JPH02174673A - アスペルギルス株構築用手段としての遺伝子置換 - Google Patents
アスペルギルス株構築用手段としての遺伝子置換Info
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- JPH02174673A JPH02174673A JP1211210A JP21121089A JPH02174673A JP H02174673 A JPH02174673 A JP H02174673A JP 1211210 A JP1211210 A JP 1211210A JP 21121089 A JP21121089 A JP 21121089A JP H02174673 A JPH02174673 A JP H02174673A
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は糸状菌形質転換体を用いた形質転換および表現
に関するものである。
に関するものである。
（従来の技術）
表現可能なりＮＡで生育性の細胞を形質転換する可能性
は新規かつ改良された生成物に対し多くの方法を切開い
た。この可能性は哺乳動物のタンパクの大多数を生成す
ること可能にしたが、これらタンパクはこの方法によら
なければ容易に得ることはできなかった。他の例、特に
血液タンパクにおいて、このようなタンパクの製造に天
然資源を用いる必要性が、−船釣に知られた肝炎および
エイズの問題のために増々許容し難くなってきた。
は新規かつ改良された生成物に対し多くの方法を切開い
た。この可能性は哺乳動物のタンパクの大多数を生成す
ること可能にしたが、これらタンパクはこの方法によら
なければ容易に得ることはできなかった。他の例、特に
血液タンパクにおいて、このようなタンパクの製造に天
然資源を用いる必要性が、−船釣に知られた肝炎および
エイズの問題のために増々許容し難くなってきた。
医薬品として用いる哺乳類タンパクに加えて、多くの工
業的方法での用途が見出されている他の多くのタンパク
、特に酵素がある。キモシンはチーズの生産において使
用でき、リパーゼは特にエステル交換反応における利用
が見出されており、プロテアーゼは特に食品での利用が
あり、また医学的用途なども見出されている。
業的方法での用途が見出されている他の多くのタンパク
、特に酵素がある。キモシンはチーズの生産において使
用でき、リパーゼは特にエステル交換反応における利用
が見出されており、プロテアーゼは特に食品での利用が
あり、また医学的用途なども見出されている。
これらの様々な製品の生産においては、該製品製造の経
済性が特に興味の対象となる。関連する第１の局面は所
定の製品の表現の程度である。第２の重要な点は特定の
宿主内での該生成物の安定性である。第３の関心事は、
特に該生成物が医薬または食品添加物とされるような場
合には、該生成物の単離および精製である。
済性が特に興味の対象となる。関連する第１の局面は所
定の製品の表現の程度である。第２の重要な点は特定の
宿主内での該生成物の安定性である。第３の関心事は、
特に該生成物が医薬または食品添加物とされるような場
合には、該生成物の単離および精製である。
このようなタンパク製品を生産する場合、機能性のシグ
ナル配列に依存して、該製品は細胞質内に保持されるか
、あるいは栄養培地内に分泌される。異る宿主は別々の
分泌生成物並びに異る分泌率を有する。ここで分泌は誘
発性でも非−誘発性でも良い。多くの状況下では、分泌
は多くの利点をもたらす。というのはこの場合該生成物
は実質上細胞内タンパクおよび細胞デブリを含まない栄
養培地から単離できるからである。かくして、分離は単
に該宿主によって分泌された他のタンパクおよび細胞の
溶解または分解に起因する少量のタンパクについて行え
ばよい。従って、単離並びに精製の容易な条件下で対象
とする生成物を効率良く表現かつ分泌する系を得ること
が実質上の興味の対象となる。
ナル配列に依存して、該製品は細胞質内に保持されるか
、あるいは栄養培地内に分泌される。異る宿主は別々の
分泌生成物並びに異る分泌率を有する。ここで分泌は誘
発性でも非−誘発性でも良い。多くの状況下では、分泌
は多くの利点をもたらす。というのはこの場合該生成物
は実質上細胞内タンパクおよび細胞デブリを含まない栄
養培地から単離できるからである。かくして、分離は単
に該宿主によって分泌された他のタンパクおよび細胞の
溶解または分解に起因する少量のタンパクについて行え
ばよい。従って、単離並びに精製の容易な条件下で対象
とする生成物を効率良く表現かつ分泌する系を得ること
が実質上の興味の対象となる。
糸状菌の形質転換については数人の著者により記載され
ている。例えば、チルバーン（Ｔｉ １ｂｕｒｎ）等、
ジータ（Ｇｅｎｅ） 、ｌ ９８３．２６．２ｏ５−２
２１；ジョンおよびペパーデイ（Ｊｏｈｎ ａｎｄ Ｐ
ｅｂｅｒｄｙ） 、エンザイム マイクロバイオロジー
＆チク／ロジー（Ｂｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃ
ｈｎｏｌ、） 、１９８４、下、３８６−３８９．バラ
ンス （口ａｌｌａｎｃｅ） ＆ターナー（Ｔｕｒｎｅ
ｒ） 、Ｇｅｎｅ、 ｌ ９８５．３６．３２１３３
１；ファンハルチングスベルッ（Ｖａｍ Ｈａｒｔｉｎ
ｇｓｖｅｌｄｔ）等、モレキュラージーヌ＆ジェネティ
ツクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、） 、ｌ ９８
７．２０６．７１−７５；グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等
、カレントジェネティックス（Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅｔ
、）、１９８７．１１．４９９−５０３；ＥＰ−Δ−０
１３４４３８および０２３８０２３並びに国際特許出願
（ＰＣＴ）ＷＯ８６１０６０９７゜ 菌種、例えばアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇ１
１１ｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス オリザエ（
Ａｓｐｅｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が酵素、例えば食
