JPH08512199A

JPH08512199A - ムンプスウイルス由来の組換え抗原およびワクチンにおける使用

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Publication number: JPH08512199A
Application number: JP6523863A
Authority: JP
Inventors: ボラン，アレックス; ウアール，ソフィー; ノルビー，エルリング・カール・ヤコブ; ヴァルサニー，タマス・マルク
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-26
Publication date: 1996-12-24
Also published as: GB9308963D0; EP0695358A1; WO1994025600A1; CN1126492A; CA2161645A1; KR960702000A; AU6964894A

Abstract

(57)【要約】本発明は（ａ）シグナルペプチド（ｓ）および膜アンカードメイン（ａ）を有してなる完全な融合タンパク質（Ｆ）の全長（Ｆｓ＋ａ＋と称する）；付着タンパク質またはヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）の全長；ヌクレオキャプシドの全長（ＮＰ）；（ｂ）膜アンカードメインを欠失した、切断された融合タンパク質（Ｆｓ＋ａ−と称する）；（ｃ）Ｆ、ＨＮおよび／またはＮＰタンパク質、またはその一部の融合により誘導されるハイブリッドタンパク質からなる群より選択されるムンプスウイルスの抗原をコードする組換えＤＮＡを提供する。さらに、本発明のＤＮＡからなるベクター、該ベクターで形質転換またはトランスフェクションされたワクシニアウイルス、哺乳動物細胞または細菌細胞のごとき宿主、および該宿主により発現されたタンパク質も本発明の範囲内である。

Description

【発明の詳細な説明】ムンプスウイルス由来の組換え抗原およびワクチンにおける使用ムンプス（Mumps）ウイルスはパラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する。それは、耳下腺炎からなる伝染性の小児疾病を引き起こす病原体である。感染後の潜伏期間の間に、そのウイルスは呼吸器上皮組織にて複製し、次いで耳下腺の分泌腺中に広まる。その後、他の分泌腺が感染するようになり、髄膜炎となるケースが多数報告されている。その感染に関連する合併症の中でも脳炎は、致死率約１％の重症であり、耳が聞こえなくなるケースも報告されている。ムンプスに対するワクチンは入手可能である：それは感染ニワトリ胚細胞の培養によって作られた弱毒化生ウイルスから作られる。そのワクチンは、ワクチンで免疫された個体において血清変換を引き起こし、血清反応陰性のヒトの９５％以上において感染に対し抵抗できる。かくして、そのワクチンは合併症の頻度を顕著に減少させた。しかしながら多数のケースにおいては、効果が亜臨床的なままであるためウイルス感染が検出されない。子供および年配の人々は、おそらく、ムンプス感染由来の合併症を発病するであろう。ワクチンで免疫された個体における自然の菌交代症での疾病の悪化のような、弱毒化生ワクチンの使用に関連する固有の危険性に鑑みて、特に危険状態にある群のために、ワクチンの安全性を改良することが望まれる。本発明は、宿主細胞、特に真核生物細胞において、組換えムンプスタンパク質、特にＦ、ＨＮならびにＮＰタンパク質およびそれに由来する融合タンパク質を製造するためのシステムを提供することにより、この問題に取り組むものである。本発明は前記タンパク質を構築する方法、そこで使用するための中間体、およびその中間体から得られるであろう組換えタンパク質にも関する。本発明の具体化において、ムンプスウイルスＮＰタンパク質は細菌においても発現されている。本発明の組換えタンパク質はムンプスウイルス感染予防のためのサブユニットワクチンの開発における使用の可能性を有する。ムンプスウイルスの融合タンパク質Ｆは５３８アミノ酸残基を含有し；アミノ酸残基１ないし２６がシグナルペプチドに相当し、アミノ酸残基４８３ないし５１２が膜アンカードメインに相当する。その分子は７つのグリコシレーションされる可能性のある部位を有する。Ｆタンパク質は６５−７４ＫＤａの前駆体（Ｆ₀ ）として合成され、蛋白分解的成熟を経てＳＳ結合を介して連結したＦ₁（５８ −６１ＫＤａ）およびＦ₂（１０−１６ＫＤａ）サブユニットを生成する。Ｆタンパク質はウイルス感染中の細胞融合に関与し、溶血活性を有し、細胞へのウイルスの侵入において役割を果たしている。しかし、該タンパク質は別のムンプスウイルス糖タンパク質、ＨＮ（後記参照）で観察される抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は有さない。ＨＮタンパク質（分子量７４−８０ＫＤａ）は、血球凝集（ヘマグルチニン）活性およびノイラミニダーゼ活性を有し、ウイルスの細胞への付着および宿主細胞膜の破壊に関与する。ＨＮタンパク質（「付着タンパク質」またはヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）は中和抗体を製造し、ＡＤＣＣの発達に重要であるらしい。ＨＮタンパク質は５８２アミノ酸残基からなり、Ｎ末端アンカードメイン（アミノ酸残基３３ないし５２）および９つのグリコシレーションされる可能性のある部位を有する。ヌクレオキャプシドタンパク質ＮＰは、ウイルスＲＮＡに結合しており、転写過程に関与している。インフルエンザウイルスとのアナロジーから、ムンプスウイルスのＮＰタンパク質は細胞性免疫の発達に重要であるかもしれない。ＮＰタンパク質は５５３アミノ酸残基からなり；７２ＫＤａの分子量を有し、リン酸化されている。本発明は、（ａ）シグナルペプチド(ｓ)および膜アンカードメイン(ａ)を有してなる完全な融合タンパク質(Ｆ)の全長（本明細書において、Ｆｓ＋ａ＋と称する）；付着タンパク質の全長またはヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）：ヌクレオキャプシドタンパク質の全長（ＮＰ）；（ｂ）膜アンカードメインを欠失した、切断された融合タンパク質（本明細書において、Ｆｓ＋ａ−と称する）；（ｃ）Ｆ、ＨＮおよび／またはＮＰタンパク質、またはその一部の融合により誘導されるハイブリッドタンパク質；からなる群より選択されるムンプスウイルスの抗原をコードする組換えＤＮＡを提供するものである。