JPH02156883A - 組み換えワクチニアウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組み換えワクチニアウィルスに関し、さらに詳
しくは、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノムＤ
ＮＡ領域に牛パラインフルエンザ■型ウィルス由来のｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａが組み込まれた組み換えワクチニアウィル
ス及び同ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに関する。

（従来の技術） パラミクソウィルス科の牛パラインフルエンザ■型（以
下、ＢＰＩＶ３という）の遺伝子については、現在、解
析が進みつつある（　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６２、　３８
ｇ−３９６（１９８８）　）。

ＢＰＩＶ３はマウスを自然宿主としないが、生後２週間
以内のマウスに脳内接種すると強毒株のＭ株では致死性
の、弱毒株の９１ＯＮ株、８０株では非致死性の水頭性
を起こす。また、Ｍ株の弱毒化ミュータントで９１ＯＮ
株様の性質を示すＭＲ株もＭ株に比べれるとかなり弱い
が、最終的に致死性を示す。この場合、弱毒株の感染が
脳室上皮に限局するのに対し、強毒株の感染は脳実質細
胞に波及している。また、ウィルスタンパク質量あたり
のウィルス粒子数はどの株もほぼ同様であリ、９１ＯＮ
株、ＭＲ株は赤血球凝集（ＨＡ）価もニューラミニデー
ス（ＮＡ）力価も高いが、Ｍ株、８０株のＨＡ価、ＮＡ
価は極めて低い。Ｍ株、８０株のＮＡは螢光基質によっ
てのみ検出でき。

その酵素としての性質は同一である。

これらの株は人、猿、牛山来の細胞では良く増殖するが
、強毒のＭ株では激しい多核巨細胞形成（以下、５ｙｎ
Ｆという）を示すか弱毒の９１ＯＮ株、８０株では微弱
な５ｙｎＦを示すにすぎない。また、ＭＲ株でも微弱な
５ｙｎＦが示される。９１ＯＮ株や８０株の５ｙｎＦは
外から添加されたＮＡにより完全に阻止されるが、Ｍ株
では阻止されず、Ｍ株の膜融合活性が８０株等より強い
か、Ｍ株のウィルス粒子成熟機構に欠陥があるかのいず
れかであることを示唆した。これらの株に対するウィル
スレセプターは同一であるが、マウス脳由来のＤＢＴ細
胞に対してＭ株は比較的良く感染し、９１ＯＮ株、８０
株、特に９１ＯＮ株の感染効率は極めて低い。

これは侵入効率の差によるものと推定され、何等かの理
由でＭ株の膜融合活性が強いことを示唆している。

９１ＯＮ株を抗原として作製した四群の抗へマグルチニ
ン・ノイラミニダーゼ（以下、ＨＮという）モノクロー
ナル抗体は９１ＯＮ株やＭＲ株、８０株よりもＭ株をは
るかによく中和する。抗膜融合タンパク質（以下、Ｆタ
ンパク質という）モノクロナール抗体もＭ株のみを中和
する。これはウィルス粒子構造上の差によるものと考え
られる。

ＮＡ活性が低いことは膜融合能を上昇させる方向に働く
と考えられるが、以上の所見は、共にＮＡ活性の低い８
０株とＭ株を比べても、Ｍ株の方がより高い膜融合活性
を持っていることを示している６　その結果、本来侵入
しにくいマウスの細胞にＭ株は効率良く侵入でき、それ
がマウスに対する病原性につながっていることをうかが
わせた。

Ｍ株の膜融合活性が高い理由として、Ｆタンパク質自体
が他のウィルス株と異なっている、またはＨＮ、Ｆタン
パク質、膜タンパク質（以下、Ｍタンパク質）の３種の
エンベロープタンパク質の集合状態が他のウィルスと異
なフている、の二つが考えられ、これらの株のウィルス
について、ＨＮ、　　Ｍ、　　Ｆ膜タンパク質の構造と
機能を分子レベルで比較検討した。

Ｍ株のＨＮのアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子の
塩基配列を第４図に、Ｍ株のＭタンパク質のアミノ酸配
列とそれをコードする遺伝子の塩基配列を第５図に、Ｍ
株のＦタンパク質のアミノ酸配列とそれをコードする遺
伝子の塩基配列を第６図に示す。また、株の違いによる
各タンパク質のアミノ酸配列の違いを第１表に、各タン
パク質をコードする遺伝子の塩基配列の違いを第２表に
示す。

第２表 第１表 Ｍ株と８０株の３種のエンベロープタンパク質の違いは
、Ｍタンパク質の７０番目の残基とＨＮの５３９番目の
残基の二箇所だけであり、しかもこのいずれも、Ｍ株は
９１ＯＮ株と同じであった。

即ち、９１ＯＮ株とのアミノ酸置換数では、Ｍ株の方が
８０株より少なく、８０株にみられるアミノ酸置換の組
み合わせの方が、ウィルス粒子形成やウィルス粒子の分
子集合にとってより安定な組み合わせであり、そのため
、Ｍ株ではウィルス粒子成熟過程に異常があり（激しい
５ｙｎＦ）、また出来上がったウィルス粒子の膜融合能
が高い（ＤＢＴ細胞へ良く侵入する）と考えられた。Ｍ
Ｒ株とＭ株の違いは、ＨＮの１９３番目の残基が異なる
のみである。

