JPH0215566B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は水媒体中で分散安定性のよい親水性重
合体粒子の製造方法である。特に酵素，蛋白質，
及び免疫活性物質などを固定化して診断用試薬と
して好適に使用し得る親水性重合体粒子の製造方
法を提供するものである。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 抗原・抗体反応を利用する免疫学的検査におい
て、凝集反応は沈降反応，補体結合反応と共に、
あるいはこれらに比して著しく簡便かつ鋭敏な反
応として利用されている。そして、凝集反応は、
遊離細胞や細菌膜表面に局在する抗原を検出する
反応と共に、抗原精製技術の進歩により特異性の
高い抗血清が得られることによつて、特異性の高
い抗体を血球粒子，ベントナイト粒子，カオリン
粒子，ラテツクス粒子などの粒子担体に固定させ
ておき、対応する抗原を凝集反応によつて検査す
るなど、臨床検査における応用範囲が著しく拡大
している。 免疫学的凝集反応用としての担体は種々のもの
が公知で、該担体を使用した種々の診断用試薬が
知られている。これらを大別すると免疫活性物質
を物理的に吸着した診断用試薬と免疫活性物質を
共有結合で結合させた診断用試薬になる。これら
の試薬にはそれぞれ一長一短があり現在なお完全
に満足出来る診断用試薬は存在しない。 しかも近年、抗原の精製技術の進歩、特異性の
高い抗体の開発、更には定量分析の発展と共に免
疫学的凝集反応は鋭敏性と迅速性が増加し、非特
異的凝集反応が起こらない、しかもより保存安定
性に優れた等の性状を有する診断用試薬の開発が
要望されている。 診断用試薬の担体としては、一般に重合体粒子
が用いられており、診断用試薬に適した重合体粒
子の製造方法の開発が望まれている。 かくして、免疫活性物質を固定化した担体の非
特異的凝集反応を抑制することと、保存安定性を
高めるために数多くの方法が開発されている。こ
れらの方法は、免疫活性物質を固定化した担体に
保護コロイドを添加する方法と、担体を親水性重
合体粒子にする方法に大別される。前者の方法に
ついては、例えば、免疫活性物質を担体に固定化
した後に、牛血清アルブミン，ゼラチンなどの親
水性蛋白質を添加する方法が一般的によく採用さ
れているが、検定混合物中で非特異的な蛋白質―
蛋白質相互作用に起因する妨害作用が指摘されて
いる（特開昭56―158947号公報）。また後者の方
法について、例えば、特開昭56―30405号公報，
特開昭56―141559号公報には繰返し単位が２，３
―ジオキシプロピルメタクリレート単位から成る
親水性架橋共重合体粒子を用いる方法が、また特
開昭57―135801号公報にはスチレン―グリシジル
メタクリレート共重合体粒子を合成し、エポキシ
基を加水分解してジヒドロキシル基に変換して親
水性重合体粒子を得る方法が提案されている。こ
れらの方法は極めて秀れた方法である。しかし、
親水性基であるジヒドロキシル基濃度を増加する
と重合体粒子の安定性を向上させることが可能で
あるが、免疫活性物質を共有結合させる活性点濃
度が減少するために免疫活性物質の固定化量が減
少するとか、あるいは免疫活性物質を吸着固定化
するに有効な疎水性表面が減少するために、免疫
学的凝集反応の鋭敏性が著しく低下する欠点があ
る。このように免疫活性物質の固定化担体の免疫
学的凝集反応性と物理的安定性を同時に満足させ
ることは従来極めて困難であつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明者等は免疫学的凝集反応の鋭敏性に優れ
ると共に、非特異的凝集反応が低くかつ保存安定
性の優れた免疫活性物質の固定化担体となる重合
体粒子について鋭意研究を重ねて来た結果、エポ
キシ基を表面に有する重合体粒子にエポキシ基と
反応する官能基とヒドロキシル基を有する有機化
合物を反応させることにより、前記要望を満す優
れた効果をもたらすことを見い出した。 即ち本発明は、(A)エポキシ基を表面に有する重
合体粒子、及び(B)分子中に、カルボキシル基，ア
ミノ基，メルカプト基及びアミド基よりなる群か
ら選ばれた少くとも１種のエポキシ基と反応する
官能基とヒドロキシル基とを有する有機化合物を
反応させ、親水性重合体を得ることを特徴とする
親水性重合体の製造方法である。 本発明で用いられるエポキシ基を表面に有する
重合体粒子は、グリシジル（メタ）アクリレート
を単独で重合することによつて、或いは、グリシ
ジル（メタ）アクリレートと共重合可能なビニル
系単量体とを共重合させることによつて得ること
ができる。グリシジル（メタ）アクリレートと共
重合させるビニル系単量体の代表的なものを挙げ
れば、スチレン，ビニルトルエン，クロルメチル