本発明の個々の具体例において、ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、（ｉ）融合タンパク質のシグナルドメインに融合した、５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質（本明細書において、ｓ＋ＦＨＮａ−と称する）；または（ii）本明細書においてｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ−と称されるハイブリッドタンパク質；または（iii）５'膜ドメインを欠失した付着タンパク質に融合した、３'膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質（本明細書において、Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ− と称する）；をコードする。好ましくは、本発明に係る組換えＤＮＡは、適当な宿主をトランスフェクションまたは形質転換するのに適当である、ベクター、有利には発現ベクターであり、その結果、ＤＮＡによりコードされたタンパク質を多量に得ることができる。一の態様において、本発明に係る組換えベクターはワクシニア転移ベクター、例えば後記のｐＵＬＢ５２１２由来のベクターである。このタイプの個々のベクターは、本明細書においてはｐＮＩＶ３２０５、ｐＮＩＶ３２０８、ｐＮＩＶ３２１３およびｐＮＩＶ３２３２と称される。別の態様において、本発明に係る組換えベクターは、哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクションするために適当なものである。このタイプのベクターは、有利には、グルタミン合成酵素ベクター、例えば後記のｐＥＥ１４として知られるベクターより誘導されるかもしれない。本発明による特定のベクターは、ｐＥＥ１４ｓ＋ＦＨＮａ−である。もう一つ別の態様において、本発明に係る組換えベクターはイー・コリ（E．c oli）のごとき細菌細胞を形質転換するのに適当なものである。この種の適当なベクターは、例えば、周知のベクターｐＵＣ１９から誘導されるかもしれない。別の態様において、本発明は、本発明に係るベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主を提供する。その宿主は、適当には、ワクシニアウイルス；哺乳動物細胞または細菌細胞から選択される。本発明はまた、本発明に係るＤＮＡによりコードされた組換えタンパク質の製法であって、（ａ）該ＤＮＡを前記した適当な組換え宿主において発現させ；および（ｂ）例えば後記するように、標準的な技術によって産生されたタンパク質を単離すること；からなる方法も提供する。本発明の方法によって産生されたある種のタンパク質は新規であり、それゆえにこれらは、本発明のさらなる態様を形成する。個々のタンパク質は：膜アンカードメインを欠失した切断された融合タンパク質（本明細書において、Ｆｓ＋ａ−と称する）；Ｆ、ＨＮ、および／またはＮＰタンパク質またはその部分の融合によって生じるハイブリッドタンパク質、特に：（ｉ）融合タンパク質のシグナルドメインに融合した、５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質（本明細書において、ｓ＋ＦＨＮａ−と称する）；（ii）本明細書において、ｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ−と称されるハイブリッドタンパク質；（iii）５'膜ドメインを欠失した付着タンパク質に融合した、３'膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質（本明細書において、Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ− と称する）；を包含する。本発明の方法により入手できるタンパク質は、適当な担体と混合すれば、ワクチンである可能性を有する。それゆえにさらなる態様において、本発明は、医薬上許容される担体と共に、本発明のタンパク質または本発明の方法によって調製された免疫防御に十分量のタンパク質からなる、ムンプス感染に対するワクチン組成物を提供する。そのようなワクチン組成物におけるタンパク質は、有利には、ＦまたはＨＮタンパク質である。「免疫防御」という語は、ムンプスの曝露に対し免疫応答を誘起し、その結果その疾病を予防または軽減し、その疾病の伝染を阻止または遅延させるために必要な量をいう。ワクチンの調製は、一般に、ニュー・トレンズ・アンド・ディベロップメンツ・イン・ワクチンズ（New Trends and Developments in vaccines）、ボラー（V oller）ら（編）、ユニバーシティ・パーク・プレス（University park Press）、ボルチモア（Baltimore）、メリーランド（Maryland）、１９７８年に記載されている。各ワクチン一回分の本発明のタンパク質量は、典型的なワクチンにおける顕著な副作用なしに、免疫防御応答を誘発する量として選択される。かかる量は、いずれの特異的な免疫原が使用されるのか、およびワクチンがアジュバント化されているか否かに依存して様々であろう。一般に各用量は１−１０００μｇタンパク質、好ましくは１−２００μｇからなると考えられる。ワクチンの最適量は、抗体力価および対象における他の応答の観察を包含する標準的研究によって推定することが可能である。最初のワクチン接種に続いて、好ましくは、対象は約４週間で追加免疫を受け、感染の危険が存在する限り、引き続いて６ヶ月毎に追加免疫を繰り返す。本発明のさらなる態様は、ヒトにおいてムンプス感染を予防する方法であって、免疫学的有効量の本発明タンパク質または本発明の方法によって製造されたタンパク質を、該予防を必要とする対象に投与することからなる方法を提供する。本発明は、ヒト対象におけるムンプス感染予防のためのワクチン組成物を調製するための、本発明によるタンパク質または本発明による方法によって調製されたタンパク質の使用も提供する。以下の実施例および添付図面を用いて本発明を説明する。実施例実施例１ベクターの構築Ａ）ワクシニアウイルスへの転移用１）融合タンパク質Ｆｓ＋ａ＋Ｆタンパク質のＣ末端半分をコードしている９００ｄｐのｃＤＮＡクローンであるプラスミドｐＭＦ１（スウェーデン、ストックホルム（Stockholm）、カロリンスカ（Karolinska）研究所、イー・ノービー(E．