これらの結果から５ｙｎＦを利用した新しいワクチンの
開発の可能性がうかがえた。

近年、ワクチニアウィルスに外来性ＤＮＡを組み込んだ
組み換えワクチニアウィルスの構築法が考案され、外来
性ＤＮＡとして、例えば感染症ウィルスの抗原コードＤ
ＮＡを用いた組み換えワクチニアウィルスを生ワクチン
として利用する方法が提案されるようになった（例えば
特開昭５８−１２９９７１号、特公表昭６０−５００５
１８号、特公表昭６１−５０１９５７号など）、、シカ
シ、ＢＰＩＶ３（７）抗原ヲコードする遺伝子をワクチ
ニアウィルスに組み込んだ例としては、ワクチニアウィ
ルスの増殖に非必須なゲノム領域にＢＰＩＶ３由来のＨ
Ｎをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを組み込んだ組み換えワ
クチニアウィルス（特開昭６３−２８３５７８号）が知
られているだけで、Ｆタンパク質や、Ｍタンパク質をコ
ードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを組み込んだ組み換えワクチニ
アウィルスは知られておらず、５ｙｎＦを利用したワク
チンも知られていなかった。

（発明が解決しようとする課題） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下でＢＰＩＶ３
由来のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａより、ＦおよびＭタンパク質をコ
ードする領域を選択し、ワクチニアウィルスのプロモー
タに連結しワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノム
領域に組み込めば増殖可能な組み換えワクチニアウィル
スが得られること、を見い出し、さらに細胞中でＦタン
パク質とＨＮを発現させることで５ｙｎＦが起こること
を見い出した。

（課題を解決するための手段） かくして本発明によれば、ＢＰＩＶ３由来のＦまたはＭ
タンパク質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ及び同ｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａをワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノム領
域に、好ましくはプロモーター機能を有するＤＮＡと共
に、発現可能な形で組み込まれた組み換えワクチニアウ
ィルスが提供され、ざらにＦタンパク質とＨＮの両方を
発現させることで、ＢＰＩＶ３に対する免疫効果を高め
る方法が提供される。

本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはワクチニアウィルスに分類されるウィルスであれ
ばいかなるものでもよく、例えばＷＲ株（ジャーナル　
オブ　ヴイロロジ−４９゜８５７　、　（１９８４））
、リスター株、リスター株の温度感受性変異株（ＵＳＰ
４，５６７．１４７）Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｏａｒｄ　
ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ株、Ｌ　Ｃ１６ｍ　８株などの種痘
ワクチン株（ワクチン抗原用ベクターとしてのワクチニ
アウィルス“Ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓｅｓａｓ　
　ｖｅｃｔｏｒ　　ｆｏｒ　　Ｖａｃｃｉｎｅ　　Ａｎ
ｔｉｇｅｎｓ”　　ｐｐ・　８７−１００ｈＪ、　Ｑｕ
ｉｎｎａｎｍ　　アムステルダム、ニューヨークおよび
オックスフォード：エルセバー社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）
版）などが例示される。

また、ＢＰＩＶ３由来のＦおよびＭタンパク質をコード
するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、例えば上記ＢＰＩＶ３のＭ株、
８０株（共にＩｎｆｅｃｔ、　ｉｍｍｕｎ、　３４．２
６２−２６７　（１９８１））、ＭＲ株（ＩｎｆｅｃＬ
　ｉｍｍｕｎ、　３５．４３７〜４４１　（１９８２）
）や９１ＯＮ株（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎ。

２３、６１７〜６２８　　（１９７９））を用いて調製
することができる。

例えば上記Ｍ株からｍ製されたＭ、　　Ｆタンパク質Ｈ
Ｎのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａはそれぞれ第４図、第５図、第６図
に示す塩基配列を有し、上記の他の株は第２表に示す部
分の塩基の違い以外は同じ配列を示す。

このように、ＢＰＩＶ３由来のＦ、　　Ｍタンパク質、
ＨＮをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの配列は必ずしも一様
ではないが、本発明においては、上記のｃＤＮＡと実質
的に同一の機能を有する範囲において、修飾されたｃＤ
ＮＡ（即ち、塩基配列が置換、挿入、欠乏したもの）で
あってもよい。もちろん、実質的に同一の機能を有する
かぎり、アミノ酸配列が異なる程度に修飾されたもので
あってもよい。

本発明を実施するに当たっては、まずワクチニアウィル
スの増殖に非必須なりＮＡ領領域組み込んだ第一の組み
換えベクターで作製される。同領域内にワクチニアウィ
ルス内で機能するプロモーターが含まれているものが好
ましい。ここで言う増殖に非必須なりＮＡ領領域は、例
えばワクチニアウィルスのチミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）
遺伝子、赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、ワクチニアウィ
ルスＷＲ株ＤＮＡのＨｉｎｄｍ切断Ｆフラグメント、Ｍ
フラグメント、Ｎフラグメント（ウィルス　３６１゜２
３−３３（１９８６））など、外来性ＤＮＡの挿入によ
る変異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさ
ない領域を言う。

また、ワクチニアウィルス内で機能するプロモーターと
は、合成・天然を問わずワクチニアウィルスが保有する
転写の系でプロモーターとして有効に機能しえるものな
らいかなる塩基配列のものでも良く、その具体例として
は例えばジャーナルオブ　ヴイロロジ−６６２−６６９
（１９８４）に示されるようなワクチニアウィルスのプ
ロモーター具体的には７．５にポリペプチドをコードす
るワクチニアウィルス遺伝子のプロモーター、　１９に
ポリペプチドをコードするワクチニアウィルス遺伝子の
プロモーター　４２にポリペプチドをコードするワクチ
ニアウィルス遺伝子のプロモーター　チミジンキナーゼ
をコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモーター
　２８にポリペプチドをコードするワクチニアウィルス
遺伝子のプロモーターなどが例示される。

