JPH021553A - ヒトｉｖ型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、肝臓疾患を簡易に診断するのに有用なヒトＩ
Ｖコラーゲンペプチドの酵素免疫学的定量法に関するも
のである。

さらに詳しく官えば、本発明は、ヒトＩＶコラーゲンに
対するモノクローナル抗体を用いた１段階サンドイツチ
法に基づく酵素免疫学的定量法によるヒトＩＶコラーゲ
ンの分子中央三重ラセン部位の定量法ならびにヒトＩＶ
コラーゲン７−Ｓドメインの定量法を提供するものであ
る。

〔背景技術〕

従来、血中ヒト■をプロコラーゲンＮ末端ペプチド、ヒ
ト■梨コラーゲンＮ末端ペプチド７−Ｓドメインおよび
同、Ｃ末端ペプチドＭＣＩドメインの各ポリクローナル
抗体を用いて放射性免疫学的測定を行ったという報告が
なされている　（Ｒｏｈｄｇら、Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　
Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、＋　　９．　４５１〜４
５Ｌ　　１９７９、Ｈａｇｅｍａｎｎら、Ｃ１１ｎ、　
Ｃｈｉｍ−Ａｃｔａ。

１４４　１−１０．　１９８４．５ｃｈｕｐｐａｎら、
Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　７８．２４４〜２４８．１９８６）。

しかしながら、血中のヒトＩＶコラーゲンの分子中央三
重ラセン部位について、ならびにヒトＩＶコラーゲン７
−Ｓドメインについて、それらを定量する方法に関して
は、未だ報告はなされていない。

本発明者らは、ヒトＩＶコラーゲンを特異的に定量する
方法に関し、種々研究した結果、本発明によりペプシン
可溶化ヒトＩＶコラーゲンに対するモノクローナル抗体
あるいはヒトＩＶ［コラーゲン７−Ｓドメインに対する
モノクローナル抗体を用い、１段階サンドイッチ法に基
づく酵素免疫学的定量法を行うことにより、少量の試料
で、良好な精度で迅速に測定し得るヒトＩＶコラーゲン
ペプチドの定量法を提供することに成功した。従来知ら
れているサンドイツチ法、すなわち、同相化抗体と試料
中の抗原との反応（第１反応）、次いで、固相化抗体−
抗原複合体と酵素標識抗体との反応（第２反応）、さら
に酵素基質による発色反、応（第３反応）と、発色反応
までに２段階の免疫反応を必要とするサンドイッチ法に
くらべ、本発明方法においては、第１反応と第２反応を
同時に行う１段階サンドイッチ法によるため、より高い
精度で、短時間で、多数の検体の測定を簡易に行うこと
ができる。

〔発明の開示〕

本発明は、下記（１）および（２）に記載した１段階サ
ンドイツチ法に基づく酵素免疫学的定量法を行うことに
よるヒトＩＶコラーゲンの定量法を提供するものである
。

（１）ペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンに対するモノ
クローナル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく酵素免
疫学的測定法によるヒトＩＶコラーゲンの分子中央三重
ラセン部位の定量法であって、 （ａ）ヘプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンの分子中央三
重ラセン部位と交差反応するモノクローナル抗体に酵素
標識を付与した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測
定対象試料を希釈して得られる試料希釈液と、（ｂ）ペ
プシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンのみに交差反応するモ
ノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体結合固相
担体 とを用い、上記希釈液（ａ）中に、上記の抗体結合固相
担体（ｂ）を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒ
トＩＶコラーゲンと上記の酵素標識抗体ならびに上記の
固相担体に結合している抗体とにおいて免疫反応を行わ
しめた後、固相担体を分別し、その固相担体の酵素活性
を測定することにより、ヒトＩＶコラーゲンの分子中央
三重ラセン部位を定量する方法。

（２）ヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメインに対するモノ
クローナル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく酵素免
疫学的測定法によるヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメイン
の定量法であって、 （ａ）ペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメイ
ンと交差反応するモノクローナル抗体に酵素標識を付与
した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測定対象試料
を希釈して得られる試料希釈液と、 （ｂ）ヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメインのみに交差反
応するモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体
結合固相担体 とを用い、上記希釈液（ａ）中に、上記の抗体結合固相
担体（ｂ）を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒ
トＩＶコラーゲン７−Ｓドメインと上記の酵素標識抗体
ならびに上記の固相担体に結合している抗体とにおいて
免疫反応を行わしめた後、固相担体を分別し、その固相
担体の酵素活性を測定することにより、ヒトＩＶコラー
ゲン７−Ｓドメインを定量する方法。

本発明方法において、酵素標識を付与する抗体としては
、抗体含有物を硫安分画後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ
　ｌおよびプロティンＡアフイニテイ力ラムにより精製
したＩｇＧ画分が用いられる。

本発明方法においては、使用するモノクローナル抗体、
ポリクローナル抗体としては、それら抗体における特異
的結合部分Ｆ（ａｂ’）、、あるいはＦａｂ’そのもの
を使用する態様も含まれるものである。

添付の第２図および第５図にみられるように本発明方法
で測定した肝疾患患者血清中のヒトＩＶ型コラーゲンペ
プチドの分子中央三重ラセン部位およびヒトＩＶコラー
ゲン７−Ｓドメインの濃度の測定値は、健常人血清中の
それよりも有意に高いことが認められ、本発明方法を用
いれば、血中ヒトＩＶコラーゲンペグチドの分子中央三
重ラセン部位およびヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメイン
の濃度測定により、患者に負担のかかるバイオプシーを
実施することなく、肝疾患、特に肝線維化、肝癌および
肝転移消化器癌を予知することができる。

従来の肝機能判定法として使用されているＺＴＴ（硫酸
亜鉛混濁反応）、ＧＯＴ（グルタミンピルビン酸トラン
スアミナーゼ）、ＧＰＴ（グルタミンピルビン酸トラン
スアミナーゼ）、ＡＬＰ（アルカリ性７オスフアターゼ
）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）およびγ−ＧＴＰ　（γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ）などの測定では、
肝組織の線維化、肝癌および肝転移消化器癌を判定する
ことはできず、このことは、本発明者らによって確認さ
れている。したがって、本発明者らが先に報告した血中
ヒトプロリン水酸化酵素濃度の測定（特開昭６１−２０
２１６２公報参照）と本発明方法とをあわせて用いて血
中の、ヒトＩＶコラーゲンペプチドの分子中央三重ラセ
ン部位およびヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメインの濃度
を測定することにより、この種の疾患を早期発見するこ
とが期待される。