Norrby）博士より得た、エランゴ（Elango）ら、１９８９年、ジェイ・ジェン・ビロロジー（J.Gen.Virolo gy）、第７０巻、８００１−８０７頁に記載）から始めて、完全なＦｓ＋ａ＋タンパク質、即ちシグナルペプチドおよび膜アンカードメインを共に含有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを再構築した。このために、ムンプスウイルスから抽出したウイルスゲノムＲＮＡを、ムンプスＦｍＲＮＡの塩基１ないし２０に対応し、以下の配列（５'−ＡＡＧＣＣＴＡＧＡＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＡ− ３'）を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ｐｏ８２）をプライマーとして用いて、相補的一本鎖ＤＮＡに複製した。次いで、その一本鎖ｃＤＮＡを、ｐｏ８２およびｐｓｔＦＭ１、あるいはｐｓｔＦＭ２およびｐＦ１０１３をプライマーとして用い、ポリメラーゼ鎖反応によって増幅した。最初のプライマーの組み合わせは、増幅後、ムンプスＦｍＲＮＡの塩基１ないし７６９に対応する二本鎖ｃＤＮＡを生成し、二番目のプライマーの組み合わせは、塩基７４８ないし１０３５をカバーするｃＤＮＡ断片を生成した。ｐｓｔＦＭ１、ｐｓｔＦＭ２およびｐＤ１０１３プライマーの配列は以下のとおりである：次いで、増幅したｃＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩ−ＰｓｔＩ部位に分割してクローン化し、ジデオキシヌクレオチド法（サンガー（Sang er）ら、１９７７年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（P．N．A．S．）、第７４巻、５４６３−５４６７頁）を用いて配列を決定した。両方のＤＮＡ断片をそれらの共通のＰｓｔＩ部位で連結し、プラスミドｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した；これは中間構築物ｐＮＩＶ３２０４となる。ＦｃＤＮＡの５'末端を回収するためにプラスミドｐＮＩＶ３２０４をＥｃｏＲＩおよびＨａｅＩＩ酵素で開裂した。ＦｃＤＮＡの３'末端を、プラスミドｐＭＦ１をＰｓｔＩおよびＨａｅＩＩで消化することによって回収した。完全なＦｃＤＮＡを５'および３'部分をそれらの共通のＨａｅＩＩ制限部位で連結することによって再構築し、クローニングビヒクルｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に導入し、プラスミドｐＮＩＶ３２１４を得た（図ＩＡ）。ここから、ＦＳ＋ａ＋タンパク質をコードするｃＤＮＡ基本単位（１７０１ｂｐ）を酵素ＳｍａＩおよびＡｈａＩＩＩで開裂することにより回収し、標準的ワクシニアベクターｐＳＣ１１（チャクラバチー（Chakrabati）ら、１９８５年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology ）、第５巻、３４０３−３４０９頁）由来のワクシニア転移ベクターｐＵＬＢ５２１３のＳｍａＩ部位に導入した。得られたプラスミドｐＮＩＶ３２０５を図１Ｂに図示した。２）付着タンパク質ＨＮＨＮタンパク質のＣ末端部分をコードする１０００ｂｐのｃＤＮＡクローンであるプラスミドｐＭＨ１（スウェーデン、ストックホルム（Stockholm）、カロリンスカ（Karolinska）研究所、イー・ノービー（E．Norrby）博士より得た、コバミーズ（Kovamees）ら、１９８９年、ウイルス・リサーチ（Virus Research ）、第１２巻、８７−９６頁、公表）から始めて、ムンプスウイルスの完全なＨＮタンパク質に対応するｃＤＮＡクローンを再構築した。このために、方法は、Ｆタンパク質について前記した方法に従った。簡単には、まず、ムンプスウイルスＲＮＡを、ｐｏ８３オリゴデオキシヌクレオチド（５'ＡＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＧＡＴ３'）をプライマーとして用いて、一本鎖ＤＮＡに複製した。次いで、このｃＤＮＡを２組のプライマーの組み合わせでＰＣＲによって増幅し、最初にＨＮｍＲＮＡの塩基７９ないし６２９に対応する二本鎖ｃＤＮＡを生成し（プライマーは、ｐＨＮ−１３およびＥｃｏＨＮＭ１）、二番目に、塩基６０３ないし１００５のｃＤＮＡ断片を生成した（プライマーは、ＥｃｏＨＮＭ２およひｐＨ９８２）。これらプライマーの配列は以下のとおりである：増幅したｃＤＮＡ断片をブラスミドｐＶＣ１９のＨｉｎｄＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、サンガー（Sanger）法（前掲参照）によって配列を決定し、次いで、ｐＵＣ１９クローニングビヒクルにＥｃｏＲＩ部位で連結した。得られた中間構築物ｐＮＩＶ３２０７は、かくして、ＨＮをコードする配列の５'末端を有し、それはｐＮＩＶ３２０７をＨｉｎｃＩＩおよびＢａｎＩで消化することにより切り出すことができる。ＨＮｃＤＮＡの３'末端を、プラスミドｐＭＨ１をＢａｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって回収した。完全なＨＮｃＤＮＡを、５'および３'部分をそれらの共通のＢａｎＩ部位で連結することによって再構築し、プラスミドｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ部位に導入し、プラスミドｐＮＩＶ３２１５を得た（図２Ａ）。完全なＨＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ基本単位（１７７９ｂｐ）を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで開裂することにより回収し、ＳｍａＩで消化したワクシニア転移ベクタ −ｐＵＬＢ５２１３（前掲参照）に、平滑末端で導入した。得られたプラスミドｐＮＩＶ３２０８を図２Ｂに図示する。３）ヌクレオキャプシドタンパク質ＮＰ完全なムンプスＮＰタンパク質をコードするｃＤＮＡを２つの部分的ｃＤＮＡクローンｐＭＮ１およびｐＭＮ２（スウェーデン、ストックホルム（Stockholm ）、カロリンスカ（Karolinska）研究所、イー・ノービー（E．Norrby）博士より得た、エランゴ（Elango）、１９８９年、ウイルス・リサーチ（Virus Resear ch）、第１２巻、７７−８６頁、公表）から構築した。プラスミドｐＭＮ１はＮＰｃＤＮＡの５'末端を欠失した１７００ｂｐの挿入物を有し；ｐＭＮ２はその分子の３'末端を含有しない１７００ｂｐのｃＤＮＡ挿入物を有する。