JPH02169596A - 中性スフィンゴ糖脂質の濃縮及び精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、牛乳等に含まれている中性スフィンゴ糖脂質
を効率よく精製する方法に関する。

（従来の技術） 糖脂質は、グリコリピッドともいい、炭水化物と脂質を
主成分とするもので、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂
質などに分類される。

近年、この脂質に関する研究が、医学及び薬学の分野を
中心に、盛んに行われるようになり、その生理的機能性
が注目されるようになってきている。

このうち、スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴシンのアミ
ノ基に脂肪酸が酸アミド結合した構造を持つセラミドの
一級アルコールに各種の糖類がグリコシド結合した糖脂
質の総称であり、中性スフィンゴ糖脂質と酸性スフィン
ゴ糖脂質とから成っているンこのスフィンゴ糖脂質は、
種々の動物組織に存在していることが知られており、細
胞や組織の発生・分化、神経８！能、怒染及び正常細胞
の悪性化などに関係していると言われている。

また、永井らの脂質化学研究、第２７巻、１８２〜１８
５頁（１９８５）、藤野らの日本畜産学会報、第４０巻
、第８号、３４９〜３５４頁（１９６９）、及び森らの
日本畜産学会報、第４１巻、第２号、７５〜７９頁（１
９７０）など、牛乳中に含有されるスフィンゴ糖脂質に
関する研究が行われており、酸性スフィンゴ糖脂質のガ
ングリオシドや中性スフィンゴ糖脂質のグリコジルセラ
ミド、ラクトシルセラミドなどが比較的多く存在してい
ることが明らかにされている。

一方、一般的に行われている中性スフィンゴ糖脂質の調
製方法として、酢酸またはトリクロル酢酸などの酸で蛋
白質と複合体を形成している中性スフィンゴ糖脂質を沈
澱させ、その沈澱物に、クロロホルム−メタノール混合
液などのアルコールを含む有機溶媒を加えて、蛋白質と
の複合体から中性スフィンゴ糖脂質を分離、抽出する方
法が行われている。しかし、このような方法では、比較
的高含有量の中性スフィンゴ糖脂質を含む組成物を得る
ことはできず、従って、効率よく中性スフィンゴ糖脂質
を精製できないという問題がある。

このような事情により、牛乳等に含まれる中性スフィン
ゴ糖脂質を工業的規模で調製することは、事実上、困難
であった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、先に、牛乳ガングリオシドを含む乳質物
質に蛋白質加水分解酵素を作用させて蛋白質を分解し、
得られた蛋白質加水分解溶液を限外濾過法、ゲル濾過法
、或いは透析法などから選ばれる方法で処理することに
より、牛乳ガングリオシドを濃縮調製する方法（特開昭
６３−２６９９９２）を提案した。

その後、上述の牛乳ガングリオシドを濃縮調製する方法
により得られた組成物中には、酸性スフィンゴ糖脂質の
ガングリオシドと共に、中性スフィンゴ糖脂質、特にグ
ルコシルセラミド及びラクトシルセラミドが、比較的多
く存在していることの知見を′得て、この牛乳ガングリ
オシドを濃１１１！製する方法を牛乳等に含まれる中性
スフィンゴ糖脂質の抽出、精製の際に、前処理法として
応用することにより、効率よく中性スフィンゴ糖脂質を
精製する方法を成すに至った。

従って、本発明では、牛乳等に含まれる中性スフィンゴ
糖脂質を効率よく精製する方法を提供することを課題と
する。

以下、本発明を説明する。

（課題を解決するための手段） 本発明に係る中性スフィンゴ糖脂質の精製法は、一般的
な中性スフィンゴ糖脂質の抽出、精製の操作に先立って
、中性スフィンゴ糖脂質を含む物質に蛋白質加水分解酵
素を作用させて蛋白質を加水分解し、得られた蛋白質加
水分解溶液を、例えば限外濾過法、ゲル濾過法、或いは
透析法などから選ばれる方法で処理して中性スフィンゴ
糖脂質を濃縮し、必要に応じて、この溶液を通常行われ
る方法で乾燥した粉末を用い、中性スフィンゴ糖脂質を
抽出、精製することを特徴とする。

本発明において、出発原料として用いる物質としては、
牛乳及び牛乳から得られるバターミルク、ホエー、脱脂
乳などの乳質物質、動物の脳や腎等が挙げられる。これ
らの物質は、スフィンゴ糖脂質以外に蛋白質、乳糖、脂
質などを含有するため、これらを除く必要がある。

まず、蛋白質加水分解酵素を用いて蛋白質をペプチド、
或いはアミノ酸まで加水分解する。この加水分解に用い
る蛋白質加水分解酵素としては、トリプシン、ペプシン
、キモトリプシン、パパイン、タカジアスターゼ、枯草
菌プロテアーゼなどを例示し得る。蛋白質加水分解の反
応条件は、例えば、原料の乳質物質に含まれる蛋白質濃
度に対して０．１〜１０重量％となるように蛋白質加水
分解酵素を添加し、ｐＨ２〜１０、温度２０〜６０℃に
て３〜１００時間反応させることが好ましい。このよう
にして、原料の乳質物質に含まれる蛋白質を加水分解し
た溶液を９０−１００℃で数分間加熱し、蛋白質加水分
解酵素を失活させる。

