JPS6239598A - 標識付けした核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、核酸の、同位体（アイソトープ）を用いない
標識付けに関する。

従来の技術 核酸の標識付けは医学および研究の両方における多くの
分析目的のために必須である。例えば、このような標識
付けした分子は、複雑な細菌群の中で、特殊な細菌の遺
伝子の単一コピー（ｃｏｐｙ）の存在を検出するために
使用することができ、こうして感染の迅速な診断を行な
うことができる。伝統的に、こうした標識付けは、放射
性をもつように傳識付けられたヌクレオチドを、ＤＮＡ
Ｊリメラーゼを用いて核酸内に、酵素により組み入れる
ことを包含していた。

同位体を用いない核酸の標識付は法も存在する。

このような方法の一つは、核酸内へのビオチンで標識付
けたヌクレオチドの組み入れを要する。

〔ランジャー（Ｌａｎｇｅｒ）外、プロシーデインダス
・オブーナショナル・アカデミ−・オプｅサイエンシー
ズ（ＰｒＯｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ＮａｔｉＯｎａｌ
　Ａｃａ、ｄｅｍｙＯｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）＋　　７
８．６６３３．　１９８１）。この標識付けした核酸の
、フィルターに結合された標的ＤＮＡへのハイブリッド
形成（交ＩＡ）後に、これを比色法による検定により検
出することができる（１９８３年９月２日にランデス（
Ｌａｎｄｅｓ）が出願し、本出願人と同一人に譲渡され
た、ＵＳＳＮＳＳＮ第５２５芳４４ アヒシンとの複合体の形成；下記酵素がアビジン更複合
するための、ビオチンで標識付けした酵素の添加；およ
び比色法基質の添加による酵素の検゛出；を含む。

本発明は、アクリジンエステル類または発光ランタニド
で標識付けしたポリヌクレオチドを提供する。これらの
ｑ識付けしたポリヌクレオチドは、相同のポリヌクレオ
チド配列の直接検定の手段を与える。

アクリジンエステル類〔キャンプベル（Ｃ姐ｐｂｅｌｌ
）外、ヨーロッパ特許第００８２６３６号〕または発光
ランタニド〔ヘミン（Ｈｅｍｍｉｌａ）　、ヨーロッパ
特許第００６４４８４号〕、最も好ましくはユーロピウ
ム、テルビウムまたはサマリウムをポリヌクレオチドに
くみ入れることにより同位体を用いないで標識づけられ
たポリヌクレオチドを合成する方法は、一般に、官能化
試薬のこのポリヌクレオチト９への組み入れ、およびこ
れに続くアクリジンエステル、発光ランタニド、または
発光ラン。

タニドキレートのこれらの試薬への結合を包含する。こ
れらの官能化試薬は、化学的または酵素的て組み入れる
ことができる。一つの具体化では、シトシンの同族体が
ポリヌクレオチド９の合成の間に化学的に付加され、別
の具体化では、単一または二重鎖の鋳型（テンプレート
）から合成されるポリヌクレオチド内に、例えば三リン
酸化塩基の同族体を組み入れるのにＤ　Ｎ　Ａ　＄　＋
）メラーゼが使用される。このような三リン酸化塩基の
例を下に示す： ○ＨＸ 式中、ＸはＨまたはＯＨであり、ｚくｎ＜−ｔｏである
。もう一つの方法には、先に標識付けたヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドを、例えばカルボジイミド結合（
ｃｏｕｐｌ工ｎｇ）によシ存在するポリヌクレオチドへ
共有結合させる方法が包含される。

標識付けしたポリヌクレオチドは、酵素または酵素基質
の添加を必要とすることなく、ニトロセルロースのよう
な適当な媒体上のＲＮＡまたはＤＮＡの相同配列の直接
検出のための標準法に使用することができる。

本発明のその他の特徴および利点は、以下に示すその好
ましい具体化の説明および特許請求の範囲から明らかで
あろう。

構造 「ポリヌクレオチド」という語は、２またはそれ以上の
ヌクレオチビ塩基対を含有するヌクレオチド配列を指す
。これらは、鋳型なしで化学的に、または単一または二
重鎖のボ゛リヌクレオチド鋳型を用いて酵素により合成
することができ、あるいは、ゲノム、プラスミＬ”　（
ｐｌａｓｍｉＪ　ウィルス、またはその他のベクター中
に遺伝子または遺伝子の部分として存在する天然配列か
ら誘導することができる。本発明に従えば、ポリヌクレ
オチドは１またはそれ以上のアクリジンエステル基また
は発光ランタニド９を用いて標識づけられる。