ｐＭＮ１をＰｓｔＩで消化し、１１００ｂｐ断片を回収し、プラスミドベクタ −ｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位にサブクローン化した。ＮＰタンパク質のＣ末端の２４８アミノ酸残基をコードし、終止コドンを有する断片を回収するために、この中間構築物をＡｓｐ７１８ＩおよびＥｃｏＲＶで消化した。アミノ酸残基６ないし４５８にわたる１３６１ｂｐ断片を回収するために、ｐＭＮ２をＨｇｉＡＩおよびＰｖｕＩＩで消化した。ＡＴＧ開始コドン（Ｍｅｔ１）およびＮＰタンパク質のアミノ酸残基２ないし５をコードする配列を再構築するために、合成二本鎖ヌクレオチド（Ｍｕｍ１／Ｍｕｍ２）を調製した（図３Ａ）。この合成断片の側面にＢａｍＨＩ部位（５'）およびＨｇ１ＡＩ部位（３'）を付加した；それは、翻訳開始に最適であるコザック（ＫＯＺＡＫ）コンセンサス（コザック（Koza k）、１９８４年、ネイチャー（Nature）、第３０８巻、２４１−２４６頁）も含有していた。その合成アダプターおよびｐＭＮ２から回収した１３６１ｂｐＤＮＡ断片を組み立て、プラスミドベクターｐＵＣ１９にクローン化した。この中間構築物をＡｓｐ７１８ＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、４６６ｂｐ断片を除去し、ｐＭＮ１由来の２４８Ｃ末端アミノ酸残基をコードするＡｓｐ７１８ＩおよびＥｃｏＲＶ断片で置換した。これは、ｐＵＣ１９をベクターとする、完全なＮＰタンパク質の基本単位をコードする１６９９ｂｐを含有するプラスミドｐＮＩＶ３２１６となる（図３Ｂ）。次いで、暗号カセット（１６８２ｂｐ）を切り出すために、プラスミドｐＮＩＶ３２１６をＢａｍＨＩおよびＢｃＩＩで消化し、ワクシニア転移プラスミドｐＵＬＢ５２１３（前掲参照）のＳｍａＩ部位に平滑末端で挿入し、最終構築物ｐＮＩＶ３２１３を得た（図３Ｃ）。４）膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質Ｆｓ＋ａ＋Ｆタンパク質全長をコードするｃＤＮＡクローンであるプラスミドｐＮＩＶ３２１４（前掲参照）をＮｓｉＩおよびＳｐｈＩで消化した。Ｆタンパク質の８０Ｃ末端アミノ酸残基をコードし、膜アンカードメイン（残基４８３−５１２）および終止コドンを有する２５０ｂｐＮｓｉＩ−ＳｐｈＩ断片を除去した。アミノ酸残基４５９ないし４６２をコードする配列および終止コドンを再構築するために、合成二本鎖ヌクレオチド（Ｆａ−ｍｕｌ／Ｆａ−ｍｕ２）を調製した（図４Ａ）。この合成断片の側面にＮｓｉＩ部位（５'）およびＳｐｈＩ部位（３'）を付加した。その合成アダプターをｐＮＩＶ３２１４のＮｓｉＩおよびＳｐｈＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドｐＮＩＶ３２２０は、アミノ酸残基１ないし４６２をコードし、それに終止コドンが続き、ｐＵＣ１９ベクターにクローン化されている。ＫＯＺＡＫコンセンサス配列（前掲参照）を形成するために、プラスミドｐＮＩＶ３２２０をＢｓｐｈＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化し；突出末端をクレノー（Klenow）ポリメラーゼで充填し、次いで連結した。これにより、Ｆタンパク質の残基１ないし４６２をコードする配列、続いて終止コドン、そして開始コドン周辺にＫＯＺＡＫコンセンサスを含有するプラスミドｐＮＩＶ３２２１を作製した（図４Ｂ）。プラスミドｐＮＩＶ３２２１をＡｓｐ７１８ＩおよびＳｐｈＩで消化し、１４０２ｂｐ断片を平滑末端化し、ｐＵＬＢ５２１３（前掲参照）のＳｍａＩ部位に連結することにより挿入した。得られたプラスミドｐＮＩＶ３２２６を図４Ｃに図示する。５）融合タンパク質のシグナルドメインに融合した、５'膜アンカードメインを欠失したヘマグルチニンーノイラミニダーゼ、ｓ＋ＦＨＮａ− ＨＮタンパク質全体をコードするｃＤＮＡクローンであるプラスミドｐＮＩＶ３２１５（前記参照）をＰｖｕＩＩで消化し；アミノ酸残基７９ないし５８２をコードし、終止コドンを有する１７００ｂｐ断片を精製した。融合タンパク質（Ｆ）（前掲参照）のアミノ酸残基１ないし４６２をコードするプラスミドｐＮＩＶ３２２１をＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｐＵＣ１９の配列および融合タンパク質のアミノ酸残基１ないし５１をコードする配列を含有する２９００ｂｐ断片を平滑末端化し、ＨＮタンパク質のアミノ酸残基７９ないし５８２をコードする１７００ｂｐのＰｖｕＩＩ断片、それに続く終止コドンをｐＵＣ１９ベクター中に連結した（図５Ａ）。プラスミドｐＮＩＶ３２２２をＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し；１６９４ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片を精製し、ｐＵＬＢ５２１３（前掲参照）のＳｍａＩ部位に連結により挿入した。得られたプラスミドｐＮＩＶ３２２７を図５Ｂに図示した。６）ハイブリッドタンパク質ｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ− アンカードメインを欠失したＦタンパク質をコードする配列を含有するプラスミドｐＮＩＶ３２２１（前掲参照）をＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｆタンパク質のアミノ酸残基５２ないし４６２をコードする１２４６ｂｐの平滑末端断片を精製した。融合タンパク質のアミノ酸残基１ないし５１、無関係のスレオニン（アミノ酸残基５２）およびＨＮタンパク質のアミノ酸残基７９ないし５８２をコードし、それに続く終止コドンを有するプラスミドｐＮＩＶ３２２２（前掲参照）を、アミノ酸残基５７６に対応するコドンの３'側で開裂するＮｈｅＩで消化した。次いで、ＮｈｅＩで消化し、平滑末端化したプラスミドｐＮＩＶ３２２２、をＦタンパク質のアミノ酸残基５２ないし４６２をコードする１２４６ｂｐ断片に連結することにより構築した。かくして、得られたプラスミドｐＮＩＶ３２２３は、ｐＵＣ１９ベクター中に、アミノ酸残基１ないし５１（Ｆタンパク質のシグナルを含有する）、無関係のスレオニン、ＨＮタンパク質のアミノ酸残基７９ないし５７６、無関係のグルタミンおよびＦタンパク質のアミノ酸残基５３ないし４６２をコードし、それに引き続いて終止コドンを有する（図６Ａ）。プラスミドｐＮＩＶ３２２３をＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し，２９４５ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＬＢ５２１３（前掲参照）のＳｍａＩ部位に平滑末端で連結した。