JPH02167470A - 神経芽細胞腫マススクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は高速液体クロマトグラフのみを用い試料中のバ
ニルマンデル酸、ホモバニリン酸及びクレアチニンを複
数の試料について連続的に検出する神経芽細胞腫マスス
クリーニング法に関する。

［従来の技術］ 小児病の一種である神経芽細胞腫の早期発見法として、
尿中のカテコールアミン代謝産物であるバニルマンデル
酸（ＶＭＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）及びクレアチ
ニンの３成分を検出する方法が有用であることが知られ
ている。

従来の神経芽細胞腫マススクリーニング法では、これら
ＶＭＡ及びＨＶ　Ａについては、分離カラムとしてＯＤ
Ｓカラム等のシリカ系逆相カラムを用い検出器として電
気化学検出器（ＥＣＤ）又は蛍光検出器を用いた高速液
体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により検出しく特開昭６
２−６３８５９号公報）、一方、クレアチニンについて
は、Ｊａｆｆｅ法と称す比色法で検出していた。

そして、両手法で測定された値の比を用いて神経芽細胞
腫の診断をおこなっていた。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、ＶＭＡ、　ＨＶＡとクレアチニンとを異なる手
法で測定しなければならないので、測定操作が煩雑であ
り、処理の迅速化の妨げとなっていた。

本発明の目的は、このような問題点に鑑み、高速肢体ク
ロマトグラフのみによりバニルマンデル酸、ホモバニリ
ン酸及びクレアチニンを検出することにより測定操作を
簡単化し、処理を迅速化することができる神経芽細胞腫
マススクリーニング法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ この目的を達成するために、本発明に係る神経芽細胞腫
マススクリーニング法では、高速液体クロマトグラフを
用いて次のような処理を行う。

最初に、イオン交換カラム又は逆相系カラムである第１
カラムの後段にイオン交換カラム又は逆相系カラムであ
る第２カラムを接続した状態で移動相を送液し、該第１
カラムに試料を導入して、該試料中のクレアチニンを該
第１カラム内に保持させた状態で該試料中のバニルマン
デル酸及びホモバニリン酸を該第１カラムから溶出させ
て該第２カラムへ導く。

次に、流路を切り換えて該第１カラムと該第２カラムと
を並列にし、該第２カラムの後段に蛍光検出器を接続し
た状態で該第１カラム及び該第２カラムに該移動相を別
個に送液して、該第１カラム内で該クレアチニンの溶離
を進行させつつ、これと並行して、該第２カラムで該バ
ニルマンデル酸及び該ホモバニリン酸を分離させ該第２
カラムから溶出された該バニルマンデル酸及び該ホモバ
ニリン酸を蛍光検出器で検出する。

次に、流路を切り換えて該蛍光検出器を該第１カラムの
後段に接続し、該第１カラムと該蛍光検出器との間の流
路に該クレアチニンと反応して蛍光物質を生成させる反
応液を合流させた状態で、該第１カラム内でクレアチニ
ンを溶離させ該第１カラムから該クレアチニンを溶出さ
せて該蛍光物質を生成させ該蛍光物質を該蛍光検出器で
検出し、これと並行して、該第２カラムに洗浄液を通し
て該第２カラムを洗浄し該第２カラム、に該移動相を通
して該第２カラムを安定させる。

以上の操作を異なる試料に対し繰り返し行うことにより
複数の試料を連続的に処理する。

［実施例］ 以下、図面に基づいて本発明の一実施例を説明する。

第１図は神経芽細胞腫マススクリーニング法を実施する
ためのＨＰ　Ｌ　Ｃを示す。

図中、Ｓｌは移動相溶媒、Ｓ、は洗浄溶媒、Ｓ４は反応
液であり、クレアチニンと反応させて蛍光物質を生成さ
せるためのもの、Ｓ３は反応促進液であり、ｐＨを調節
して該反応を促進させるためのものである。