本発明方法により、ヒトＩＶコラーゲンペプチドの濃度
測定に基づく肝組織線維化、肝癌および肝転移消化器癌
の診断を行うことができるので、本発明は著しい有用性
を有するものである。以下、一実施例により本発明を具
体的に説明する。ただし本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。

実施例　１ 抗ヒトＩＶコラーゲンペグチドモノクローナル抗体の作
製 （ａ）抗原−ペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンの調製 ヒト胎盤を材料としてＡｒｔｅｒｙ、　７．２６２〜２
８０（１９８０）に記載のＭａｙｎｅらの方法に従い０
．５Ｎ酢酸でホモゲナイズし、ペプシン消化（１ｍｙ／
　ｍ（１）でコラーゲンを可溶化後、最終濃度２Ｍとな
るように塩化ナトリウムを加えコラーゲンを析出させた
。これを０．５Ｎ酢酸に溶解し０．７Ｍ塩化ナトリウム
含有０，５Ｎ酢酸溶液で透析することによりＩ、ＩＩＩ
型コラーゲンを析出させ、その上清を１．２Ｍ塩化ナト
リウム含有０．５Ｎ酢酸溶液で透析し、■、ｖ型コラー
ゲンを析出させた。■、ｖ型コラーゲン画分を０．５Ｍ
塩化ナトリウム含有５ＱｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）に溶解させ、２．２Ｍ塩化ナトリウム含有５
０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で１Ｖｆｉ
コラーゲンを析出させ、Ｖ型コラーゲンと分別した。得
られたＩＶｆｉの純度をＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ−、７２，１４７２〜
１４８０（１９７６）記載の５ｙｋｅｓらの方法に従イ
トデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気
泳動（５ＯＳ−ＰＡＧＥ）で調べたところ約９５％であ
った。

なお、その際１７４ＫＤ、　１３５ＫＤ、　１０８ＫＤ
、　９２ＫＤ、７８ＫＤ、　６８ＫＤ、　６０ＫＤ、　
５６ＫＤ１４３ＫＤ、　３４ＫＤおよび２９．５ＫＤ　
（メルカプトエタノール存在下）の１１個の異なるバン
ドが検出された。

（ｂ）型別コラーゲン、酸抽出■をコラーゲン、ＩＶｆ
ｆｉコラーゲン？−Ｓドメイン、ＩＶＷコラーゲンＮＣ
ｌドメインおよびラミニンＰｉ画分の調製 ヒト胎盤および新生仔ラットを原料に前記（ａ）記載の
方法に従ってヒト胎盤からペプシン可溶化ＩＶ以外にＩ
、Ｉ［、■および■型コラーゲンを分別精製した。また
、新生仔ラットから同様にペプシン″可溶化ＩＶコラー
ゲンを調整した。

ヒトＩＶコラーゲンＮ末端長形７−Ｓドメインは前記（
ａ）で調製したペプシン可溶化ＴＶＷコラーゲンを材料
としてＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　１０８＋
２３９〜２５０（１９８０）に記載のＲ１５ｔｅｌｉら
の方法により調製しＩ；。

酸抽出ＩＶＷコラーゲンはヒト胎盤を材料にＥｕｒ、　
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　８４．４３〜５２（１９７
８）および旺。

２５５〜２６３（１９７９）に記載のＴｉｍｐｌらの方
法に従って調製した。また、ＩＶｆｆｉコラーゲンＣ末
端ＮＣｌドメインは上記酸抽出ＩＶＷコラーゲンを材料
にＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１２０．２０
３〜２１１’（１９８１）に記載のＴｉｍｐｉらの方法
に従って調製した。

一方、ラミエフ２１画分はヒト胎盤を原料にＢｉｏｃｈ
ｅｍ−Ｊ、、　　１９３．７４９〜７５５　（１９８１
）に記載のＲｔｓｔｅｌｉらの方法に従って調製した。

（Ｃ）抗体産生細胞の調製 ペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンｌｏｏμ９を完全フ
ロインドアジュバントと共に８週令のＢＡＬＢ／　Ｃ雌
マウス２匹に初回腹腔内投与した。

２回目以降は０．５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解させた抗原１００
μ９を２〜４週間毎に、２〜４回ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
に追加免疫した。最終免疫として牌臓摘出３日前に静脈
内投与し牌細胞を調製した。

（ｄ）　ｍ泡量合 以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　１６４０　（
Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａ−Ｌｏｒｉｅｓ製）に重炭酸
ナトリウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍ
Ｍ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧカリウ
ム（５０ｕ／ｍα）、硫酸ストレプトマイシン（５０μ
ｇ／ｒＲＱ）、および硫酸アミカシン（ｌＯＯｕｇ／ｌ
ｌ１１２）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、
Ｑ、２７１ｍ　Ｔｏｙｏメンブレンフィルターで除菌濾
過する。

Ｎ５−１培・地：上記ＲＰＭＩ　　１６４０培地に除菌
濾過した仔牛脂児血清（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ製）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加える。

ＨＡＴ培地：上記のＮ５−１培地にさらにヒボキサンチ
ン（１００μＭ）、アミノプテリン（０，４μＭ）、お
よびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＩＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

ＰＥＧ　４，０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地の
ポリエチレングリコール４，０００　（ＰＥＧ　４．０
００．　Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｇｏ。

