JPH0653069B2 - 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 - Google Patents
耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法Info
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- JPH0653069B2 JPH0653069B2 JP60020625A JP2062585A JPH0653069B2 JP H0653069 B2 JPH0653069 B2 JP H0653069B2 JP 60020625 A JP60020625 A JP 60020625A JP 2062585 A JP2062585 A JP 2062585A JP H0653069 B2 JPH0653069 B2 JP H0653069B2
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y103/03—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with oxygen as acceptor (1.3.3)
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ビリルビン・オキシダーゼ（Bilirubin Oxid
ase）の新規な製法に関する。さらに詳しくは、バチル
ス（Bacillus）属に属するビリルビン・オキシダーゼ生
産菌を培養し、培養物より該ビリルビン・オキシダーゼ
を採取してなるビリルビン・オキシダーゼの製造法に関
する。
ase）の新規な製法に関する。さらに詳しくは、バチル
ス（Bacillus）属に属するビリルビン・オキシダーゼ生
産菌を培養し、培養物より該ビリルビン・オキシダーゼ
を採取してなるビリルビン・オキシダーゼの製造法に関
する。
従来技術 従来、ビリルビンに基質特異性を有し、ビリルビンおよ
び酸素からビリベルジンと水を生成する反応を触媒する
酵素としてビリルビン・オキシダーゼが知られており、
その生産菌としは、ミロセシウム（Myrothecium）属由
来〔N.Tanaka and S.Murao,Agric.Biol.Chem.,46,2499
（１９８２）〕、スエヒロタケ（Schizophy11um）属由
来（特開昭５９−１３５８８６号公報）、コプリナス
（Coprinus）属、トラメテス（Trametes）属、レンヂテ
ス（Renzites）属、コリオラス（Coriolus）属、フオリ
オタ（Pholiora）属、プロイタス（Pleurotus）属又は
フミトプシス（Fomitopsis）属由来、（特開昭５９−１
９８９７１号公報）が報告されている。
び酸素からビリベルジンと水を生成する反応を触媒する
酵素としてビリルビン・オキシダーゼが知られており、
その生産菌としは、ミロセシウム（Myrothecium）属由
来〔N.Tanaka and S.Murao,Agric.Biol.Chem.,46,2499
（１９８２）〕、スエヒロタケ（Schizophy11um）属由
来（特開昭５９−１３５８８６号公報）、コプリナス
（Coprinus）属、トラメテス（Trametes）属、レンヂテ
ス（Renzites）属、コリオラス（Coriolus）属、フオリ
オタ（Pholiora）属、プロイタス（Pleurotus）属又は
フミトプシス（Fomitopsis）属由来、（特開昭５９−１
９８９７１号公報）が報告されている。
発明が解決しようとする問題点 ビリルビン・オキシダーゼは、臨床化学の分野における
血清中のビリルビンの定量や血清中のビリルビン以外の
被験成分を分析定量する際に測定値の誤差要因となるビ
リルビンの除去試薬として近年注目されているが、従来
のビリルビン・オキシダーゼにおいて、ミロセシリウ属
由来の酵素は１５分、３７℃で安定であるが７０℃にお
いては残存活性２０％程度であり、またスエヒロタケ属
由来の酵素は１０分間４５℃まで安定であるにすぎず、
さらにそのほかの生産菌由来の酵素、例えばコプリナス
属由来の酵素も１０分間、６０℃において残存活性９０
〜９５％を示すもので、熱安定性において十分ではな
く、さらに製造時、処理等において温度管理を要求さ
れ、また酵素利用の一手段として固定化する場合におい
ても条件によつては酵素の失活をまねき、酵素の取り扱
いにおいて必ずしも満足のいくものではなかつた。
血清中のビリルビンの定量や血清中のビリルビン以外の
被験成分を分析定量する際に測定値の誤差要因となるビ
リルビンの除去試薬として近年注目されているが、従来
のビリルビン・オキシダーゼにおいて、ミロセシリウ属
由来の酵素は１５分、３７℃で安定であるが７０℃にお