品工業で用いる酵素の工業的生産において広く用いられ
ている（例えば、ストリー力−） （Ｓｔｒｉｊｋａ
ｒｔ）、アントニーファンリーベンノエク（人口ｔｏ旧
ｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈａｃｋ）、１９８７．５
３．３５７−３６２参照）。
ている。例えば、チルバーン（Ｔｉ １ｂｕｒｎ）等、
ジータ（Ｇｅｎｅ） 、ｌ ９８３．２６．２ｏ５−２
２１；ジョンおよびペパーデイ（Ｊｏｈｎ ａｎｄ Ｐ
ｅｂｅｒｄｙ） 、エンザイム マイクロバイオロジー
＆チク／ロジー（Ｂｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃ
ｈｎｏｌ、） 、１９８４、下、３８６−３８９．バラ
ンス （口ａｌｌａｎｃｅ） ＆ターナー（Ｔｕｒｎｅ
ｒ） 、Ｇｅｎｅ、 ｌ ９８５．３６．３２１３３
１；ファンハルチングスベルッ（Ｖａｍ Ｈａｒｔｉｎ
ｇｓｖｅｌｄｔ）等、モレキュラージーヌ＆ジェネティ
ツクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、） 、ｌ ９８
７．２０６．７１−７５；グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等
、カレントジェネティックス（Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅｔ
、）、１９８７．１１．４９９−５０３；ＥＰ−Δ−０
１３４４３８および０２３８０２３並びに国際特許出願
（ＰＣＴ）ＷＯ８６１０６０９７゜ 菌種、例えばアスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇ１
１１ｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス オリザエ（
Ａｓｐｅｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が酵素、例えば食
品工業で用いる酵素の工業的生産において広く用いられ
ている（例えば、ストリー力−） （Ｓｔｒｉｊｋａ
ｒｔ）、アントニーファンリーベンノエク（人口ｔｏ旧
ｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈａｃｋ）、１９８７．５
３．３５７−３６２参照）。
これら菌種の使用はその分泌能力に基くものである。Ａ
、 ニガーおよびＡ１オリザエはこの工業生産のために
大量にかつ工業的規模で使用され、しかもその醗酵特性
について十分に特徴付けされた微生物である。遺伝子工
学的技法がアスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇ ｉ ］ ｌ
ｉ）に適用されて形質転換体が作られ、これは付随的
に有用な生成物を合成する（カレン（［：ｕ ｌ ｆｅ
ｎ）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／１ｅｃｌ＋ｎｏ
ｌｏｇｙ） 、ｌ ９８７．５．３６９−３７６；ギン
（Ｇｗｙｎｎｅ）等、Ｂｉｏ ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、 ｌ ９８７．５．７１３−７１９；ウブシャル（Ｕ
ｐｓｈａｌ ｌ）等、Ｂｉｏ ／ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、 ｌ ９８７．５．１３０１−１３０４）。これ
らの場合において、選ばれたタンパクが通常宿主の分泌
するタンパクの他に表現され、結果として選ばれたタン
パクをこれらから分離する必要がある。
、 ニガーおよびＡ１オリザエはこの工業生産のために
大量にかつ工業的規模で使用され、しかもその醗酵特性
について十分に特徴付けされた微生物である。遺伝子工
学的技法がアスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇ ｉ ］ ｌ
ｉ）に適用されて形質転換体が作られ、これは付随的
に有用な生成物を合成する（カレン（［：ｕ ｌ ｆｅ
ｎ）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／１ｅｃｌ＋ｎｏ
ｌｏｇｙ） 、ｌ ９８７．５．３６９−３７６；ギン
（Ｇｗｙｎｎｅ）等、Ｂｉｏ ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、 ｌ ９８７．５．７１３−７１９；ウブシャル（Ｕ
ｐｓｈａｌ ｌ）等、Ｂｉｏ ／ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、 ｌ ９８７．５．１３０１−１３０４）。これ
らの場合において、選ばれたタンパクが通常宿主の分泌
するタンパクの他に表現され、結果として選ばれたタン
パクをこれらから分離する必要がある。
遺伝子置換はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）
について実証されている（例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅ
ｒ）等、モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏ１． ［
：ｅｌｌ、 Ｂｉｏｌ、） 、１９８５．５．１７２１
；ファン ハンチングスペル’；／ （Ｖａｎ Ｈａｒ
ｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ）等、上記文献；グーセン（Ｇｏ
ｏｓｅｎ）等、Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅｔ、、 、 １９
８７．１１．４９９−５０３；ウエルナーズ（Ｗｅｒｎ
ａｒｓ）等、 Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ（ｔ ９
８ ７ 、 ２０９ 、 ７１７７）。生合成、例え
ばアミノ酸、ヌクレオチド合成の経路の一部をなす酵素
をコードする遺伝子については、Ａ、＝デユランス（＾
、 ｎ１ｄｕｌａｎｓ）に関連して、様々な方法な用い
られている。ミラー等（上記文献）は、変性相同遺伝子