アクリジンエステル アクリジンエステルおよびこれらの合成は、キャンプベ
ル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）外（前述）、マクカプラ（Ｍｃ
Ｃａｐｒａ）　外の英国特許第１，４６１，８７７号お
よびシーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ）の米国特許第３５３９
５７４号に記載されておシ、これらは両者ともここで参
照されている。

本発明に有用なアクリジンエステルは、一般式：（式中
、Ｔは、サルファイド基、アミド基まだは１またはそれ
以上のヒドロキシル基、を含有シテいてもよい飽和また
は不飽和脂肪族鎖である）を有する。Ｔの長さは、相同
ポリヌクレオチドのハイブリット９形成を有意には妨げ
ないようなものでなくてはならない。好ましくは、Ｔの
脂肪族鎖中の炭素原子の数は１−１０であシ、最も好ま
しくは、２から５までである。Ａは離脱基である。好ま
しくは、Ａは： である。

発光ランタニド 発光ランタニドは一般に、キレートとして使用される。

ランタニビキレートの例は、ヘミ２（ＨｅｍｍｉｌａＸ
前述）、ヒント、シュア（Ｈｉｎｄｓｈｕｒｅ）外のヨ
ーロッパ特許第００６８８７５号、ソイニ（Ｓｏｉｎｉ
）　　外の米国特許ｍ４３７４ｔ２ｏ号；フランク（Ｆ
ｒａｎｋ）　外の米国特許第４．２８３３８２号；フラ
ンク（１’ｒａｎｋ）外の米国特許第４２５Ｑ３１３号
；ウイーダー（Ｗｉｅｄｅｒ）外の米国特許第４，３５
２，７５１号；ウイーダ−（ｗｉａｅｒ）外の米国特許
第４，４３２，９０７号；およびソイニ（Ｓｏｉｎｉ）
　　外のヨーロッパ特許第０１０３５５８号；に示され
ており、上記のものはここで参照されている。本発明で
使用されるキレート化剤は、次の性質を有していなくて
はならない：（ａ）分子の一端は発光ランタニドをキレ
ート化することができなくてはならず、そして（ｂ）分
子の他端は、ポリヌクレオチド配列上のアミン、アミノ
プロピルまたは他の反応基と共有結合することができる
基を有していなくてはならない。一般に、これらのキレ
ート化剤は、下記（Ａ）、　（Ｂ）の２構造の１つを有
している； （Ａ） 〔式中、２は、 （ａ）　　Ｎ＝Ｃ＝８　。

（Ｃ）　　”３１ （ここで１＜ｎ＜１０．） （ここで１≦ｎ＜１０．） または （ｇＪ−ＣＨ−Ｃ−ＣＨ２−Ｗ　　（ここでＷはハロゲ
ン、好ましくは臭素である）；αＤ であり、Ｙはポリアミノカルボキシレート配位子、好ま
しくは、 または （ここでｎ、ｍおよびｐの各々は別個に、２−４である
） である〕；または （Ｂ）　　構造 ここで２≦ｎ（１０そして２≦ｒｎ　＜　４のＤＴＰＡ
Ａｏ （勾に示されたキレート化剤は、一般的にヘミラ（Ｈｅ
＋ｎｍ１ｌａ）外、〔アナリテイカル・バイオケミス　
ト　リ　イ　（Ａｍａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｎｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）　　ｌ　　３７　　：３３５．１９８４
）に記載されているように、市販品として入手できる化
合物から合成することができる。ＤＴＰＡＡ　　（上記
Ｂに示されている）の合成は、エムΦビー・ベイリイ（
Ｍ、Ｐ、Ｂａ１ｌｅＹ）　　外、アナリスト（Ａｎａｌ
ｙｓｔ）、　１０９．１４４９．１９８４に示されてい
る。ポリヌクレオチドヲ、Ｚが上記式〇〇に示された通
りであるキレートで標識付けしようとするときは、この
ポリヌクレオチドは、キレートが結合できるようにする
ために、まずアミノチオランと反応させねばならない。

合成 官能基の導入 標識付けされるべきポリヌクレオチドは、最初に、アク
リジンエステルと反応することができるアミノプロピル
または第一アミン基のような反応基、または発光ランタ
ニドをキレート化することができる成分１またはそれ以
上の導入により官能化しなくてはならない。このような
官能基は、次にポリヌクレオチドの化学的または酵素的
合成に使用されるヌクレオチドに結合させることができ
る。別法として、官能基を、存在するポリヌクレオチド
に化学的に結合させることもできる。