いては残存活性２０％程度であり、またスエヒロタケ属
由来の酵素は１０分間４５℃まで安定であるにすぎず、
さらにそのほかの生産菌由来の酵素、例えばコプリナス
属由来の酵素も１０分間、６０℃において残存活性９０
〜９５％を示すもので、熱安定性において十分ではな
く、さらに製造時、処理等において温度管理を要求さ
れ、また酵素利用の一手段として固定化する場合におい
ても条件によつては酵素の失活をまねき、酵素の取り扱
いにおいて必ずしも満足のいくものではなかつた。
発明が解決しようとする手段 本発明者らは、種々研究した結果、神奈川県足柄下群箱
根町の大桶谷の土壌より分離したバチルス属に属する菌
株Ｂ−０８９１株が、ビリルビンおよび酸素からビリベ
ルジンと水を生ずる反応を触媒するビリルビン・オキシ
ダーゼを生産し、かつこのビリルビン・オキシダーゼ
が、７０℃付近において安定である熱安定性良好な酵素
であることを見い出した。
根町の大桶谷の土壌より分離したバチルス属に属する菌
株Ｂ−０８９１株が、ビリルビンおよび酸素からビリベ
ルジンと水を生ずる反応を触媒するビリルビン・オキシ
ダーゼを生産し、かつこのビリルビン・オキシダーゼ
が、７０℃付近において安定である熱安定性良好な酵素
であることを見い出した。
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので少なくと
もビリルビンに基質特異性を有し、ビリルビンおよび酵
素からビリベルジンと水を生ずる反応を触媒するビリル
ビン・オキシダーゼにおいて少なくとも耐熱性を有する
ことを特徴とするビリルビン・オキシダーゼおよびバチ
ルス属に属するビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培地
に培養し、培養物よりビリルビン・オキシダーゼを採取
することを特徴とするビリルビン・オキシダーゼの製造
法に関するものである。
もビリルビンに基質特異性を有し、ビリルビンおよび酵
素からビリベルジンと水を生ずる反応を触媒するビリル
ビン・オキシダーゼにおいて少なくとも耐熱性を有する
ことを特徴とするビリルビン・オキシダーゼおよびバチ
ルス属に属するビリルビン・オキシダーゼ生産菌を培地
に培養し、培養物よりビリルビン・オキシダーゼを採取
することを特徴とするビリルビン・オキシダーゼの製造
法に関するものである。
本発明の新規なビリルビン・オキシダーゼ生産菌の分類
学的性状は以下の通りである。
学的性状は以下の通りである。
(1)形態（普通寒天培地にて３０℃、２４時間培養の結
果） 細胞の形、大きさ、多形性の有無 単独、または短連鎖で端の丸い桿菌で、大きさは、0.5
〜0.8×2.0〜４０μｍで、多形性は無い。
果） 細胞の形、大きさ、多形性の有無 単独、または短連鎖で端の丸い桿菌で、大きさは、0.5
〜0.8×2.0〜４０μｍで、多形性は無い。
運動性及び鞭毛：なし 芽胞（形、大きさ、位置、菌体のふくらみ）：中央又
は中央に近い位置に楕円形又は円筒形で大きさは0.5×
1.0μｍの芽胞を形成する。芽胞によつて菌体は膨張し
ない。
は中央に近い位置に楕円形又は円筒形で大きさは0.5×
1.0μｍの芽胞を形成する。芽胞によつて菌体は膨張し
ない。
染色：陽性 抗酸化性染色：陰性 (2)生育試験 普通寒天平板培養（２８〜３０℃ ２４時間）円形で
平らな柔らかい集落を形成する。周辺は不規則で表面は
やや乾燥している。色は灰白色で可溶性色素は産生しな
い。
平らな柔らかい集落を形成する。周辺は不規則で表面は
やや乾燥している。色は灰白色で可溶性色素は産生しな
い。
普通寒天斜面培養（２８〜３０℃ ２４時間）線状に
生育し、生育は良好であり、色は灰白色で可溶性色素は
産生しない。
生育し、生育は良好であり、色は灰白色で可溶性色素は
産生しない。
液体培養（ペプトン水、２８〜３０℃ ２４時間）生
育は弱く柔毛状沈澱を生ずる。
育は弱く柔毛状沈澱を生ずる。
ＢＣＰミルク（２８〜３０℃ ２４時間）溶液はアル
カリ性になりペプトン化する。
カリ性になりペプトン化する。
(3)生理的性質 硝酸塩の還元 ＋ 脱窒反応 − ＭＲテスト − ＶＰテスト ＋ 硫化水素の生成 − インドールの生成 − デンプンの加水分解 ＋ クエン酸塩の利用（シモンズ培地） ＋ 〃 （クリステンゼン培地） ＋ マレイン酸塩の利用 ＋ プロピオン酸塩の利用 − 可溶性色素の生成 − ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） − 〃 （クリステンゼン） − オキシダーゼ産生 ＋ レシチナーゼ産生 − カタラーゼ産生 ＋ 生育の範囲（pH） 5.0〜9.0 生育温度 ５０℃ ＋ ２０℃ ＋ １５℃ − 嫌気条件での生育 ＋ ＯＦテスト Ｆ ゼラチンの加水分解 ＋ ガゼインの加水分解 ＋ エスクリンの加水分解 ＋ セルロースの加水分解 − チロシンの加水分解 − 耐塩性 ４％まで サブロー培地での生育 ＋ ＧＣ％（Ｔｍ法） ４４％ (4)糖より酸・ガスの産生（基礎培地：ペプトン不含培