ＧＰは低圧混合グラジェントユニットであり、移動相溶
媒Ｓ１又は洗浄溶媒Ｓ２を選択的に切り換え、又は、移
動相溶媒ＳＩと洗浄溶媒ｓ２の混合比を一定着しくは連
続的に変化させるためのもの、Ｐ１〜Ｐ４は送液ポンプ
であり、ポンプＰ、はＧＰを通る溶媒を送液するもの、
Ｐ７、Ｐ３、Ｐ４はそれぞれ移動相溶媒ＳＩ、反応促進
液Ｓ３、反応液Ｓ４を定流量送液するものである。

■は試料注入用インジェクタ、Ｃ３はイオン交換カラム
であり、試料中のクレアチニンを分離するためのもの、
Ｃ７は逆相系ＯＤＳカラムであり、試料中のＶＭＡと１
１　Ｖ　Ａを分離するためのもの、Ｄは蛍光検出器であ
り、ＶＭＡ、ＨＶＡ及びクレアチニンを検出定量するた
めのもの、Ｖ、、Ｖ、は流路切換用電磁六方弁、Ａは混
合コイル、Ｂは混合反応コイル、ＣＯは恒温槽であり、
逆相系ＯＤＳカラムＣ３イオン交換カラムＣ２、混合カ
ラムＡ及び混合反応コイルＢを収容してこれらを設定温
度に保つためのもの、ＤＰは検出データを処理するデー
タ処理装置、ＳＣはシステムコントローラであり、低圧
混合グラジェントユニットＧＰ、送液ポンプｐ、、ｐ、
、蛍光検出器り及び電磁六方弁Ｖ５、■、を制御するた
めのものである。

次に、上記ＨＰＬＣを用いた神経芽細胞腫マススクリー
ニング法を試験例に基づいて説明する。

（試験例） 試験条件は次の通りである。

移動相溶媒ＳＩ及び洗浄溶媒Ｓ、は同一溶媒であって、
１５０ｍＭのＮａＣＱＯ４と５０ｍＭのクエン酸三ナト
リウム（Ｎａｓｃａｎｓｏｔ）の水溶液をＨＣｆｆＯ，
でｐＨ５，９５に調整したもの。

反応促進液Ｓ３は０７５規定のＮａＯＨ水溶液。

反応液Ｓ４は０６％のニンヒドリン（Ｃ６Ｈ，Ｃ０ＣＯ
ＣＯ）水溶液。

イオン交換カラムＣ１は日本分光工業株式会社製、型式
Ｆｉｎｅｐａｋ　ＧＥＬ　５Ｃ−１２０、逆相系ＯＤＳ
カラムＣ７は日本分光工業株式会社製、型式Ｃａｔｅｃ
ｈｏｌ　ｐａｋ。

送液ポンプの設定流量は、送液ポンプＰ、が１．０ｍ１
２／ｍｉｎ、送液ポンプＰ、が０．５ｍｆｆ／ｍｉｎ、
送液ポンプＰ３が０．４ｍ１２／ｍｉｎ、送液ポンプＰ
４が０．６ｍ（！／ｍ１ｎ０蛍光検出器りの励起波長λ
Ｔ、ｘ及び蛍光波長λＦＬは、ＶＭＡ及び）ＩＶＡの検
出については、λｇｘ＝２８２ｎｍ、λＦＬ＝３１５ｎ
ｍ。

クレアチニンの検出については、 λＥｘ＝３９５ｎｍ、λｒＬ−５００ｎｍ０恒温槽Ｃｏ
の設定温度は４０℃。

なお、移動相溶媒ＳＩと洗浄溶媒Ｓ、とを同一にしたの
で、低圧混合グラジェントユニットＧＰは用いなかった
。

上記条件の下で、電磁六方弁Ｖ５、Ｖ２の内部流路を第
１図実線で示す流路にして、送液ポンプＰ１、インジェ
クタ■、イオン交換カラムＣＩ、逆相系ＯＤＳカラムＣ
２、蛍光検出器りをこの順に接続する。

また、恒温槽Ｃｏを設定温度にし、送液ポンプＰいＰ７
、Ｐ３及びＰ４を駆動する。

次に、尿試料をインジェクタＩから流路内に注入する。

この試料は電磁六方弁■１を介してイオン交換カラムＣ
８中に導入され、成分に分離される。ＶＭＡ及びＨＶＡ
は試料注入後３分弱でほぼ同時にイオン交換カラムＣ１
から溶出されて電磁六方弁■、を介し逆相系ＯＤＳカラ
ムＣ２に導入されるが、方、クレアチニンはイオン交換
カラムＣ３内で溶離進行中である。