Ｉｎｃ、製）５０％（ｗ／ｖ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＮＳ−１（Ｒ３−
ＮＳＩ−１）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ　１Ｊｅｔｈ
ｏｄ　１ｎＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　
（ｅｄ、　Ｂ、Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄＳ、Ｍ、
　Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　
Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、　３５１〜３７２に記載
のＯｌらの方法を若干改変して行った。前記（ｃ）で調
製した有核牌臓細胞（生細胞率９５％）とミエローマ細
胞（生細胞率９５％）とを５〜６：１の割合で融合する
。肺臓細胞とミエローマ細胞とを別々に前記のＲＰＭ　
１１６４０培地で洗浄する。次に同じ培地にけん濁し、
融合させるため上記の割合で混合する。容量５０ｍＱの
円錐形スチロール樹脂製試験管（ＴｖａｋｉＧｌａｓｓ
製）を用い、４０ｍａのＲＰＭＩ　１６４０培地中４０
０×９．１０分間遠心し、上溝を完全に吸出する。

沈殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ　４．０００溶液ＬｍＱを
穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間撹
拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に３７℃加温ＲＰ
ＭＩ　１６４０培地１ｍＱを１分間で滴下する。

この操作をさらに１回繰返した後、同培地７ｍｇを２〜
３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞を分散させる。こ
れを４００Ｘｙ、１０分間遠心分離し、上溝を完全に吸
引除去する。次にこの沈殿細胞に３７℃加温Ｎ５−１培
地１０ｍＱをすみやかに加え、細胞の大きい塊りを１０
＋＋Ｉ２のピペットを用いて注意深くピペッティングし
て分散する。さらに同培地２０ｍ（ｌを加えて希釈し、
ポリスチレン製９６穴マイクロウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇ
ｌａｓｓ製）にウェル当り５．９×１０Ｓ個１０．１ｍ
（２の細胞をまき込む。なおこの時使用しＩ；９６六マ
イクロウエルの前処理としてＱ、２ｍＱのＮＳ−１培地
を加え、炭酸ガス培養器中（３７’ｃ）で−晩保温し、
使用時に培地を吸引除去する。細胞融合完了したマイク
ロウェルを７％炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、
湿度１００％下にインキュベートする。

（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 培養１日月にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍ１２）を加える。２．３．５．８．１１日日目
培地の半分（０，１ｍ＋２）を新しいＨＡＴ培地で置き
換える。１４日日目ＨＴ培地に切換え以降３〜４日毎に
同操作を繰り返す。通常２〜３週間で充分なハイブリド
ーマの生育が観察される。ハイブリドーマ生育全ウェル
について次項（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト（ＥＬ
ＩＳＡ）法により陽性ウェルをチエツクする。次にフィ
ーダーとしてｌＯｙ個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地
１ｍαをポリスチレン製２４穴セルウエル（Ｉｗａｋｉ
　Ｇｌａｓｓ製）に加えたものを用い、上記で検出され
た各陽性ハイブリドーマの全内容物を移す。これを前記
（ｄ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３７°Ｃ
で約１週間インキュベートする。その間１〜２回各ウェ
ルの上清０．５ｍＱを新しいＨＴ培地０．５ｍＱと交換
する。ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ
法により陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｇ）
記載の限界希釈法によるクロニングを行う。なお、クロ
ーニングに使用後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ２組
織培養フラスコ（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ製）に移し、
凍結保存用試料を調製する。

（ｆ）　ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＩＶコラーゲンペプ
チド抗体産土ハイブリドーマの検索 Ａｎａ１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１０４．　２０５
−２１４（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法
を若干改変した方法を用いる。この方法は、ハイブリド
ーマ抗体の検出に適している。９６穴ミクロタイトレー
ジヨンプレート（Ｆｌｏｗ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　　Ｉｎｃ、！ａ）を０．５〜１．０μ９のペプシ
ン可溶化ヒトＩＶコラーゲンでコートし、さらにその他
を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でコートしブロック
する。これにハイブリドーマ生育ウェルの上溝の一部を
加えて室温で約１時間インキュベートする。２吹拭体と
して西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）　Ｉ！
識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａ
ｂ。

製）を加えさらに室温で約１時間インキュベートする。

次に過酸化水素と基質である。−フ二二レンジアミン（
ＯＰＤ）を加え生成した褐色の程度ヲマイクロプレート
リーダー（ＭＰＲ−Ａ４．東洋曹達工業製）を用いて４
９２ｎｍの吸光度を測定する。

（ｇ）クローニング 各ウェル中には２種以上のハイブリドーマが生育してい
る可能性があるので、限界希釈法に、Ｉリクローニング
を行い、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得
する。ＮＳ−１培地Ｉ＋ＩＱ当りフィーダーとして１０
’個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製し
９６穴マイクロウエルの３６ウエル、３６ウエルおよび
２４ウエルにつエル当り５個、１個および０．５個のハ
イブリドーマを加える。５日目、１２２日目６約０．１
ｍＱのＮＳ−１培地を追加する。クローニング開始後１
４〜１５日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、
コロニー形成陰性ウェルが５０％以上である群について
ＥＬＩＳＡ法を行う。テストした全ウェルが陽性でない
場合、抗体陽性ウェル中のコロニ数を確認し、ウェル中
に１コロニー＋７）ウェル全４〜６個選び再クローニン
グする。最終的にペプシン可溶化ＩＶコラーゲンに対し
て２２株のクローンを得た。

（ｈ）モノクローナル抗体のインビトロ増殖およびイン
ビボ増殖 モノクローナル抗体は、上記（ｇ）で得られた各クロー
ンをＮＳ−１培地などの適当な培養液で培養（インビト
ロ増殖）し、その培養上清から得ることができる（モノ
クローナル抗体たん白濃度はｌＯ〜１００μｇ７ｍＱで
ある）。一方、大量に抗体を得るためには牌細胞とミエ
ローマ細胞の由来動物と同系の動物（ＢＡＬＢ／ｃ、マ
ウス）に腫瘍形成促進剤プリスタン（２，６，１０，１
４−テトラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ製）をマウス１匹当り０．５ｍｆｆ腹腔内
投与する。１〜３週間後にハイブリドーマｌＸｌ０’個
を同じく腹腔内投与することによりインビボで１〜２週
間後にモノクローナル抗体たん白質濃度４〜７ｍｇ／ｍ
（ｌの腹水を得ることができる。

（ｉ）モノクローナル抗体の重鎮、軽鎖のアイソタイプ 上記（ｈ）で得られた各々の腹水を先ずペプシン可溶化
ヒトＩＶコラーゲンをコートしたミクロタイトレージョ
ンプレートのウェルの各列に入れ、前述したＥＬＩＳＡ
法に従って各腹水中のモノクローナル抗体を結合させる
。洗浄後、アイソタイプ特異性ウサギ抗マウス！ｇ抗体
（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を加える。