地，NH4H2PO41.0ｇ、KCl0.2ｇMgSO4・７H2O 0.2ｇ、イ
ーストエキス1.0ｇ寒天3.0ｇ、ＢＴＢ（0.2％）10.0ml
蒸留水１０００ml、pH7.2） 以上の結果から、本菌株の主性状は、単独、または短連
鎖で端の丸い桿状のグラム陽性の非運動性の細菌であ
り、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性で、グルコース
より発酵的に酸を産生し、５０℃で生育し、核酸のグア
ニン・シトシン含量（ＧＣ％）は４４％である。
地，NH4H2PO41.0ｇ、KCl0.2ｇMgSO4・７H2O 0.2ｇ、イ
ーストエキス1.0ｇ寒天3.0ｇ、ＢＴＢ（0.2％）10.0ml
蒸留水１０００ml、pH7.2） 以上の結果から、本菌株の主性状は、単独、または短連
鎖で端の丸い桿状のグラム陽性の非運動性の細菌であ
り、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性で、グルコース
より発酵的に酸を産生し、５０℃で生育し、核酸のグア
ニン・シトシン含量（ＧＣ％）は４４％である。
本菌株の主な性状について、Bergey's Manual of Deter
minative Bactenology８版（１９７４）を参照とした結
果、本菌株は、バチルス属に属する菌株と判定し、そこ
で、Handbook No.４２７The genus Bacillusを参照とし
て近似菌であるバチルス・リフエニフオルミス（Bacill
us licheniformis），バチルス・セレウス（Bacillus c
ereus），バチルス・コアギユランス（Bacillus coaqul
ans）の諸性状に基づいて比較検討の結果、バチルス・
リフエニフオルミスの諸性状がよく一致しているが、そ
の運動性、耐塩性において若干の相異が認められた。以
上の結果から本菌株は、バチルス・リフエニフオルミス
に属し、その変異株と判断したもので、よつて本菌株を
バチルス・リフエニフオルミス・Ｂ−０８９１（Bacill
us licheniformisＢ−Ｏ８９１）と命名した。
minative Bactenology８版（１９７４）を参照とした結
果、本菌株は、バチルス属に属する菌株と判定し、そこ
で、Handbook No.４２７The genus Bacillusを参照とし
て近似菌であるバチルス・リフエニフオルミス（Bacill
us licheniformis），バチルス・セレウス（Bacillus c
ereus），バチルス・コアギユランス（Bacillus coaqul
ans）の諸性状に基づいて比較検討の結果、バチルス・
リフエニフオルミスの諸性状がよく一致しているが、そ
の運動性、耐塩性において若干の相異が認められた。以
上の結果から本菌株は、バチルス・リフエニフオルミス
に属し、その変異株と判断したもので、よつて本菌株を
バチルス・リフエニフオルミス・Ｂ−０８９１（Bacill
us licheniformisＢ−Ｏ８９１）と命名した。
なお、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第８０１８号（ＦＥＲＭ−８０１８）として寄託
された。
研菌寄第８０１８号（ＦＥＲＭ−８０１８）として寄託
された。
本発明のビリルビン・オキシダーゼを生産するに当つて
は、このビリルビン・オキシダーゼ生産菌を酵素などを
生産する通常の方法で培養する。培養の形態は、液体培
養でも固体培養でもよいが工業的にはビリルビン・オキ
シダーゼ生産菌の細胞をその生産用培地に接種し、深部
通気攪拌培養を行なうのが有利である。ビリルビン・オ
キシダーゼを培養するための培地組成は、微生物の培養
に通常用いられるものが広く使用される。窒素源として
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコーン・ス
リーブ・リカー、ペプトン、カゼイン、大豆粉、酵母エ
キス、種々の肉エキスなどが使用される。炭素源として
は資化可能な炭素化合物であればよく、例えば糖蜜、グ
ルコース、グリセリン、シユクロース、デキストリンな
どが使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム
などの種々の無機塩が必要に応じて使用される。培養温
度は菌が発育し、ビリルビン・オキシダーゼを生産する
範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは、２５〜３０℃
である。培養時間は、条件によつて多少異なるが、通常
７〜８日程度である。しかしながら、ビリルビン・オキ
シダーゼが最高力価に達する時期をみはからつて適当な