モツク（Ｍ○ｃｋ）により記載された（１９８５年５月
１５日に出願され、本出願人と同一人に■渡された米国
特許出願筒７３４，３２３号、これによって参照されて
いる）もののような塩基同族体を、通常の塩基の代りに
、ポリヌクレオチドの合成の間に組み入れることができ
る。これらは、分子の末端に組み入れられ、次に続く塩
基を必要に応じて加え得るものであり、そしてアクリジ
ンエステルまたは発光ランタニドキレート化化合物を結
合させることのできるアミノプロピル基、または発光ラ
ンタニドを直接キレート化するのに使用することができ
る基を導入する役目を果す。このような同族体の一般構
造を下に示す： 式中、Ｄはあらゆる保護基、好ましくは４４７−ジメト
キントリチル基であり、Ｇは他のヌクレオチドへの化学
的結合を可能にする基、例えば：であり、Ｊはアクリジ
ンエステルまたはランタニドキレート化化合物と反応す
ることができるか、または発光ランタニド９をキレート
化することのできる基である。Ｊの例は： （ａ）　　−ＨＮ（ＣＨ）　ＮＨＣＯＣＦ’　　　ここ
で１≦ｎ＜１０゜２　ｎ　　　　　　３′ および（ｃ） である。

ホＩＪヌクレオチビを官能化するには、後の２つの例（
ｂおよびＣ）を、合成ポリヌクレオチドへの組み入れ後
に塩基によって加水分解しなくてはならない。このよう
な反応は、結果的に、構造二〇 ０−Ｐ−０ （ここで、ｌおよびｍばＯまたは正の整敬であり、ｋば ＯＨＯＨ または の、ｄ　＋）ヌクレオチドを形成することになる。発光
ランタニドは直接、これらの後者の化合物にキレート化
されることができる。

このような化学的に合成された官能化ｄ　ＩＪヌクレオ
チビの例は、自動化された亜リン酸塩合成によシ、合成
３３塩基対ポリヌクレオチドの両末端にＣ−４アミノプ
ロピル−変形されたシチジンが組み入れられているもの
である。このようなポリヌクレオチド９は、次式： ％式％ の構造を有している。

酵素によるポリヌクレオチド合成 下に示したもののような、反応性またはアミン官能性を
有する変形されたヌクレオチ）”　［ｏ１族体を、単一
または二重鎖の鋳型を利用して、ポリヌクレオチド標識
付けの間に、通常の三すン酸化ヌクンオチド塩基の代り
に組み入れることができる。このような三すン酸化ヌク
レオチビの例は：（ここでＸはＨ（ＤＮＡ）まだは０Ｈ
（ＲＮＡ）であり、２≦ｎ≦１０） である。

このような酵素法の例には、ＤＮＡアーゼＩを加えるか
または加えないで、ＤＮＡポリメラーゼを用いる二重鎖
ＤＮＡのニックトランスレーション（ｎｉｃｋ　ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉＯｎ）　；　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ（
フレノウ断片）を用いる二重鎖領域からの単一鎖ＤＮＡ
のゾライマ−（ｐｒｉｍｅｒ）伸長；ＤＮＡの末端デオ
キシトランスフェラーゼテーリング（ｔａｎｉｎｇ）；
または糖成分上に２′および３′ヒドロキシル基を有す
る同族体および二重鎖領域を滲なう単一鎖ＤＮＡ祷型に
ついてのＲＮＡポリメラーゼの使用〔マニアテイス（Ｍ
ａｎｉａｔ、ｉｓ）外、１９８２モレキユラー・クロー
ニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｕｎｎｉｎｇ）　、ア・
ラボラトリイ・マニ二アル　゛（Ａ　Ｌａｂｎｒａｔｎ
ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング＋１　ハ
ーバ−研究所（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒＬ
ａｂｎｒａｔｎｒｙ）　、　ニュー　ヨーク州、コール
）”＠、Ｘプリン／拳ハーバー２私書箱１００）；が含
まれる。

