ルとして基質の代りに、水を用いたものを同
様に行なう。500nｍに於ける反応液の吸収
値およびコントロールの吸収値を測定し、そ
の差を求め△O.D.とする。 (ニ) 力価の計算法 アルデハイド・オキシダーゼの１単位は37
℃で１分間にアセトアルデハイドを1μmol分
解する酵素量である。 一方、１ｍＭのキノンイミンの吸光係数は
5.33と報告されている〔Clin.Chem.、20、
470（1974）〕から、(ハ)の操作で求められた反
応液３mlの500nｍの吸収（△O.D.）をａと
表示すると、求める酵素溶液１ml当りの力価
(A)は Ａ＝ａ×１／5.33×３×１／10 ＝ａ×0.056（unit／ml） より求められる。 次に本発明によるアルデハイド・オキシダー
ゼ（以下本酵素という場合もある）の理化学的
性質を述べる。なおアルデハイド・オキシダー
ゼは実施例１で得られた精製酵素標品を用い
た。 (1) 作用および基質特異性 本酵素は式(1)の酸化反応を触媒し、基質ア
ルデヒドに対応する酸を生成する。 RCHO＋O2＋H2O→RCOOH＋H2O2
……(1) 例えばホルムアルデハイド、アセトアルデ
ハイド、グリセルアルデハイドを酸化してそ
れぞれ、ギ酸、酢酸、グリセリン酸にする。
本酵素の作用するアルデヒドはホルムアルデ
ハイド、アセトアルデハイド、プロピオンア
ルデハイド、ｎ−バレルアルデハイド、ｎ−
ヘキシルアルデハイド、ヘプチルアルデハイ
ド等の飽和脂肪族アルデハイド、クロトンア
ルデハイド、シトラール等の不飽和脂肪族ア
ルデハイド、ベンズアルデハイド等の芳香族
アルデハイド、Ｄ−またはＬ−グリセルアル
デハイド等広い範囲にわたる。しかし、本酵
素はメタノール、エタノール等のアルコー
ル、N′−メチルニコチンアマイド、キノリ
ン、キニン等には作用しない（第１表参照）。 【表】 (2) 至適PH、温度および安定PH、温度範囲 本酵素の至適PHは6.5附近にある。本酵素
の安定PH領域は70℃、30分間の処理でPH5.5
からPH８にある。本酵素の最適温度は50℃附
近にある。また本酵素はPH7.0、30分間の処
理で80℃まで安定である。本酵素のPH作用曲
線を第１図に、PH7.0に於ける温度活性曲線
を第２図に、70℃、30分間後のPH安定曲線を
第３図に、PH7.0に於ける熱安定曲線を第４
図に示す。 (3) 各種金属イオン、阻害剤の影響 本酵素は塩化第２水銀、ｐ−クロロマーキ
ユリフエニルスルホン酸によつて阻害される
ので、SH基が反応に関与しているものと思
われる。第２表に本酵素に対する各種金属イ
オン、阻害剤の影響を示す。 【表】 【表】 ＊ 動物由来のアルデハイド・オキシダ
ーゼの場合
(4) 分子量 セフアクリル（Sephacryl）Ｓ−300Super
Pine（フアルマシアフアインケミカルズ社
製、スウエーデン）を用いたゲル過法によ
り測定した本酵素の分子量は約11万であつ
た。 (5) 均一性 本酵素の超遠心（最高回転55430rpm）像
は単一の沈降パターンを示す。 上記の性質を従来公知の動物由来アルデハイ
ド・オキシダーゼと比較すると、(1)公知のアルデ
ハイド・オキシダーゼが種々の含窒素芳香族ヘテ
ロ環化合物、プリン、ハイポキサンチン、キニン
類など広範囲の基質に作用するのに対し、本酵素
はアルデハイドに特異的に作用し、他の含窒素化
合物には作用しないこと、および(2)公知のアルデ
ハイド・オキシダーゼがアンテイマイシンＡおよ
びKCNによつて強く阻害されるのに対し、本酵
素は強く阻害されないなどの差異があることか
ら、本酵素は新規なアルデハイド・オキシダーゼ
であると同定できる。 本酵素は臨床診断薬の分野で、種々アルデハイ
ドの定量に使用でき、また食品工業の分野で大豆
臭の脱臭等に使用できる。 本酵素は微生物の培養によつて製造される。用
いる微生物はシユードモナス属、バチルス属、ミ
クロバクテリウム属、エシエリヒア属、サイトフ
アーガ属またはスポロラクトバチルス属に属し、
本発明のアルデハイド・オキシダーゼを生産する
能力を有する微生物である。このような微生物と
しては具体的に好適なものとして次のごとき菌株
を一例として挙げることができる。 【表】 【表】 シユードモナス・エスピーと同定したNo.6233菌
株は本発明者らが新たに分離した菌株で、その菌
学的性質および同定の準拠について以下に示す。
同定のための実験方法は主に長谷川武治編著「微
生物の分類と同定」学会出版センター（1975）に
よつた。また、分類、同定の基準として、バージ
ーズ・マニユアル 第８版（1974）およびR.Y.