時期に培養を終了するのは当然のことである。
は、このビリルビン・オキシダーゼ生産菌を酵素などを
生産する通常の方法で培養する。培養の形態は、液体培
養でも固体培養でもよいが工業的にはビリルビン・オキ
シダーゼ生産菌の細胞をその生産用培地に接種し、深部
通気攪拌培養を行なうのが有利である。ビリルビン・オ
キシダーゼを培養するための培地組成は、微生物の培養
に通常用いられるものが広く使用される。窒素源として
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコーン・ス
リーブ・リカー、ペプトン、カゼイン、大豆粉、酵母エ
キス、種々の肉エキスなどが使用される。炭素源として
は資化可能な炭素化合物であればよく、例えば糖蜜、グ
ルコース、グリセリン、シユクロース、デキストリンな
どが使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マ
グネシウム、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム
などの種々の無機塩が必要に応じて使用される。培養温
度は菌が発育し、ビリルビン・オキシダーゼを生産する
範囲内で適宜変更し得るが、好ましくは、２５〜３０℃
である。培養時間は、条件によつて多少異なるが、通常
７〜８日程度である。しかしながら、ビリルビン・オキ
シダーゼが最高力価に達する時期をみはからつて適当な
時期に培養を終了するのは当然のことである。
培養終了後、該培養物より本酵素を採取するには通常の
酵素採取手段を用いて得ることができる。なお、本酵素
は菌体内および培養液相の両方に存在するが、採取効率
等の問題により、通常は、該培養物より菌体を分別除去
した培養液相より得るが、菌体内より酵素を採取する通
常の手段を用い酵素を採取、培養液相より得たものと合
わせて用いてもよい。このようにして得られた粗酵素液
はさらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製手段を用
いて精製し、精製されたビリルビン・オキシダーゼが得
られる。例えば、粗製のビリルビン・オキシダーゼ含有
液に、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶
媒による分別沈澱法、硫安、食塩、硫酸アルミニウムな
どによる塩析法などを用い溶液から酵素を沈澱せしめ、
粗酵素を回収すればよい。
酵素採取手段を用いて得ることができる。なお、本酵素
は菌体内および培養液相の両方に存在するが、採取効率
等の問題により、通常は、該培養物より菌体を分別除去
した培養液相より得るが、菌体内より酵素を採取する通
常の手段を用い酵素を採取、培養液相より得たものと合
わせて用いてもよい。このようにして得られた粗酵素液
はさらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製手段を用
いて精製し、精製されたビリルビン・オキシダーゼが得
られる。例えば、粗製のビリルビン・オキシダーゼ含有
液に、アセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶
媒による分別沈澱法、硫安、食塩、硫酸アルミニウムな
どによる塩析法などを用い溶液から酵素を沈澱せしめ、
粗酵素を回収すればよい。
次いでさらに必要に応じて精製するに当つて、この沈澱
物を、トリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、これを
ジエチルアミノエチル−セルロース、ジエチルアミノエ
チル−デキストランゲル、四級アミノエチル−デキスト
ランゲルなどのイオン交換樹脂やデキストランゲルやポ
リアクリルアマイドゲルなどのゲルろ過剤によるクロマ
トグラフィーを適宜組合せて行なつて精製し、次いでこ
れを凍結乾燥等の手法をもちい乾燥し、精製ビリルビン
−オキシダーゼを得る。
物を、トリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、これを
ジエチルアミノエチル−セルロース、ジエチルアミノエ
チル−デキストランゲル、四級アミノエチル−デキスト
ランゲルなどのイオン交換樹脂やデキストランゲルやポ
リアクリルアマイドゲルなどのゲルろ過剤によるクロマ
トグラフィーを適宜組合せて行なつて精製し、次いでこ
れを凍結乾燥等の手法をもちい乾燥し、精製ビリルビン
−オキシダーゼを得る。
このようにして得られたビリルビン・オキシダーゼの、
理化学的性質は以下に述べる通りである。
理化学的性質は以下に述べる通りである。
(1)活性測定法 0.2Ｍトリス塩酸緩衝液 （pH8.0／ｎＭ ＥＤＴＡ含有）0.5ml 水 0.94ml ビリルビン・オキシダーゼ溶液 0.05ml 上記組成の反応液1.49mlを小試験管にとり、３７℃に加