のみを含む制限フラグメントによるＴｒｐ Ｃ遺伝子の
一段階遺伝子置換または環状プラスミドを用いた二段階
法を用いている。“−段階”遺伝子置換では単一の遺伝
子置換で２つの交叉事象の出現を必要としく第７図参照
）、また二段階法では、第１段階は単一の組込み事象で
あり、これに伴って組込まれた遺伝子コピーを遊離し、
かつ在来遺伝子を放出する組換え（第２段階）が起こる
。この第２段階の出現は該組込み遺伝子コピーのフェノ
タイプをスクリーニングすることにより選別される。
について実証されている（例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅ
ｒ）等、モレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏ１． ［
：ｅｌｌ、 Ｂｉｏｌ、） 、１９８５．５．１７２１
；ファン ハンチングスペル’；／ （Ｖａｎ Ｈａｒ
ｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ）等、上記文献；グーセン（Ｇｏ
ｏｓｅｎ）等、Ｃｕｒｒ、 Ｇｅｎｅｔ、、 、 １９
８７．１１．４９９−５０３；ウエルナーズ（Ｗｅｒｎ
ａｒｓ）等、 Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ（ｔ ９
８ ７ 、 ２０９ 、 ７１７７）。生合成、例え
ばアミノ酸、ヌクレオチド合成の経路の一部をなす酵素
をコードする遺伝子については、Ａ、＝デユランス（＾
、 ｎ１ｄｕｌａｎｓ）に関連して、様々な方法な用い
られている。ミラー等（上記文献）は、変性相同遺伝子
のみを含む制限フラグメントによるＴｒｐ Ｃ遺伝子の
一段階遺伝子置換または環状プラスミドを用いた二段階
法を用いている。“−段階”遺伝子置換では単一の遺伝
子置換で２つの交叉事象の出現を必要としく第７図参照
）、また二段階法では、第１段階は単一の組込み事象で
あり、これに伴って組込まれた遺伝子コピーを遊離し、
かつ在来遺伝子を放出する組換え（第２段階）が起こる
。この第２段階の出現は該組込み遺伝子コピーのフェノ
タイプをスクリーニングすることにより選別される。
アミノ酸代謝経路における多くの遺伝子、例えばＴｒｐ
Ｃおよび＾ｒｇ Ｂの自然の表現程度はほんの中程度
にあるにすぎないことが知られている。これら遺伝子に
よりコードされた酵素は全細胞タンパクの極わずかな部
分を占めるにすぎない。しかし、これら遺伝子は必須で
ある。というのは、これらを失うことにより栄養要求性
となり、かつその生育培地に代謝物またはアミノ酸を供
給する必要性が生ずる。従って、これら遺伝子置換およ
び類似遺伝子の遺伝子置換両者とも容易に達成され、か
つ形質転換体を容易に単離できる（エッサー＆モーア（
Ｅｓｓｅｒ ａｎｄ １Ｊｏｈｒ） 、プロセスバイオ
ケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ） 、ｌ ９８６．１５３−１５９） 。
Ｃおよび＾ｒｇ Ｂの自然の表現程度はほんの中程度
にあるにすぎないことが知られている。これら遺伝子に
よりコードされた酵素は全細胞タンパクの極わずかな部
分を占めるにすぎない。しかし、これら遺伝子は必須で
ある。というのは、これらを失うことにより栄養要求性
となり、かつその生育培地に代謝物またはアミノ酸を供
給する必要性が生ずる。従って、これら遺伝子置換およ
び類似遺伝子の遺伝子置換両者とも容易に達成され、か
つ形質転換体を容易に単離できる（エッサー＆モーア（
Ｅｓｓｅｒ ａｎｄ １Ｊｏｈｒ） 、プロセスバイオ
ケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ） 、ｌ ９８６．１５３−１５９） 。
人、ニガーについて同様な結果がファン ハンチングス
ペルツ等の上記文献およびグーセン等の上記文献（ＰＪ
！ＬＧ座に関する）に報告されている。
ペルツ等の上記文献およびグーセン等の上記文献（ＰＪ
！ＬＧ座に関する）に報告されている。
このｐｙｒ Ｃ遺伝子はウリジンに導く生合成路からの
酵素をコードする。これらの例において、遺伝子置換は
容易に選別し得る遺伝子状態にあり、従って該遺伝子は
形質転換における選別マーカーとして用いられた。
酵素をコードする。これらの例において、遺伝子置換は
容易に選別し得る遺伝子状態にあり、従って該遺伝子は
形質転換における選別マーカーとして用いられた。
上記文献に記載された生成タンパクのいずれも人、ニデ
ユランスまたはＡ、ニガーにより分泌されないことに注
目すべきである。
ユランスまたはＡ、ニガーにより分泌されないことに注
目すべきである。
従って高活性で表現されかつ全細胞タンパクの大部分を
占めるタンパクをコードする遺伝子座、および細胞によ
り活発に分泌されるタンパクをコードする遺伝子座に対
する遺伝子置換系を得る必要性がある。
占めるタンパクをコードする遺伝子座、および細胞によ
り活発に分泌されるタンパクをコードする遺伝子座に対
する遺伝子置換系を得る必要性がある。
（発明が解決しようとする課題、課題を解決するための
手段） 糸状菌用の表現系は、分泌効率のよい宿主を用いて得ら
れ、該宿主は高度に表現されかつ分泌されるタンパクを
コードする配列の座に相同組換えするために工夫された
カセットをもつ。
手段） 糸状菌用の表現系は、分泌効率のよい宿主を用いて得ら
れ、該宿主は高度に表現されかつ分泌されるタンパクを
コードする配列の座に相同組換えするために工夫された
カセットをもつ。
有利には、組込みはマーカータンパクを含むことができ
、ここで表現カセットはターゲット遺伝子の５′−およ
び３′−非コード領域と境界をなしている。この形質転
換体は高度の表現および高効率の分泌をもたらす場合に
よりプロテアーゼ阻害剤が栄養培地内に加えられていて
、所定の生成物のタンパク分解を防止している。
、ここで表現カセットはターゲット遺伝子の５′−およ
び３′−非コード領域と境界をなしている。この形質転
換体は高度の表現および高効率の分泌をもたらす場合に
よりプロテアーゼ阻害剤が栄養培地内に加えられていて
、所定の生成物のタンパク分解を防止している。
高効率の表現系は糸状菌を用いて得られる。この系は表
現構築体の組込み用分泌宿主を用いる。
現構築体の組込み用分泌宿主を用いる。
この表現構築体は組込み用の対象とする遺伝子を含み、
これは相同組換に対してターゲット座の３′−および５