存在するポリヌクレオチドの官能化 ポリヌクレオチドは、例えば、ＢＳＰＳＥ　　（ランデ
ス（Ｌａｎｄｅｓ　）　＊　前述〕を用いる、主にアデ
ニンおよびシトシン残基でのアルキル化によって化学的
に変形されることができる。別法として、先に標識付け
したポリヌクレオチドまたはポリリジンは、例えば、カ
ルボジイミド結合〔・・ロラン（Ｈａｌｌｎｒａｎ）外
、ジャーナル・オメ・イムノロシイ（Ｊｒ＋ｕｒｎａｌ
　ｎｆ　工ｍｍｕｎｎｌｏｇｙ）、　９６　：　３７３
゜１９６６）　　を用いて、第二のポリヌクレオチドに
共有結合により結合させることができる。ポリリジンは
また、ここに参照されているワード’（Ｗａｒｄ）のヨ
ーロッパ特許第００６３８７９号によシ記載されている
ように標識付けの前にｇ　ＩＪヌクレオチビの５１末端
に結合させることもできる。

アクリジンエステルの付加 １またはそれ以上の反応性第一アミン基を用いて官能化
されたポリヌクレオチド９は、下記の実施例に示すよう
に、アクリジンエステルで容易に標識付けされる： 実施例 ポリヌクレオチドの標識付けの前に、アクリジンエステ
ルのは下に示すようにして合成されるニアクリジン−９
−カルボ／ｒ１！（８７０ｒｎ９）を塩化チオニル（ｌ
　ＯｍＪ）に加え、混合物を３時間油浴中で還流させる
。この反応混合物を回転蒸発器上で真空蒸発させ、転像
残留物を６０℃よシ低温に加熱しながら無水ピリジン（
５０ｍ／）中に再溶解させる。この溶液を水浴中でｌ”
Ｌぼ２０℃に冷却した。ｐ−ヒドロキシフェニルプロピ
オン酸ｎ−ヒドロキシこはく酸イミビエステル（１ｇ）
を無水ピリジン（ｌＯ＋＋＋／）に溶解させ、かくはん
しながら、上記のアクリジン−９カルボン酸塩化物−ピ
リジン溶液に加える。この反応混合物を１５−３０℃で
ほぼ３０分間かくはんした後、かくはんしながら氷水（
２５０ｒｄ”）中に注ぐ。この混合物を分液ロート中に
移して酢酸エチル（２５０ｘｔ）で抽出する。有機相を
分離し、無水硫酸す）　ＩＪウム上で乾燥させ、濾過し
て、真空蒸発させる。残留物を無水トルエン（５０ｒ）
）から３回蒸発させて、無水ジメトキシエタン（５ＯＷ
ｌ）に再溶解させる。こうして得られる溶液を、光線を
通さない容器で約１５時間１５−３０℃に置く。この保
温中に形成されるすべての沈殿を濾去し、溶液をシリカ
ゲルカラム（３００グラム）にかけ、溶離溶媒として酢
酸エチルおよびヘキサン（２：１）の溶液を用いてフラ
ッシュクロマトグラフィー〔ダブリュー・シー・ステイ
ル（Ｗ、Ｃ，５ｔｉｌｌ）外、ゼネラルφオプ・オーガ
ニック・ケミストリイ（Ｇｅｎｅｒａｌ　ｎｆ　Ｏｒｇ
ａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９７８）　。

第４３巻、２９２３）によシ精製する。純粋な分画を合
わせて、テフロン（Ｔｓｆｌｎｎ）　４７　ｔｒｙｓ　
０．４５μｍフィルターを通して清適し、真空蒸発させ
る。

収率はほぼ３６％である。これを無水クロロホルム（２
５＋、ｘｌ　）に再溶解させ、混合物にフルオルスルホ
ン酸メチル（１，１ｍ１）を加えて、１５−３０℃で約
２０時間かくはんする。形成される沈殿を濾去し、無水
トルエンで３回すしてジメトキシエタンで２回洗浄する
。乾燥させた結晶を乾燥させ、−２０℃で光から保護し
て貯蔵する。最終的な収量は、純粋なアクリジンエステ
ル１２３　）１ぼ５５６■である。

官能化ＤＮＡ（構造（２２に示されたように両端を第一
アミン基で官能化されだ３３塩基対の、ｌ　ＩＪヌクレ
オチビ）１００μ９を、水（１９０μｌ）、ＮａＣ１（
５Ｍ溶液ｔｏμｌ）およびＮａＨＣＯ３（５チ溶液２５
μｌ）と混合する。０，１０および２０分で、アクリジ
ンエステル（２り（ンメチルホルムアミビ中の６０μＭ
原液８３μｌ）を加える。