スチレン，クロルスチレン，塩化ビニル，臭化ビ
ニル，メチル（メタ）アクリレート，エチル（メ
タ）アクリレート，プロピル（メタ）アクリレー
ト，（メタ）アクリロニトリル，酢酸ビニル等の
疎水性ビニル系単量体，また、アクリル酸，メタ
クリル酸，マレイン酸，スチレンスルホン酸，２
―アクリルアミド―２―メチルプロパンスルホン
酸，アクリルアミド，Ｎ―（２―ヒドロキシプロ
ピル）メタアクリルアミド，２―ヒドロキシエチ
ルメタアクリレート，グリセロールモノメタクリ
レート，ポリエチレングリコールモノメタクリレ
ート等の水溶性ビニル系単量体などが例示され
る。これらのビニル系単量体は２種以上を混合し
て用いることもできる。さらにまた、必要に応じ
て、ジビニルベンゼン，エチレングリコールジメ
タクリレート，ジエチレングリコールジメタクリ
レート，ビスフエノールＡジグリシジルエーテル
等の架橋性単量体も好適に使用できる。 本発明で用いる重合体粒子のグリシジル（メ
タ）アクリレートの組成は0.05乃至100モル％が
好適に採用される。免疫活性物質を物理的に吸着
させた診断用試薬に本発明の親水性重合体粒子を
用いる場合、グリシジル（メタ）アクリレートの
組成は0.05〜20モル％，さらに0.1〜15モル％で
あることが好ましい。また、免疫活性物質を共有
結合で結合させた診断用試薬に用いる場合には、
10〜100モル％，さらに3099モル％であることが
好ましい。 このような組成とすることによつて、表面のエ
ポキシ基の濃度が前者で0.001〜0.4モル％，後者
で0.2〜２モル％である重合体粒子を得ることが
できる。 本発明で用いられるエポキシ基を表面に有する
重合体粒子を得るための製造方法は特に限定され
ず、公知の製造方法が好適に採用される。例え
ば、アニオン性界面活性剤，非イオン系界面活性
剤の存在下に水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を
用いて乳化重合する方法、界面活性剤を使わずに
水媒体中で水溶性ラジカル開始剤を用いて不均一
重合する方法、部分鹸化ポリビニルアルコール，
ポリビニルピロリドン等の保護コロイドの存在下
に懸濁重合する方法、ビニル系単量体は溶解する
が重合体は溶解しない有機溶媒中で沈澱重合する
方法等が採用される。 本発明で使用する重合体粒子の平均粒子径は特
に限定されないが、一般には0.05乃至10ミクロン
の範囲内にあるのが好ましい。該粒子径が0.05ミ
クロン以下では微弱な免疫学的凝集反応と計測す
ることが困難になる場合がある。また粒子径が10
ミクロン以上になると鋭敏性が低下するだけでな
く、分散安定性，保存安定性が悪くなる場合があ
る。さらにまた、該重合体粒子の粒子径の標準偏
差は小さいことが望ましい。 本発明で使用する上記重合体粒子と反応させる
有機化合物は、分子内に上記重合体粒子の表面に
有るエポキシ基と反応する特定の官能基と該重合
体粒子に親水性を付与するためのヒドロキシ基と
を併せ有する有機化合物である。エポキシ基と反
応する官能基としては、カルボキシル基，アミノ
基，メルカプト基，アミド基等が挙げられる。就
中、エポキシ基と容易に付加反応するアミノ基又
はメルカプト基が好ましい。また、エポキシ基と
反応する官能基とヒドロキシル基との間の炭素原
子数は２〜30好ましくは、３〜10であることが得
られる親水性重合体粒子の分散安定性が向上する
ために好ましい。さらに、またヒドロキシル基を
複数個有する有機化合物は、上記と同様に得られ
る親水性重合体粒子の分散安定性が向上するため
に好ましい。また、これらの有機化合物の中で、
水溶性の有機化合物が重合体粒子の安定化作用に
特に有効であり、好ましく採用される。 本発明に於いて好適に使用される有機化合物の
代表的なものを例示すると次のとおりである。例
えば、グロン酸等のヒドロキシカルボン酸類；セ
リン，トレオニン等のヒドロキシアミノ酸類；Ｎ
―（２―ヒドロキシエチル）ラクタミド，ラクタ
ミド，Ｄ―パンセノール等のヒドロキシアミド
類；２―メルカプトエタノール，２―メルカプト
プロパノール，３―メルカプトプロパノール，４
―メルカプトブタノール，３―メルカプト―１，
２―プロパンジオール，メルカプトペンタエリス
リトール，パントテニル・ミステイン等のヒドロ
キシメルカプタン類；エタノールアミン，プロパ
ノールアミン，ジエタノールアミン，２―アミノ
―２―エチル―１，３―プロパンジオール，２―
アミノ―２―メチル―１，３―プロパンジオー
ル，３―アミノ―１，２―プロパンジオール，ジ
グリコールアミン，トリス（ヒドロキシエチル）
アミノメタン，ジイソプロパノールアミン，グル
コサミン，ガラクトサミン，DL―イソセリン，
Ｎ―トリス（ヒドロキシメチル）メチル―３―ア
ミノプロパンスルホン酸，Ｎ―トリス（ヒドロキ
シメチル）メチルグリシン等のヒドロキシアミン
