JPH0217445A - ランタニド標識ヌクレオチドの時間分解型螢光分析検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の第１１用分野 本発明は、ゲル電気泳動系中で分離した螢光標識ヌクレ
オチドモノマー　オリゴマーまたはポリマーの時間分解
型螢光分析検出法に関する。

従来の技術 核酸またはヌクレオチドを痕跡レベルで検出する能力は
、バイオテクノロジーの多くの分野において要求されか
つ極めて重要である。過去においては、ヌクレオチドの
追跡および検出は、通常放射性同位元素を使用して実施
された。しかし、放射性同位元素を使用するこれらの方
法は一般に非常に困難で、時間がかかり、高価でありか
つ放射性同位元素標識試乗の取扱いおよび廃棄処理の問
題を生じる、不安定で危険な放射性同位元素の使用を必
要とする。従って、別のより安全な検出法を見出す興味
が生じた。

１つのかかる方法は、酵素の触媒作用による発色を第１
１用する提案であった。しかし、この提案された方法は
、放射性標識ヌクレオチドを使用する方法よりもはるか
に低い感ｍ゛のため、−般に採用されなかった。さらに
酵素触媒法は、放射性標識ヌクレオチド法以上の一般的
に改良された実施の容易さを有することが認められなか
った。

従って、螢光発光に基づく、核酸またはヌクレオチドを
検出する他の種々の方法が提案または使用された。恐ら
く、最も広く使用された方法は、臭化エチジウムのよう
な染料での染色を包含する。しかし、結合されてない染
料からのバックグラウンド発光のため、検出範囲はオー
トラジオグラフィーにおける検出範囲には接近できない
。遊離染料によるバックグラウンドの問題の除去を、核
酸を螢光標識物により共有結合修飾し、次いで未反応標
識を分離することによって達成しうろことも提案されて
いる。発蛍光団の適当な選択および光学装置の最適化に
より、放射性同位元素検出の感度に近似または適合する
感度が可能であると考えられる。幾つかの研究ゲループ
は、この提案をポリアクリルアミドケ°ル中のＤＮＡフ
ラグメントを検出するために検出した。この提案の欠点
は、ゲルが顕著な散乱およびバックグラウンド螢光の源
であることである。

オートラジオグラフィーよりも胛論的により敏感な別の
検出プランは、時間分解型螢光分析である。この方法に
よれば、長い放射寿命を有するキレート結合ランタニド
金属を重要な分子に結合させる。ｒ−）検出装置と結合
されたノ４ルス励起は、短命のバックグラウンド発光に
対する有効な識別が可能である。サイバネン（Ｓｙｖａ
ｎｅｎ　）等〔“Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ第５ｅａｒｃｈ０１７頁〜第１０２６頁（１
９８６年）〕は、この提案がユウロピウム標識抗体を介
してＤＮＡハイブリッドを処世するために有用であるこ
とを証明した。さらに、ビオチニル化ＤＮＡは、ｌ−−
レｙ　（Ｄ、　Ｄａｈｌｅｎ）［“Ａｎａ　ｉ　、　ｓ
　ｒ　ｏｃｈｅｍ、　　　第１６４巻、第７８頁〜第８
３頁（１９８２年）〕Ｋより報告されたように、Ｅ　Ｕ
　−横ＲＸ　）　！／　／’　ヒシン（Ｓｉ　ｒ　ｅｐ
ａｖ　ｉ　ｄ　Ｉ　ｎ）を使用して微を滴定装置（ｍｉ
ｃｒｏｔｉｔｅｒ　Ｗｅｌｌｓ）で測定した。しかし、
この型の検定の欠点は、標識を試料から洗浄しなければ
ならずかつその螢光が増強液中に山状することである。

さらに、許容しうる検出を提供するのに十分に安定な標
識分子を得ることが困難であった。さらに、ゲル電気泳
動系中で標識分子は一般に希釈の際またはゲル電気泳動
系が高められた温度を受けた時に、標識分子の許容しう
る検出が可能であるのに十分な安定性を有していない。

もう１つの欠点は、生じた螢光がたんにナノ秒（ｎｓ）
の範囲内で、標識分子の適切な検出およびバックグラウ
ンド螢光からの識別のための、−般に許容されない程短
かい時間を有しているにすぎないといり事実であった。