′−非コード領域と境界をなしている。
これは相同組換に対してターゲット座の３′−および５
′−非コード領域と境界をなしている。
このターゲット座は分泌タンパクをコードする遺伝子を
含む。形質転換体宿主の育生および誘発は所定の生成物
の効率的な表現および分泌、並びに単離し易さをもたら
す。これは栄養培地中に該ターゲット座の表現生成物が
ないことによる。
含む。形質転換体宿主の育生および誘発は所定の生成物
の効率的な表現および分泌、並びに単離し易さをもたら
す。これは栄養培地中に該ターゲット座の表現生成物が
ないことによる。
対象とする宿主は糸状菌であり、これはその内在タンパ
クの高効率の分泌性をもつ。アスペルギルス、特に、ニ
ガー、アワモリ （ａｗａｍｏｒｉ）またはオリザエの
工業的生産株は特に興味がある。また、トリコデルマ
リーゼイ、Ｍ、ミニハイおよびアスペルギルス、例えば
、人、フィクーム（ｆｉｃｕｕｍ）などを用いることが
できる。
クの高効率の分泌性をもつ。アスペルギルス、特に、ニ
ガー、アワモリ （ａｗａｍｏｒｉ）またはオリザエの
工業的生産株は特に興味がある。また、トリコデルマ
リーゼイ、Ｍ、ミニハイおよびアスペルギルス、例えば
、人、フィクーム（ｆｉｃｕｕｍ）などを用いることが
できる。
該表現構築体は対象とする遺伝子を含み、該遺伝子は通
常シグナル配列をもち、この配列は該宿主内で機能性で
あり、かつ表現生成物を分泌する。
常シグナル配列をもち、この配列は該宿主内で機能性で
あり、かつ表現生成物を分泌する。
相同組換えの大部分に対し、このシグナル配列は該ター
ゲット座における遺伝子のシグナル配列と相同もしくは
実質的に相同である。しかし、シグナル配列は分泌する
ように工夫することができる。
ゲット座における遺伝子のシグナル配列と相同もしくは
実質的に相同である。しかし、シグナル配列は分泌する
ように工夫することができる。
例えば、フォノ バイン（Ｖｏｎ Ｈｅ１ｊｎｅ） 、
Ｅｕｒ、 ＪＢｉｏｃｈｅｉ、、 ｌ ９８３．１３
３．１７−２１；およびパールマン＆ハルボルソン（Ｐ
ｏｒｌｍａｎ ａｎｄ ｈａｌｖｏｒｓｏｎ）、Ｊ 、
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、 １９８３．１６７．３９１４
０９参照。この表現生成物および対象とする遺伝子は宿
主に対し相同でも非相同でもよい。ここで、“相同（ｈ
ｏｍｏｌｏｇｏｕｓ） ”とは野性型の宿主に固有の
タンパクを意味し、一方“非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ
ｏｕｓ） ″とは該宿主にとって外来性のタンパクを
意味し、かつ自然にはみられない変異体を含むものとす
る。
Ｅｕｒ、 ＪＢｉｏｃｈｅｉ、、 ｌ ９８３．１３
３．１７−２１；およびパールマン＆ハルボルソン（Ｐ
ｏｒｌｍａｎ ａｎｄ ｈａｌｖｏｒｓｏｎ）、Ｊ 、
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、 １９８３．１６７．３９１４
０９参照。この表現生成物および対象とする遺伝子は宿
主に対し相同でも非相同でもよい。ここで、“相同（ｈ
ｏｍｏｌｏｇｏｕｓ） ”とは野性型の宿主に固有の
タンパクを意味し、一方“非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ
ｏｕｓ） ″とは該宿主にとって外来性のタンパクを
意味し、かつ自然にはみられない変異体を含むものとす
る。
対象とする遺伝子はそれ自体のシグナル配列をもつこと
ができ、あるいは宿主のシグナル配列もしくは適当なら
ば合成シグナル配列に結合できる。
ができ、あるいは宿主のシグナル配列もしくは適当なら
ば合成シグナル配列に結合できる。
選ばれた特定のシグナル配列は対象とする遺伝子および
ターゲット座に応じて変えることができる。
ターゲット座に応じて変えることができる。
特に興味あることは、その部位における組込みに対し相
同の付随的領域をもち、かつ高効率の分泌を可能ならし
めることが知られているターゲット座をもつシグナル配
列を用いることである。このシグナル配列をコードする
ＤＮＡ配列は直接プロセシングシグナル（開裂認識サイ
ト）をコードする配列を介して、成熟タンパクをコード
する配列に、あるいは短いブリッジ（通常は１０コドン
未満）を介して結合できる。
同の付随的領域をもち、かつ高効率の分泌を可能ならし
めることが知られているターゲット座をもつシグナル配
列を用いることである。このシグナル配列をコードする
ＤＮＡ配列は直接プロセシングシグナル（開裂認識サイ
ト）をコードする配列を介して、成熟タンパクをコード
する配列に、あるいは短いブリッジ（通常は１０コドン
未満）を介して結合できる。
対象とする遺伝子のためのオープン読取り粋に対する領
域５′は転写開始調節領域を含んでいる。
域５′は転写開始調節領域を含んでいる。
宿主内で機能性の任意の領域を用いることができる。し
かし、多くの場合、使用する領域は該ターゲット座の領
域と相同である。これは該ターゲット座の表現生成物を
対象とする表現生成物で置換した効果である。内在性タ
ンパクの表現および分泌の程度が効率の良い生産をもた
らす程度に、この転写開始調節領域は通常満足であるこ
とがわかっている。しかし、いくつかの例において、野
性型遺伝子よりも高い転写率を得たい場合、あるいは特
定の誘発剤を用いて誘発性表現を得たい場合がある。こ
れらの例において、転写開始調節領域としては、該ター
ゲット座における領域とは違ったものが使用される。糸
状菌内で機能性の多数の転写開始調節領域が知られてい
る。これら領域はグルコアミラーゼ、真菌アミラーゼ、
酸性ホスファターゼ、Ｇ Ａ Ｐ Ｄ Ｈ、ｈＣ、ハｄ
’Ｓ、ＡＪ！ｃＡ。
かし、多くの場合、使用する領域は該ターゲット座の領
域と相同である。これは該ターゲット座の表現生成物を
対象とする表現生成物で置換した効果である。内在性タ
ンパクの表現および分泌の程度が効率の良い生産をもた
らす程度に、この転写開始調節領域は通常満足であるこ
とがわかっている。しかし、いくつかの例において、野
性型遺伝子よりも高い転写率を得たい場合、あるいは特
定の誘発剤を用いて誘発性表現を得たい場合がある。こ
れらの例において、転写開始調節領域としては、該ター
ゲット座における領域とは違ったものが使用される。糸
状菌内で機能性の多数の転写開始調節領域が知られてい