洗浄後、ＰＯＤ標識ヤギ抗ウサつＩｇＧ（Ｈ＋　Ｌ）抗
体を加え、基質として２．２′−アジノージ（３−エチ
ルベンゾチアゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用い
て重鎮、軽鎖のアイソタイプを検出した。その結果を第
１表に示した。得られたベズシン可溶化ヒト■塁コラー
ゲンに対するモノクローナル抗体の内、１６個が免疫グ
ロブリン鎖γｌ／にを、２個がγ２ｂ／にを、１個がａ
／におよび３個がμ／にを有していた。

Ｃ１ Ａｌｌ Ｄ３ Ｄ６ ＥＩＯ Ａ７ Ｄ５ Ｈ１ Ａ９ Ｂ１ Ｈ１２ Ｄ１０ Ｆ６ Ｂ５ Ｃ１１ Ｇ５ Ｃ８ Ｈ２ Ｂ４ Ｇ１２ Ａ３ Ｃ７ 第１表 １ｇＭ １ｇＭ Ｇ１ Ｇ１ Ｇ１ Ｍ Ｇ１ Ａ Ｇ１ Ｇ１ Ｇ１ Ｇ１ Ｇ１ ｇＧＩ ｇＧＩ Ｉ　ｇＧ２　ｂ ｇＧＩ ｇＧＩ ｇＧｌ ［ｇＧＩ Ｉ　ｇＧ２　ｂ ｇＧｌ μ／に μ／に γｌ／に γ１／に γｌ／に μ／に γｌ／に α／に γｌ／に γｌ／に γｌ／に γ１／に γｌ／に γｌ／に γｌ／に γ２ｂ／に γｌ／に γｌ／に γｌ／に γｌ／に γ２ｂ／に γｌ／に （ｊ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｈ）で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽和）
後、ＩｇＧクラスは０．０６Ｍ塩化ナトリウム含有４０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＤＥＡＥ
−５ｅｐｈａｃｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）の非吸着
画分を分取し、培地中の仔牛脂児血清およびマウス由来
のたん白質を分離、除去した。ＩｇＡおよび１ｇＭクラ
スの精製につむ（てはＯ，１Ｍ塩化ナトリウム含有４０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＤＥＡＥ
−Ｓａｐｈａ−ｃｅｌカラムクロマトグラフィーにおい
て塩化ナトリウム０．１Ｍから１．ＯＭまでのグラデイ
エンドでそれぞれ両画分を溶出した。

さらに、ＩｇＧクラスはＯ，１５Ｍ塩化ナトリウム含有
５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，６）で平衡化
したプロティンＡセルロファイン（生化学工業製）カラ
ムに吸着させ非吸着画分を除去した後、０．１５Ｍ塩化
ナトリウム含有５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で溶
出することにより精製した。なお、溶出液は直ちに１．
５Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，９）により中和し
た。

実施例　２ ヒト血清中のＩＶコラーゲンの分子中央三重ラセン部位
の定量 （ａ）酵素標識モノクローナル抗体（Ｆａｂ’−ＰＯＤ
複合体）の調製法 （１）　Ｆａｂ’画分の調製 実施例１（ｊ）で得られたＩｇＧ画分を０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２）に溶解
し、その溶液を以下に述べるようにしてペプシンで消化
した。すなわち、前記画分中の１ｇＧに対し２％（ｖ／
ｖ）のペプシンを加え、３７℃、２４時間消化した。更
にその消化物に２Ｍトリス溶液を加えてｐＨを７．０に
調整することにより消化反応を停止させ、Ｏ，１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したクルトロゲルＡｃ
Ａ４４カラム（ＬＫＢ製）を用いたゲル濾過によりＦ（
ａｂ’）、両分を分取した。

次に、このＦ（ａｂ’）’を画分を５ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）中で透析し、終濃度１０ｍＭとなるようにア
ミノエタンチオール（ＭＥＡ）を加え３７℃で１．５時
間還元した後、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ
　４４カラムを用いてゲル濾過し、Ｆａｂ’画分を分取
した。

（２）マレイミド標識ＰＯＤ画分の調製上記（１）の操
作とは別に、以下に述べるようにしてＰＯＤにマレイミ
ドを標識した。すなわち、ＰＯＤをｌＯｍｙ／ｍ（ｌの
量で０．１Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７，Ｏ）に溶解し、
そのＰＯＤに対して、２５倍モル量のＮ−（ε−マレイ
ミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣ５）を
ジメチルホルムアミド溶液として加え、３０°０１３０
分間反応させた。これを０．１Ｍ　Ｕン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）で平衡化したセファデックスＧ−５０カラムで
ゲル濾過し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を分取した。

（３）　Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合体画分の調製上記（１）
の如くして調製した画分中のＦａｂ’に対して上記（２
）で得られた画分中のマレイミド標識ＰＯＤとして等モ
ルになるようにして、両両分を混合し、更にＦａｂ’お
よびマレイミド標識ＰＯＤの終濃度が１００μＭとなる
ように５ｍＭＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）で希釈した。この混合液を４℃、２０時間反応
後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレイミドで
未反応のチオール基をブロックした。これを０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化したウルトロゲルＡ
ｃＡ　４４カラムでゲル濾過し、Ｆａｂ’−ＰＯＤ複合
体画分を分取後、０，１％ＢＳＡ及び０．００５％チメ
ロサールを添加し、４℃で保存した。

（ｂ）固相担体としてポリスチレンポール（１６，５ｍ
ｍ、　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ
製）を用いた１段階サンドイッチ法 実施例１　（ｊ）で得られたペプシン可溶化ヒトＩＶコ
ラーゲンに対する精製モノクローナル抗体（クローンＮ
ｏ、４Ｈ１２）を０．１％アジ化ナトリウム含有０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解しその濃度を０．
１ｍｇ／ｍＱにＴＡ製する。この抗体溶液に固相担体と
してのポリスチレンポールを浸漬シポリスチレンポール
に抗体をコートする。次に抗体浸漬液を回収しポリスチ
レンボールを０．１％ＢＳＡ、　０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．１％アジ化ナトリウム含有１０ｍＭ’Ｊン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄し、４°Ｃに保存する。