得られたプラスミドを図６Ｂに図示する。７）５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質に融合した３'膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質、Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ− ＨＮタンパク質全体をコードするプラスミドｐＮＩＶ３２１５（前掲参照）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、突出末端をクレノーポリメラーゼで充填し、そしてＳａｃＩで消化し；１７６２ｂｐの断片をＳｍａＩおよびＳａｃＩで消化したｐＵＣ１９に連結し、プラスミドｐＮＩＶ３２２９を構築した。連続したオープンリーディングフレームを形成させる、ＦおよびＨＮ暗号配列間の連結部分を構築するために、合成二本鎖アダプター（ｆｈｎオリゴ１／ｆｈｎオリゴ２）を調製した（図７Ａ）。プラスミドｐＮＩＶ３２２９をＫｐｎＩおよびＢｂｓＩで消化し、ＨＮタンパク質のアミノ酸残基１ないし６６をコードする２２９ｂｐ断片を除去し、合成アダプターで置換し、これをｐＮＩＶ３２３０とした。アンカードメインを欠失したＦタンパク質をコードするプラスミドｐＮＩＶ３２２１（前掲参照）をＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化した。１３８７ｂｐ断片を精製し、ＫｐｎＩおよびＮｓｉＩで消化したｐＮＩＶ３２３０に連結した。こうして、ベクターｐＵＣ１９中に、Ｆタンパク質のアミノ酸残基１ないし４６０をコードする基本単位、それに続いてヒスチジンおよびＨＮタンパク質のアミノ酸残基６３ないし５７８、続いて終止コドンを含有するプラスミドｐＮＩＶ３２３１を形成する（図７Ｂ）。プラスミドｐＮＩＶ３２３１をＡｓｐ７１８ＩおよびＳｐｈＩで消化して３００７ｂｐ暗号基本単位を切り出し、それをワクシニア転移プラスミドｐＵＬＢ５２１３（前掲参照）のＳｍａＩ部位に平滑末端で挿入し、ｐＮＩＶ３２３２を得た。Ｂ）ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション用１）膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質、Ｆｓ＋ａ− プラスミドｐＮＩＶ３２２１（前掲参照）をＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し；１４０２ｂｐの平滑末端断片を精製し、グルタミン合成酵素（ＧＳ）ベクターｐＥＥ１４（コケット（Cockett）ら、１９９０年、バイオテクノロジー（Bio/Technology）第８巻、６６２−６６７頁）のＳｍａＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドｐＥＥ１４−Ｆａ−は、ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）の主要前初期プロモーターの制御下にある、アンカードメインを欠失した融合タンパク質を含有する（図４Ｄ）。２）融合タンパク質のシグナルドメインに融合した、５'膜アンカードメインを欠失したヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、ｓ＋ＦＨＮａ− プラスミドｐＮＩＶ３２２２をＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１６９４ｂｐの平滑末端ＤＮＡ断片を精製し、ｐＥＥ１４ベクター（前掲参照）のＳｍａｌ部位に連結することにより挿入した。得られたプラスミドｐＥＥ１４ｓ＋ＦＨＮａ−はｈＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｆタンパク質のアミノ酸残基１ないし５１（Ｆタンパク質のシグナル領域を含有する）、無関係のスレオニン、およびＨＮタンパク質のアミノ酸残基７９ないし５８２に対する配列を含有する（図５Ｃ）。３）ハイブリッドタンパク質、ｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ− プラスミドｐＮＩＶ３２２３（前記参照）をＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し；２９４５ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ｐＥＥ１４ベクター（前掲参照）のＳｍａＩ部位に平滑末端で連結した。得られたプラスミドｐＥＥ１４ｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ−は、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｆタンパク質のシグナル領域（アミノ酸残基１ないし５１）、無関係のグルタミン、シグナルおよびアンカードメインを欠失したＦタンパク質をコードする配列を含有する（図６Ｃ）。４）５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質に融合した、３'膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質、Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ− プラスミドｐＮＩＶ３２３１（前記参照）をＡｓｐ７１８ＩおよびＳｐｈＩで消化して３００７ｂｐ断片を切り出し、ｐＥＥ１４ベクター（前記参照）のＳｍａＩ部位に平滑末端で連結した。得られたプラスミドｐＥＥ１４Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ−はｈＣＭＶプロモーターの制御下で、膜アンカードメインを欠失したＦタンパク質（アミノ酸残基１−４６０）および膜アンカードメインを欠失したＨＮタンパク質（アミノ酸残基６３−５７８）に融合したヒスチジンをコードする配列、それに続いて終止コドンを含有する（図７Ｃ）。Ｃ）細菌の形質転換用ＮＰタンパク質ｐＵＣ１９ベクター中にＮＰタンパク質全体のｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＮＩＶ３２１６（前記参照）をＢａｍＨＩで消化した。１６８２ｂｐ平滑末端断片を精製し、イー・コリ（E．