る。これら領域はグルコアミラーゼ、真菌アミラーゼ、
酸性ホスファターゼ、Ｇ Ａ Ｐ Ｄ Ｈ、ｈＣ、ハｄ
’Ｓ、ＡＪ！ｃＡ。
ＬすＡ１ヒストンＨ２Ａ 、 ｈＬ４ 、ｈＬＧ 、イ
ソペニシリンＮシンセターゼ、ＰＧＫ、 酸性７’ロチ
アーゼ、アシルトランスフェラーゼ、などをコ−ドする
遺伝子を含む。
ソペニシリンＮシンセターゼ、ＰＧＫ、 酸性７’ロチ
アーゼ、アシルトランスフェラーゼ、などをコ−ドする
遺伝子を含む。
このターゲット座は高度に表現されたタンパク遺伝子、
即ち醗酵工程の終点において少なくとも約０．１ｇ／ｊ
！の濃度まで表現生成物を分泌する遺伝子をコードする
ことが好ましい。この工程の期間は、特に望むタンパク
生成物に応じて変えることができる。このような遺伝子
の例として、グルコアミラーゼ（ＡＧ）をコードするも
のを例示する。他の興味ある遺伝子は真菌α−アミラー
ゼ、酸性ホスファターゼ、プロテアーゼ、酸性プロテア
ーゼ、リパーゼ、フィツーゼおよびセロバイオヒドロラ
ーゼを包含する。
即ち醗酵工程の終点において少なくとも約０．１ｇ／ｊ
！の濃度まで表現生成物を分泌する遺伝子をコードする
ことが好ましい。この工程の期間は、特に望むタンパク
生成物に応じて変えることができる。このような遺伝子
の例として、グルコアミラーゼ（ＡＧ）をコードするも
のを例示する。他の興味ある遺伝子は真菌α−アミラー
ゼ、酸性ホスファターゼ、プロテアーゼ、酸性プロテア
ーゼ、リパーゼ、フィツーゼおよびセロバイオヒドロラ
ーゼを包含する。
対象とする遺伝子はある意図された用途をもち得る任意
の遺伝子である。アスペルギルスに非相同な選ばれたタ
ンパクは、例えばキモシン、インターロイキン、血液凝
集素因子、例えば第■または第■因子、ホスホリパーゼ
、リパーゼおよび細胞壁分解酵素（植物細胞壁にある多
糖類を分解する酵素）である。アスペルギルスに相同な
タンパクの例はフィツーゼ、ホスファターゼ、キシラナ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レンネット（ｒｅｎｎｅ
ｔｓ） 、グルコースオキシダーゼふよびアミラーゼで
ある。
の遺伝子である。アスペルギルスに非相同な選ばれたタ
ンパクは、例えばキモシン、インターロイキン、血液凝
集素因子、例えば第■または第■因子、ホスホリパーゼ
、リパーゼおよび細胞壁分解酵素（植物細胞壁にある多
糖類を分解する酵素）である。アスペルギルスに相同な
タンパクの例はフィツーゼ、ホスファターゼ、キシラナ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レンネット（ｒｅｎｎｅ
ｔｓ） 、グルコースオキシダーゼふよびアミラーゼで
ある。
転写集結調節領域は対象とする遺伝子、ターゲット座ま
たは任意の他の有利な配列からのものであり得る。該構
築体が更に対象とする遺伝子から転写方向に興味ある下
流配列を含む場合には、該ターゲット座と相同であるよ
うな転写終結調節領域は相同フランキング（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇ）領域よりも実質的に小さい。
たは任意の他の有利な配列からのものであり得る。該構
築体が更に対象とする遺伝子から転写方向に興味ある下
流配列を含む場合には、該ターゲット座と相同であるよ
うな転写終結調節領域は相同フランキング（ｆｌａｎｋ
ｉｎｇ）領域よりも実質的に小さい。
選別マーカーが通常使用される。これは表現構築物の一
部であっても、またこれとは別のものであってもよく、
従って対象とする遺伝子とは異る部位に組込むことがで
きる。本発明の組換え分子は工業生産に用いることので
きる宿主株に形質転換されることが好ましいので、この
形質転換をモニタするための選別マーカーは優性選別マ
ーカーであることが好ましい。即ち、これらの選別マー
カーが用い得るものであるためには、宿主株に何等の変
異も導入してはならない。その例は、規定した栄養源上
で形質転換体が生育し得るようなマーカー（例えば人、
ニデユランス ａｎｄ Ｓ遺伝子は唯一の窒素源として
のアセタミド上での人、三方−形質転換体の生育を可能
とする）あるいは抗生物質耐性を授与されたマーカー（
例えばｂＬｅ遺伝子にはフレオマイシン耐性が、また屁
し遺伝子にはハイグロマイシンＢ耐性が与えられている
）などである。
部であっても、またこれとは別のものであってもよく、
従って対象とする遺伝子とは異る部位に組込むことがで
きる。本発明の組換え分子は工業生産に用いることので
きる宿主株に形質転換されることが好ましいので、この
形質転換をモニタするための選別マーカーは優性選別マ
ーカーであることが好ましい。即ち、これらの選別マー
カーが用い得るものであるためには、宿主株に何等の変
異も導入してはならない。その例は、規定した栄養源上
で形質転換体が生育し得るようなマーカー（例えば人、
ニデユランス ａｎｄ Ｓ遺伝子は唯一の窒素源として
のアセタミド上での人、三方−形質転換体の生育を可能
とする）あるいは抗生物質耐性を授与されたマーカー（
例えばｂＬｅ遺伝子にはフレオマイシン耐性が、また屁
し遺伝子にはハイグロマイシンＢ耐性が与えられている
）などである。
この選別遺伝子は該マーカーの独立の表現を可能とする
それ自身の転写および翻訳開始並びに終止調節領域をも
っている。前述の如く、多くの転写開始調節領域が知ら
れており、１だ該マーカー遺伝子との組合せで使用でき
る。抗生物質耐性を用いた場合、選別用の抗生物質濃度
は抗生物質によって異り、一般には約３０〜３００μｇ
／ ｍ １の範囲である。
それ自身の転写および翻訳開始並びに終止調節領域をも
っている。前述の如く、多くの転写開始調節領域が知ら
れており、１だ該マーカー遺伝子との組合せで使用でき
る。抗生物質耐性を用いた場合、選別用の抗生物質濃度
は抗生物質によって異り、一般には約３０〜３００μｇ
／ ｍ １の範囲である。
様々な配列を公知の方法で結合できる。公知の方法は、
例えば制限、補足制限サイトの結合および結合、突出部
で閉鎖することによる（ｂｙ ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ
ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）プラントエンデイングおよびブラ
ント結合、Ｂａｊ！３１切除、ブライマー修復、インビ
トロ変異誘発、などである。必要ならば、ポリリンかお