第一の組み換えベクターの作製については常法に従えば
良く、例えばワクチニアウィルスの増殖に非必須なりＮ
Ａ断片を適当なベクターに組み込んだ後、必要に応じて
該断片中に存在する制限酵素切断点を利用しその下流に
制限酵素切断配列を付加したプロモーターを組み込めば
良い。用いら、れるベクターの具体例として、例えばｐ
ＢＴ３２２、ＰＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２
８、ｐＵｃ７、ｐＵｃ８、ｐＵｃ９、ｐＵｃ１９などの
ごときプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどの
ごときファージ、　ｐＨＣ７９（ジーン、１１．２９１
　（１９８０）　）などのごときコスミドが例示される
。

本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流にＢＰＩＶ３のＭ、またはＦタンパ
ク質あるいはＨＮをコードする領域を挿入して第二の組
み換えベクターが作製さ、れる。挿入方法もまた常法に
従えばよく、例えば第一のベクターのプロモーターの下
流に予め設けられた制限酵素切断点を利用してＢＰＩＶ
３由来のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を挿入すればよい。

これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。

本発明においては、次に、予めワクチニアウィルスを感
染させた動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入
し、ベクターＤＮＡとウィルスゲノムＤＮＡの間に相同
組み換えを起こさせ、組み換えワクチニアウィルスを構
築する。ここで用いられる動物培養細胞はワクチニアウ
ィルスが増殖可能なものであればよく、その具体例とし
て、例えばＴＫ−１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ（ヒ
ト羊膜由来）、Ｈｅ１ａ　（ヒト子宮頚部癌由来）、Ｋ
Ｂ　（ヒト鼻咽喉癌由来）、ＣＶ−１（サル腎由来）、
Ｂ１０−１　（サル腎由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由来
）、Ｌ９２９　（マウス結合組織由来）、ＣＥ　（鶏胚
）細胞、ＣＥＦ　（鶏胎児繊維芽細胞）などが例示され
る。

組み換えワクチニアウィルスの構築に当たっては常法に
従えば良く１例えば＋　　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇＶｏ
ｌ、Ｉ［、ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ
　　ｐｐ、１９１−２１１゜（Ｄ　Ｍ　Ｇｌｏｖｅｒ編
、ＵＲＬプレス、オックスフォード、ワシントン）の記
述に準じてワクチニアウィルスを感染させたＣＶ−１細
胞にリン酸カルシュウム共沈法により処理した第二の組
み換えベクタ−を移入させ、得られる組み換えウィルス
を含むウィルス集団をＥａｇｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍ上に培養
されたＴＫ陰性細胞に感染させＢＵｄＲ存在下生育して
くるプラークを選択し、組み換えウィルス候補株とすれ
ば良い。これら候補株の内からＢＰＩＶａのＭまたはＦ
タンパク質あるいはＨＮをコードするＤＮＡ断片が組み
込まれたウィルスを選択する方法については、候補株を
プラーク純化したのち、該ＤＮＡをプローブとするハイ
ブリダイゼーション法を利用するか、あるいは、ＢＰＩ
Ｖ３抗体を用いるイムノアッセイを利用すれば良い。

ひとつの細胞中でＦ、　　Ｍタンパク質、ＨＮから選ば
れる２種あるいは３種のタンパク質全てを発現させるに
は、上記の方法で調製されるＦ、　　Ｍタンパク質、Ｈ
Ｎそれぞれをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを組み込んだ３
種の組み換えワクチニアウィルスを細胞に二重、三重に
感染させても、上記の方法に準じて二種または三種のタ
ンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組み換えウィ
ルスを調製し、細胞に感染させてもよい。

感染させたｃｖ−ｉ細胞をウィルス吸着終了後に単ＪＩ
ＦＭＤ　Ｂ　Ｋ　（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ　ｂｏｖｉ
ｎｅ　ｋｉｄｎｅｙ　）細胞に接種して５ｙｎＦ発現を
観察したところ、Ｆタンパク質とＭ株のＨＮが同時に発
現すると著明な５ｙｎＦが起こり、Ｆタンパク質と８０
株またはＭＲ株のＨＮの組み合せの場合　５ｙｎＦは微
弱であった。

また、これらの組み合せにＭタンパク質の発現を加えて
も５ｙｎＦには影響なく、またいずれのタンパク質も単
独発現では　５ｙｎｐを示さなかった。これらの結果か
ら５ｙｎＦにはＦタンパク質とＨＮの両者が必要であり
、Ｍ株の著明な５ｙｎＦは、そのＨＮの変異によること
が示された。

従って、ＢＰＩＶａの病原性は５ｙｎＦ能と密接に関係
し、強毒株の５ｙｎＦが弱毒株の５ｙｎＦよりはるかに
強いこと考え合わせると、Ｆタンパク質を有効に発現で
きる組み換えワクチニアウィルスをワクチンとして動物
に接種した場合、誘起されるＦタンパク質に対する抗体
はＢＰＩＶａの感染もしくは感染の結果としての発病を
押え得る可能性が極めて強いことが容易に類推できる。