類等の有機化合物をあげることができる。更に好
ましくは、エポキシ基と容易に付加反応するヒド
ロキシメルカプタン類又はヒドロキシアミン類の
有機化合物が重合体粒子との反応で苛酷反応条件
を必要としないので好適に採用される。 本発明において、エポキシ基を表面に有する重
合体粒子（以下単に重合体粒子という）と分子中
にエポキシ基と反応する官能基とヒドロキシル基
とを有する有機化合物（以下単に有機化合物とい
う）の反応は、重合体粒子表面の特定量のエポキ
シ基と反応させるに必要な量の有機化合物及び重
合体粒子を水媒体中、エポキシ基に不活性な緩衝
液中、あるいは、エポキシ基と反応性の極めて乏
しくかつ重合体粒子を溶解させない有機溶媒中で
混合すればよい。有機溶媒としてはメタノール，
エタノール，イソプロパノール，アセトン，酢酸
メチル，酢酸エチルあるいはこれらの混合溶媒等
の水と親和性の大きい有機溶媒が好ましい。反応
温度は重合体粒子の分子構造やエポキシ基濃度、
有機化合物のエポキシ基と反応する官能基の種
類、及び反応媒体によつて異なるが、一般的には
４℃乃至100℃，好ましくは４℃乃至60℃が好適
に採用される。反応媒体に有機溶媒を用いる場合
には重合体粒子を溶解させない処理温度を選ぶこ
とが重要である。 本発明の反応における重合体粒子の濃度は、反
応中に重合体粒子が非特異的に凝集しないように
選択すればよく、一般的には0.01乃至20％の範囲
にあることが好ましく、更に0.05乃至10％の範囲
にあることがより好ましい。また、有機化合物の
濃度は、重合体粒子の表面のエポキシ基濃度、反
応すべきエポキシ基濃度、及び反応条件によつて
異なるが、一般的には重合体粒子の表面のエポキ
シ基濃度に対して、モル比で0.5〜200の範囲で選
択される。免疫活性物質を物理的に吸着させた診
断用試薬に本発明の親水性重合体粒子を用いる場
合は、有機化合物の濃度は重合体粒子の表面のエ
ポキシ基濃度に対してモル比で１〜200の範囲と
することが好ましい。また、免疫活性物質を共有
結合によつて結合させた診断用試薬に用いる場合
は、モル比で0.5〜25の範囲とすることが好まし
い。 本発明の反応における反応時間は、重合体粒子
のエポキシ基濃度，有機化合物の濃度及びエポキ
シ基との反応性，反応温度によつて異なるので特
に限定的でないが、一般に10分乃至100時間が好
ましく、更には30分乃至50時間がより好ましく採
用される。 本発明の反応における重合体粒子と有機化合物
の混合方法は、特に限定的でない。一般的には、
重合体粒子の懸濁媒体中へ有機化合物の水又は有
機溶媒の希釈溶液を一括に添加する方法もしくは
滴々添加する方法、あるいは有機化合物の反応媒
体中へ重合体粒子の水又は有機溶媒の希釈懸濁液
を一括に添加する方法もしくは滴々添加する方法
が好ましくは採用される。 本発明により得られた親水性重合体粒子は、水
媒体中での疎水性有機化合物の吸着剤，生体内で
の各種細胞、組織による貧食作用の観察用粒子，
及び酵素，蛋白質あるいは免疫活性物質の固定化
用粒子等に応用でき、特に免疫活性物質を吸着法
もしくは共有結合法で固定化した診断用試薬は免
疫学的凝集反応性が大きいだけでなく、分散安定
性と保存安定性に優れる特徴がある。 以下に、本発明で得られた親水性重合体粒子を
診断用試薬として用いた場合について説明する。 本発明で得られた親水性重合体粒子に吸着法も
しくは共有結合法によつて固定化する免疫活性物
質としては、特に限定的でなく公知のものが使用
出来る。代表的なものを例示すれば、例えば、変
性ガンマグロブリン，抗核因子，ヒトアルブミ
ン，抗ヒトアルブミン抗体，イムノグロブリンＧ
（IgG），抗ヒトIgG抗体，イムノグロプリンＡ
（IgA），抗ヒトIgA抗体，イムノグロブリンＭ
（IgM），抗ヒトIgM抗体，ストレプトリジンＯ，
ストレプトキナーゼ，ヒアルロンダーゼ，抗スト
レプトリジンＯ抗体，Ｃ―反応性蛋白，抗Ｃ―反
応性蛋白抗体，アルフアーフエトプロテイン
（AFP），抗AFP抗体，癌胎児性抗原（CEA），
抗CEA抗体，ヒト繊毛性ゴナドトロピン
（HCG），抗HCG抗体，抗エストロゲン抗体，抗
インシユリン抗体，Ｂ型肝炎表面抗原（HBs），
抗HBs抗体，梅毒トレポネマ抗原，風疹抗原，
インフルエンザ抗原，補体成分C_1q，抗C_1q抗体，
抗C_3q抗体，等の公知の免疫活性物質をあげるこ
とができる。 本発明で得られた親水性重合体粒子に固定化さ
れる該免疫活性物質の量は、各検査項目に適して
いる割合で親水性重合体粒子に固定化させればよ
く、一概に限定されない。一般には、該免疫活性
物質の量が多い程、診断用試薬の鋭敏性が上がる
ため、鋭敏性を要求する場合には、前記の親水性
重合体粒子に飽和する迄、免疫活性物質を吸着さ
せることが好ましい。 本発明により得られた親水性重合体粒子は免疫