発明が解決しようとする課題 こうして、螢光標識ヌクレオチドに対して、間歇的励起
源および螢光の時間結合測定の使用によるバックグラウ
ト螢光をさけるため長命螢光を得るためにゲル電気泳動
系中で使用することができるようにする必要が生じた。

かかる螢光標識ヌクレオチドに対するもう１つの散求は
、標識ヌクレオチドが安定にとどまりかつ検出範囲がナ
ノ秒範囲内の螢光寿命を有する共有結合標識または臭化
エチジウムのような染色剤を使用するかかる系と比べて
著しく改善されているゲル電気泳動系中で分離したかか
る標識ヌクレオチドの時間分解型螢光分析定量によりヌ
クレオチドの検出に使用できるようにすることである。

もう１つの要求は、整光標識ヌクレオチドがケ゛ル系中
および電場中で約６０℃の高めた温度で希釈の際に安定
で螢光を発するような検出法を提供することである。さ
らにもう１つの要求は、検出のために増強＃港が必委で
なく、これにより螢光標識ヌクレオチドのオン・ライン
検出を可能にするゲル１λ気泳動系中でかかる時間分解
型螢光検出方法を柳供することである。

課題を解決する之めの手段 ケ゛ル宵、気泳動系中で分離した、螢光標識ヌクレオチ
ドモノマー　オリゴマーまたはポリマーの時間分解型螢
光分析検出法は、螢光標識ヌクレオチドとしてランタニ
ドキレート標識共有結合ヌクレオチド接合体を使用する
ことによって得られる。さらに本発明によれば、ゲル電
気泳動系中で分離したかかる螢光標識ヌクレオチドのオ
ン・ライン時間分解型螢光分析検出法が得られる。

本所明によれば、ランタニドキレート標識共有結合ヌク
レオチド被合体を使用することにより、ケ°ル電気泳動
系中で分離した螢光標識ヌクレオチドの時間分解型螢光
分析検出が得られ、該ヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮ
Ａのモノマー　オリゴマーまたはポリマーであってもよ
いが、本弁明を説明する目的のために下記笑施例および
記載はＤＮＡヌクレオチドに関するものである。

本発明において有用なランタニドキレート標識共有結合
ヌクレオチド接合体は、上述した性質を有する共有結合
ヌクレオチド接合体の安定なランタニドキレートを生成
する任意の適当なランタニドのキレートであってもよい
。任意の適当なランタニドキレートを使用することがで
きるが、ランタニドかテルビウム、サマリウム、ユウロ
ピウム、ジスプロシウムまたはネオジムであるのが望ま
しく、テルビウムが殊に有利なランクニド成分である。

ランタニドは、強いランタニドキレート化剤と共有結合
により反応したヌクレオチドにキレート結合される。ヌ
クレオチドと反応するキレート化剤は、ヌクレオチドの
反応性基に４１．有結合することができ、かつ螢光ラン
タニドに安定にキレート結合して、共有結合したヌクレ
オチドキレート化剤接合体の長命のランタニドキレート
を生成する任意の適当なキレート化剤である。長命の螢
光とは、高い量子収景の螢光、つまりバックグラウンド
干渉が既に減衰しているときに、認めうる程度には減衰
しない螢光を表わす。キレート化剤がハイブリッド形成
を受けるヌクレオチドの６１．力に不利な影春を及はさ
ないことも望ましい。

ヌクレオチドと反応して、ランタニドをキレート結合す
るのに適したヌクレオチド接合体を形成するのにｉａな
キレート化剤の例としては、たとえばアミンポリ酸、ク
リプタント、ポリ酸置換ピリジン展導体船を挙げること
ができる。

詳細なキレート化剤の例としては、たとえばジエチルト
リアミンインク酢酸二無水物（ＤＴＰＡＡ）、ベンゼン
ジアゾニウムエチレンジアミンテトラ酸ＩＥＤＴＡ）の
ようなアミンポリ酸、イソチオシアネトペン・ゾル２Ｂ
：２：１クリプタンドのようなりリプタンド、および２
゜６−ビス［Ｎ、Ｎ−ジ（カルゲキシメチル）アミノメ
チル）　−４−（’３−イソチオシアネトフェニル）−
ピリジンテトラ酸のようなポリ酸置換ビリソン訃、導体
を挙げることができる。キレート化剤としてとくに望ま
しいのＦｉ、ＤＴＰＡＡである。