StanierらのThe Aerobic Pseudomonads：Ａ
Taxonomic Study（J.Gen.Microbiol.、43；159
−271、1966）などを参考にした。 菌学的性質 Ａ 細胞形態 肉汁寒天培地30℃、24時間培養細胞：（0.7
〜0.8μ）×（2.0〜3.0μ）の桿状菌、主に単独稀
に２連で存在、１本の極べん毛をもち運動性
がある。グラム陰性、無胞子、細胞内にポ
リ・ベーターヒドロキシ酪酸の顆粒の存在を
認める。 Ｂ 培養的性質 １ 肉汁寒天平板培養30℃、48時間：直径２
〜３mmの円形、隆起状、表面は平滑で光沢
がある。コロニー周縁は全縁、コロニーは
均質、不透明で黄色、可溶性色素は生成し
ない。 ２ 肉汁寒天斜面培養30℃、24時間：糸状、
良好な生育を示す。コロニーは黄色でバタ
ー質である。 ３ 肉汁寒天穿刺培養30℃、48時間：表面に
のみ生育する。 ４ 肉汁液体培養30℃、48時間：やゝ濁る程
度の生育で粉状ないし毛房状の沈渣を生じ
る。皮膜は形成しない。 ５ 肉汁ゼラチン培養30℃；ゼラチンをやゝ
遅く（５日目以後）液化する。 ６ リトマスミルク：リトマスを脱色する
が、ペプトン化および凝固は起らない。 Ｃ 生理学的性質 １ 生育温度：範囲15〜42℃、至適25〜33℃ ２ 生育PH：範囲5.5〜9.0、至適6.5〜7.5 ３ 酸素の要求性：絶対好気性 ４ Ｏ−Ｆテスト：グルコースから好気的に
のみ酸を生成、ガスは生成しない。 ５ 硝酸塩の還元：陰性 ６ 脱窒反応：陰性 ７ MRテスト：陰性 ８ VPテスト：陰性 ９ インドールの生成：陰性 10 でん粉の加水分解：陰性 11 カゼインの分解：陰性 12 多糖類の生成：陰性 13 オキシダーゼ：陰性 14 ウレアーゼ：弱陽性 15 カタラーゼ：陽性 16 セルラーゼ：陰性 17 アルギニン・デヒドラーゼ・陰性 18 リジン脱炭酸酵素：陽性 19 オルニチン脱炭酸酵素：陰性 20 卵黄テスト：陰性 21 食塩抵抗性：３％で生育、７％で非生育 22 0.1％トリフエニル・テトラゾリウム クロライドに対する耐性：あり 23 栄養要求性：なし 24 炭水化物から酸の生成 陽性のもの：グルコース、フラクトース、
Ｌ−アラビノース、トレハロース 弱陽性のもの：キシロース、ガラクトー
ス、マルトース、ラクトース、イノシツ
ト 陰性のもの：シユクロース、セロビオー
ス、メリビオース、ラフイノース、グリ
セリン、マンニツト、ソルビツト、ズル
シツト、サリシン 25 炭素化合物の資化性 資化性のあるもの：リボース、キシロー
ス、Ｌ−アラビノース、グルコース、フ
ラクトース、マルトース、トレハロー
ス、セロビオース、グルコン酸、２−ケ
ト−グルコン酸、糖酸、グリセリン、マ
ンニツト、イノシツト、酢酸、ピルビン
酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、フマー
ル酸、リンゴ酸、マロン酸、酒石酸、グ
リコール酸、β−ヒドロキシ酪酸、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸、エタノールDL−
アルギニン、セリン、ヒスチジン、バリ
ン、アスパラギン、ベタイン、ザルコシ
ン 資化性のないもの：Ｌ−ラムノース、シユ
クロース、エリスリツト、アドニツト、
エチレングリコール、プロピレングリコ
ール、レブリン酸、ｍ−ヒドロキシ安息
香酸、メタノール、、ゲラニオール、β
−アラニン、アセトアルデヒド（0.1
％）、パラアルデヒド（0.2％） Ｄ DNAのＧ−Ｃ含量：63.8モル．パーセン
ト 同定の準拠 上記の菌株は以下に記す根拠からシユードモ
ナス属に属するものと同定できる。 グラム陰性、無胞子の桿菌で、極べん毛を有
し運動性がある。絶対好気性でグルコースから
酸を生成するがガスを生成せずカタラーゼ陽性
である。インドールの生成、MRテスト、VP
テストいずれも陰性である。多種類の炭素化合