よびアダプタを用いることができ、公知の方法で導入も
しくは除去して、表現構築物の組立てを容易なものとす
ることができる。この構築物の合成の各段階において、
フラグメントを制限酵素消化、配列決定、ハイブリッド
化などによってクローニング、かつ分析できる。多数の
ヘクタをクローニングのために使うことができ、特定の
選択は本発明では特にしないが、通常クローニングはＥ
、、１１Ｊ−内で行われる。
例えば制限、補足制限サイトの結合および結合、突出部
で閉鎖することによる（ｂｙ ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ
ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）プラントエンデイングおよびブラ
ント結合、Ｂａｊ！３１切除、ブライマー修復、インビ
トロ変異誘発、などである。必要ならば、ポリリンかお
よびアダプタを用いることができ、公知の方法で導入も
しくは除去して、表現構築物の組立てを容易なものとす
ることができる。この構築物の合成の各段階において、
フラグメントを制限酵素消化、配列決定、ハイブリッド
化などによってクローニング、かつ分析できる。多数の
ヘクタをクローニングのために使うことができ、特定の
選択は本発明では特にしないが、通常クローニングはＥ
、、１１Ｊ−内で行われる。
フランキング領域は少なくとも部分的にターゲット座の
オープン読取り枠を含み、特にシグナル配列、該ターゲ
ット座の遺伝子の調節領域５′および３′を含み、ある
いは該調節領域を越えて伸びていてもよい。オープン読
取り枠を含むフランキング領域のタンパクは、通常機能
性生成物を表現し得る完全な遺伝子をコードしない。通
常フランキング領域は少なくとも１ｏｏｂｐ、−ａに少
なくとも２００ｂ９あるいは５００ｂｐ以上であっても
よい。フランキング領域は該ターゲット遺伝子を崩壊さ
せてその表現を阻止するように選ばれる。
オープン読取り枠を含み、特にシグナル配列、該ターゲ
ット座の遺伝子の調節領域５′および３′を含み、ある
いは該調節領域を越えて伸びていてもよい。オープン読
取り枠を含むフランキング領域のタンパクは、通常機能
性生成物を表現し得る完全な遺伝子をコードしない。通
常フランキング領域は少なくとも１ｏｏｂｐ、−ａに少
なくとも２００ｂ９あるいは５００ｂｐ以上であっても
よい。フランキング領域は該ターゲット遺伝子を崩壊さ
せてその表現を阻止するように選ばれる。
これは５′領域に隣接するオープン読取り枠に表現カセ
ットを挿入することにより、該ターゲット遺伝子の全体
または一部を該表現構築物で置換することにより、ある
いは該ターゲット座における転写開始調節領域と該オー
プン読取り枠との間に該表現構築体を介在させることに
より達成できる。
ットを挿入することにより、該ターゲット遺伝子の全体
または一部を該表現構築物で置換することにより、ある
いは該ターゲット座における転写開始調節領域と該オー
プン読取り枠との間に該表現構築体を介在させることに
より達成できる。
既に述べたように、該終止調節領域が該ターゲット座に
おける領域と相同である場合、該３′−フランキング領
域は該構築体中にある終止調節領域よりも実質的に大き
いはずである。
おける領域と相同である場合、該３′−フランキング領
域は該構築体中にある終止調節領域よりも実質的に大き
いはずである。
この構築体は、綿状または環状のクローニングベクタと
して宿主内で形質転換されるか、あるいは必要ならばク
ローニングベクタから分離できる。
して宿主内で形質転換されるか、あるいは必要ならばク
ローニングベクタから分離できる。
このプラスミドは通常該表現構築体の末端約１ｋｂｐ内
で線状とされている。様々な方法が糸状菌の形質転換の
ために知られている。これらの方法はプロトプラスト融
合または形質転換、エレクトロポレーシ→ン、および細
胞内へのマイクロプロジェクタイルファイアリング（ｍ
ｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｆｉｒｉｎｇ）などを
含む。プロトプラスト形質転換が好都合であることがわ
かり、有利に使用できる。対象とする真菌株の菌糸体は
、まずＫＣｆまたはソルビトールなどの浸透圧安定剤の
存在下での該細胞壁の酵素消化によりプロトプラストに
転化する。
で線状とされている。様々な方法が糸状菌の形質転換の
ために知られている。これらの方法はプロトプラスト融
合または形質転換、エレクトロポレーシ→ン、および細
胞内へのマイクロプロジェクタイルファイアリング（ｍ
ｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｆｉｒｉｎｇ）などを
含む。プロトプラスト形質転換が好都合であることがわ
かり、有利に使用できる。対象とする真菌株の菌糸体は
、まずＫＣｆまたはソルビトールなどの浸透圧安定剤の
存在下での該細胞壁の酵素消化によりプロトプラストに
転化する。
プロトプラストによるＤＮＡの取込みはＣａＣｌ！ｔお
よびポリエチレングリコールの濃厚液を加えることによ
って促進される。ポリエチレングリコールはプロトプラ
ストの凝集を生じ、このような工程により形質転換ＤＮ
Ａは該凝集体に含められ、かつプロトプラストにより取
込まれる。プロトプラストは後に浸透圧安定化剤を含む
固体培地上で再生できる。場合によっては該培地は該形
質転換ＤＮＡがコードする耐性に対する選別剤をも含む
。
よびポリエチレングリコールの濃厚液を加えることによ
って促進される。ポリエチレングリコールはプロトプラ
ストの凝集を生じ、このような工程により形質転換ＤＮ
Ａは該凝集体に含められ、かつプロトプラストにより取
込まれる。プロトプラストは後に浸透圧安定化剤を含む
固体培地上で再生できる。場合によっては該培地は該形
質転換ＤＮＡがコードする耐性に対する選別剤をも含む
。
形質転換体につき選別を行った後、対象とする遺伝子の
存在を種々の方法で決定することができる。抗生物質を
用いることにより、表現生成物が宿主に対して非相同で
ある場合には、対象の遺伝子の表現の存在を検知できる
。また、サザンまたはノーザンプロットを用いて、組込
まれた遺伝子またはその転写生成物の存在を検出できる
。
存在を種々の方法で決定することができる。抗生物質を
用いることにより、表現生成物が宿主に対して非相同で
ある場合には、対象の遺伝子の表現の存在を検知できる