活性物質の固定化能力と親水性のバランスが極め
て良く調節されているので、抗原又は抗体と親水
性重合体粒子を緩衝液又は生理食塩水などの水媒
体中で混合し、抗原又は抗体が化学的に変化しな
いように、そしてそれらの免疫学的性質を保持さ
せるように、非常に温和な条件下に抗原又は抗体
を親水性重合体粒子表面に固定化させることがで
きるだけでなく、該媒体中で極めて安定性が高い
特徴がある。親水性重合体粒子表面に固定化され
た免疫活性物質の量は、重合体粒子の蛋白結合部
位を飽和又はブロツクされるように選ぶことが好
ましいが、残存する蛋白結合部位を免疫学的に不
活性な適当な物質でブロツク又は不活性化させる
ことができる。 （効果及び作用） 本発明で得られた親水性重合体粒子に免疫活性
物質を固定化した診断用試薬は、分散安定性と保
存安定性が著しく優れている。特に、電解質を多
量に含む緩衝液中で十分安定であるため、免疫活
性物質の固定は電解質を含む緩衝液中で行なえ
る。従つて、上記の診断用試薬は被検体液と混合
時に非特異的凝集を防止できるという特徴をも有
している。しかも免疫学的凝集反応の鋭敏性も良
好である特徴を有する。 本発明により得られた親水性重合体粒子が、こ
のような優れた性質を有する理由は明らかでない
が、本発明者等は次のように推測している。エポ
キシ基を有する重合体粒子とヒドロキシル基を有
する有機化合物とを反応させることにより、ヒド
ロキシル基を親水性重合体粒子の表面から遠ざけ
ることが可能になるので免疫学的性物質を固定化
した親水性重合体粒子のコロイド学的安定性が高
まると推定される。また、抗体を共有結合法で重
合体粒子に固定化した場合、抗体のFab部分の先
端に存在する抗原認識部位は重合体粒子表面と反
対の方向を向くことが望ましい。本発明の方法で
は、親水性重合体粒子表面から離れた位置にある
ヒドロキシル基あるいはまたヒドロキシル基を有
する有機化合物が立体障害となるために、共有結
合で固定化した抗体のFabの抗原認識部位が親水
性重合体粒子の表面に向くことが阻害され易くな
る。そのため、抗体を共有結合で固定化した免疫
学的診断用試薬の性能が長期間保持されると推定
される。さらに、有機化合物として複数個のヒド
ロキシル基を有するものを用いた場合には、上記
の有機化合物と親水性重合体粒子の持つエポキシ
基とが反応してヒドロキシル基が生成するだけで
なく、有機化合物の持つヒドロキシル基によつて
親水性が付与され、親水性重合体粒子の分散安定
性と保存安定性が増加すると推定される。ヒドロ
キシル基濃度が増加すると重合体粒子の分散安定
性と保存安定性が増加すると考えられる。重合体
粒子のヒドロキシル基濃度を増加させるために重
合体粒子の重合の段階でヒドロキシル基を有する
モノマーを多量に使用することが考えられるが、
この方法は、免疫活性物質を共有結合活性点が減
少したり、また免疫活性物質を吸着固定化するに
有効な疎水性表面が減少するために、免疫学的凝
集反応の鋭敏性が低下する欠点が生じる。しかし
ながら、本発明の方法によれば、これらの免疫活
性物質の共有結合活性点濃度もしくは吸着固定化
する疎水性表面積を減少させることなく、親水性
のヒドロキシル基濃度を増加させることが可能に
なるので、免疫学的診断用試薬の鋭敏性を損うこ
となく、分散安定性と保存安定性が高まると考え
られる。 以下に本発明をさらに具体的に説明するため
に、実施例及び比較例を掲げるが、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。 実施例１〜９及び比較例１〜２ (1) 重合体粒子の調製 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.加えて70℃に保つた後に、窒素
雰囲気下、撹拌下に過硫酸カリウムを5.0ミリモ
ル／濃度になるように添加した。次いでジ―２
―エチルヘキシルスルホコハク酸1.5ｇを乳化剤
として添加した後、70℃に加温したグリシジルメ
タクリレート30ミリモルとスチレン100ミリモル
の混合物を添加して時間重合を行なつた。その後
スチレン２，６モルを定量ポンプで滴々添加して
から70℃で29時間撹拌下に重合した。重合後、室
温まで冷却してから、得られた重合体粒子を濾紙
（No.２）で濾別して大きな凝集体を除いた。次い
で透析を行なつた後に、遠心分離，蒸留水への再
分散の操作を繰返した後に、イオン交換樹脂で脱
イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行な
つて重合体粒子を精製した。得られた重合体粒子
の粒子径は0.237μmであつた。 (2) 親水性重合体粒子の調製 得られた重合体粒子を２％濃度で蒸留水に分散
した懸濁液100mlと、有機化合物の水溶液もしく
はメタノール溶液を第１表に示す添加割合で混合