物を資化し、かつ栄養要求性がない。PH4.5で
非生育、37℃で生育できる。DNAのGC比が
63.8モルパーセントである。なお、シユードモ
ナス属菌は一般にオキシダーゼが陽性である
が、少数ではあるが、オキシダーゼ陰性の種や
株も含まれている。バージーズ・マニユアル８
版にシユードモナス属の菌種として記載されて
いるものは29種である。これら29種中、該バー
ジーズ・マニユアルおよび上記の文献の記載か
ら見て本菌株と相違点が比較的少ないものとし
てシユードモナス・セパシア（Pseudomonas
cepacia）およびシユードモナス・マルギナタ
（Pseudomonas marginata）の２種、また本
明細書にアルデヒド酸化酵素生産菌として記載
したシユードモナス・ステユツエリ
（Pseudomonas stutzeri）およびその近縁種で
かつ黄色のシユードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina）の以上４株をと
り上げ、No.6233菌株との菌学的性質の相違点を
まとめ第３表に示した。 【表】 【表】 P.marginataはオキシダーゼを含めて最も多
くの点でNo.6233と類似しているが、かなり基本
的な種の性質と考えられるＧ−Ｃ比やべん毛の
数を異にしている。P.cepaciaもかなり類似性
が高いがオキシダーゼ陽性であり、またＧ−Ｃ
比、べん毛の点でも異なつている。P.stutzeri
とP.mendocinaはＧ−Ｃ比、べん毛、さらに後
者は黄色の色素を有する点を含めてNo.6233と一
致しているが、オキシダーゼ、脱窒反応、アル
ギニンデヒドラーゼが異なり、さらに炭素化合
物の資化性の点でもかなりの相違が見られる。 なお本明細書に記載されている
Pseudomonas pavonaceaはバージーズ・マニ
ユアル８版には菌種名の記載しかなく詳細は判
らない。 バージーズ・マニユアル７版の記載（p.105）
を参照するとNo.6233と以下の点で異なつてい
る。 １ 細胞は0.5μ×4.5μで単独および連鎖状。 ２ コロニーは緑色である。 ３ 培地を褐色にする。 ４ 液体培養における沈渣は粘稠である。 ５ グルコースから酸を生成しない。 ６ 通性好気性である。 ７ 生育適温が27℃で、37℃では生育が悪い。 上記比較によりNo.6233株はシユウドモナス属
に属するが上記４菌種を含めてバージーズ・マ
ニユアル８版に記載されている29種のいずれに
も属さない新しいタイプの細菌であると同定し
た。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
Pseudomonas sp.No.6233FERM BP−267とし
て寄託されている。 本発明で使用する培地としては炭素源、窒素
源、無機物、その他の栄養素を程よく含有する
培地ならば合成培地または天然培地のいずれも
使用可能である。 炭素源としてはグルコース、シユクロース、
可溶性でんぷん、廃糖蜜などの糖類、グリセロ
ール、ソルビトール、マンニトールなどの糖ア
ルコール類が使用できる。 窒素源としてはアンモニア水、塩化アンモニ
ア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等の各種無
機および有機のアンモニウム化合物、尿素など
の窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆あるいはその液化物な
どの窒素性有機物などが使用できる。 無機物としてはナトリウム、カリウム、マン
ガン、マグネシウム、カルシユウム、コバル
ト、ニツケル、亜鉛、銅等の金属の塩類、クロ
ム、硫酸、燐酸、硝酸、塩酸などの塩類が使用
できる。 本発明方法においては酵素の誘導物質として
ザルコシン、ベタイン、ジメチルグリシン、コ
リン、ベタインアルデヒド、トリメチルアミ
ン、エチルアルコール、メチルアルコール等ま