温後、１０ｍＭビリルビン0.01mlを添加して反応を開始
し、３７℃で１０分間反応せしめる。反応後、１％ＣＰ
Ｃ（塩化Ｎ−セチルピリジニウム）を1.5ml添加し反応
を停止させた後４５３ｎｍにて比色して、その吸光度
(S)を測定した。一方、ブランクとして、上記反応液よ
り酸素溶液を除いた反応液1.44mlにビリルビン0.01mlを
添加して正確に３７℃で１０分間経過した後１％ＣＰＣ
1.5ml、ビリルビン・オキシダーゼ0.05mlを順次添加
し、４５３ｎｍにて比色し、その吸光(B)度を測定し、
下記の計算式より酵素活性を算出する。酵素活性／単位
(U)は上記条件において１分間に１μモルのビリルビン
を酸化する酵素量とする。
温後、１０ｍＭビリルビン0.01mlを添加して反応を開始
し、３７℃で１０分間反応せしめる。反応後、１％ＣＰ
Ｃ（塩化Ｎ−セチルピリジニウム）を1.5ml添加し反応
を停止させた後４５３ｎｍにて比色して、その吸光度
(S)を測定した。一方、ブランクとして、上記反応液よ
り酸素溶液を除いた反応液1.44mlにビリルビン0.01mlを
添加して正確に３７℃で１０分間経過した後１％ＣＰＣ
1.5ml、ビリルビン・オキシダーゼ0.05mlを順次添加
し、４５３ｎｍにて比色し、その吸光(B)度を測定し、
下記の計算式より酵素活性を算出する。酵素活性／単位
(U)は上記条件において１分間に１μモルのビリルビン
を酸化する酵素量とする。
(2)基質特異性 酸素電極計を用いて各基質に対する酸素消費速度から特
異性を検討した結果、第２表に示す通りである。使用基
質量は、0.1ｍＭ、使用酵素量は0.005Ｕで行なつた。
異性を検討した結果、第２表に示す通りである。使用基
質量は、0.1ｍＭ、使用酵素量は0.005Ｕで行なつた。
(3)酵素作用 次の反応を触媒する。
ビリルビン＋1/2O2→ビリベルジン＋H2Oしかしながら下
記に示すビリベルジンから、淡紫色物への酸化はごく微
弱に生ずる。
記に示すビリベルジンから、淡紫色物への酸化はごく微
弱に生ずる。
ビリベルジン＋1/2O2→淡紫色物＋H2O (4)熱安定性 pH7.5（トリス−塩酸緩衝液）で３０〜１００℃の各温
度にて、１０分間処理した後、氷水中にて冷却し、次い
でこれを酵素の活性測定法に基いてその残存活性を測定
した。その結果第１図に示す通りで、本発明のビリルビ
ンオキシダーゼの熱安定性は、７０℃付近まで安定であ
り、９０℃においても、５０％以上の活性が残存した。
度にて、１０分間処理した後、氷水中にて冷却し、次い
でこれを酵素の活性測定法に基いてその残存活性を測定
した。その結果第１図に示す通りで、本発明のビリルビ
ンオキシダーゼの熱安定性は、７０℃付近まで安定であ
り、９０℃においても、５０％以上の活性が残存した。
(5)至適温度 前記活性測定法における反応液および方法を用いて種々
の温度における影響を調べた。
の温度における影響を調べた。
その結果は第２図に示す通りであり、本発明のビリルビ
ン・オキシダーゼの至適温度は、８０℃付近であると認
められた。
ン・オキシダーゼの至適温度は、８０℃付近であると認
められた。
(6)pH安定性 各種pHの緩衝液にて３７℃、１時間保持した後、本酵素
の活性を前記活性測定法に基づいて測定してpHの影響を
調べた。
の活性を前記活性測定法に基づいて測定してpHの影響を
調べた。
その結果は第３図に示す通りであり〔図中、 酢酸緩衝液（pH4.0−6.0）、○−○：ジメチルグルタル
酸−NaOH緩衝液（pH7.5−9.0）、●−●：リン酸緩衝液
（pH6.5−8.0）、 トリス・塩酸緩衝液（pH7.5−9.0）を示す〕、本発明の
ビリルビン・オキシダーゼのpH安定性は、pH７−９付近
と認められた。
酸−NaOH緩衝液（pH7.5−9.0）、●−●：リン酸緩衝液
（pH6.5−8.0）、 トリス・塩酸緩衝液（pH7.5−9.0）を示す〕、本発明の
ビリルビン・オキシダーゼのpH安定性は、pH７−９付近
と認められた。
(7)至適pH 前記活性測定法における緩衝液として各種pHの緩衝液を
用いて、本酵素の活性に及ぼすpHの影響を調べた。
用いて、本酵素の活性に及ぼすpHの影響を調べた。
その結果は第４図に示す通りであり〔図中、 酢酸緩衝液（pH4.0−6.0）、○−○：ジメチルグルタル
酸−NaOH緩衝液（pH7.5−9.0）、●−●：リン酸緩衝液
（pH6.5−8.0）、 トリス−塩酸緩衝液（pH7.5−9.0）を示す、本発明のビ
リルビン・オキシダーゼの至適pHは、pH８付近と認めら
れた。
酸−NaOH緩衝液（pH7.5−9.0）、●−●：リン酸緩衝液
（pH6.5−8.0）、 トリス−塩酸緩衝液（pH7.5−9.0）を示す、本発明のビ
リルビン・オキシダーゼの至適pHは、pH８付近と認めら
れた。
(8)阻害および活性化 本ビリルビン・オキシダーゼは、Cu2+，Zn2+，Mn2+，の