キレート化剤は望ましくは、エネルギー伝達剤、望まし
くはアミン芳香族化合物、たとえばｐ−アミノフタル酸
（ＰＡＳ　）、アミノフェナジン、アミノメチルサリチ
ル酸、アニリン、アミノフタルＭ、３．４−一ノヒドロ
キシベンツルアミン、５−アミノイソフタル酸、５−ア
ミノフェナントロリン、３−アミン安息香酸紙と共にヌ
クレオチドに共有結合する。

望ましくは、ランタニドかキレート結合されるヌクレオ
チド接合体は式： ％式％ を有する接合体であり、式中Ｎｕｃはヌクレオチドモノ
マー　オリゴマーまたはポリマーであり、Ｎ１′はヌク
レオチドに固有の、または接合に先立ち標識として導入
された外因性のアミンを素であり、Ｙはランタニドをキ
レート結合しうるキレート形成基であり、２はエネルギ
ー伏込成分である。望ましくは、Ｙはジエチレントリア
ミンペンタ酢酸基であり、２はｐ−アミノサリシレート
成分であり、こうして接合体は次式を有する１、： 本発明方法において使用されるとくに望ましいランタニ
ドキレート標識ヌクレオチド検出法は、ヌクレオチド・
ＤＴＰＡＡ・ＤＡＳ接合体のテルビウムキレートである
。

本発明において使用されるランタニド標識ヌクレオチド
接合体は、マイクロ秒（ｍｓ）範囲の寿命を有する、高
度に螢光を発する標識接合体である。それで、パルス発
生源およびゲートエレクトロニクスを使用する場合、長
命の螢光減衰は、パックグラウンド螢光、迷光および散
乱励起に対する有効な識別を可能にする。さらにかかる
ランタニド標識ヌクレオチド接合体は電気泳動ゲル系中
で非常に安定で、その弛さを維持し、かつ希釈の際およ
び電婆中約６０℃の高めた温度で（ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の間に遭遇する典型的糸外）その螢光特性
を維持する。さらに、かかるランタニド標識共有結合ヌ
クレオチド接合体は、検出のために増強液を必要とせず
、従って検出方法は、オン拳ライン検出が望ましいかま
たは要求されるところで使用することができる。本発明
の方法は伎光標識ヌクレオチド接合体のオン・ライン検
出が回部であるので、該方法はマクサム・ギルバート（
Ｍａｘａｍ−Ｇｌ　１ｂｅｒｔ　）またはすｙ　カー　
（Ｓａｎｇｅｒ　）の方法によるＬ）ＮＡまたはＲＮＡ
配列決定の目的のためにｒルミ気泳動系中で使用するこ
とができる。上記のすべての利点に加えて、共有結合ヌ
クレオチド接合体のランタニドキレートは、ゲル′ｍ気
泳動系中で放射性同位元素の使用を省略することが可能
であシ、放！、１性同位元素標識ヌクレオチドを使用し
たときに得られる感度に匹敵するヌクレオチド検出法を
生じる。

本発明を下記の実施例によυ説明する。

実施例 ランタニドキレート標識ヌクレチド複合体の製造 ナトリウムＰＡＳを１１０℃で一晩乾燥し、無水ＤＭＳ
Ｏ中のナトリウムＰＡＳおよびＤＴＰＡＡの０．１Ｍ溶
液をつくり：溶解を容易にするためＤＴＰＡＡ溶液に等
モルのトリエチルアミンを加えた。ＤＴＰＡＡ溶液に等
量のＰＡＳ浴液を滴加し、次いで約６０分間攪拌して共
役反応混合物またはキレート化剤を生成しに０別個に、
プラスミドｐＢＲ３２２を、塩化セシウム／臭化エチジ
ウム勾配における遠心溶離によって精製し、次いでプラ
スミドをＨｌｎｆ　Ｉ制限酵素を用いて、技術分野にＲ
げる公知方法によりカッ−ｖ　−ｑ　チス（ｆＶｌａ　
ｍａｔｌｓ）等ニヨリ（リン１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎ
ｌｎｇｌ：実験ｆｉ−＋ｒニュフル第１００〜第１０６
頁、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ研究所
、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ＋　ニュ
ー　ヨー　り州〕記載されたようにしてプラスミド消化
物をッ（ツタ。ｐＢＲ３２２７）Ｈｌｎｆ　Ｉ　　消化
は、７５塩基対から１６３１塩基対にわたる、付着端を
有する１０のフラグメントな生じ；各末端における一本
鎖の塩基の配列はＡＮＴ　（ここでＮはヌクレオチドを
表わす）である。露呈せる塩基における環外アミンはモ
ノ無水物付卯物が攻撃してアミド結合を形成する部位を
与えるものと考えられる。