また、ＨＮを発現できる組み換えワクチニアウィルスと
Ｆタンパク質を有効に発現できる組み換えワクチニアウ
ィルスを共に動物に接種した場合は（あるいは、Ｆタン
パク質、ＨＮを共に発現できる組み換えワクチニアウィ
ルスを動物に接種した場合は）、各々単独の組み換えワ
クチニアウィルスを接種する場合に比べてより大きなワ
クチン効果を期待できることも容易に推定できる。

（発明の効果） かくして本発明によれば、ワクチニアウィルスの増殖に
非必須なゲノム領域に牛パラインフルエンザ３型ウィル
ス由来の抗原コードｃ　Ｄ　Ｎ　Ａがプロモーター機能
を有するＤＮＡと共に発現可能な形で組み込まれた、牛
用生ワクチンとして利用可能な、組み換えワクチニアウ
ィルスが得られる。

さらに、Ｆタンパク質、ＨＮを共に発現させることで大
きなワクチン効果が期待できる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ （１）ＢＰＩＶａ　　Ｍ株感染細胞からのｍ　ＲＮ　Ａ
の抽出 ヒト胎児肺由来株化細胞Ｒ６６にＢＰ　Ｉ　Ｖ３Ｍ株を
それぞれ感染させ、ウィルスを増殖後、培養液を除去し
、そこにアクチノマイシンＤ含有５％ＴＰＢ−ＭＥＭを
加え更に培養し、培養液を除去する。こうして調製した
ウィルス感染細胞よりグアニジウム溶液による抽出と塩
化セシウム密度勾配遠心　（細胞工学、ｖｏｌ　、２、
Ｎｏ、２．１９８３）により全ＲＮＡを分離した。

上記全ＲＮＡをＴＥ　（トリスＥＩ：）ＴＡ）溶液とし
たのち、吸着バッファー（Ｔ　Ｅ　　ｐＨ７，５＋　０
．５ＭＮａＣ１）で平衡したオリゴｄＴセルロースカラ
ムを用いて全ＲＮＡからｍ　ＲＮ　Ａを分離した。

（２）岡山−バーブ法によ６ＢＰＩＶ３　　Ｍ株ＨＮ遺
伝子を含むプラスミドの構築（第１図参照）プラスミド
ｐｃＤＶ−１（ファルマシア製）を制限酵素Ｋｐｎ　Ｉ
で消化後、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴＴａｓｅ
）でｄＴ鎖を付加し、さらに制限酵素ＥＱＯＲＩで切断
後、長い方のＤＮＡ断片（約２．９ｋｂｐ）を分離・回
収し、ベクタープライマーを得た。

一方、プラスミドＰＬＩ　（ファルマシア製）を制限酵
素Ｐｓｔ　Ｉで消化後、　ＴＴａｓｅでｄＧ鎖を付加し
。

さらに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、最も短かい断
片（約０．５ｋｂｐ）を分離・回収しリンカ−ＤＮＡを
得た。

次いで、　（１）で得たｍ　ＲＮ　Ａと、先に調製した
ｐｃＤＶ１ベクタープライマーを混合し、アニーリング
したのち、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴａｓｅ
）を加えｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成を実施し、更にＴＴａｓｅ
によるｄＣ鎖付加反応を実施した。これを制限酵素Ｈｉ
ｎｄｌ［［で消化した。消化後、先に調製したｐＬ１由
来リンカ−ＤＮＡを加え、アニーリング後ＤＮＡリガー
ゼによりライゲーション反応を行ない、環状化した。そ
の後、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ　＋　　
ＲＮａｓｅＨを加え、ＲＮＡ鎖のＤＮＡ鎖への置換反応
を実施し、生成した組み換えプラスミドを大腸菌ＨＢＩ
ＯＩコンピテントセルに導入し、得られた形質転換菌の
中から目的のＨＮ遺伝子を含む組み換えプラスミド（Ｍ
１７６）を有する形質転換菌を以下に述べる手順により
選択した。

（３）ＢＰＩＶ３　　Ｍ株ＨＮ遺伝子を含む組み換えプ
ラスミドに１７６のスクリーニング ＢＰＩＶ３　９１ＯＮ株由来のプラスミドＰＡＬ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５．２９
２７−２９４４（１９８７ＬＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５．２９４５−２９５８（１９
８７））をＫｐｎ　ＩとＢｇＩ　ＩＩで切断し、第４図
の塩基配列で７７８位のＫｐｎ　Ｉ切断部位から１４４
３位のＢｇｌｎ切断部位までを含む５６５ｂｐの断片を
回収した。

ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５５、６８８〜６９６（１９８６
）に記載の方法に従って、　（２）で調製した形質転換
菌について、上記断片をプローブとするコロニーハイブ
リダイゼーションを行ない、ポジイティブな菌を選択し
た。

（４）ＢＰＩＶ３　　ＳＣ株ＨＮ遺伝子ヲ含ム組ミ換え
プラスミド５Ｃ１３０の構築、スクリーニングＢＰＩＶ
ａ　　Ｍ株の代わりに８０株を用いる以外は上記（１）
〜（３）と同様にプラスミドを構築し、スクリーニング
し、　５Ｃ１３０と命名した。

、（５）ＢＰＩＶ３　　ＭＲ株ＨＮ遺伝子ヲ含む組み換
えプラスミドＭＲ２−９の構築、スクリーニングＢＰＩ
Ｖａ　　Ｍ株の代わりにＭＲ株を用いる以外は上記（１
）〜（３）と同様にプラスミドを構築し、スクリーニン
グし、　ＭＲ２−９と命名した。