使用時には、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン
ＭａＩ衝液（ｐＨ７，０）　テ洗浄した抗体結合ポリス
チレンボールを用いる。

標準試料として実施例１　（ａ）で得られた精製ペプシ
ン可溶化ヒトＩＶコラーゲンを１％ＢＳＡ。

０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｌ１５０（ｖ／ｖ）馬血清（
ｌＪ、Ａ。

Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）および０．０５％チメロサ
ール含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて
、４０ａｇ／２０μａの溶液を調製し、それを段階希釈
することにより、その各２０μαをとり測定試料とじＩ
；。

一方、血清試料としては健常人（ＮＯＲ）の血清２０μ
Ｑ１肝癌（ＨＣＣ）、肝硬変（ＬＣ）および慢性活動性
肝炎（ＣＡＩ（）各患者の血清を２０ａ（ｌ用いた。こ
れらの試料をそれぞれ０．８μ９／ｍαＦａｂ’　（ク
ローンＮｏ、ＩＤ３）−ＰＯＤ複合体、１％ＢＳＡ、　
０．１Ｍ塩化ナトリウム、１１５０（ｖ／ｖ）馬血清お
よび０，０５％チメロサール含有１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）３００μａに溶解した。次にこれらの標
準試料および血清試料のそれぞれに、モノクローナル抗
体結合ポリスチレンボールを添加して３７°Ｃで４５分
間インキュベート（免疫反応）後、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて洗浄
する。

次に０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）に溶解したＰＯ
Ｄ基質、すなわち０．０１３４％テトラメチルベンチジ
ン（ＴＩＪＢＺ）を３００μ＋２加え、さらｊ：０．０
１％過酸化水素水１００μａを加えて３７°Ｃで３０分
間インキュベート（発色反応）後、１．３３Ｎ硫酸６０
０μαを添加することにより反応を停止させる。反応停
止後、水を対照として島津マイクロフロー紫外可視分光
光度計（ｕｖ−７３０）で波長４５０ｎｍの吸光度を測
定し、盲検と試料の吸光度差を求める。標準試料より作
成した検量線より検体２０μａの吸光度に相当す！１Ｖ
Ｗコラーゲンペプチド量を読みとり、その値を５０倍す
ることにより検体１　ｍＱ当りのＩＶコラーゲン量を求
めた（第２表参照）。

第１図にペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンの検量線を
示した。第１図で明らかなごとくこのサンドイッチ法の
定ｉ感度は０．３１ａｇ／試験管であり、定量範囲は０
．３１〜４０ａｇ／試験管であった。また、定量変動係
数（ＣＶ）は２．６〜９．５％であった。このビーズ法
での反応時間は免疫反応４５分間、発色反応３０分間で
従来の２段階サンドイツチ法（例えば特開昭６１−２０
２１６２公報参照）の半分以下の時間で測定が可能とな
った。

このサンドイッチ法による測定によりＮＯＲ。

ＨＣＣ，ＬＣおよびＣＡＨ患者血清中のＩＶコラーゲン
を測定した結果、ＮＯＲ血清のＭ（平均値）　＋　２Ｓ
Ｄ（標準偏差）をカットオフ値とした時、各肝疾患の陽
性率は、それぞれ９７％、８０％および８０％であった
（第２図）。

また、胃癌患者で転移を認めない無転移群（Ｍ（−））
１２例、さらに組織学的にあるいは画像診断で確論され
た肝転移群（ＨＭ）　１３例およびリンパ野性転移群（
ＬＭ）　ｔｏ例の血清中ＩＶコラーゲンを同様にこのサ
ンドイッチ法により測定した。第３図で明らかなように
ＩＶコラーゲン濃度はＨＭ、　ＬＭおよびＭ（−）では
それぞれ５５２±３００．１９９±８１および１０４±
６２ｎ９／　ｍＱ□Ｊｆ　ＳＤ）であった。

ＮＯＲ血清のＭ±２ＳＤをカットオフ値としたときに、
各疾患の陽性率は、それぞれ１００％、８０％および２
５％であった。

（ｃ）固相担体としてポリスチレン製マイクロブレード
（Ｎｕｎｃ製）を用いた１段階サンドイッチ法 実施例１　（ｊ）で得られたペプシン可溶化ヒトＩＶコ
ラーゲンに対する精製モノクローナル抗体（クローンＮ
ｏ、４Ｈ１２）を０．１％アジ化ナトリウム含有０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、その濃度をＯ
，１ｍｇ／ｍＱに調製する。この抗体溶液を固相担体と
してのポリスチレンマイクロプレートにコートするため
に１ウェル当り１００μａ添加し、４°Ｃ保存する。使
用時には１％　ＢＳＡ。

０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％アジ化ナトリウ
ム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）３００μα
にてマイクロプレートをブロックした後、Ｏ，１Ｍ塩化
ナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０
含有１０＋ｎＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄した
マイクロプレトを用いる。

標準試料として実施例１（ａ）で得られた精製ペプシン
可溶化ヒトＩＶコラーゲンを１％ＢＳＡ。

０．１Ｍ塩化ナトリウム、１１５０　（ｖ／ｖ）馬血清
および０．０５％チメロサール含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）で５０％ｇ／　５０μ４に調製し、こ
れを段階希釈したものを各々ｌウェル当り２０μａ用い
た。−方、血清試料として健常人（ＮＯＲ）あるいはＨ
ＣＣ。