試料注入後３分経過した時点（ｔｌ）で、システムコン
トローラＳＣは電磁六方弁Ｖ１を切り換えて第２図に示
す流路とする。これにより、イオン交換カラムＣ１が逆
相系ＯＤＳカラムＣ７から切り離され、イオン交換カラ
ムＣ＋は送液ポンプＰ、と混合コイルＡの間に介装され
る。

ＶＭＡ及びＨＶＡは逆相系ＯＤＳカラムＣ７内で分離さ
れ、逆相系ＯＤＳカラムＣ９から溶出し、電磁六方弁Ｖ
２を介し蛍光検出器りを通って蛍光検出器りにより第４
図に示す如く検出される。試料注入後１２．５分経過し
た時点（ｔ２）では、ＶＭＡ及びＨＶＡは既に蛍光検出
器りを通って排出されている。一方、クレアチニンは未
だイオン交換カラムＣ３内で溶離進行中である。

次に、この時点り、でシステムコントローラＳＣにより
電磁六方弁Ｖ２を切り換えて第３図に示す如く、蛍光検
出器りを逆相系ＯＤＳカラムＣ７から切り離し、この蛍
光検出器りを、混合反応コイルＢの後段に六方弁Ｖ２を
介して接続する。また、この時点ｔ２でシステムコント
ローラＳＣにより蛍光検出器りの励起波長及び蛍光波長
を上記後者の値に切り換える。

クレアチニンはイオン交換カラムＣ１から溶出され、電
磁六方弁■１を介し混合コイルＡを通って反応促進液Ｓ
３と混合され、混合反応コイルＢを通り反応液Ｓ４と混
合されて蛍光物質が生成され、次いで電磁六方弁■、を
介し蛍光検出器りを通って第４図に示す如く検出される
。ＶＭＡ、　ＨＶＡ及びクレアチニンの成分比はデータ
プロセッサＤＰにより演算されて求められる。一方、こ
れと並行して逆相系ＯＤＳカラムＣ２は移動相溶媒Ｓ、
により洗浄され、その溶出液は電磁六方弁■、のポート
Ｅｘから排出される。

クレアチニンが検出され、かつ、逆相系ＯＤＳカラムＣ
６が洗浄されて安定した後（本試験例では試料注入後２
０分経過した時点）は、システムコントローラＳＣによ
り電磁六方弁Ｖい■２が切り換えられて第１図に示ず流
路系に戻され、次の試料が上記同様にして分析される。

従来では２つの異なる手法でＶＭＡ、　ＨＶＡとクレア
チニンとを検出していたので、これら３成分の比を手計
算又は電卓等を用いて計算する必要があったが、本実施
例ではこれら３成分をＩＩＰＬｃのみ用いて検出するの
で、人手を介することなくデータプロセッサＤＰにより
求めることができ、処理が簡単迅速となる。また、ＨＰ
　Ｌ　Ｃのみでこれら３成分を検出することができるの
で、測定操作が簡単になるとともに、迅速に多検体を処
理することができる。

なお、上記試験例では移動相溶媒ＳＩと洗浄溶媒Ｓ２と
を同一溶媒にしたが、移動相溶媒Ｓ、と異なる効率のよ
い洗浄溶媒Ｓ、を用い、時点ｔ、で低圧混合グラジェン
トユニットＧＰにより移動相溶媒Ｓ、から洗浄溶媒Ｓ、
へ切り換え又は両溶媒の混合比を一定にし、一定時間後
、洗浄溶媒Ｓ２から移動相溶媒Ｓ、へ連続的に又は不連
続的に低圧混合グラジェントユニットＧＰで切り換える
構成であってもよい。また、クレアチニン検出後にイオ
ン交換カラムＣ３も洗浄溶媒で洗浄する構成であっても
よい。この洗浄溶媒Ｓ２としては各カラムを洗浄できる
溶出力の強い溶媒、例えば移動相とアセトニトリルの混
合溶媒又は移動相とメタノールの混合溶媒等が考えられ
る。