し、第１表に示す温度で所定時間反応した。反応
後、親水性重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別した
後に、遠心分離，蒸留水への再分散の操作を３回
繰返した後に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を
行ない、更に遠心分離と洗浄を行なつて親水性重
合体粒子を得た。かくして得られた親水性重合体
粒子を微量窒素分析計及び微量硫黄分析計を利用
して反応した有機化合物の反応量を分析した。そ
の結果を第１表に示す。 (3) ヒトIgGを固定化した親水性重合体粒子の調
製 (2)で得られた本発明の親水性重合体粒子を固型
分濃度１％でグリシン緩衝液に分散した。本発明
に於いてグリシン緩衝液とはグリシン0.05モル及
び食塩0.05モルを水１に溶解し、次いで２規定
水酸化ナトリウム水溶液でPHを8.2に調製し、さ
らにアジ化ナトリウムを１ｇ添加したものであ
る。 本発明に於いてヒトIgGは、ヒト血清を飽和硫
安で塩析し、さらに透析を行ない精製したものを
用いた。 ヒトIgGをグリシン緩衝液により希釈し１mg／
mlに調整する。次いで倍数希釈法によりヒトIgG
をグリシン緩衝液により希釈してヒトIgG希釈液
を調製する。１％濃度の親水性重合体粒子分散液
１容にヒトIgG希釈液１容を加え撹拌し、室温下
２時間放置する。次いでウシ血清アルブミンを１
％の濃度になるように添加し、４℃に保ち１夜放
置してヒトIgGを固定化した親水性重合体粒子を
得た。次いで遠心分離，グリシン緩衝液への再分
散の操作を繰り返えすことによりヒトIgGを固定
化した親水性重合体粒子を洗浄した。 さらに遠心分離した後、ヒトIgGを固定化した
親水性重合体粒子をウシ血清アルブミンを0.1％
の濃度で添加したグリシン緩衝液に再分散し固型
分濃度を0.5％に調整し、４℃に保ち保存した。 (4) 抗原・抗体反応 ヒトIgGをウサギに免疫して得た抗ヒトIgGウ
サギ全血清を60℃，30分非動化処理を行なつた。
この血清を以下抗ヒトIgGウサギ血清と呼ぶ。 抗ヒトIgGウサギ血清をグリシン緩衝液で20倍
に希釈したものを原液とし、倍数希釈法により抗
ヒトIgGウサギ血清をグリシン緩衝液で希釈して
抗ヒトIgGウサギ血清希釈液を調製する。抗原・
抗体反応を行なうためにガラス製10穴のホールグ
ラスを用意し、グリシン緩衝液で希釈した抗ヒト
IgGウサギ血清を各ホールに0.04ml加える。次い
でヒトIgGを固定化した親水性重合体粒子のグリ
シン緩衝液分散液を各ホールに0.04mlを加える。
この後直ちに平沢製作所製テーハー式撹拌機によ
りホールグラスを１分間に120回転の速度で水平
回転し撹拌を行なう。抗原・抗体反応により親水
性重合体粒子の凝集が認められるまでに要する時
間、すなわち凝集像出現時間及び所定時間撹拌後
の親水性重合体粒子の凝集の有無から、ヒトIgG
を固定化した親水性重合体粒子の特性である鋭敏
性を評価した。ホールグラスを用いた実施例１の
親水性重合体粒子の凝集試験の結果を図１に示
す。図１は10分間の撹拌後の凝集状態を示す。凝
集が全く認められない場合（−）、凝集の有無が
判定しがたい場合（±）、明らかに凝集が認めら
れる場合、凝集の強い順に，，＋と判定した。
図中Ｃは抗原もしくは抗体を全く含まないことを
示す。凝集試験の結果、明らかに凝集の認められ
たホールに於ける抗ヒトIgGウサギ血清希釈液の
最高希釈倍数をもつて、重合体粒子の鋭敏性を評
価した。 親水性重合体粒子の特性として、さらに親水性
重合体粒子の分散安定性を評価した。すなわち、
親水性重合体粒子にヒトIgG希釈液を加え室温で
２時間放置した後の親水性重合体粒子の分散状態
をもつて親水性重合体粒子のヒトIgG固定化時の
分散安定性を評価した。又ヒトIgG固定化後３ケ
月経過した後の親水性重合体粒子の分散状態をも
つてヒトIgGを固定化した親水性重合体粒子の保
存中の分散安定性を評価した。 さらにまた、親水性重合体粒子の特性として、
電解質を含んだ緩衝液中での親水性重合体粒子の
分散安定性を評価した。即ち、親水性重合体粒子
をイオン交換水に１％濃度になるように調製した
後、NaCl濃度が0.10モル／及び0.15モル／の
グリシン緩衝液１mlに40μl添加して充分に混合し
てから室温で３日間静置して分散安定性を調べ
た。その結果を第１表に示す。 尚、比較例１として、(1)で得られた精製重合体
粒子を濃硫酸でPH2.0に調節した酸性水媒体に１
％濃度で分散させ、室温で１週間処理し、重合体
粒子のエポキシ基を加水分解してジヒドロキシル
基に変換した。次いで濾紙（No.２）で濾別した後
透析を行なつた。その後遠心分離，蒸留水への再
分散の操作を繰返した後に、イオン交換樹脂で脱