。また、サザンまたはノーザンプロットを用いて、組込
まれた遺伝子またはその転写生成物の存在を検出できる
。
次に、細胞を適当な培地中で育生する。プロテアーゼ阻
害剤を低濃度で使用できる。該阻害剤は、例えばフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド、α２−マクログロブ
リン、ペプスタチンなどである。通常、その濃度は約１
μｇ／ｍβ−１ｍｇ／ｍ１の範囲にある。このプロテア
ーゼ遺伝子を不活性化し、所定のタンパクの分解を防止
もしくは低減することが可能である。
害剤を低濃度で使用できる。該阻害剤は、例えばフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド、α２−マクログロブ
リン、ペプスタチンなどである。通常、その濃度は約１
μｇ／ｍβ−１ｍｇ／ｍ１の範囲にある。このプロテア
ーゼ遺伝子を不活性化し、所定のタンパクの分解を防止
もしくは低減することが可能である。
有利に使用できるターゲット座はＡ、ニガーまである。
この形質転換体はバッチ式または連続式リアクタ中で育
生でき、そこで栄養培地が単離されかつ所定の生成物が
抽出される。必要に応じて種々の該生成物の精製法が用
いられる。例えば、ＨＰＬＣまたは分離用薄層クロマト
グラフィーなどのクロマトグラフィー法、溶媒−溶媒抽
出法、電気泳動法およびこれらの組合せなどが用いられ
る。
生でき、そこで栄養培地が単離されかつ所定の生成物が
抽出される。必要に応じて種々の該生成物の精製法が用
いられる。例えば、ＨＰＬＣまたは分離用薄層クロマト
グラフィーなどのクロマトグラフィー法、溶媒−溶媒抽
出法、電気泳動法およびこれらの組合せなどが用いられ
る。
（実施例）
以下の実施例は例示のためであって、本発明を限定する
ために与えられるのではない。
ために与えられるのではない。
実施例１：１ヱ少１里左鬼ム１叫は系
Ａ、方法論
すべての構築体は、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）等のモレキュラークローニング、アラポラトリー
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ （、Ｉｏｎｉｎｇ、
Ａ ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ門ａｎｕａｌ）、コールトス
プリジグハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａ、ｒｂｏｒ Ｌａｂｃｒａｔｏｒｙ）Ｎ。
ｉｓ）等のモレキュラークローニング、アラポラトリー
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ （、Ｉｏｎｉｎｇ、
Ａ ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ門ａｎｕａｌ）、コールトス
プリジグハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａ、ｒｂｏｒ Ｌａｂｃｒａｔｏｒｙ）Ｎ。
Ｙに記載の標準的分子生物学的手法を用いて作製した。
プラスミドｐＡＢ６−１、ｐＡＢ６−２Ａ、、ｐＡＢ６
−３および ＡＢ６−４ Ａ、ニガーについて公開されたヌクレオチド配列に基く
オリゴヌクレオチドプローブ（第１図）〔ボニル（Ｂｏ
ｅｌ）等、ＥＭＢＯＪ、１９８４、３．１０９７−１１
０２；ボニル等、Ｍｏｌ 、＆Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、、
１９８４．４．２３０６１３１５］を用いて、ｐＵ
ｃ１９［ヤニツシューベロン（Ｙａｎ １ｓｃｈ−Ｐｅ
ｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ、 ｌ ９８５．３３．１０３
−ｔ１９；例えばドイツのベーリンガーマンハイム（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手可）
中の３−４ ｋｂ ＢｃｏＲｌフラグメントまたは１３
−１５ＫｂＨｉｎｄ ｍフラグメントを含むプラスミド
ライブラリーからＡ、ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子
を単離した。このオリゴヌクレオチドプローブはイント
ロン２を包囲する配列由来のものであり、４２−量体は
該イントロンの３′に位置し、かつＡＧ−ｍＲＮＡと同
じ極性を有する。２４−量体は該イントロン２の上流側
にあり、該ｍＲＮＡに逆平行であるように選ばれる。プ
ラスミドｐΔＢ６−１はｌ ４．５ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメント上にＡＧ−遺伝子を含む。プラスミ
ドｐＡＢ６−２Ａにおいて、完全なＡＧ−遺伝子には３
．４ ｋｂ ＢｃｏＲｌフラグメント上にある。プラス
ミドｐＡＢ６−３は該ＡＧ−遺伝子の直ぐ上流にある１
、 ８ ｋｂ ＢｃｏＲｌフラグメントを含み、このフ
ラグメントは多分調節配列を含み、かつｐＡＢ６−１か
らサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）されている
。ｐＡＢ６−１のもう一つのサブクローンであるプラス
ミドｐＡＢ６−４はＡＧ−遺伝子の上流領域および該遺
伝子の５′−末端の一部を含む（第２図の地図参照）４
、６ ｋｂ）ＩｉｎｄＩＩＩ −Ｂｇｌ ＩＩｌフラグ
メント含有する。
−３および ＡＢ６−４ Ａ、ニガーについて公開されたヌクレオチド配列に基く
オリゴヌクレオチドプローブ（第１図）〔ボニル（Ｂｏ
ｅｌ）等、ＥＭＢＯＪ、１９８４、３．１０９７−１１
０２；ボニル等、Ｍｏｌ 、＆Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、、
１９８４．４．２３０６１３１５］を用いて、ｐＵ
ｃ１９［ヤニツシューベロン（Ｙａｎ １ｓｃｈ−Ｐｅ
ｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ、 ｌ ９８５．３３．１０３
−ｔ１９；例えばドイツのベーリンガーマンハイム（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手可）