（６）ワクチニアウィルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺
伝子を含む第１の組み換えベクター（ｐＵＨＫ）の作製
（第２図参照） ＰＬＩＣ９をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ　Ｉで消化後、ポリ
メラーゼで処理し、切断端を平滑末端したのち、連結し
、ＥｃｏＲ１部位の欠損したｐＵｃ９を作製した。この
Ｅ、ＣＯＲＩ部位欠損ｐＨｃ９を旧ｎｄｌ［［で切断後
、ワクチニアウィルスＴＫ遺伝子を含むワクチニアウィ
ルスＷＲ株のＨｉｎｄｌＩＩ　Ｊ　ｒＩＲ片に連結し、
第１の組み換えベクターＰＵＨＫを得た。

（７）ポリリンカー及びワクチニアウィルス７．５にプ
ロモーターが挿入されたワクチニアウィルスＴＫ遺伝子
を含む第二の組み換えベクターｐＮ２８８に２の作製（
第３図参照）。

ワクチニアウィルスＷＲ株の７．５にプロモーター（モ
スら、（ｌ！／ｌ／１２５．８０５−８１３　（１９８
１年））ヲｐＵｃ１９　（ファルマシア社製）の１ｉｎ
ｅ　１１部位に挿入したのち、Ｈｉ　ｎｄ　ｍとＥｃｏ
ＲＩで順次切断して７．５にプロモーターの前後にポリ
リンカ一部位を有するＤＮＡ断片（約３５０ｂｐ）を得
た。

このＤＮＡ１１１片を　（６）で得たプラスミドｐＵＨ
ＫのＥｃｏＲＩ消化物とをポリメラーゼで処理したのち
、連結し、得られた組み換えプラスミドをｐＮＺｅ８に
２と命名した。

（８）プラスミドｐＮＺ−ＭＨＮの構築（第７図参照）
（３）で得たＭ１７６をＨｉｎｄ■で切断し、クレノー
で平滑末端にした後、ＥｃｏＲＩで切断し、約４．１ｋ
ｂｐの断片を得た。また、　（４）で得た５Ｃ１３０を
Ｄｄｅ　Ｉで切断しクレノーで平滑末端にした後、Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、　２８７ｂｐの断片を得た。この２つ
の断片をＴ４リガーゼで結合し、プラスミド阿１７６Ｔ
ｒを構築した。さらにＭ１７６ＴｒをＢａｍＨＩとｔ＋
１ｎｄＩＩＩで切断して得た約１．９ｋｂｐの断片をク
レノーで平滑末端にして、（７）で得たｐＮＺ６８に２
をＳｍａ　ｒで切断して得た約８ｋｂｐの断片（以下、
　ｐＮ２６８に２　Ｓｍａ　Ｉ　　ｃｕｔ、という）と
Ｔ４リガーゼで結合し、プラスミドＰＮＺ−ＭＨＮを構
築した。

ＰＮＺ−ＭＨＮは、　　７．５にプロモーターに対し正
方向にＢＰＩＶＳ　　Ｍ株のＨＮ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドである。

（９）組み換えワクチニアウィルスｒ　Ｍ　ＨＮ　Ｗ　
Ｒ株の作成と細胞での発現 ２５ｃｒｎ２のカルチャーボトルに培養されたＣｖ−１
細胞にワクチニアウィルスＷＲ株（０，１ｐｆｕ／細胞
）を接種し、４５分後、前記の組換えプラスミドｐＮＺ
−ＭＨＮ　１２μｇを２．２艷の滅菌水で溶かし、樋高
ら（蛋白質・核酸・酵素、２７、３４０　（１９８５）
）の方法によってＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈物をつ
くり、その０．５−を感染ｃｖ−１ｍ胞上に滴下した。

３０分間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに静置し
、５％牛脂児血清を含むＥａにｌｅ　　ＭＥＭ　４．５
＋ｎｆｆを加えた。その３時間後培養液を交換し、４８
時間後、培養細胞ごと３度凍結溶解し、超音波処理（３
０秒）した。　　組換え体のＨＮＮ遺伝子六入確認する
ため、６ｃｍのペトリ皿に培養されたＴ　Ｋ−１４３細
胞に上記プラーク形成ウィルスを接種し、４５分後、１
％寒天、１２％牛脂児血清、２５μｇ／ｍ１２ＢＵｄＲ
加Ｅａｇｌｅ　　ＭＥＭを積層し、３日間培養後感染細
胞を０．０１％中性紅で染色した。形成されたプラーク
をパスツールピペットで単離しＥ　ａｇｌｅ　　Ｍ　Ｅ
　Ｍ中に希釈する。単離したプラークにつき、再度同様
の操作を繰り返しプラークを純化した。純化したプラー
クより得られたウィルスを増殖させ、増殖ウィルスより
ＤＮＡを調製し、ＨＮをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをプ
ローブとするドツトプロットハイブリダイゼーションに
より、得られた組み換えワクチニアウィルスがＢＰＩＶ
３Ｍ株由来のＨＮをコードするＤＮＡをゲノム内に持つ
組み換えウィルスであることを確認し、これをｒ　Ｍ　
ＨＮ　Ｗ　Ｒ株と名付けた。