イオン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行な
つて重合体粒子を精製した。得られた重合体粒子
を実施例１と同様の操作で性能を調べた。その結
果を第１表に示す。 また、ポリスチレンラテツクスとしてダウ社
0.497μmのラテツクスを実施例１と同様の操作で
性能を調べた結果を、比較例２として第１表に示
す。

【表】

【表】

【表】 実施例10と比較例３ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.加えて70℃に保つた後に、窒素
雰囲気下、撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモル／
濃度になるように添加した。次いで70℃に加温
したグリシジルメタアクリレート210ミリモル及
びスチレン100ミリモルの混合物を添加して70℃
で１時間撹拌下に重合した。その後スチレン2.5
モルを定量ポンプで滴々添加してから、70℃で29
時間撹拌下に重合した。その後の操作は実施例１
と同様の操作を行なつた。得られた重合体粒子の
粒子径は0.345μmであつた。この重合体粒子を蒸
留水100mlに１％濃度になるように調製し、グル
コサミン0.8mmoleを加えた。その後PHを8.0に調
製し、室温で48時間反応した。反応後は実施例１
と同様の操作を行なつて親水性重合体粒子を得
た。得られた親水性重合体粒子を実施例１と同様
の操作でヒトIgGを吸着して固定化し、抗ヒト
IgGウサギ血清との抗原・抗体反応を行なつた。
その結果、鋭敏性は１日後×1280，３ケ月後×
2560，また分散安定性は１日後２本，３ケ月後３
本の非特異的凝集反応が認められた。さらに実施
例１と同様のNaCl濃度が0.10モル／及び0.15モ
ル／のグリシン緩衝液中での分散安定性は、い
ずれも１の評価であつた。 尚比較例３として、上記で得られた重合体粒子
を水蒸気蒸留を３時間行なつて重合体粒子上のエ
ポキシ基を加水分解してジヒドロキシルに変換し
た。次いで重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別した
後に、遠心分離，蒸留水への再分散操作を３回繰
返した後に、イオン交換樹脂で脱イオン操作を行
ない、更に遠心分離と洗浄を行なつてジヒドロキ
シル基を含有する重合体粒子を得た。かくして得
られた粒子を実施例１と同様の操作でヒトIgGを
吸着して固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清との抗
原・抗体反応を行なつた。その結果、鋭敏性は１
日後×1280，３ケ月後×1280，また分散安定性は
１日後３本，３ケ月後４本の非特異的凝集反応が
認められた。さらに実施例１と同様のNaCl濃度
が0.10モル／及び0.15モル／のグリシン緩衝
液中での分散安定性は各１及び２の評価であつ
た。 実施例 11 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて75℃に保つた後に、窒
素雰囲気下，撹拌下に過硫酸カリウム５ミリモ
ル／，チオ硫酸ナトリウム５ミリモル／，硫
酸銅0.25ミリモル／を添加した。次いで75℃に
加温したグリシジルアクリレート15ミリモル及び
メチルメタクリレート250ミリモルの混合物を添
加して75℃で30分間撹拌下に重合した。その後、
メチルメタクリレート２，６モルを定量ポンプで
滴々添加して、更に75℃で２時間撹拌下に重合し
た。その後の操作は実施例１と同様の操作を行な
つた。得られた重合体粒子の粒子径は0.208μmで
あつた。この重合体粒子を蒸留水100mlに１％濃
度になるように調製１，トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン100μmoleを加えた。その後、
PH9.0に調製し、室温で48時間反応した。反応後
は実施例１と同様の操作を行なつて親水性重合体
粒子を得た。得られた親水性重合体粒子を実施例
１と同様の操作でヒトIgGを吸着して固定化し、
抗ヒトIgGウサギ血清との抗原・抗体反応を行な
つた。その結果、鋭敏性は１日後×1280，３ケ月
後×1280，また分散安定性は１日後１本，３ケ月
後３本の非特異的凝集反応が認められた。さらに
実施例１と同様のNaCl濃度が0.10モル／及び
0.15モル／のグリミン緩衝液中での分散安定性
は、いずれも１の評価であつた。 実施例12と比較例４ 熱変性ヒトIgGの固定化 PH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例３で
用いた親水性重合体粒子を0.5％になるよう分散
させた。次いで60℃で10分間加熱処理したヒト