ＬＣ，ＣＡＨ，慢性非活動性肝炎（ＣＩＨ）の各患者の
それぞれの血清をｌウェル当り各２０μα用いた。すな
わち、これらの試料各５０μａを０．８μ９／　ｒｎ（
ｌ　Ｆａｂ’（クローンＮｏ、　１Ｄ３）−ＰＯＤ複合
体、１％ＢＳＡ、　０．１Ｍ塩化ナトリウム、１１５０
（ｖ／ｖ）馬血清および０．０５％チメロサール含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）２００μａに溶解し
、ｌウェル当り１００μａの試料溶液をモノクローナル
抗体結合マイクロプレートに添加し、室温（１０〜３０
°Ｃ）で１時間インキュベート（免疫反応）後、０．１
Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅ
ｎ　２０含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）をｌ
ウェル当り１００μａ添加することにより免疫反応を停
止させ、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％（ｖ／
ｖ）Ｔｗｅａｎ　２０含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）にて洗浄する。次に、０．０２％過酸化水素含
有クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）にＯＰＤ・２
塩酸塩を溶解し、その濃度を４ｍｇ／ｍＱに調製した溶
液（ｐＨ５、０）を１００μα加え室温で１５分間イン
キュベート（発色反応）後、１．３３Ｎ硫酸１００μＱ
を添加し反応を停止させる。反応停止後、マイクロプレ
ートリーダーで波長４９２ｎｍの吸光度を測定し、盲検
と試料の吸光度差を求める。

標準試料より作成した検量線より検体２０μＱの吸光度
に相当するＩＶコラーゲン量を読みとりその値を５０倍
することにより検体ＬｍＱ当りのＩＶコラーゲン量を求
めた（第３表参照）。

第３表 第４図にペプシン可溶化ヒトＩＶＷコラーゲンの検量線
を示した。図であきらかなごとく、このサンドイッチ法
の定量感度は、０．１６％ｇ／ウェルであり、定量範囲
は０．１６〜２０ｎｇ／ウェルであった。また、本定量
系のＣｖ値は０．５〜６．０％であった。このプレート
法での反応時間は免疫反応６０分間、発色反応１５分間
で、従来の２段階サンドイッチ法の半分以下の時間で多
数の検体の測定が可能となった。また、同一検体を測定
した時の同時再現性および日差変動はいずれもＣｖ値５
％以内と非常に良好な結果が得られた（第４表参照）Ｊ 第４表 （Ａ）同時再現性 （Ｂ）日差変動 また、本発明方法を用いることにより血中コラーゲンペ
プチドを定量したとき、ＨＣＣ％ｒ−ｃ　１ＣＡＨ患者
の血清中でコラーゲンペプチドの有意な増加が認められ
た。各肝疾患の陽性率はＮＯＲ血清のＭ　＋　２ＳＤを
カットオフ値とした時、ＨＣＣ９２％、ＬＣ８７％、Ｃ
ＡＨ８３％、ＣＩＨ３９％であった（第５図）。このよ
うな肝疾患患者血清中のコラーゲンペプチドの増加は、
固相担体としてポリスチレンポールを用いた１段階サン
ドイツチ法による測定と同様な傾向を示した。

実施例　３ （ａ）抗原の同定 実施例１　（ａ）で精製したペプシン可溶化ヒトＩＶコ
ラーゲンを５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、実施例２（ａ
）で得られたＦａｂ’−ＰＯＤ複合体を用いて細胞工学
１＆２１０６１〜１０６８（１９８３）に記載の旧都の
方法に従ってウエスタンプロツテイングヲ行い、酵素抗
体染色のパターンを得た。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ後クマシりブリリアントブルーにてタ
ンパクを染色したもののパターン、ウェスタンブロッテ
ィング後のニトロセルロース膜ヲそれぞれ実施例２（ａ
）で得られたＦａｂ’（クローンＮｏ。

１Ｄ３）−ＰＯＤ複合体で免疫染色したもののパターン
には１９０ＫＤ、　１７５ＫＤ、　１２５ＫＤ、　９４
ＫＤ、および８６ＫＤの５個のバンドと２００ＫＤ以上
に凝集物２個（２０５ＫＤおよび２２０ＫＤ）のバンド
が認められた（メルカプトエタノール存在下）。同じ＜
　Ｆａｂ’　（クローンＮｏ、　４Ｈ１２）　−ＰＯＤ
複合体で免疫染色したもののパターンには１８５ＫＤ、
　１７０ＫＤ、　１５５ＫＤ、　１２０ＫＤ、および９
０ＫＤの５個のバンドと２００ＫＤ以上に凝集物２個（
２００Ｋ［ｌおよび２２０ＫＤ）のバンドが認められた
（第６図）。

（ｂ）ヒト血清中免疫反応物の分子量 実施例２（ｂ）および（Ｃ）に記載したヒトＩＶコラー
ゲン酸素免疫定量法で補足されるヒト血清中免疫反応物
の分子量サイズを測定した。すなわち、健常者および肝
疾患（ＨＣＣ）患者血清（いずれもヒトＩＶコラーゲン
３００ｎｇ含有）を０．０５％Ｔｙｅｅｎ　２０．０．
１５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍ１Ｊリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３
００　（１，６Ｘ　９０ｃｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ製
）でゲルｆ’ｓ過し、各両分の免疫反応物を実施例２（
ｂ）のポリスチレンポールを用いる１段階サンドイッチ
法で定量した。第７図に示した如く健常人（−・−）お
よび肝疾患患者（−Ｘ−）血清中の免疫反応物は単一ピ
ークであり、対照として用いたベズシン可溶化ヒトＩＶ
コラーゲンペプチド（３００ｎｇ、−〇−）より若干分
子量は小さかった。フィブリノーゲン、免疫グロブリン
、牛血清アルブミン、ペルオキシダーゼを用いた検量線
から血清中免疫反応物の分子量は６２０ＫＤと推定した
。

（ｃ）特異性 実施例１　（ｂ）で調製したヒトｒ、■、■（酸抽出）
、Ｖ、ＶＩ型コラーゲン、７−Ｓドメイン、ＮＣＩドメ
イン、ラミニンＰ１両分およびペプシン可溶化ラン１−
ＩＶ型コラーゲンを実施例２（ｂ）記載のポリスチレン
ポールを用いる１段階サンドイッチ法で定量し、ペプシ
ン可溶化ヒトＩＶコラーゲンの定量値と比較した。第５
表に示した如く■型コラーゲンで若干の交差反応（約７
％）が認められた以外は他のいずれのコラーゲンおよび
ラミエフ２１画分で交差反応は認められなかつ　ｊこ　
。