金属イオン，および、ＣＰＣ，カチオンＦＢで阻害さ
れ、ＦＡＤで活性化された。
金属イオン，および、ＣＰＣ，カチオンＦＢで阻害さ
れ、ＦＡＤで活性化された。
(9)分子量 50,000±10,000（セフアクリルＳ−３００によるゲルろ
過法にて） (10)等電点 焦点電気泳動法により測定した結果、pH3.35付近であ
る。
過法にて） (10)等電点 焦点電気泳動法により測定した結果、pH3.35付近であ
る。
(11)Ｋｍ値 2.86×１０−５Ｍ（pH8.0） 以上の本発明の酵素を従来のビリルビン・オキシダーゼ
とを比較すると第３表の如くである。
とを比較すると第３表の如くである。
上述の如く、本酵素はその酵素化学的、物理化学的諸性
質より公知の何れのビリルビン・オキシダーゼとも異な
つており、熱安定性については、既存のビリルビン・オ
キシダーゼにて最も熱安定性に優れたコプリナス属由来
のビリルビン・オキシダーゼにおいても、６０℃，１０
分間の処理で９０〜９５％の残存活性であるのに対し、
本発明のビリルビン・オキシダーゼは、７０℃，１０分
間の処理まで安定であり、９０℃，１０分間の処理して
もなお、５０％もの残存活性を有し、極めてすぐれた耐
熱性を有する酵素であつた。
質より公知の何れのビリルビン・オキシダーゼとも異な
つており、熱安定性については、既存のビリルビン・オ
キシダーゼにて最も熱安定性に優れたコプリナス属由来
のビリルビン・オキシダーゼにおいても、６０℃，１０
分間の処理で９０〜９５％の残存活性であるのに対し、
本発明のビリルビン・オキシダーゼは、７０℃，１０分
間の処理まで安定であり、９０℃，１０分間の処理して
もなお、５０％もの残存活性を有し、極めてすぐれた耐
熱性を有する酵素であつた。
また、本酵素は、Ｋｍ値が2.86×１０−５Ｍと非常に小
さく、反応性も極めて良好なものであつた。
さく、反応性も極めて良好なものであつた。
実施例 以下実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発
明はこれにより限定されるものではない。
明はこれにより限定されるものではない。
実施例１ シユクロース1.0％（Ｗ／Ｖ）、酵母菌体破砕物（ミー
スト（朝日麦酒社製））1.0％（W/V）NaCl0.3％（W/
V），MgSO4・７H2O0.05％（W/V），K2HPO40.1％（W/V）
よりなる培地１００ml（１２０℃，２０分間滅菌、pH7.
5）含有５００ml容三角フラスコにバチルス・リフェニ
フオルミス・Ｂ−０８９１（ＦＥＲＭＰ−No.８０１
８）を接種し、３０℃、２４時間振盪培養して種培養物
を得た。次いでこの種培養物を同一組成を有する培地２
０（１２０℃，２０分間減菌、pH7.5，消泡剤ＣＢ−
４４２の0.1％含有）含有３０容ジヤーフアーメン・
ターに、接種し、３０℃，３００rpm，２０／分の通
気条件にて８日間通気攪拌培養した。培養終了後培養物
を遠心分離（５０００rpm，１５分間）して上清（13.8
，２００Ｕ）を得た。上清液を限外濃縮（モジユール
装置）にて、1.96に濃縮し、濃縮液に対して0.6容の
冷アセトンを添加し、遠心分離（５０００rpm，１５分
間）して、不溶物を除去し、後に、さらに濃縮液に対し
て1.6容の冷アセトンを添加し、ビリルビン・オキシダ
ーゼ活性画分を析出せしめ、遠心分離（５０００rpm，
１５分間）して分離し、沈澱物を0.2Ｍトリス−塩酸緩
衝液にて溶解し、２０５ml，２００Ｕの酵素溶液を得
た。この酵素溶液をセルロースアセテートチユーブを用
いて１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（pH7.5）１５に対
して一液透析後、あらかじめ上記緩衝液で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セフアロースＣＬ−６Ｂカラム（5.0×14.5c
m）に吸着させ、次いで０〜1.0モルの塩化カリウム濃度
勾配溶出法で溶出せしめ、本酵素は、0.3〜0.5モルの塩
化カリウム濃度で溶出された酵素活性区分を回収した。
さらに、このビリルビン・オキシダーゼ活性区分を限外
過膜ＸＭ−５０（アミコン社製）にて濃縮して、これ
をセフアクリルＳ−２００のカラム（3.6×８０cm）に
て１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を用いて展開
し、展開液量５８０〜６４０mlの間のビリルビン・オキ
シダーゼ活性画分を回収し、これを凍結乾燥し、ビリル
ビン・オキシダーゼの粉末３５０mg（90.0Ｕ）を得た。
スト（朝日麦酒社製））1.0％（W/V）NaCl0.3％（W/
V），MgSO4・７H2O0.05％（W/V），K2HPO40.1％（W/V）
よりなる培地１００ml（１２０℃，２０分間滅菌、pH7.