coli）発現ベクターｐＡＳ１（ローゼンバーグ（Rosenberg）ら、メソッド・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）；ウー・アール（Wu，R.）ら編、第１０１巻、１２３−１３８頁、アカデミック・プレス（Academic Press）、ニューヨーク（New York）、１９８３年）の平滑末端化したＢａｍＨＩ部位にクローン化した。得られたプラスミドｐＮＩＶ３２１７は、バクテリオファージラムダＰ_Lプロモーターの制御下で、完全なＮＰタンパク質の配列に融合した無関係の７アミノ酸（ＡＴＧ開始コドンを包含する）の配列を含有する（図８）。実施例２真核生物細胞における発現Ａ）ワクシニアウイルス組換え体を介して組換え転移プラスミド、ｐＮＶ３２０５、ｐＮＩＶ３２０８、ｐＮＩＶ３２１３およびｐＮＩＶ３２３２をワクシニア感染ＣＶ−１細胞にトランスフェクションし、ブロモーウリジン選択、およびＸ−ｇａｌの存在下その青色に基づくプラークの精製後、組換えウイルスを単離した。それらを各々、ＶＶ３２０５、ＶＶ３２０８、ＶＶ３２１３およびＶＶ３２３２とする。ＲＡＴ２ＴＫ株はＷＲ型のものであった（英国のボリセビッツ（Borisewitz）から得た）。方法は、ワクシニアウイルス組換え体について以前に記載された（マケット・エム（Mackett，M.）およびスミス・ジー・エル（Smith，G．L.）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（J．Gen．Virology）、第６７巻、２０６７ −２０８２頁、１９８６年；マケット・エム（Mackett，M.）およびモス・ビー（Moss，B.）、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J．Virology）、第４９巻、８５７−８６４頁、１９８４年）とおりである。１）融合タンパク質Ｆｓ＋ａ＋組換えワクシニアウイルスＶＶ３２０５を、培養中、ＣＶ−１細胞を感染の多重度１で感染させるために使用した（感染多重度＝１）。感染細胞（１アッセイあたり約３.１０⁵）およびスペント培地（約２ｍｌ）を感染後１６ないし４８時間の間に集めた。Ｆｓ＋ａ＋タンパク質の存在を、細胞抽出液およびスペント培地の免疫沈降により測定した。免疫沈降実験は以下のごとく行った。概説すると、³⁵Ｓ−メチオニン存在下、組換えワクシニアウイルスを増殖させることにより、inv ivoにて組換え生成物を標識化した。標識化された標品、細胞抽出物および培地をモノクローナル抗体（Ｍａｂ２.０４９、２.１５９、５.３６９、５.４１４、５.４１８、５.４３９、エーベル（Orbell）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J．Immunol.）、１４９４、第１３２巻、２６２２−２６２９頁、カロリンスカ（Karokinska）研究所、ストックホルム（Stockholm）、スウェーデン、イー・ノービー（E．Norrby）博士より得た）およびウサギ抗マウス血清の混合物と連続してインキュベートし；次いで、特異的複合体をセファロース結合プロテインＡに結合させることにより回収した。免疫沈降物を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で解析し、次いで、それを乾燥後、オートラジオグラフィーに付した。細胞内組換え生成物は、還元的条件下では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で７０ＫＤａ（Ｆ₀）前駆体および６０ＫＤａ（Ｆ₁）サブユニットとして移動した。スペント培地において見られた生成物は、Ｆ₁サブユニットの形態としてのみ存在した。Ｆ₂サブユニットは、その配列中にメチオニンを有さないため、そのアッセイでは検出できない。別法として、免疫沈降実験を³Ｈ−グルコサミンでも行った。この場合、細胞抽出物をＭａｂ２.０１９および２.１５９（前掲参照）と一緒にインキュベートした。特異的複合体をセファロース−結合プロテインＡに結合させることにより回収し、免疫沈降物を１７％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で解析した。組換え生成物は、還元的条件下で、融合糖タンパク質の、各々グリコシレートおよびタンパク質分解的に開裂したＦ₁およびＦ₂サブユニットを示す６０ＫＤａのバンドとして移動した（図９、レーン３）。２）ヘマグルチニンーノイラミニダーゼ、ＨＮｓ＋ａ＋組換えワクシニアウイルスＶＶ３２０８を、培養にてＣＶ−１細胞を感染させるために使用した。発現した生成物を放射免疫沈降法によって解析した。免疫沈降について使用したモノクローナル抗体の混合物（Ｍａｂ７４１、７４３、１. ９３３、２.０７２、２.０７３、２.０７５、実施例２−Ａ１の参照と同じ、イー・ノービー（E．Norrby）博士より提供された、上記参照）を除いて、³⁵Ｓ− メチオニンで標識化する方法は前記した方法と同じであった。細胞抽出物において、組換えタンパク質は８０ＫＤａの生成物でのみ見い出された。³Ｈ−グルコサミンで細胞抽出物を標識化する場合、Ｍａｂ２.０７５をＭａｂ混合物のかわりに使用した以外は、上記の方法と同じであった。組換え体は、見かけ上の大きさが７５ＫＤａのグリコシレートされた単量体として見い出された（図９、レーン２）。３）ヌクレオキャプシドタンパク質組換えワクシニアウイルスＶＶ３２１３を、ＣＶ−１細胞を感染させるために使用した。発現した生成物をウエスタンブロッティングにより同定した。細胞抽出物およびスペント培地を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ニトロセルロース膜に転写後、分離したタンパク質をモノクローナル抗体の混合物（Ｍａｂ７０５、７２８、２．０９９、実施例２Ａ１の参照と同じ、イー・ノービー（E．Norrby）博士より提供された、上記参照）をプローブとして解析した。標準的方法に従って、アルカリホスファターゼに結合させたウサギ抗マウスＩｇＧおよび適当な染色体由来基質を使用して複合体を検出した。組換え生成物は、細胞抽出物中において７０ＫＤａタンパク質としてのみ見い出された。Ｂ）ＣＨＯ細胞における発現（安定形質転換体）１）膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質、Ｆｓ＋ａ− ｐＥＥ１４−Ｆａ^-プラスミドを、１.２５１０⁶細胞当たり２０μｇＤＮＡを用いて、リン酸カルシウム共沈法でＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞はＧＭＥＭ−Ｓ培地で増殖させた。