たはこれらの混合物、これらを含有する物質を
培地に添加すればより多量のアルデハイド・オ
キシダーゼを生成させることができる。 培養温度は通常15〜45℃の範囲で、好適には
28〜35℃で行なわれる。培養時のPHは通常6.0
〜8.5の範囲で好適には6.5〜8.0で行なわれる。
このような条件下で20〜30時間振とうもしくは
深部撹拌培養すれば培養液および／または菌体
中にアルデハイド・オキシダーゼが多量生成す
るのでそれを次のごとき方法で採取する。 アルデハイド・オキシダーゼは通常菌体中に
存在するので菌体中の酵素の採取法について述
べる。培養終了後、培養液を遠心分離して得ら
れる菌体を水または緩衝液でよく洗浄する。得
られた菌体を適量の緩衝液に懸濁し菌体を破砕
する。破砕には機械的破砕（例えば、乳鉢、ダ
イノミル、マントンガウリン、フレンチプレ
ス、フユーズプレス、超音波破砕機その他によ
る）によつて行なわれる。 かくして得られた菌体の破砕液中より、固形
物を遠心分離もしくは過によつて除去し、次
いで破砕液中のアルデハイド・オキシダーゼは
酵素単離の常法によつて採取される。 例えば(1)硫安による分画沈殿、(2)DEAE−セ
ルロース塔によるカラムクロマト、(3)セフアテ
ツクスによる篩別分画、(4)ハイドロキシアパタ
イト塔によるカラムクロマト、(5)活性区分の凍
結乾燥の工程に従つて酵素粉末を得ることがで
きる。勿論同一操作をくり返すこと、他の常法
の精製手段を必要に応じ組み合わせて用いるこ
ともできる。 菌体外の培養液中に蓄積する酵素について
は、菌体分離および菌体破砕の操作を省略する
以外は上記と同様に行い、取得できる。 次に実施例を挙げて本発明酵素の製造を具体的
に説明する。 実施例 １ シユードモナス・エスピーNo.6233をクレアチニ
ン２ｇ／dl、（NH4）2SO40.1ｇ／dl、
K2HPO40.05ｇ／dl、MgSO40.05ｇ／dl、KCl
ｇ／dl、酵母エキス0.2ｇ／dl、麦芽エキス0.1
ｇ／dl、ペプトン0.3ｇ／dlの組成（PH7.0）を有
する培地0.3を含む２容三角フラスコ14本に
植菌し、28℃で24時間通気撹拌培養した。培養液
4.2を連続遠心分離機で処理し、菌体約20ｇを
集めた。この菌体を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）
0.84に懸濁した。この懸濁液を磨砕機ダイノミ
ルKD−Ｌ（ウイリーエンバツコーフエン社製）
にかけ菌体を磨砕した。 次いで冷凍遠心分離機にて遠心分離（11000×
ｇ、20分）し上清液を採取した。得られた上清液
の硫酸アンモニウム０〜80％飽和沈殿区分は
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）95mlに溶解し、透
析膜としてセロフアンチユーブを使い、８時間毎
に透析外液を取りかえながら、40の同緩衝液で
24時間透析した。本透析液の活性収率は95％であ
つた。 次いで、本透析液を70℃に30分間保つた後、生
じた沈殿を遠心分離法（11000×ｇ、20分）で除
去した。上清液の活性回収率は、100％であつた。 次に得られた上清液に硫酸アンモニウムを加
え、硫酸アンモニウム30〜60％飽和で沈殿する区
分をとり、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）9.4mlに
溶解した。この溶液をセロフアンチユーブを透析
膜とし、12時間毎に透析外液を取りかえながら、
16の同緩衝液で24時間透析した。本透析液の活
性収率は50％であつた。 透析した酵素液を予め0.01Mリン酸緩衝液（PH
7.0）で平衡化しておいた100mlのハイドロキシア
パタイトを含むカラムに通した。この操作で、ア
ルデハイド・オキシダーゼは吸着された。さらに
同緩衝液で不純蛋白質を洗い流した。 次に、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）から0.4M