5）含有５００ml容三角フラスコにバチルス・リフェニ
フオルミス・Ｂ−０８９１（ＦＥＲＭＰ−No.８０１
８）を接種し、３０℃、２４時間振盪培養して種培養物
を得た。次いでこの種培養物を同一組成を有する培地２
０（１２０℃，２０分間減菌、pH7.5，消泡剤ＣＢ−
４４２の0.1％含有）含有３０容ジヤーフアーメン・
ターに、接種し、３０℃，３００rpm，２０／分の通
気条件にて８日間通気攪拌培養した。培養終了後培養物
を遠心分離（５０００rpm，１５分間）して上清（13.8
，２００Ｕ）を得た。上清液を限外濃縮（モジユール
装置）にて、1.96に濃縮し、濃縮液に対して0.6容の
冷アセトンを添加し、遠心分離（５０００rpm，１５分
間）して、不溶物を除去し、後に、さらに濃縮液に対し
て1.6容の冷アセトンを添加し、ビリルビン・オキシダ
ーゼ活性画分を析出せしめ、遠心分離（５０００rpm，
１５分間）して分離し、沈澱物を0.2Ｍトリス−塩酸緩
衝液にて溶解し、２０５ml，２００Ｕの酵素溶液を得
た。この酵素溶液をセルロースアセテートチユーブを用
いて１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（pH7.5）１５に対
して一液透析後、あらかじめ上記緩衝液で緩衝化したＤ
ＥＡＥ−セフアロースＣＬ−６Ｂカラム（5.0×14.5c
m）に吸着させ、次いで０〜1.0モルの塩化カリウム濃度
勾配溶出法で溶出せしめ、本酵素は、0.3〜0.5モルの塩
化カリウム濃度で溶出された酵素活性区分を回収した。
さらに、このビリルビン・オキシダーゼ活性区分を限外
過膜ＸＭ−５０（アミコン社製）にて濃縮して、これ
をセフアクリルＳ−２００のカラム（3.6×８０cm）に
て１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を用いて展開
し、展開液量５８０〜６４０mlの間のビリルビン・オキ
シダーゼ活性画分を回収し、これを凍結乾燥し、ビリル
ビン・オキシダーゼの粉末３５０mg（90.0Ｕ）を得た。
発明の効果 本発明の製造法は、熱安定性にすぐれ、酵素利用の一手
段として固定化する際に、または、臨床診断薬として取
り扱う際に、熱に対して、失活等をまねく恐れが非常に
少なく扱いやすい良好なビリルビン・オキシダーゼを提
供するものである。
段として固定化する際に、または、臨床診断薬として取
り扱う際に、熱に対して、失活等をまねく恐れが非常に
少なく扱いやすい良好なビリルビン・オキシダーゼを提
供するものである。
第１図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの熱安定性
を示し、 第２図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適温度
を示し、 第３図は本発明のビリルビン・オキシダーゼのpH安定性
を示し、 第４図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適pHを
示す。
を示し、 第２図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適温度
を示し、 第３図は本発明のビリルビン・オキシダーゼのpH安定性
を示し、 第４図は本発明のビリルビン・オキシダーゼの至適pHを
示す。
Claims (3)
- 【請求項１】下記の性状のビリルビン・オキシダーゼの
生産能を有するバチルス属に属する生産菌を培地に培養
し、培養物より該ビリルビン・オキシダーゼを採取する
ことを特徴とするビリルビン・オキシダーゼの製造法。 (a)酵素の作用および基質特異性 少なくともビリルビ
ンに基質特異性を有し、ビリルビンおよび酸素からビリ
ベルジンと水を生ずる反応を触媒する (b)分子量 ５０，０００±１０，０００（セファクリ
ルＳ−３００によるゲル濾過法） (c)等電点 pH３．３５付近 (d)Ｋｍ値 ２．８６×１０−５Ｍ付近 (e)至適pH pH８付近 (f)安定pH pH７〜９付近にて安定 (g)至適温度 ８０℃付近 (h)熱安定性 ７０℃付近まで安定 - 【請求項２】バチルス属に属する生産菌が、バチルス・
リフェニフォルミスである特許請求の範囲第１項記載の
製造法。 - 【請求項３】バチルス属に属する生産菌が、バチルス・
リフェニフォルミスＢ−０８９１株（ＦＥＲＭＰ−No.