（ｄ）回収率 ＩＶコラーゲン９３．Ｏｎ９／ｍｆｆおよび２３４．０
ｎ９／ｍＱａ度の２種のヒト血清にそれぞれ３１〜５０
０ｎｇ／ｍ（ｌの範囲でペプシン可溶化ヒト■コラーゲ
ンを添加し、実施例２（ｂ）、同２（ｃ）記載のポリス
チレンポールおよびポリスチレンプレートを用いる１段
階サンドイッチ法でそれらの回収率を調べた。第８図に
示した如くポール法およびプレート法での添加ペプシン
可溶化ＩＶコラーゲンペプチドに対する回収ＩＶコラー
ゲンの相関係数、回収率はそれぞれγ−０，９９９７，
９９，４±１０．３％　（Ｍ　ｆ　５Ｄ）８　Ｊ：びｙ
　＝　０．９９９３、ｌｏｌ、６ｆ　７．１％であった
。

（ｅ）抗原決定基 第６図のイムノブロッティング図に示した如〈実施例２
（ｂ）および同２（ｃ）記載のポールあるいはプレート
を用いる１段階サンドイツチ法に使用されている固相抗
体（クローンＮｏ、４Ｈ１２およびＰＯＤｉ識抗体（ク
ローンＮｏ、１Ｄ３）による抗原認識部位は若干具なる
。この固相抗体とＰＯＤ標識抗体の抗原認識部位を明ら
かにするために抗原抗体阻害率を調べた。すなわち、試
験管当り１０ｎｇペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンお
よび０〜ｌＯμ９モノクロ一ナル抗体（クローンＮｏｓ
　、＋　ＩＤ３．３Ａ９および４Ｈ１２）を１％ＢＳＡ
、　０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）中で３７°Ｃ１６０分間プレインキュベ
イジョンし、次に実施例２（ｂ）の方法′に従って調製
したクローンＮｏ、４Ｈ１２からのモノクローナル抗体
コートポリスチレンポールを加えて更に３７°Ｃ１６０
分間反応させる。次に試験管当り４０ｎｇＦａｂ’（ク
ローンＮｏ、３Ａ９）　−ＰＯＤ複合体を加え３７°Ｃ
！、６０分間反応後、ＴＭＢＺｊ−、’よび過酸化水素
水を加え３０°Ｃ１６０分間静置後、Ａｔｓ。

を測定した。第９図に示した如く標準ペプシン可溶化ヒ
トＩＶコラーゲンをクローンＮｏ、１Ｄ３（−Ｘ−）か
らのモノクローナル抗体で処理した場合は、抗原抗体反
応の阻害は観察されなかったが、ここで固相抗体および
複合体に用いたりａ　−ンＮｏ、３Ａ９（−＠　　）お
よびクローンＮｏ、　４Ｈ１２（−０−）からのモノク
ローナル抗体で処理した場合には阻害が認められた。こ
の結果より、本明細書に開示されている１段階サンドイ
ッチ法に使用されている固相抗体（クローンＮｏ、４Ｈ
１２）がＰＯＤ標識抗体（クローンＮｏ、ＩＤ３）に対
してペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンの異なる抗原決
定基と特異的に反応していることが明らかである。

以上、（ａ）〜（ｅ）の結果より、本明細書に開示され
ているポールおよびマイクロプレートを用いる１段階サ
ンドイッチ酵素免疫定量法は極めてＩＶコラーゲン分子
中央三重ラセン部位を特異的に認識する測定系であると
言える。

実施例　４ （ａ）坑ヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメインモノクロー
ナル抗体の作製 実施例１に記載の方法に従ってヒトｌＶ型コラーゲン７
−Ｓドメインに対するモノクローナル抗体１７個を調製
した。それらクローンの内４個が免疫グロブリン鎖γｌ
／にを、他の１３個はμ／にを有していた（第６表）。

クローンＮｏ。

１−ＩＧ４ ３１−２Ｈ１２ １−３Ｄ２ ３１−４Ｈ９ １−５Ｈ８ ３１−６’Ｈ４ １−７Ｅ４ １−８Ｇ９ ３１−９Ｈ８ ３１−１０Ｆ５ ３１−１１ＤＩＩ ３１−１２Ｇ１２ ３１−１３Ｈ３ ３１−１５Ｂ４ ３１−１７Ｈ６ ３１−１８Ｈ５ ３１−１９Ｆ４ 第　　６　　表 アイソタイプ ｇＧＩ １ｇＭ ｇＧＩ １ｇＭ １ｇＭ １ｇＭ １ｇＭ ｇＧＩ １ｇＭ １ｇＭ ［ｇＭ １ｇＭ ｇＧＩ １ｇＭ １ｇＭ １ｇＭ １ｇＭ 鎖 γｌ／に μ／に γ１／に μ／に μ／に μ／に μ／に γｌ／に μ／に μ／に μ／に μ／に γ１／に μ／に μ／に μ／に μ／に （ｂ）固相担体としてポリスチレンマイクロブレｈ　（
Ｎｕｎｃ製）を用いる１段階サンドイッチ法 上記（ａ）で得られたヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメイ
ンに対する精製モノクローナル抗体（クローンＮｏ、３
１８Ｇ９）を実施例２（ｃ）と同様な方法でマイクロプ
レートにコートした。一方、ＰＯＤ標識抗体は実施例１
で得られたペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンペプチド
に対するモノクローナル抗体（クローンＮｏ、４Ｈ１２
）を用いて実施例２の方法に従って調製した。

実施例１　（ｂ）で調製したヒトＩＶ型コラーゲン７−
Ｓドメインを標準試料として第７表に示した方法で検量
線を作製した（第１０図）。

第１Ｏ図で明らかな如くこのサンドイッチ法の定量感度
は０．５ｎｇ／ウェルであり、定量範囲は、０．５〜５
４ｎｇ／ウェルであった。また、その時のＣＶは０．３
〜６．８％であった。このプレート法での免疫反応は６
０分間、発色反応３０分間であり、実施例２（ｃ）に示
したヒトＩＶコラーゲン中央三重ラセン部分の測定と同
様に短時間、高感度でヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメイ
ンの測定が可能となった。