組織培養用チャンバースライドに培養したｃｖ−１艷胞
に、ｍ、ｏ、ｉ、１又はｏ、ｉのｒ　Ｍ　ＨＮ　Ｗ　Ｒ
を接種し、３７℃、１時間感染後ウィルス液を抜きとり
、細胞をＥ　ａｇｌｅ　　Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄し、５％牛
脂児血清、４０Ｉｔｇ／ｄシトシンアラビノシド加Ｅａ
ｇｌｅ、ＭＥＭを加えた。１６時間後、Ｅａｇｌｅ　　
ＭＥＭを除き、軽＜ＰＢＳ　（リンＷ！ｉ緩衝生理食塩
水）で洗い、軽く風乾した後、−２０℃アセトン：エタ
ノール（１１）中５分間処理し細胞を固定する。−次抗
体として抗ＢＰＩＶ３ウィルス・ウサギ抗体、二次抗体
としてイソチアン酸フルオレセイン結合抗つサギＩｇＧ
抗体を使用する螢光抗体法でチエツクし、組み換えワク
チニアウィルスがＢＰＩＶ３ウィルスのＨＮ生産能を持
つことを確認した。

（１０）プラスミドｐＮＺ−５ＣＨＮの構築（第７図参
照）（４）で得た５Ｃ１３０をＰｓ七■とＢｇｌ　ＩＩ
で切断し、４４０ｂｐの断片を得た。同様に（８）で得
たＭ１７６ＴｒをＰｓｔｌとＢ［Ｉ　ｎで切断し約４ｋ
ｂρの断片を得た。この２つの断片をＴ４リガーゼで結
合し、プラスミド５Ｃ１３０Ｔｒを構築した。さらに、
　５Ｃ１３０ＴｒをＢａｍＨＩとＨｉｎｄｍで切断して
得た約１．９ｋｂｐの断片をクレノーで平滑末端にした
後、　ｐＮＺ６８に２　Ｓｍａ　ＩｃｕｔとＴ４リガー
ゼで結合して、プラスミドｐＮＺＳＣＨＮを構築した。

ＰＮＺ−５ＣＨＮは、７．５にプロモーターに対シ正方
向にＢＰＩＶａ　　ＳＣ株のＨＮ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドである。

（１１）組み換えワクチニアウィルスｒ　Ｓ　ＣＨＮ　
Ｗ　Ｒ株の作成と細胞での発現 ｐＮＺ−ＭＨＮの代わりにｐＮＺ−５ＣＨＮを用いるこ
と以外は（９）と同様に組み換えワクチニアウィルスｒ
　Ｓ　ＣＨＮ　Ｗ　Ｒを作成し、細胞での発現を確認し
た。

（１２）プラスミドｐＮＺ−ＳＣＨＮ＋７）構築（第７
図参照）（５）で得たＭＢ２−９をＨｉｎｄＩＩ［で切
断し、クレノーで平滑末端にした後、ＥｃｏＲＩで切断
し、約４．１ｋｂＰの断片を得た。この断片と　（８）
で得た２８７ｂｐの断片をＴ４リガーゼで結合し、プラ
スミドＭＲ２−９Ｔｒを構築した。さらに、　ＭＢ２−
９ＴｒをＢａｍＨＩとＨｉｎｄｍで切断して得た約１．
９ｋｂｐの断片をクレノーで平滑末端にした後、　ｐＮ
Ｚ６８に２　Ｓｍａ　Ｉ　　ｃｕｔとＴ４リガーゼで結
合して、プラスミドｐＮＺ−ＭＲＨＮを構築した。

ｐＮＺ−ＭＲＨＮは、７．５にプロモーターに対し正方
向にＢＰＩＶａ　　ＭＲ株のＨＮ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドである。

（１３）組み換えワクチニアウィルスｒ　Ｍ　ＲＨＮ　
Ｗ　Ｒ株の作出と細胞での発現 ｐＮＺ−阿［（Ｎの代わりにｐＮＺ−ＭＲ）ＩＮを用い
ること以外は（９）と同様に組み換えワクチニアウィル
スｒ　Ｓ　ＣＨＮ　Ｗ　Ｒを作成し、細胞での発現を確
認した。

参考例１ （１）ＢＰＩＶ３　　ＳＣ株Ｍ遺伝子を含む組み換えプ
ラスミド５Ｃ２００１の構築、スクリーニングＭ遺伝子
のＢＰＩＶ３　９１ＯＮ株由来のプラスミドＰＴ３８　
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５
．２９２７−２９４４（１９８７））をＢａｍＨＩとＨ
ｐａｌで切断し、第５図の塩基配列で１６７位のＢａｍ
ＨＩ切断部位から８６４位のＨｐａ　Ｉ切断部位までを
含む６９７ｂｐの断片を口取した。

ＢＰＩＶ３　　Ｍ株の代わりにＳＣ株を、プローブとし
て上記の６９７ｂρの断片を用いること以外は参考例１
の（１）〜（３）と同様に、プラスミドを構築し、スク
リーニングし、５Ｃ２００１と命名した。