共役反応混合物の７　ｕｔをプラスミド消化物（○、１
４５Ｌ１ｇ／　Ｕ　１切断ｐＢＲ３２２）のＬ　５０ｕ
Ｌに側え、室温で約６０分間攪拌した。冬℃で一晩貯蔵
した後、０．０５Ｍの塩化テルビウム６、δＵＺを加え
、混合物を振り、約３０分放置した。

過剰の塀水分解キレートを、セファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）　Ｇ　２５−１５０を充填し７．−１６　Ｘ
　ｌ副のカラムに２回通すことによってプラスミド消化
キレート接合体から分離した。溶離緩衝液はｌｏｍＭの
３−ＣＮ−モルホリノ〕プロパンスルホン＠（ＭＯＰＳ
）（ｐＨ７，０）であった。各精製後、ＤＮＡ含有フラ
クションを集め、真空下で蒸発乾個してテルビウム標識
ヌクレオチド接合体を生成した。

テルビウム標識ＤＮＡ接合体の特性決定標識ＤＮＡ接合
体のＤＮＡ濃度は、精製した標識ヌクレオチド接合体の
螢光乞遊離キレート、つ筐ワテルビウムで錯生成された
、ジエチレントリアミンペンタ酢酸ジ無水物／ｐ−アミ
ノサリシレート付那物（ＤＴＰＡＡ　＠ＰＡＳ）　　の
螢光と比較することによって決定した。この方法に固有
の仮足を工、共役結合した標識の１を子収量が遊離キレ
ートに等しいことであり。ＤＮＡ濃度乞測足する場合２
６０　ｎｍにおけるＰＡＳ吸収の補正は、ＰＡＳ／塩基
の比が低いため必要でなカッタ。スペクトル測定は、パ
ーキン・ニルマー社のラムダ配列ＵＶ−ＶＩＳ分元計お
よびパーキン・ニルマー社のＬＳ−５螢光定量分元計を
用いて実施した；後者はパルス光源およびゲート検出エ
レクトロニクス（遅延発光の選択的観察を可能ならしめ
る）ン使用する。試料を２ｅｌＱｎｍで励起し、ＬＯｎ
ｍのスリットヲ用いて５４５ｎｍで検出した；励起と検
出との間の遅延は０．１　ｍ　ｓであり、ゲートは６ｍ
ｓであった。

精製したＤＮＡ中へのキレート組込みの程度は、ＤＮＡ
ｌｕｇあたり６．３ｐモルと計算されたＯ 遊離キレートの量子収量は次の関係式を用いて算定した
： Ｑｑ　Ｓ　　　　　ｑ　Ｓ　　　　ｑ　ＳＡ ただし、ＱｃおよびＱｑ５は遊離キレートおよび硫酸キ
ニーネそれぞれの量子収量でありＩＦ０８よびＦｑ、は
補正された発光スペクトル下の面積であＩ：）＋Ａｏ′
ｊ６よびＡｑ、はそれぞれの励起波長における吸光度で
ある。Ｑｑ、は３４７　ｎｍ励起では０．５９と算定さ
れた。硫酸キニーネ螢光は、励起と検出との間で時間の
遅れなしに測定し、遊離キレート螢光は上述した遅れお
よびゲート設定で測定した。異なる装置的条件下での標
準および試料発光の測定は算定されるＱＣの正確さに影
響を与えるが、これは標識が遅れて螢光を発することに
よる人為的に低い値に計算されるのを防止する。

寿命は、励起と検出との間の時間の遅れ（ゲートは一定
に保持）の関数として発光強さを測定することによって
決定した。データは式：Ｉ＝Ｉｅ”ｔ　の最も簡単な指
数に適合した。