感染後２日間、２５μ Ｍメチオニンスルホキシミンの添加により、ＧＳトランスフェクション体を選択した。１０ないし１４日後、耐性コロニーをひろい、９６穴プレートに移した。次いで、各形質転換体を２４穴プレート、その後８０ｃｍ²フラスコに移した。細胞が約８０％集密に達したとき、ＧＳ形質転換体をＦｓ＋ａ−タンパク質について解析した。その方法は、コケット・エム・アイ（Cockett，M．I.）、ベビングトン・シー・アール（Bebbington，C．R.）、およびヤラントン・ジー・ティー（Yarranton，G．T.）、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）、第８巻、６６２−６６７頁、１９９０年に記載された通りである。Ｆｓ＋ａ−タンパク質は、ＧＳ形質転換体のスペント培地中に見い出された。それは、精製ムンプスウイルス粒子に対して生成したウサギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティング実験により検出される。そのタンパク質の２つのサブユニットを構成する２つのバンドが観察される（５０ＫＤａおよび２０ＫＤａ）。２）融合タンパク質のシグナルドメインに融合した、５'膜アンカードメインを欠失したヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、ｓ＋ＦＨＮａ− ＣＨＯ細胞におけるｓ＋ＦＨＮａ−の発現のための方法は、上記の通りであった。そのｓ＋ＦＨＮａ−タンパク質は、精製ムンプスウイルス粒子に対して生成したウサギポリクローナル抗体を用いる免疫沈降によってスペント培地において検出され；８４ＫＤａの単量体として現れた。３）ハイブリッドタンパク質ｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ− ＣＨＯ細胞におけるｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ−の発現のための方法は、上記の通りであった。４）５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質に融合した、３'膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質、Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ− ＣＨＯ細胞におけるＦｓ＋ａ−ｘＨＮａ−の発現のための方法は、上記の通りであった。Ｃ）大腸菌（Escherichia coli）における発現ＮＰタンパク質プラスミドｐＮＩＶ３２１７を、温度感受性リプレッサーｃＩ８５７ｔｓ（ｐＬ転写を低温で抑制するが、高温では抑制しない）をコードする欠陥ラムダバクテリオファージを含有するイー・コリ（E．coli）ＡＲ５８株（モット・ジェイ・イー（Mott，J．E.）、グラント・アール（Grant，R.）、ホー・ワイ・ゼット（Ho，Y．Z.）およびプラット・ティー（Platt，T.）、１９８５年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ユーエスエー（Pr oc. Natl．Acad．Sci．USA）、第８２巻、８８−９２頁）を形質転換するために使用した。形質転換された細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した２０ｍｌの富栄養（ＬＢ）培地中で、Ｏ.Ｄ.₆₃₀が０.６になるまで培養した。培地の温度を３０℃から４２℃に変えることにより、ラムダＰＬプロモーターの誘発を行った。１ｍｌのアリコートの培養液を集め、遠心し、ペレットを１００μｌの１％ＮａＤｏｄＳＯ₄、６Ｍ尿素、５％２−メルカプトエタノール、および１０％グリセロールに再懸濁し、５分間煮沸し、、１０μｌの標品を１０％ＳＤＳ−アクリルアミドゲル上で分画した。ニトロセルロース膜上に転写後、分離したタンパク質を抗ＮＰモノクローナル抗体の混合物（前掲実施例IIＡ３参照）をプローブとして解析した。ＮＰタンパク質に対応する６９ＫＤａの生成物は、誘発した標品でのみ見い出された。実施例３新生ハムスターモデルにおける曝露実験ワクシニア組換え体ＶＶ３２０５（Ｆタンパク質）、ＶＶ３２０８（ＨＮタンパク質）、およびＶＶ３２１３（ＮＰタンパク質）の防御能力を以前に記載されたごとく（オーバーマン（Overman）ら、１９５３年；バー（Burr）およびナグラー（Nagler）、１９５３年；ラブ（Love）ら、１９８５年；ラブ（Love）ら、１９８６年）、新生ハムスターモデルにおいて評価した。その実験は、数段階あり：ａ）メスのハムスターを、上記の各ワクシニア形質転換体および対照ワクシニア構築物（２ｘ１０⁸ｐｆｕ／動物）で、皮膚乱切法により感染させた。ｂ）免疫応答が形成されたことを確認するために、ワクチン接種後数週間、定期的に特定のタンパク質に対する抗体力価を測定した。ｃ）次いで、実際の曝露実験のための新生動物を得るために、免疫されたメスのハムスターを交配させた。ｄ）新生ハムスターの大脳にムンプスウイルスのキルハム（Kilham）株（１動物当たり９.１０⁵ｐｆｕ）を接種し、脳炎による致死を曝露後１０日間追跡した。結果その結果は、ＮＰタンパク質を発現するＶＶ３２１３が、ムンプスウイルスに曝露された新生ハムスターの致死を減少させないことを示す。しかし、ＶＶ３２０５（Ｆ）または３２０８（ＨＮ）で免疫された母ハムスターから生まれた新生ハムスターの致死率は減少し、このことは母親から子供に受け継がれた抗Ｆおよび抗ＨＮ抗体が、ムンプスウイルスの感染に対抗する能力を有することを示す。実施例４：組換えワクシニアウイルスＶＶ３２０８からムンプスウイルスＨＮタンパク質の精製１７個の１５０ｃｍ²フラスコのＣＶ１細胞をＶＶ３２０８で感染多重度＝２で感染させた。その後の精製のためのトレーサーとして、もう１個別のフラスコには35Ｓ−メチオニンを添加した。感染の２日後、細胞を集め、溶解した。細胞の破片を遠心により除去し、澄明な上清をモノクローナル抗体Ｍａｂ２０７２のアフィニティーカラムに通した（１ｍｌのファルマシア（Pharmacia）社製のＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂに１０.８ｍｇの抗体を結合させた；当該分野においてよく知られている方法）。組換えＨＮタンパク質をアフィニティーカラムに結合させ、洗浄後、３ＭＫＳＣＮでカラムから溶出させる。