このサンドイッチ法による測定によりＮ０Ｒ１ＬＣおよ
びＨＣＣ患者血清中のヒトＩＶ７−Ｓドメイン濃度を測
定した結果、ＮＯＲ血清のＭ　＋　２３Ｄをカットオフ
値とした時、ＬＣおよびＨＣＣ疾患の陽性率はそれぞれ
７１％、１００％であった（第８表）。

（Ｃ）回収率 ＩＶ型コラーゲン７−Ｓドメイン５Ｂ／ｍα濃度のヒト
血清に４０〜１２８０ｎｇ／　ｍＱの範囲でヒトＩＶコ
ラーゲン７−Ｓドメインを添加し、上記（ｂ）記載のマ
イクロプレートを用いる１段階サンドイッチ法でそれら
の回収率を調べた。第１１図に示した如く添加７−Ｓド
メインに対する回収７−Ｓドメインの相関係数および回
収率はそれぞれγ＝　０．９９９１および９４．２±１
４．７％（Ｍ　：Ｉ：ＳＤ）であった。この結果より、
上記（ｂ）に記載のマイクロプレートを用いる１段階サ
ンドイッチ法はヒト■コラーゲン７−Ｓドメインの特異
的測定法であると言える。

【図面の簡単な説明】

第１図は、固相担体としてポリスチレンポールを用いた
１段階サンドイッチ法（ビーズ法）によるペプシン可溶
化ヒトＩＶコラーゲンの検１線である。 第２図は、ビーズ法により測定したＮＯＩ？、１（ＣＣ
１ＬＣ，ＣＡＨの各患者の血清中の免疫反応性■？コラ
ーゲンペプチド濃度を示す。図中、横棒はＭを、点線は
ＮＯＲのＭ　＋　２５Ｄを、０内数値は検体数を示す。 第３図はビーズ法により測定したＨＭ、　ＬＭおよびＭ
（−）の各患者の血清中の免疫反応性ＩＶコラーゲン濃
度を示す。図中、縦棒は、Ｍ±ＳＤを、点線は、ＮＯＲ
のＭ±２５Ｄを、０内数値は、検体数を示す。 第４図は、固相担体としてポリスチレンマイクロプレー
トを用いた１段階サンドイッチ法（プレート法）による
ペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンの検量線である。 第５図は、プレート法により測定したＮＯＲ。 ＨＣＣｌＬＣ，ＣＡＨおよびＣＩＨ各患者の血清中の免
疫反応性ＩＶコラーゲンペプチド濃度を示す。図中横棒
はＭを、点線はＭ　＋２ＳＤを、０内数値は検体数を示
す。 第６図は漂準ペプシン可溶化ヒトＩＶコラーゲンペプチ
ドのイムノブロッティング図である。 Ａ　：　Ｆａｂ’（クローンＮｏ、１Ｄ３）　−ＰＯＤ
による染色Ｂ：　Ｆａｂ’（クローンＮｏ、４Ｈ１２）
　−ＰＯＤによる染色。 第７図はヒト血清中免疫反応物のゲルが過パターンを示
す図である。第８図はポール法（Ａ）およびプレート法
（Ｂ）によるヒト血清への添加ペプシン可溶化ヒトＩＶ
Ｗコラーゲンペプチドに対する回収ＩＶコラーゲンの相
関図を示す。 第９図は３種類のモノクローナル抗体に対する抗原抗体
反応の阻害率を示す図である。 第１Ｏ図はヒトＩＶコラーゲン７−Ｓドメインの検量線
を示す図である。第ｔｉ図はヒト血清への添加ヒトＩＶ
コラーゲン７−Ｓドメインに対する回収コラーゲン７−
Ｓドメインの相関図を示す。 特許出願人　富士薬品工業株式会社 第 図 第 図 回収ＩＶコラーデン （ｎ？／ｍ１） 第 図 ０．０００６４ ０．００３２ ０．０１６ ０．０８ ０．４ モノクローナル抗体 （μ２／試験管） 手続補正書 平成１年７月２１日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ペプシン可溶化ヒトIVコラーゲンに対するモノクロ
   ーナル抗体を用いたサンドイッチ法に基づく酵素免疫学
   的測定法によるヒトIV型コラーゲンの分子中央三重ラセ
   ン部位の定量法であって、 （ａ）ペプシン可溶化ヒトIV型コラーゲンの分子中央三
   重ラセン部位と交差反応するモノクローナル抗体に酵素
   標識を付与した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測
   定対象試料を希釈して得られる試料希釈液と、 （ｂ）ペプシン可溶化ヒトIV型コラーゲンのみに交差反
   応するモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体
   結合固相担体とを用い、 上記希釈液（ａ）中に、上記の抗体結合固相担体（ｂ）
   を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒトIV型コラ
   ーゲンと上記の酵素標識抗体ならびに上記の固相担体に
   結合している抗体とにおいて免疫反応を行わしめた後、
   固相担体を分別し、その固相担体の酵素活性を測定する
   ことにより、ヒトIV型コラーゲンの分子中央三重ラセン
   部位を定量する方法。２）ヒトIV型コラーゲン７−Ｓド
   メインに対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッ
   チ法に基づく酵素免疫学的測定法によるヒトIV型コラー
   ゲン７−Ｓドメインの定量法であって、 （ａ）ペプシン可溶化ヒトIV型コラーゲン７−Ｓドメイ
   ンと交差反応するモノクローナル抗体に酵素標識を付与
   した酵素標識抗体の緩衝液溶液を用いて、測定対象試料
   を希釈して得られる試料希釈液と、 （ｂ）ヒトIV型コラーゲン７−Ｓドメインのみに交差反
   応するモノクローナル抗体を固相担体に結合させた抗体
   結合固相担体とを用い、 上記希釈液（ａ）中に、上記の抗体結合固相担体（ｂ）
   を混和し、上記測定対象試料中に存在するヒトIV型コラ
   ーゲン７−Ｓドメインと上記の酵素標識抗体ならびに上
   記の固相担体に結合している抗体とにおいて免疫反応を
   行わしめた後、固相担体を分別し、その固相担体の酵素
   活性を測定することにより、ヒトIV型コラーゲン７−Ｓ
   ドメインを定量する方法。