精製したテルビウム標識ヌクレオチド接合体の発光スペ
クトルは、５４５ｎｍに生じる最大強さを有するテルビ
ウムイオンの特徴である。

励起スペクトルは、テルビウム発光は直接に励起されな
いで、サリシレート基からのエネルギー伝達によるもの
であるという認識と一致して、ＰＡＳの吸収スペクトル
に密に適合する。使用された濃度において、テルビウム
螢光はＤＴＰＡＡ／ＰＡＳ付加物の不在では検出するこ
とができなかった。検出は、ＰＡＳｇよび２１］Ｘ分解
ＤＴＰＡＡの存在では不可能であった（付７ＩＯｗＪ形
成７：ｃ　Ｌ　）。

遊離キレートの量子収量は室温で０．０９であると算定
され、これはかかる寿命の発螢光団に対して評価できる
。遊離キレートのスペクトル物性はＤＮＡに結合したキ
レートのスペクトル物性に類似であると想定される。そ
れというのも励起スペクトルと発光スペクトルは実質的
に同一であるからである。遊離キレートｉｄよびＤＮＡ
キレート接合体の時間分解型の発光測定は、それぞれ１
．７ｍｓおよび１．５ｍ５０）螢光寿命を生じた。こう
して、短命の散乱によびバックグラウンド螢光に対する
識別αノためにゲートエレクトロニクスを使用する場合
、キレートの検出は非常に低Ｖペルで可能である。上述
した標準条件を用いて遊離キレートのｌｎＭ浴液の発光
スキ’ｒ　ｙ　（６０ｎｍ／ｍ　Ｉ　ｎ　）　＆！　、
５４５　ｎｍ　Ｋ　Ｍいて６４の信号対雑音比（Ｓ／Ｎ
比〕を与えた。

ゲル電気泳動およびテルビウム標識ヌクレオチド接合体
検出 上記製法によって製造し１こテルビウム標識ヌクレオチ
ド接合体（標識制限フラグメント）ヲ、１．５１１ＬＸ
１．６譚、ｐＨ８，０のトリスホウ酸塩緩衝液（０，０
８９Ｍ、ＥＤＴＡなし）中の５％ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動じた。ポリアクリルアミドゲルは次の配合
のものであった：脱イオン水　　　　　　　　　４０ゴ アクリルアミド　　　　　　　　　養、８１１ビス−ア
クリルアミド　　　　　　Ｏ，ｌ’１尿　　素　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４２１来 １０×配列決定緩衝液　　　　１ｏｔｊ１０％の過硫酸
アンモニウム　　　　　０．６６ｄＴＥＭＥＤ　　　　
　　　　　　　　　　　０．０６０罰脱イオン水で１０
０１にする。

”１０×配列決足緩衝液 ５００ｍＭ　）　ＩＪ　ス塩基、５００ｍＭホウ酸装置
は、ブロモフェノールブルー追跡用染料がゲルの底から
約２画流出すまで、８ｖ／ｒｎＩで運転した。次いで、
装置からゲルを取り出し、透視法（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ、
Ｍｏｄｅｌ　　３−３０００）　　で、標６＋ＨＤ　Ｎ
　Ａフラグメントの位置を決定した。特徴ある緑の発光
によって確認されるＤＴＰＡＡ・ＰＡＳ−Ｔｔ）標識Ｄ
ＮＡｆラスミド消化物を言有するゲルの部分を、ゲルか
ら切出し、個々に脱イオン水１ｄを有する遠心分離用試
験管に入れた。冬℃で６日間貯蔵した後、上澄液をゲル
断片から分離し、ｌ、５＊／の最終体積に希釈し、キレ
ート発光につぎ定量した。

ゲル抽出物の時間分解の螢光強さは、パーキン−ニルマ
ー社のモデルＬ　Ｓ　−５：、＊光分析分光計で次の条
件下に測定したニスリット幅　１０ｎｍ　ｉ励ｉｔｙ、
長２　ｅｊ　Ｏｎｍ；　　発光波長５４５ｎｍｉ　　励
起から発光までの時間の遅れＯ，１ｍＳ＋観皺ゲート時
間　５　ｍ９０　　すべての抽出物は、測定前に１．５
Ｍの最終体積に希釈した。ゲルの８つの７ラクシヨンに
つき記録された強さの絶対値（標識した制限フラグメン
トは、ゲルの８片から抽出した）は次表に掲げる。７ラ
クシヨンの液部は最小可動フラクション（ゲルの頂部）
から最大可動７ラクシヨン（ゲルの底部）に向う。