８０１８）である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60020625A JPH0653069B2 (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 |
| US06/820,011 US4770997A (en) | 1985-02-05 | 1986-01-21 | Thermostable bilirubin oxidase and production process thereof |
| DE19863603257 DE3603257A1 (de) | 1985-02-05 | 1986-02-03 | Thermostabile bilirubin-oxidase und verfahren zur herstellung derselben |
| FR8601498A FR2576909B1 (fr) | 1985-02-05 | 1986-02-04 | Bilirubine oxydase thermostable et son procede d'obtention |
| IT47616/86A IT1203738B (it) | 1985-02-05 | 1986-02-04 | Bilirubin-cssidasi termostabile e procedimento per produrla |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60020625A JPH0653069B2 (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61209587A JPS61209587A (ja) | 1986-09-17 |
| JPH0653069B2 true JPH0653069B2 (ja) | 1994-07-20 |
Family
ID=12032419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60020625A Expired - Lifetime JPH0653069B2 (ja) | 1985-02-05 | 1985-02-05 | 耐熱性ビリルビン・オキシダーゼの製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4770997A (ja) |
| JP (1) | JPH0653069B2 (ja) |
| DE (1) | DE3603257A1 (ja) |
| FR (1) | FR2576909B1 (ja) |
| IT (1) | IT1203738B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2578430B2 (ja) * | 1987-06-10 | 1997-02-05 | 旭化成工業株式会社 | 新規なビリルビン．オキシダーゼおよびその製造法 |
| EP0320095A3 (en) * | 1987-12-10 | 1989-08-02 | HEALTH & RESEARCH SERVICES INC. | Bilirubin degrading enzymes |
| JP2856757B2 (ja) * | 1989-03-13 | 1999-02-10 | ユニチカ株式会社 | 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬 |
| DE4406379A1 (de) * | 1993-03-24 | 1994-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Bilirubinoxidase aus Alfalfa und Verwendung des Enzyms |
| JP3320307B2 (ja) * | 1996-06-06 | 2002-09-03 | 株式会社エス・ディー・エス バイオテック | フェノール性化合物等の高分子化方法及びその利用 |
| JP3734115B2 (ja) * | 1997-02-28 | 2006-01-11 | 日東紡績株式会社 | ビリルビン画分の測定方法 |
| ATE418605T1 (de) * | 2003-03-28 | 2009-01-15 | Council Scient Ind Res | Verfahren zur herstellung von hitzebeständige enzyme |
| US7504243B2 (en) * | 2004-03-19 | 2009-03-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods for the production of biliverdin |
| WO2007103427A2 (en) * | 2006-03-06 | 2007-09-13 | Wang Xiang H | Medical use of bilirubin and its structural analogues |
| FR2957934B1 (fr) | 2010-03-24 | 2014-10-17 | Centre Nat Rech Scient | Bilirubine oxydase de bacillus pumilus et ses applications |
| US8740994B2 (en) | 2011-05-11 | 2014-06-03 | Amano Enzyme Inc. | Dyeing agent and use for same |
| FR2975704B1 (fr) | 2011-05-24 | 2015-02-20 | Centre Nat Rech Scient | Bilirubine oxydase de magnaporthe oryzae et ses applications |
| EP4582549A1 (en) | 2022-09-02 | 2025-07-09 | Amano Enzyme Inc. | Phenylacetaldehyde production method and use application thereof |
| WO2024247292A1 (ja) | 2023-05-26 | 2024-12-05 | 天野エンザイム株式会社 | アルデヒド化合物の製造方法及びその応用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5861000A (ja) * | 1981-10-08 | 1983-04-11 | Nippon Shoji Kk | 体液成分の酵素的定量におけるビリルピンの干渉除去方法 |
| JPS59198971A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ビリルビンオキシダ−ゼの製造法 |
-
1985
- 1985-02-05 JP JP60020625A patent/JPH0653069B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-21 US US06/820,011 patent/US4770997A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-03 DE DE19863603257 patent/DE3603257A1/de not_active Ceased
- 1986-02-04 FR FR8601498A patent/FR2576909B1/fr not_active Expired
- 1986-02-04 IT IT47616/86A patent/IT1203738B/it active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8647616A0 (it) | 1986-02-04 |
| FR2576909B1 (fr) | 1988-10-14 |
| DE3603257A1 (de) | 1987-01-08 |
| US4770997A (en) | 1988-09-13 |
| FR2576909A1 (fr) | 1986-08-08 |
| IT1203738B (it) | 1989-02-23 |
| JPS61209587A (ja) | 1986-09-17 |
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