IgGをグリシン緩衝液により希釈し１mg／mlに調
整した。0.5％濃度の親水性重合体粒子分散液１
容に熱変性したヒトIgG希釈液１容を加え、撹拌
し、室温下２時間放置した。その後ウシ血清アル
ブミンを１％の濃度になるように添加し、４℃に
保ち１夜放置して熱変性ヒトIgGを固定化した親
水性重合体を得た。次いで遠心分離，グリシン緩
衝液への再分散の操作を繰返して洗浄した後、熱
変性ヒトIgGを固定化した親水性重合体粒子をウ
シ血清アルブミンを0.1％の濃度で添加したグリ
シン緩衝液に再分散し、固型分濃度を0.5％に調
整した。 リチウム因子の測定 検体として非動化慢性関節リウマチ患者プール
血清をグリシン緩衝液で20倍に希釈したものを原
液として、実施例１と同様にしてガラス製10穴の
ホールグラスにグリシン緩衝液で希釈した慢性関
節リウマチ患者血清を各ホールに0.04mlを加え、
次いで熱変性ヒトIgGを固定化した親水性重合体
粒子をグリシン緩衝液で希釈した分散液を各ホー
ルに0.04ml加えて実施例１と同様の操作で鋭敏性
及び分散安定性を調べた。その結果、鋭敏性は１
日後×1280，３ケ月後×1280，であり、分散安定
性は１日後及び３ケ月後に共に非特異凝集反応は
認められなかつた。 尚、比較例４として比較例１で用いた重合体粒
子を用いて上記と同様の操作でテストすると、鋭
敏性は１日後×1280，３ケ月後は非特異凝集のた
め評価できなかつた。 実施例 13 アルフアーフエトプロテインの抗体の固定化 PH8.2に調製したグリシン緩衝液に実施例１で
用意した親水性重合体粒子を1.0％になるように
分散させた。次いで家兎の産生したアルフア―フ
エトプロテイン（以下α―EPと略す）の抗体を
アフイニテイ―クロマトグラフイーにより精製し
て得た精製α―FP抗体を、グリシン緩衝液で
500μg／mlの濃度に希釈した。親水性重合体粒子
分散液１容と精製α―FP抗体の希釈液１容とを
加え、撹拌し、室温下２時間放置した。その後ウ
シ血清アルブミンを１％の濃度になるように添加
し、４℃に保ち１夜放置してα―FP抗体を固定
化した親水性重合体粒子を得た。次いで遠心分
離，グリシン緩衝液への再分散の操作を繰り返し
て洗浄した後、α―FP抗体を固定化した親水性
重合体粒子をウシ血清アルブミンを0.1％の濃度
で添加したグリシン緩衝液に再分散し、固型分濃
度を0.5％に調整した。 アルフア―フエトプロテインの測定 検体としてヒト血清中のα―FPの濃度が
1000μg／mlであるものを原液とし、グリシン緩
衝液で10倍ごとの希釈系列を調製した。実施例１
と同様にして、ガラス製10穴のホールグラスにグ
リシン緩衝液で希釈したα―FPを各ホールに
0.04ml加え、次いでα―FP抗体を固定化した親
水性重合体粒子の分散液を各ホールに0.04ml加え
て、実施例１と同様の操作で鋭敏性，分散安定性
を調べた。その結果、鋭敏性は１日後10μg／ml，
３ケ月後10μg／mlであつた。分散安定性は１日
後及び３ケ月後共に非特異凝集反応は全く認めら
れなかつた。 実施例14と比較例５ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて70℃に保つた後に、窒
素雰囲気下，撹拌下に過硫酸カリウム４ミリモ
ル／チオ硫酸ナトリウム２ミリモル／，及び
硫酸銅0.2ミリモル／を添加した。次いで70℃
に加温したグリシジルメタクリレート1.5モル及
びスチレン0.5モルの混合物を添加して70℃で６
時間重合した。その後の操作は実施例１と同様の
操作を行なつた。得られた重合体粒子の粒子径は
0.304μmであつた。 得られた重合体粒子を蒸留水100mlに１％濃度
になるように調製し、ジエタノールアミン
10μmoleを加えてからPH9.5に調製後、室温で４
時間反応した。反応後は実施例１と同様の操作を
行なつて親水性重合体粒子を得た。かくして得ら
れた親水性重合体粒子をPH7.5に調製し、水蒸気
蒸留を行なつて、残存するエポキシ基をジヒドロ
キシル基に変換した。次いで蒸留水100mlに0.8％
濃度になるように再分散してからH₂SO₄でPH＝
3.0に調製した。その後NaIO₄9mmoleを加えて40
℃で18時間反応して、ジヒドロキシル基をアルデ
ヒド基に変換した。得られたアルデヒド基含有親
水性重合体粒子を濾紙（No.２）で濾別した後に、
遠心分離，蒸留水への再分散の操作を６回繰返し
た。その後イオン交換樹脂で脱イオン操作を行な
い、更に遠心分離と洗浄を行なつて精製した。か
くして得られたアルデヒド基含有親水性重合体粒
子を緩衝液をグリシン緩衝液から0.10モルのホウ
酸―ホウ砂とNaCl0.05モルを蒸留水１に溶解
したPH＝8.2に調製したホウ酸緩衝液に変えたこ
とと、ウシ血清アルブミンを全工程で添加しなか
つたこと以外は全て実施例１と同様の操作でヒト