表　　　■ 螢光の強さ ゲル　フラクション　（強さの絶対値）　標識のｐｍｏ
　１１　　　　　　　４７．７　　　　　１δ９２　　
　　　　　５１、’５　　　　　１６．６３　　　　　
　　４３．９　　　　　　８．２４　　　　　　　４１
．４−　　　　　　５．２５　　　　　　　４５．３　
　　　　　９．６６　　　　　　　　４．７　　　　　
　９．１７　　　　　　　４２．０　　　　　　５．９
δ　　　　　　　３７．９　　　　　　１．１螢光強さ
の測定値は、校正曲線により、各ゲルフラクション中の
ｐＢＲ３２２制限フラグメントに結合した、螢光標識Ｄ
ＴＰＡＡ−ＰＡＳφＴｂの量に換算した。校正曲線は、
標識制限フラグメントと同じ計測条件下にテルビウム（
遊離キレート）で錯形成された加水分解付那物の連続的
希釈からの螢光強さを測定することによって作製された
。これらの測定の結果は次の表■に示した。

表 ■ 遊離キレート（ｎｍｏ　ｌ　／Ｌ　）　　　螢光の強さ
０　　　　　　　３７．０ ８．３３　　　　　　　４３．８ １６．６７　　　　　　　５１．３ ２５．００　　　　　　　５８．５ ３３．３３　　　　　　　６５．２ これらのデータ？プロットし、最小自乗法（Ｌｅａｓｔ
　５ｑｕａｒｅｓ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）　Ｋ　、Ｊ：
　’）式：螢光の強さ＝３６．９４＋０．８５３２Ｘ濃
度（ｎｒｒｏ　ｌ　／ｌ　）によって描かれる線に適合
させる。式は、表■における強さの数値の濃度への換算
が可能である。たとえばゲルフラタション１は、ｐ８Ｒ
３２２フラグメントに結合した標識乞４７．７−３６．
９４７０．８５３２＝　１２．６　ｎｍｏ　ｌ／ｌを含
有する。各ゲル抽出物の体積は０．００１５ｔであった
。従って、７ラクシヨン１中のｐＢＲ３２２に結合した
標識ノＪｌｔＸ、１２．６ｎｍＯ１／１ＸＯ１００１５
ｔ＝Ｏ，ＯＬ８９ｎｍｏ　＋　’！　ｒ、ニー＆Ｓ　ｌ
　８．９９ｍｏ　ｌ　　テある。各ケル７２クシヨンの
量は、上記の表■の第３欄に記載されている。

ゲルに適用されろ標識制限フラグメントの質ｔは２０．
７Ｌ１ｇであった。電気泳動より以前の標識制限フラグ
メントの特性決定は、ＤＮＡのこのｆＸ量が螢光標識１
３０ｐｍｏｆを担持していたことを示した。表１に２け
ろ第３（銅を要約すれは、標識７４．８ｐｍｏｆが抽出
操作によりゲルから回収されたことを示す。従って、ゲ
ルから回収される標識（およびＤＮＡ　）の、ｏ−セン
トは、１００Ｘ７４．８ｐｍｏｌ／Ｌ３０ｐｍｏｌ＝５
８％である。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた標識ＤＮＡフ
ラグメントの安定度 Ｔｔ）標識二本鎖ＤＮＡ７ラグメントを、接合錯体の光
全性が電場中で高め定温夏ｖこ？いて維持できるか否か
乞決定するため、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動後呈温でのゲル
の賭視により、共役ＤＮＡの特徴的な緑の発光の可視化
可能であった。ＤＮＡバンドをゲルからさぎに記載した
と同じ方法で抽出し、キレート含量は時間分解螢光分析
によって定量した。ゲルから回収されｒｓ全螢光＋ｓキ
Ｖ−ドア５ｐｍｏｌ　（ＤＮＡ　　１２ｕｇ　）に相当
し、ゲルに適用した量の５８噂を表わす。

遊離ＤＴＰＡＡ／ＰＡＳキレートの量子効率に対する温
度の効果を別の実験で調べた。ＤＴＰＡＡ／ＰＡＳ／Ｔ
ｂを１合前の８％ポリアクリルアミドゲルに塀え５１ｃ
ｍの標準キュベツト中で架橋結合を行なわせた。２５℃
および６０℃に調温したキュベツトで得られ′ｒＳ螢元
螢光クトルは、遊離キレートの螢光強さの２０％が温度
の上昇で保持され、螢光は検出可能に残存していたこと
を示した。