（２）プラスミドｐＮＺ−ＭＭの構築（第８図参照）（
１）に記載のプラスミドＰＴ３８をＤｄｅ　Ｉで切断し
、クレノーで平滑末端にして、約１．１ｋｂρの断片を
得た。　また、ｐＲＳＶ−ｎｅｏ　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎ
ｉｎｇＶｏｌ、ＩＩ、　　ａｐｒａｃｔ、１ｃａｌ　　
ａｐｐｒｏａｃｈ　　　ｐｐ、１４３−１９０、　　Ｄ
　　Ｍ　　Ｇｌｏｖｅｒ［ｉｇ、ＩＲＬプレス、オック
スフォード、ワシントン）をＨｉｎｄｌＩＩとｐｖｕｌ
［で切断し、クレノーで平滑末端にして、約４．４ｋｂ
ｐの断片を得た。この２つの断片をＴ４リガーゼで結合
してプラスミドＰＲ３Ｖ−９Ｍを得た。さらに、　ｐＲ
ＳＶ−９ＭをＨｉｎｄｌｌｌとＰｓｔ　Ｉで切断して得
た約１．１ｋｂｐの断片をクレノーで平滑末端にした後
、　ｐＮＺ８８に２　ＳｍａＩ　　ｃｕｔとＴ４リガー
ゼで結合して、プラスミドｐＮＺ−ＭＭを構築した。

ｐＮＺ−ＭＭは、７．５にプ０％−ターに対し正方向ニ
ＢＰＩＶａ　　Ｍ株のＭ遺伝子が挿入さ九たプラスミド
である。

（３）組み換えワクチェアウイルスｒＭＭＷＲ株の作成
と細胞での発現 ｐＮＺ−ＭＨＮ（７）代わりニｐＮＺ−ＭＭを、ＨＮを
コードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの代わりにＭタンパク質をコ
ードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを用いること以外は実施例１の
（９）と同様に組み換えワクチニアウィルスｒＭＭＷＲ
を作成し、細胞での発現を確認した。

（４）プラスミドｐＮＺ−ＳＣＭの構築（第８図参照）
（３）で得たｐＲＳＶ−９？ｆをＢａｒｔｒＨＩとＡａ
ｔ　Ｕで切断し、約２．７ｋｂｐの断片を得た。また、
同様にＡａｔＩＩとＸｂａ　Ｉで切断し、約２．３ｋｂ
ｐの断片を得た。また。

（２）で得た５Ｃ２００１をＸｂａ　ＩとＢａｍ）Ｉ　
Ｉで切断し、約０．５ｋｂｐの断片を得た。これら３つ
の断片をＴ４リガーゼで結合し、プラスミドｐＲ５Ｖ−
５ＣＭを構築した。

さらに、ｐＲＳＶ−５ＣＭをＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔ　
Ｉで切断した約１．１ｋｂｐの断片をクレノーで平滑末
端にした後、ｐＮ２６８に２　ＳｍａＩ　　ｃｕｔとＴ
４リガーゼで結合して、プラスミドｐＮＺ−３ＣＭを構
築した。

ｐＮＺ−ＳＣＭは、７．５にプｏ　モー　１−　！：　
対し／　正方向ニＢＰＩＶａ　　ＳＣ株のＭ遺伝子が挿
入されたプラスミドである。

（５）組み換えワクチニアウィルスｒｓｃＭＷＲ株の作
成と細胞での発現 ｐＮＺ−ＭＨＮの代わりにｐＮＺ−５ＣＭを、ＨＮをコ
ードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの代わりにＭタンパク質をコー
ドするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを用いること以外は実施例１の（
９）と同様に組み換えワクチニアウィルスｒＭＭＷＲを
作成し、細胞での発現を確認した。

実施例２ （１）ＢＰＩＶＳ　　Ｍ株Ｆ遺伝子を含む組み換えプラ
スミドＭ４２０の構築、スクリーニング参考例１の（１
）記載のプラスミドＰＴ３８をＰｓｔ、Ｉと［：ｃｏＲ
Ｉで切断し、第９図の塩基配列の１８８位のＰｓｔＩ切
新部位から１７９４位のＥｃｏＲＩ切断部位までの１６
０６ｂｐを得た。

上記の１６０６ｂｐの断片をプローブとして用いること
以外は、実施例１の（１）〜（３）と同様に、プラスミ
ドを構築し、スクリーニングし、Ｍ４２０と命名した。

（２）プラスミドｐＮＺ−Ｆの構築（第９図参照）Ｍ４
２０を　Ｐｓｔ　Ｉで切断し、約１．３ｋｂｐと約３．
５ｋｂｐの２つの断片を得、Ｔ４リガーゼで結合し、プ
ラスミドＮ４２０Ｔｒを構築した。Ｍ４２０Ｔｒを　Ｐ
ｓｔ　ＩとＢａｍＨＩで切断して得た約１．７ｋｂｐの
断片をクレノーで平滑末端にした後、　ｐＮＺ６８に２
　ＳｍａＩ　　ｃｕｔとＴ４リガ−ゼで結合して、プラ
スミドｐＮＺ−Ｆを構築した。

ｐＮＺ−Ｆは、７．５にプロモーターに対し正方向にＢ
ＰＩＶａ　　Ｍ株のＦ遺伝子が挿入されたプラスミドで
ある。

（３）組み換えワクチェアウィルスｒＦＷＲ株の作成と
細胞での発現 ｐＮＺ−ＭＨＮの代わりにＰＮＺ−Ｆを、ＨＮをコード
するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの代わりにＦタンパク質をコードす
るｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを用いること以外は実施例１の（９）
と同様に組み換えワクチニアウィルスｒＦＷＲを作成し
、細胞での発現を確認した。組み換えワクチニアウィル
スｒＦＷＲは本願発明の組み換えワクチニアウィルスで
ある。