リン酸緩衝液（PH7.0）までの濃度勾配をつくり、
通筒し、溶出液を分画回収した比活性の高い分画
を集め、これに70％飽和量の硫酸アンモニウムを
加えて沈殿させた。沈殿を遠心分離法（11000×
ｇ、20分）で集め、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
1.5mlに溶解し、透析膜としてセロフアンチユー
ブを用い、透析外液として同緩衝液を用いて透析
した。 本透析液の活性回収率は約10％であつた。 次に得られた上清液を0.1M NaClを含む0.05M
リン酸緩衝液（PH7.0）で予め平衡化しておいた
230mlのセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−150（フ
アルマシア フアインケミカルス社製）を含むカ
ラムに通した。同緩衝液を流して溶出液を分画し
た。 この結果、活性画分は単一のピークとして溶出
された。比活性の高い分画を集め、コロジオンバ
ツク（ザルトリウス社製）を用いて濃縮し、アル
デハイド・オキシダーゼの精製酵素標品2.3mg
（比活性2.88U／mg）を得た。 全体の活性収率は2.2％であり、比活性は100倍
に達した。
第１図は本発明酵素のPH作用曲線を示す。第２
図は本発明酵素の温度活性曲線を示す。第３図は
本発明酵素のPH安定曲線を示す。第４図は本発明
酵素の熱安定曲線を示す。
図は本発明酵素の温度活性曲線を示す。第３図は
本発明酵素のPH安定曲線を示す。第４図は本発明
酵素の熱安定曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記性質を有する新規アルデハイド・オキシ
ダーゼ (a) 作用 基質アルデヒドに作用し対応する酸を生成す
る。 (b) 基質特異性 アルデハイドに特異的に作用し、他の含窒素
芳香族ヘテロ環化合物、プリン、ハイポキサン
チンおよびキニンに対して触媒作用を示さな
い。 (c) 至適PH：6.5附近 (d) 安定PH：5.5〜８（70℃、30分間処理） (e) 作用適温：50℃附近 (f) 各種金属イオン、阻害剤の影響 塩化第２水銀、ｐ−クロロマーキユリフエニ
ルスルホン酸によつて阻害される。 (g) 分子量：約11万。
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|---|---|---|---|
| JP57060709A JPS58179489A (ja) | 1982-04-12 | 1982-04-12 | 新規アルデハイド・オキシダ−ゼ |
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| DE8383302021T DE3370494D1 (en) | 1982-04-12 | 1983-04-11 | Aldehyde oxidase, process for its production and microorganism therefor |
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|---|---|---|---|
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Family
ID=13150080
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|---|---|---|---|
| JP57060709A Granted JPS58179489A (ja) | 1982-04-12 | 1982-04-12 | 新規アルデハイド・オキシダ−ゼ |
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