その溶出液を、取り込まれた³⁵Ｓ−メチオニンで標識化されたアリコートを計数することによりモニターする。次いで、組換えタンパク質を含有する画分をプールし、ＫＳＣＮを除去するために透析し、凍結乾燥した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を移動させ、ゲル乾燥し、オートラジオグラフィーに付すことによって、調製品の純度を試験した。その実験は、組換えＨＮタンパク質が予想される分子量約８０ＫＤａとして現れ、その純度が９０％を超えたことを示す。精製により２５０μｇの精製組換えＨＮタンパク質を得た。この物質を、上記の動物モデルにおける免疫応答を強化するため、および別法として、マウスまたはウサギにおいて抗体を作らせ、検出用の有用な道具を提供するために使用することができる。引用文献：オーバーマン・ジェイ・アール（Overmen,J.R.）、ピアーズ・ジェイ・エイチ（ Peers,J.H.）およびキルハム・エル（Kilham,L.）、（１９５３年）、アーキ・パソロ（Arch.Pathol.）、第５５巻、４５７−４６５頁バーン・エム・エム（Burn,M.M.）およびナグラー・エフ・ピー（Nagler,F.P.）、（１９５３年）、プロク・ソサ・イクスプ・バイオル・メディ（Proc.Soc.Exp .Biol.Med.）、第８３巻、７１４−７１７頁ラブ・エイ（Love,A.）、リドベック・アール（Rydbeck,R.）、クリステンソン・ケイ（Kristensson,K.）、オーベル・シー（Orvell,C.）およびノービー・イー（Norrby,E.）、（１９８５年）ジェイ・ビロロ（J.Virol.）、第５８巻、６７−７４頁ラブ・エイ（Love,A.）ら、（１９８６年）ジェイ・ビロロ（J.Virol.）第５９巻、２２０−２２４頁

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ウアール，ソフィーベルギー国ベー―1400ニーベル、リュ・デュ・ランディストリ24番、セルヴィス・デュ・ジェネティク・アプリケ、ファキュルテ・デ・スィヤンス、ユニベルシテ・リブレ・デュ・ブリュッセル (72)発明者ノルビー，エルリング・カール・ヤコブスウェーデン国エス―171・77ストックホルム、カロリンスカ・インスティテュート、ボックス280、マイクロバイオロジー・アンド・テューマバイオロジー・センター、エム・ティー・シー (72)発明者ヴァルサニー，タマス・マルクスウェーデン国エス―171・77ストックホルム、カロリンスカ・インスティテュート、ボックス280、マイクロバイオロジー・アンド・テューマバイオロジー・センター、エム・ティー・シー

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）シグナルペプチド（ｓ）および膜アンカードメイン（ａ）を有してなる完全な融合タンパク質（Ｆ）の全長（Ｆｓ＋ａ＋と称する）；付着タンパク質またはヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）の全長；ヌクレオキャプシドの全長（ＮＰ）；（ｂ）膜アンカードメインを欠失した、切断された融合タンパク質（Ｆｓ＋ａ −と称する）；（ｃ）Ｆ、ＨＮおよび／またはＮＰタンパク質、またはその一部の融合により誘導されるハイブリッドタンパク質からなる群より選択されるムンプスウイルスの抗原をコードする組換えＤＮＡ。２．群（ｃ）において、ハイブリッドタンパク質が、（ｉ）融合タンパク質のシグナルドメインに融合した、５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質（ｓ＋ＦＨＮａ−と称する）；（ii）ｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ−と称されるハイブリッドタンパク質；（iii）５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質に融合した、３'膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質（Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ−と称する）より選択される請求項１記載の組換えＤＮＡ。３．ベクターである請求項１または請求項２記載の組換えＤＮＡ。４．ワクシニア転移ベクター由来である請求項３記載のベクター。５．ｐＵＬＢ５２１２由来である請求項４記載のベクター。６．ｐＮＩＶ３２０５、ｐＮＩＶ３２０８、ｐＮＩＶ３２１３およびｐＮＩＶ３２３２から選択される請求項５記載のベクター。７．哺乳動物をトランスフェクションするのに適した請求項３記載のベクター。８．グルタミン合成酵素ベクター由来である請求項７記載のベクター。９．ｐＥＥ１４由来である請求項８記載のベクター。 10．細菌細胞を形質転換するのに適した請求項３記載のベクター。 11．ｐＵＣ１９由来である請求項１０記載のベクター。 12．請求項３記載のベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主。 13．ワクシニアウイルス、哺乳動物細胞または細菌細胞から選択される請求項１２記載の宿主。 14．請求項１または請求項２に記載のＤＮＡによってコードされた組換えタンパク質の製法であって、（ａ）該ＤＮＡを請求項１３に記載の組換え宿主にて発現させ、（ｂ）産生されたタンパク質を標準技法によって単離することからなる製法。 15．膜アンカードメインを欠失した切断された融合タンパク質（Ｆｓ＋ａ− と称する）；Ｆ、ＨＮおよび／またはＮｐタンパク質、またはその一部の融合により誘導されるハイブリッドタンパク質からなる群より選択されるタンパク質。 16．ハイブリッドタンパク質が、（ｉ）融合タンパク質のシグナルドメインに融合した、５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質（ｓ＋ＦＨＮａ−と称する）；（ii）ｓ＋ＦＨＮａ−ｘＦａ−と称されるハイブリッドタンパク質；（iii）５'膜アンカードメインを欠失した付着タンパク質に融合した、３'膜アンカードメインを欠失した融合タンパク質（Ｆｓ＋ａ−ｘＨＮａ−と称する）；から選択される請求項１５記載のタンパク質。 17．請求項１４の方法に従って製造される、免疫防御に十分な量のタンパク質、または請求項１５もしくは請求項１６記載のタンパク質と、医薬上許容される担体とからなるワクチン組成物。 18．ヒトにおけるムンプス感染の予防方法であって、免疫学的有効量の請求項１７に記載のワクチン組成物を該予防を必要とするヒトに投与することからなる方法。