次に、この蛋白質加水分解溶液を限外濾過法、ゲル濾過
法、或いは透析法などで処理して、溶液中のスフィンゴ
糖脂を濃度を高める。

限外濾過法は、大きい溶質分子を小さい溶質分子や溶媒
分子から篩い分ける分子レベルの濾過法で、通常は限外
濾過膜を装着した装置を用いる。

限外濾過膜としては、２．０００〜５００．０００の分
画分子量のものを用いるとよい。この限外濾過膜を装着
した装置を用いて限外濾過を行うことにより、蛋白質加
水分解酵素によって加水分解されたペプチド及びアミノ
酸や乳糖その他の低分子勧賞が溶出液として除かれ、濃
縮槽でスフィンゴ糖脂質が濃縮される。

ゲル濾過法は、溶媒で膨潤させたゲル粒子を充填したカ
ラムを用い、溶出速度の違いで高分子の溶質と低分子の
溶質とを分離する方法で、セファデックス（登録商標）
、バイオゲル（登録商標）、アガロースゲルなどが用い
られている。この方法では、ボイド画分にスフィンゴ糖
脂質が溶出される。

このようにして得られたスフィンゴ糖脂質を含む溶液を
必要に応じて濃縮、乾燥し、得られた濃縮液又は乾燥粉
末を用いて、中性スフィンゴ糖脂質を抽出、精製する。

中性スフィンゴ糖脂質の抽出及び精製は、例えば、次の
ような手順で行うことができる。

＋１１　　溶媒としてクロロホルム−メタノール混合溶
液（２：　１　、ｖ／ｖ）を上記の濃縮液又は乾燥粉末
に加え、室温で３０分間攪拌して中性スフィンゴ糖脂質
を抽出し、この抽出液を蒸発乾固する。

（２）溶媒としてアセトンを上記の蒸発乾固した抽出物
に加え、室温で２０分間攪拌して中性スフィンゴ糖脂質
を抽出し、この抽出液からアセトンを除去する。

（３）上記のアセトンを除去した抽出液の残渣にクロロ
ホルムを加えて溶解し、この溶液をシリカゲルカラムに
通液して中性スフィンゴ糖脂質をシリカゲルに吸着させ
た後、シリカゲルカラムをクロロホルムで洗浄する。

（４）　　溶出液としてクロロホルム−メタノール混合
溶液（９：１、ｖ／ｖ）を用い、上記の中性スフィンゴ
糖脂質を吸着させたシリカゲルからグルコシルセラミド
を？８出する。

（５）中性スフィンゴ糖脂質を吸着させたシリカゲルか
らグルコシルセラミドを溶出した後、溶出液としてクロ
ロホルム−メタノール混合液（８：２、ｖ／ｖ）を用い
、ラクトシルセラミドを溶出する。

以上のようにして溶出されたグルコシルセラミド及びラ
クトシルセラミドの溶出液を蒸発乾固することにより、
それぞれ純度９０％以上の白色粉末を得ることができる
。

（発明の効果） 本発明は、中性スフィンゴ糖脂質の新規な濃縮調製法、
即ち、蛋白質分解酵素を用い蛋白質を分解し、限外濾過
法、ゲル濾過法あるいは透析法等により、濃縮調製する
方法を用いたので、中性スフィンゴ糖脂質を効率よ（有
利に濃縮調製し、高濃度の中性スフィンゴ糖脂質を工業
的規模で調製することができた。

なお、中性スフィンゴ糖脂質は、一般に蛋白質と複合体
を形成しており、この結合を切るには、アルコールを含
む有機溶媒が必須とされている。

しかし本発明においては、これらアルコールなどを必要
とせずに濃縮調製することが可能となった。

（実施例） 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ バターミルクｔ１２０ｋｇを水１８０　＃に溶解した溶
液に０．５ｋｇの枯草菌プロテアーゼを添加し、ｐＩＩ
　７　、６、温度４０℃で１５時間反応させ、蛋白質を
分解した後、９０°Ｃで１０分間加熱し、酵素を失活さ
せた。

次イテ、コノ溶液を、ＧＲ−５１Ｐ　（ＤＤＳ社製）の
膜面積０．３６ｉの濾過膜を装着した限外ｄｆｉ過装置
（ＬＡＢ−２０型モジユール、ＤＤＳ社製）４．：て、
温度４０℃、流量１５１／分、平均圧力０．６　ＭＰａ
で濾過し、中性スフィンゴ糖脂質を濃縮した。濃縮終了
後、濃縮槽より濃縮液を回収し、凍結乾燥を行って、粉
末１　、４００ｇを得た。