「″ごア 代　理　人　弁理士　矢　野　敏　雄ｉ′−，、’：）
、−１１・十

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ゲル電気泳動系中で分離した螢光標識ヌクレオチド
   モノマー、オリゴマーまたはポリマーの時間分解型螢光
   分析検出法において、螢光標識ヌクレオチドとしてラン
   タニドキレート標識共有結合ヌクレオチド接合体を使用
   することを特徴とするランタニド標識ヌクレオチドの時
   間分解型螢光分析検出法。 ２、ヌクレオチド接合体が式： ＮｕＣ−Ｎ＾＊−Ｙ−Ｚ 〔式中ＮｕＣはヌクレオチドモノマー、オリゴマーまた
   はポリマーであり、Ｎ＾＊はヌクレオチドに固有の、ま
   たは接合に先立ち標識として導入された外因性のアミン
   窒素であり、Ｙはランタニドをキレート結合しうるキレ
   ート形成基であり、Ｚはエネルギー伝達成分である〕を
   有し、かつ該ヌクレオチド接合体にキレート化されるラ
   ンタニドがテルビウム、サマリウム、ユーロピウム、ジ
   スプロジウムまたはネオジムからなる群から選択される
   、請求項１記載の方法。 ３、ヌクレオチド接合体が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有しかつ、これにキレート結合したランタニドがテル
   ビウムである、請求項２記載の方法。 ４、ゲル電気泳動系がポリアクリルアミドゲル系である
   、請求項１記載の方法。 ５、ゲル電気泳動系がポリアクリルアミドゲル系である
   、請求項２記載の方法。 ６、ゲル電気泳動系がポリアクリルアミドゲル系である
   、請求項３記載の方法。 ７、標識ヌクレオチドの検出がＤＮＡまたはＲＮＡ配列
   決定のためである、請求項１記載の方法。 ８、標識ヌクレオチドの検出がＤＮＡまたはＲＮＡ配列
   決定のためである、請求項２記載の方法。 ９、標識ヌクレオチドの検出がＤＮＡまたはＲＮＡ配列
   決定のためである、請求項３記載の方法。 １０、標識ヌクレオチドの検出がゲル電気泳動系中のオ
   ン・ライン検出による、請求項１記載の方法。 １１、標識ヌクレオチドの検出がゲル電気泳動系中のオ
   ン・ライン検出による、請求項２記載の方法。 １２、標識ヌクレオチドの検出がゲル電気泳動系中のオ
   ン・ライン検出による、請求項３記載の方法。 １３、ゲル電気泳動系中で螢光標識ヌクレオチドモノマ
   ー、オリゴマーまたはポリマーを分離する方法において
   、螢光標識ヌクレオチドとしてランタニドキレート標識
   共有結合ヌクレオチド接合体を使用することを特徴とす
   る螢光標識ヌクレオチドを分離する方法。 １４、ヌクレオチド接合体が式： Ｎｕｃ−Ｎ＾＊−Ｙ−Ｚ 〔式中Ｎｕｃはヌクレオチドモノマー、オリゴマーまた
   はポリマーであり、Ｎ＾＊はヌクレオチドに固有の、ま
   たは接合に先立ち標識として導入された、外因性のアミ
   ンの窒素であり、Ｙはランタニドをキレート結合しうる
   キレート形成基であり、Ｚはエネルギー伝達成分である
   〕を有し、かつ該ヌクレオチド接合体にキレート化され
   るランタニドが、テルビウム、サマリウム、ユウロビウ
   ム、ジスプロシウムまたはネオジムからなる群から選択
   されることを特徴とする請求項１３記載の方法。 １５、ヌクレオチド接合体が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、かつそれにキレート結合されるランタニドがテ
   ルビウムである、請求項１４記載の方法。 １６、ゲル電気泳動系がポリアクリルアミドゲル系であ
   る、請求項１３記載の方法。 １７、ゲル電気泳動系がポリアクリルアミドゲル系であ
   る、請求項１４記載の方法。 １８、ゲル電気泳動系がポリアクリルアミドゲル系であ
   る、請求項１５記載の方法。 １９、ヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のた
   めに分離する、請求項１３記載の方法。 ２０、ヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のた
   めに分離する、請求項１４記載の方法。 ２１、ヌクレオチドをＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定のた
   めに分離する、請求項１５記載の方法。