さらに１０分後に、Ｎａ（Ｊ　（２００ｍＭ）を含有す
るクエン酸塩（１００ｍＭ溶液５００Ａ７．ｐＨ５，５
）を加える。こうして得られる標識付けしたポリヌクレ
オチドを、Ｎａ（Ｊ（２００ｍＭ）を廿有するクエン酸
塩（ｌ　ＯＯｍＭ、　　ｐＥ（５）で平衡させたセファ
デクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　２５カラム上で精製し
た。

１　　　　　　　　　　ｕ ポリヌクレオチド鎖 のポリヌクレオチドゝが得られる。

■ま光はそれ以上のアミノプロピル基で官能化されたポ
リヌクレオチド〔モツク（Ｍｎｃｋ）　外、前述、参照
〕を、発光ランタニドがこのポリヌクレオチげに結合す
ることができるように、発光ランタニドヤレートと混合
する。例えば、ポリヌクレオチド５０μ９（構造器に示
されている）を、トリエチルアミン（５μ９）および式
： のユーロピウムキレート（３１５μ９．硼酸ナトリウム
緩衝液０．２　Ｍ、　　ｐ）１９．５に溶解させたもの
）と混合して、１５°−３０℃に３時間放置する。

この標識付けしたポリヌクレオチドを、硼酸ナトリウム
（０，１Ｍ、ｐＨ８，０）で平衡させたセファデクス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　　Ｇ　５０−８０カラム上で精製
し、必要があれば、移動相として酢酸トリエチルアンモ
ニウム（０，１Ｍ、　　ｐＨ７，０）　　およびアセト
ニトリルの混合物を用いる逆相ＨＰＬＣによシ゛さらに
精製する。この方法によれば、構造：■ のポリヌクレオチドが形成される。別の出発キレートを
使用すると、上記の方法で構造：Ｑ−ＮＨ−［（−Ｌ または　Ｑ−ＮＨ−Ｃ−Ｌ ＮＨ （ここでｌ≦ｎ＜ｉ　ｏ　） または　Ｑ、−ＮＨ−Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｌ（ここでｌ
≦ｎ≦１０） またば　Ｑ−１（Ｈ−ＣＨ２ＴＣＨ２−Ｌ（ここでＱは
ポリヌクレオチドであり、Ｌば である） （ここでｌ≦ｎ≦１０） ＣＨ−Ｃｏ　　− （Ｅ　ｕ３　＋　）　　　ＯＨ 罰 ■ または ２〈尤＜１０．） のポリヌクレオチドが形成されることになるであろう。

検出 標的ホＩＪヌクレオチドへの標識付けされたポリヌクレ
オチビプローブのハイブリット９形成は、ポール（Ｐａ
ｌｌ）ナイロンフィルターまたはそれらの同等物に関す
る標準方法〔マニアテイス（Ｍａｎｉａ−ｔｉｓ）外、
前述〕Ｋより実施した。結合された発光ランタニドで標
識付けしたポリヌクレオチドは、ＬＫＢ蛍光計による時
間分割蛍光を使用して測定“°これは試料中の標的ｙＮ
　＋）ヌクレオチドの尺つる０シグナルの強化は、標識
付けしたフィーにＬＫＢ”強化１溶液を加えることによ
つ１することができる。

アクリジンエステル １されるべき試料のホＩＪヌクレオチドは、標二よって
普通にニトロセルロースフィルターボさせられた後、次
のようにハイブリッド形成させられる： これらのフィルターは、フィルタ−１立方センチメート
ルあたり１００μｌの予備ハイブリッド緩衝液を用いて
、４８℃で２時間予備ノ・イズリツ１した後、４８℃の
アクリジンエステルで標識付けしたオリゴマープローブ
（１ｄあたり５０℃ｇ）を含む緩衝液中で、遮断剤とし
てメチル硫酸メトキシフェナジンを用いるかまたは用い
ないで、２時間ハイブリッド形成させる。この予備ハイ
ブリッドおよびハイブリッド形成緩衝液は、塩化テトラ
メチルアンモニウム（０，９Ｍ）、クエン酸ナトリウム
（５０ｍＭ）、デフ　ハーノ（Ｄｅｎｈａｒ　ｔｓ　）
（５Ｘ）、５ＤＳ（Ｑ、１％）、ピロリン酸ナトリウム
（０，１％　）、および大腸菌（Ｅ、ｃｎｌｌ）　ｔＲ
ＮＡ（５０η／罰原液Ｌ　ｍ、ｌあたり２μｌ）より成
っている。次にフィルターを１５−３０℃で、クエン酸
ナトリウム（ｌ　ＯＯｒｎ！Ｊ、　　ｐＨ６，５）を含
有する塩化テトラメチルアンモニウム（０，９Ｍ　’）
中で４回５分間洗浄する。次に、ポリヌクレオチドが結
合されている領域を切り取って、１２Ｘ４７＋＋Ｌ！ｎ
プリスチレン管に入れた酢酸ナトリウム（１０ｍＭ。