実施例３ ２５ＣＩ１１２のカルチャーボトルに培養されたＣｖ−
１細胞をＭＥＭで洗浄し、ＷＲ株、ｒ　Ｍ　ＨＮ　Ｗ　
Ｒ株、　ｒＭＨＮＷＲ株、　ｒＭＲＨＮＷＲ株、　ｒＦ
ＷＲ株、　ｒＭＨＮＷＲ株とｒＦＷＲ株を１：　１に混
合したもの、ｒ　Ｓ　ＣＨＮ　Ｗ　Ｒ株とｒ　Ｆ　Ｗ　
Ｒ株を１：１に混合したもの、ｒ　Ｍ　ＲＨＮ　Ｗ　Ｒ
株とｒＦＷＲ株を１＝　１に混合したものの８種の組合
わせをそれぞれにｍ、ｏ、ｉ、２で接種し、３７℃で１
時間放置した後、上滑を除去、ＰＢＳで洗浄し、０．０
２５％トリプシン溶液０．３−を加えて、３７℃で５分
放置した。ｌＯ％ＦＣ８含有ＭＥＭＩＯ−を加えて細胞
を剥し、細胞懸濁液を調製した。

６ウエルのマルチプレートに培養されたＭＤＢＫ細胞を
ＭＥＭで洗浄し、上記細胞懸濁液を０．１ｗｄ２　／　
ｗｅｌｌ加え、さらに１０％ＦＣ８含有ＭＥＭを３−加
えて、３７℃で１６〜１８時間培養した。上滑を除いた
後、５％グルコース・１０％ホルマリン含有ＰＢＳ２−
を加え、室温で３０分放置し、細胞を固定し、ＰＢＳで
洗浄、ＰＢＳで２００倍に希釈したギムザ液を２−加え
て、室温で１晩放置して染色し、ｇ＊鏡で観察した。

その結果、ｒ　Ｆ　Ｗ　Ｒ株とｒ　Ｍ　ＨＮ　Ｗ　Ｒ株
の両方が感染した細胞では激しい５ｙｎＦが、ｒＦＷＲ
株とｒ　Ｓ　ＣＨＮ　Ｗ　Ｒ株の両方が感染した細胞で
は弱い５ｙｎＦが認められ、ｒＦＷＲ株とｒＭＲＨＮＷ
Ｒ株の両方が感染した細胞ではほとんど５ｙｎＦは認め
られなかった（第１０図参照）。

参考例２ 実施例３のウィルスの組合せ８種の代わりに、８種中Ｗ
Ｒ株を除く７種の組合せに各ウィルスと等量のｒＭＭＷ
Ｒ株またはｒ　Ｓ　ＣＭ　Ｗ　Ｒ株を混合した１４種の
組合せを用いること以外は実施例３と同様に処理し、観
察した。

その結果、ｒＭＭＷＲ株、ｒｓｃＭＷＲ株を加えても５
ｙｎＦには何等の影響も与えないことが判った。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭ１７６、第２図はｐ　ＵＨＫ、第３図はＰＮ
Ｚ６ＢＫ２の構築手順を示す。第４図は牛パラインフル
エンザ■型ウィルスＭ株由来のへマグルチニン・ノイラ
ミニダーゼをコードするｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ
酸配列を、第５図は牛パラインフルエンザ■型ウィルス
Ｍ株由来の膜タンパク質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの
塩基配列及びアミノ酸配列を、第６図は牛パラインフル
エンザ■型ウィルスＭ株由来の膜融合タンパク質をコー
ドするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの塩基配列及びアミノ酸配列を示
す。 第７図はｐ　Ｎ　Ｚ　−Ｓ　ＣＨＮ、　　ｐ　Ｎ　Ｚ　
−ＭＨＮ、ｐＮＺ−ＭＲＨＮ、第８図はｐＮＺ−３ＣＭ
、ｐＮＺ−ＭＭ、　　第９図はｐＮＺ−Ｆ（７）構築手
順を示す。第１０図は多核巨細胞形成の様子を示す。 特許出願人　日本ゼオン株式会社 ヒー り く リ （ν　ｑ す ｒ−υコ ト一 リ ロコ：Ｔに遺伝子 手続補正書 （方式） ％式％ 発明の名称　　組み換えワクチニアウィルス補正をする
者 住所　　東京都千代田区丸の内二丁目６番１号５、補正
の対象 明細書の［発明の詳細な説明」、　「図面の簡単な説明
」の欄、及び図面 ６、補正の内容 １、　明細書第３３頁第１行目の「（第１０図参照）」
を削除する。 明細書第３４頁第５行目の「第１０図は多核巨細胞形成
の様子を示す。」を削除する。 ２゜

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ワクチニアウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
   に牛パラインフルエンザIII型由来の膜融合タンパク質
   をコードするｃＤＮＡの全部または一部を組み込んだ組
   み換えワクチニアウイルス。
2. （２）該ｃＤＮＡがプロモーターの支配下にある請求項
   （１）記載の組み換えワクチニアウイルス。
3. （３）該ｃＤＮＡが第６図のアミノ酸配列またはそれと
   実質的に同一機能を有するポリペプチドをコードするも
   のである請求項（１）または（２）記載の組み換えワク
   チニアウイルス。
4. （４）該ｃＤＮＡが第６図の塩基配列またはそれと実質
   的に同一の機能を持つ塩基配列を有するものである請求
   項（１）または（２）記載の組み換えワクチニアウイル
   ス。