また、移動相溶媒Ｓ１の種類によっては、イオン交換カ
ラムＣ５の代わりに逆相系カラムを用い又は逆相系ＯＤ
ＳカラムＣ２の代わりにイオン交換カラムを用いること
が考えられる。逆相系カラムはＯＤＳカラムに限定され
ない。

さらに、反応液Ｓ４の種類及び移動相溶媒Ｓ、の１）Ｈ
によっては、反応促進液Ｓ３、送液ポンプＰ３及び混合
コイルＡを用いる必要がない。

また、インジェクタＩの代わりにオートサンプラを用い
てもよいことは勿論である。

［発明の効果］ 以上説明した如く、本発明に係る神経芽細胞腫マススク
リーニング法によれば、高速液体クロマトグラフのみを
用いてバニルマンデル酸、ホモバニリン酸及びクレアチ
ニンを検出することができるので、測定操作が簡単にな
り、そのうえ、多数の試料を誤りなく迅速に分析するこ
とが可能となるという優れた効果を奏し、神経芽細胞腫
集団検診の迅速化に寄与するところが大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図は本発明の一実施例に係り、第１図は
神経芽細胞腫マススクリーニング法を実施するための高
速液体クロマトグラフの流路図、第２図は時点［１で第
１図に示す電磁六方弁Ｖ。 を切り換えた流路図、 第３図は時点ｔ２で第２図に示す電磁六方弁Ｖ２を切り
換えた流路図、 第４図は上記高速液体クロマトグラフを用いた試験結果
を示すクロマトグラムである。 図中、 Ｓ、は移動相溶媒 Ｓ２は洗浄溶媒 Ｓ３は反応促進液 Ｓ４は反応液 Ｐ１〜Ｐ４は送液ポンプ ＧＰは低圧混合グラジエントユニット ■はインジェクタ ｖｌ、■、は電磁六方弁 Ｃ４はイオン交換カラム Ｃ２は逆相系ＯＤＳカラム Ｄは蛍光検出器 Ａは混合コイル Ｂは混合反応コイル ＤＰはデータプロセッサ ＣＯは恒温槽 ＳＣはシステムコントローラ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 イオン交換カラム又は逆相系カラムである第１カラムの
   後段にイオン交換カラム又は逆相系カラムである第２カ
   ラムを接続した状態で移動相を送液し、該第１カラムに
   試料を導入して、該試料中のクレアチニンを該第１カラ
   ム内に保持させた状態で該試料中のバニルマンデル酸及
   びホモバニリン酸を該第１カラムから溶出させて該第２
   カラムへ導き、 次に、流路を切り換えて該第１カラムと該第２カラムと
   を並列にし、該第２カラムの後段に蛍光検出器を接続し
   た状態で該第１カラム及び該第２カラムに該移動相を別
   個に送液して、該第１カラム内で該クレアチニンの溶離
   を進行させつつ、これと並行して、該第２カラムで該バ
   ニルマンデル酸及び該ホモバニリン酸を分離させ該第２
   カラムから溶出された該バニルマンデル酸及び該ホモバ
   ニリン酸を蛍光検出器で検出し、 次に、流路を切り換えて該蛍光検出器を該第１カラムの
   後段に接続し、該第１カラムと該蛍光検出器との間の流
   路に該クレアチニンと反応して蛍光物質を生成させる反
   応液を合流させた状態で、該第１カラム内でクレアチニ
   ンを溶離させ該第１カラムから該クレアチニンを溶出さ
   せて該蛍光物質を生成させ該蛍光物質を該蛍光検出器で
   検出し、これと並行して、該第２カラムに洗浄液を通し
   て該第２カラムを洗浄し該第２カラムに該移動相を通し
   て該第２カラムを安定させ、 以上の操作を異なる試料に対し繰り返し行うことにより
   複数の試料を連続的に処理することを特徴とする、高速
   液体クロマトグラフを用いた神経芽細胞腫マススクリー
   ニング法。