このようにして得られた粉末は、中性スフィンゴ糖脂質
を７．６％含有していた。

実施例２ 牛乳５ＯＮにトリプシンを１５０ｇ添加し、ｐｌ’ｌ　
７．６、温度４０℃で２４時間蛋白質を分解した後、９
０℃で１０分間加熱し、酵素を失活させ、た。

次いで、この溶液をＨＷ−５５（ＴＯＹＯ５ＯＤＡ社製
）を充填したゲル濾過カラム（６０Ｘ　１００ｃｍ）に
流し、中性スフィンゴ糖脂質が濃縮されているボイド画
分を回収し、凍結乾燥を行って粉末１，２００ｇを得た
。

このようにして得られた粉末は、中性スフィンゴ糖脂質
を１．８％含有していた。

実施例３ 実施例１により調製した高含有中性スフィンゴ糖脂質粉
末１　ｋｇにクロロホルム−メタノール混液（２：　１
　、、　ｖ／ｖ）を１０ｆ加え、室温で３０分間攪拌し
、中性スフィンゴ糖脂質を抽出した。

次に、抽出液を濃縮乾固した後、アセトン２１を加え室
温で２０分間攪拌し、アセトンに中性スフィンゴ糖脂質
を溶出させた後、アセトンを除去した。

残渣をクロロホルムで溶解し、シリカゲルカラム（４，
０Ｘ６０ｃ＋＋＋）に流し、中性スフィンゴ糖脂質を吸
着させ、次いでクロロホルム２１で洗浄した後、クロロ
ホルム−メタノール混液（９：　１　、ν／ｖ）２１で
グルコシルセラミド ホルム−メタノール混液（８：２、ｖ／ν）２βでラク
トシルセラミドを？８出させた。

各々の溶出液をエバポレータで蒸発乾固し、各々白色粉
末３０ｇを得た。

このようにして得られた粉末の中性スフィンゴ１ｇ脂質
の純度は薄層クロマトグラフィーで９０％（オルシノー
ル法）であった。

実施例４ 新鮮な牛脳２０ｋｇに４倍量の水を加えて十分に均質化
した溶液に３０ｇのペプシンを添加し、ｐｌ！７．６、
温度４０℃で８時間反応させ、蛋白質を分解した後、９
０℃で１０分間加熱し、酵素を失活させた。

次いで、この溶液を、ＧＲ−５１Ｐ　（ＤＤＳ社製）の
膜面積Ｏ．３Ｓ＝の濾過膜を装着した限外濾過装置（Ｌ
ＡＢ−２０型モジユール、ＤＤＳ社製）にて、温度４０
℃、流量１５１／分、平均圧力０．　６　ＭＰａで濾過
し、′中性スフィンゴ糖脂質を濃縮した。濃縮終了後、
濃縮槽より濃縮液を回収し、凍結乾燥を行って、粉末２
，　３００ｇを得た。

このようにして得られた粉末は、中性スフィンゴ糖脂質
を９．３％含有していた。

手続補正書 平成元年３月３０日 特許庁長官　　吉　　１）　文　　毅　　殿１、事件の
表示　　昭和６３年特許願第３２１９５６号２、発明の
名称 中性スフィンゴ糖脂質の濃縮及び精製法３、補正をする
者 事件との関係　特許出願人 北海道札幌市東区苗穂町六丁目一番ー号雪　　印　　乳
　　業　　株　　式　　会　　社代表者　　正　　野　
　勝　　也 ４、代理人 明細書の発明の詳細な説明の欄 １）　明細書第８頁、１２〜１５行目の「室温で２０分
間攪拌して中性スフィンゴ糖脂質を抽出し、この抽出液
からアセトンを除去する。

（３）上記のアセトンを除去した抽出液の残渣に」を 「室温で２０分間攪拌して中性脂質を抽出し、アセトン
と共に除去する。

（３）上記のアセトンと共に中性脂質を除去した残渣に
」 に訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　中性スフィンゴ糖脂質を含む物質に蛋白質加水分解
   酵素を作用させて蛋白質を加水分解し、得られた蛋白質
   加水分解溶液を限外濾過法、ゲル濾過法及び透析法から
   選ばれる方法で濃縮することを特徴とする中性スフィン
   ゴ糖脂質の濃縮法。 ２　中性スフィンゴ糖脂質を含む物質が乳質物質である
   請求項１記載の濃縮法。 ３　請求項１又は２記載の濃縮法で調製された濃縮液か
   ら中性スフィンゴ糖脂質を抽出、精製することを特徴と
   する中性スフィンゴ糖脂質の精製法。 ４　請求項１又は２記載の濃縮法で調製された濃縮液を
   、更に乾燥した後、該乾燥粉末から中性スフィンゴ糖脂
   質を抽出、精製することを特徴とする中性スフィンゴ糖
   脂質の精製法。 ５　中性スフィンゴ糖脂質がグルコシルセラミドである
   請求項３又は４記載の精製法。 ６　中性スフィンゴ糖脂質がラクトシルセラミドである
   請求項３又は４記載の精製法。