IgGを固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清との抗
原・抗体反応を行なつた。その結果、鋭敏性は１
日後×2560，３ケ月後×2560，また分散安定性は
１日後２本，３ケ月後４本の非特異的凝集反応が
認められた。 尚、比較例５として、本発明のジエタノールア
ミンと重合体粒子のエポキシ基の反応を行なわず
に上記と同様の操作を行なつた。その結果、ヒト
IgGを固定化していないものまで非特異的凝集反
応がみられたために正確な鋭敏性が判定できなか
つた。また、分散安定性は１日後７本，３ケ月後
10本の非特異的凝集反応が認められた。 実施例15と比較例６ 撹拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後
に、蒸留水2700c.c.を加えて70℃に保つた後に、窒
素雰囲気下，撹拌下に過硫酸カリウム5.0ミリモ
ル／，チオ硫酸ナトリウム５ミリモル／，及
び硫酸銅0.25ミリモル／を添加した。次いで70
℃に加温したグリシジルメタクリレート2.0モル
及びエチレングリコールジメタクリレート30ミリ
モルの混合物を添加して70℃で２時間重合した。
その後の操作は実施例１と同様の操作を行なつ
た。得られた重合体粒子の粒子径は0.261μmであ
つた。 得られた重合体粒子を蒸留水100mlに２％濃度
になるように調製し、Ｎ―トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル―３―アミノプロパンスルホン酸
8μmoleを加えてからPH9.0に調製した後、37℃で
６時間反応した。反応後は実施例１と同様の操作
を行なつて親水性重合体粒子を得た。かくして得
られた親水性重合体粒子をPH7.5に調製し、水蒸
気蒸留を行なつて残存するエポキシ基をジヒドロ
キシル基に変換した。次いで蒸留水100mlに1.6％
濃度になるように調製し、予めCH₃COOH20ミ
リモルとNaIO₄20ミリモルを溶解した水溶液100
mlを加えて40℃で20時間反応して、ジヒドロキシ
ル基をアルデヒド基に変換した。得られたアルデ
ヒド基含有親水性重合体粒子を濾紙（No.２）で濾
別した後に、遠心分離，蒸留水への再分散の操作
を６回繰返した。その後、イオン交換樹脂で脱イ
オン操作を行ない、更に遠心分離と洗浄を行なつ
て精製した。かくして得られたアルデヒド基含有
親水性重合体粒子を緩衝液をグリシン緩衝液から
0.10モルのホウ酸―ホウ砂とNaCl0.05モルを蒸留
水１に溶解したPH＝8.2に調製したホウ酸緩衝
液に変えたことと、ウシ血清アルブミンを全行程
で添加しなかつた以外は全て実施例１と同様の操
作でヒトIgGを固定化し、抗ヒトIgGウサギ血清
との抗原・抗体反応を行なつた。その結果、鋭敏
性は１日後×2560，３ケ月後×2560，また分散安
定性は１日後１本，３ケ月後３本の非特異的凝集
反応が認められた。 尚、比較例６として、本発明のＮ―トリス（ヒ
ドロキシエチル）メチル―３―アミノプロパンス
ルホン酸と重合体粒子のエポキシ基の反応を行な
わずに上記実施例と同様の操作を行なつた。その
結果、ヒトIgGを固定化していないものまで非特
異的凝集反応がみられたために正確な鋭敏性が判
定できなかつた。また、分散安定性は１日後３
本，３ケ月後に７本の非特異的凝集反応が認めら
れた。 比較例 ７ 実施例１〜９の項の(1)と同様にして重合体粒子
を得た。得られた重合体粒子を２％濃度で蒸留水
に分散した懸濁液100mlに、実施例１〜９の項の
(2)と同様な操作でポリエチレングリコール（平均
分子量600）の３％水溶液を１ml（50μモル）を
加えた。これに触媒として硫酸を100mg加えたと
ころ、重合体粒子が激しく凝集した。凝集状態を
実施例１〜９の(4)の判定基準に従い肉眼で判定し
たところ極めて強い凝集（＋＋＋）であつた。ヒ
トIgGを固定化する以前に非特異的凝集反応がお
こつたために、抗原・抗体反応の試験が実施でき
なかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた親水性重合体粒
子を用いた診断用試薬の凝集状態を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １(A) エポキシ基を表面に有する重合体粒子及び (B) 分子中に、カルボキシル基，アミノ基，メル
   カプト基及びアミド基よりなる群から選ばれた
   少くとも１種のエポキシ基と反応する官能基と
   ヒドロキシル基とを有する有機化合物、 を反応させ親水性重合体を得ることを特徴とする
   親水性重合体の製造方法。 ２ 有機化合物が複数個のヒドロキシル基を有す
   る有機化合物である特許請求の範囲１記載の親水
   性重合体の製造方法。