ｐＨ４，７５のもの５０−）で処理する。試料を、注入
試薬として過酸化水素（０，１％　）を含有するＮａＯ
Ｈ（０，ｌ　Ｍのもの１０（ｉｔ／）を用イーＣ、ベル
トールド（Ｂｅｒｔｂｎｌｄ）　９５００　Ｔ光子計数
装置で、化学発光ングナルについて測定する（ピーク領
域積分型）。得られる形を、ポリヌクレオチドを含まな
かったフィルターから得られたものと比較する。遮断剤
試薬は、非特異結合を消去する。

その他の具体化は前記の特許請求の範囲内にある。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中にアクリ
   ジンエステルまたは発光ランタニドを組み入れることよ
   り成る、アイソトープを用いないで標識付けしたヌクレ
   オチドまたはポリヌクレオチドを合成する方法。
2. （２）アクリジンエステルが構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔは、飽和脂肪族鎖、不飽和脂肪族鎖、サルフ
   ァイト基を含有する脂肪族鎖、アミド基を含有する脂肪
   族鎖、２つのヒドロキシル基を含有する脂肪族鎖から選
   択され、Ａは離脱基である） を有する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）発光ランタニドが、式（１）または（２）：▲数
   式、化学式、表等があります▼（１） 〔式中、Ｚは、 （ａ）Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、 （ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼（ここでＷは
   ハロゲンである）、 （ｃ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｄ）Ｎ＿３ （ｅ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＶはアルキル基またはフェニル基であり、１≦
   ｎ≦１０） （ｆ）▲数式、化学式、表等があります▼（ここで１≦
   ｎ≦１０）および （ｇ）▲数式、化学式、表等があります▼（ここで１≦
   ｎ≦１０）； から選択され、そしてＹは （ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼ および（ｂ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでｎ、ｍおよびｐは各々別個に２−４である） から選択される〕； ▲数式、化学式、表等があります▼（２） （ここで２≦ｎ≦１０および２≦ｍ≦４） の化合物でキレート化されているものである、特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）Ａ成分が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の構造を有している、特許請求の範囲第２項に記載の方
   法。
5. （５）アクリジンエステルまたは発光ランタニドで標識
   付けされた第一ヌクレオチドまたは第一ポリヌクレオチ
   ド。
6. （６）ランタニドがユーロピウム、テルビウムまたはサ
   マリウムである、特許請求の範囲第５項に記載の第一ヌ
   クレオチドまたは第一ポリヌクレオチド。
7. （７）ユーロピウムをキレート化することができる基で
   標識付けされたヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
8. （８）キレート団が、 ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ または ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでｎ、ｍおよびｐは各々別個に２−４である） または ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで２≦ｍ≦４） である特許請求の範囲第７項に記載のヌクレオチドまた
   はポリヌクレオチド。
9. （９）アクリジンエステルが、第一ヌクレオチドまたは
   第一ポリヌクレオチド上のアミン基に化学的に結合して
   いる、特許請求の範囲第６項に記載の上記第一ヌクレオ
   チドまたは第一ポリヌクレオチド。
10. （１０）下記アミン基を包含する第二ヌクレオチドまた
    は第二ポリヌクレオチドを下記第一ヌクレオチドまたは
    第一ポリヌクレオチドに化学的にまたは酵素を用いて結
    合させることにより、アミン基が第一ヌクレオチドまた
    は第一ポリヌクレオチドに導入されたものである、特許
    請求の範囲第９項に記載の第一ヌクレオチドまたは第一
    ポリヌクレオチド。
11. （１１）ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがユーロ
    ピウム、テルビウムまたはサマリウムにキレート化され
    ている、特許請求の範囲第８項に記載のヌクレオチドま
    たはポリヌクレオチド。
12. （１２）ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを化学的
    に変形し、アクリジンエステルまたは発光ランタニドを
    この変形されたヌクレオチドまたは変形ポリヌクレオチ
    ドに結合させることより成る、特許請求の範囲第１項に
    記載の方法。
13. （１３）上記変形が、上記ヌクレオチドまたはポリヌク
    レオチドの塩基のアルキル化である、特許請求の範囲第
    １２項に記載の方法。