中の３−４ ｋｂ ＢｃｏＲｌフラグメントまたは１３
−１５ＫｂＨｉｎｄ ｍフラグメントを含むプラスミド
ライブラリーからＡ、ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子
を単離した。このオリゴヌクレオチドプローブはイント
ロン２を包囲する配列由来のものであり、４２−量体は
該イントロンの３′に位置し、かつＡＧ−ｍＲＮＡと同
じ極性を有する。２４−量体は該イントロン２の上流側
にあり、該ｍＲＮＡに逆平行であるように選ばれる。プ
ラスミドｐΔＢ６−１はｌ ４．５ ｋｂ Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメント上にＡＧ−遺伝子を含む。プラスミ
ドｐＡＢ６−２Ａにおいて、完全なＡＧ−遺伝子には３
．４ ｋｂ ＢｃｏＲｌフラグメント上にある。プラス
ミドｐＡＢ６−３は該ＡＧ−遺伝子の直ぐ上流にある１
、 ８ ｋｂ ＢｃｏＲｌフラグメントを含み、このフ
ラグメントは多分調節配列を含み、かつｐＡＢ６−１か
らサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ）されている
。ｐＡＢ６−１のもう一つのサブクローンであるプラス
ミドｐＡＢ６−４はＡＧ−遺伝子の上流領域および該遺
伝子の５′−末端の一部を含む（第２図の地図参照）４
、６ ｋｂ）ＩｉｎｄＩＩＩ −Ｂｇｌ ＩＩｌフラグ
メント含有する。
すべてのフラグメントはｐｕｃ １９にクローニングさ
れた。
れた。
プラスミドｐＡＢ６４−４０
プラスミドｐＡＢ６−２Ａ （第２図）をＡｃｃ １お
よびＴ４ポリメラーゼで処理して、プラントエンドをも
つ八ｃｃ ｌフラグメントを生成した。ターミネータを
含む、ＡＧ−遺伝子の３′フランキング配列を含有する
１、 ２ ｋｂｌフラグメント単離した。
よびＴ４ポリメラーゼで処理して、プラントエンドをも
つ八ｃｃ ｌフラグメントを生成した。ターミネータを
含む、ＡＧ−遺伝子の３′フランキング配列を含有する
１、 ２ ｋｂｌフラグメント単離した。
牛キモシンｃ ＤＮＡ （ＥＰ−Ａ−０７７１０９参照
）を含むプラスミドｐＵＲ１５２４を部分的にＳａｌ
ＩとＥｃｏ ＲＩとで消化した。キモシンｃＤＮＡを
含むフラグメントを単離し、付着末端をＴ４−ＤＮＡポ
リメラーゼで閉鎖し、かつプラントエンドフラグメント
をＳａｌ １リンカ−で結合した。
）を含むプラスミドｐＵＲ１５２４を部分的にＳａｌ
ＩとＥｃｏ ＲＩとで消化した。キモシンｃＤＮＡを
含むフラグメントを単離し、付着末端をＴ４−ＤＮＡポ
リメラーゼで閉鎖し、かつプラントエンドフラグメント
をＳａｌ １リンカ−で結合した。
このフラグメントをＳａｔ Ｉ ＋ＨｉｎｄＩＩＩで
消化し、結合してｐＰＡ１５３−２０９とした（ファン
ブテン（Ｖａｎ Ｐｕｔｔｅｎ）等、Ｊ 、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏ！、、 １９８６．１６８、？２）３−７３
３）、これはＳａｌ ｌおよびＨｉｎｄＩＩＴで消化
されていた。得られた構築体、ｐＲＣＨ４をＢｃｌ
Ｉで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理してプラントエン
ドを生成した。次いでＡＧ−ターミネータを含むＡｃｃ
ｌフラグメントをこの部位に結合して、ｐ Ａ Ｂ
６４−１０を得た。この構築体において、Ｂｃｌ Ｉ
閉鎖部位、キモシン遺伝子の３′は保存される。
消化し、結合してｐＰＡ１５３−２０９とした（ファン
ブテン（Ｖａｎ Ｐｕｔｔｅｎ）等、Ｊ 、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏ！、、 １９８６．１６８、？２）３−７３
３）、これはＳａｌ ｌおよびＨｉｎｄＩＩＴで消化
されていた。得られた構築体、ｐＲＣＨ４をＢｃｌ
Ｉで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで処理してプラントエン
ドを生成した。次いでＡＧ−ターミネータを含むＡｃｃ
ｌフラグメントをこの部位に結合して、ｐ Ａ Ｂ
６４−１０を得た。この構築体において、Ｂｃｌ Ｉ
閉鎖部位、キモシン遺伝子の３′は保存される。
次に、プラスミドｐＡＢ６−３ （第２図）をＥｃｏ
ＲＩで部分的に消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理した
。このブタター中に、再度Ｔ４ポリメラーゼ処理した後
プラスミドｐＡＢ６−４の旧ｎｄＩＩＩ＋８ｃｏ Ｒｌ
フラグメントが結合された。得られた構築体はｐＡＢ６
−３１であり、これは中央に崩壊されたＥｃｏ Ｒｌサ
イトとＡＧ−遺伝子に隣接した独特のＢｃｏ Ｒｌサイ
トとをもつＡＧ−遺伝子の３．６ｋｂ上流側フラグメン
トを含む。この独特のＢｃｏ Ｒｌサイトに、キモシン
ｃＤＮＡ＋ΔＧ−ターミネータを含むｐＡＢ６４−１０
からのＥｃｏ ＲＩで部分的に消化されたフラグメント
を結合した。
ＲＩで部分的に消化し、Ｔ４ポリメラーゼで処理した
。このブタター中に、再度Ｔ４ポリメラーゼ処理した後
プラスミドｐＡＢ６−４の旧ｎｄＩＩＩ＋８ｃｏ Ｒｌ
フラグメントが結合された。得られた構築体はｐＡＢ６
−３１であり、これは中央に崩壊されたＥｃｏ Ｒｌサ
イトとＡＧ−遺伝子に隣接した独特のＢｃｏ Ｒｌサイ
トとをもつＡＧ−遺伝子の３．６ｋｂ上流側フラグメン
トを含む。この独特のＢｃｏ Ｒｌサイトに、キモシン
ｃＤＮＡ＋ΔＧ−ターミネータを含むｐＡＢ６４−１０
からのＥｃｏ ＲＩで部分的に消化されたフラグメント
を結合した。
生成する構築体はｐＡＢ６４−２０である。該ターミネ
ータと該ベクターとの間にあるＨｃｏ Ｒｌサイトは１
Ｅｃｏ ＲＩで部分消化して崩壊され、次いでＴ４ポリ
メラーゼ処理し、かつ結合する。この新たな構築体はｐ
ＡＢ６４−４０であり、これは、今度ＡＧ−上流配列と
キモシンｃ ＤＮ Ａ （Ｆｉｇ、 ３ ）との接合部
に存在する独特のＥｃｏ Ｒｒサイトを含む。
ータと該ベクターとの間にあるＨｃｏ Ｒｌサイトは１
Ｅｃｏ ＲＩで部分消化して崩壊され、次いでＴ４ポリ
メラーゼ処理し、かつ結合する。この新たな構築体はｐ
ＡＢ６４−４０であり、これは、今度ＡＧ−上流配列と
キモシンｃ ＤＮ Ａ （Ｆｉｇ、 ３ ）との接合部
に存在する独特のＥｃｏ Ｒｒサイトを含む。
プラスミドｐΔＮ７６−１
プラスミドｐＡＮ７−１ （プント （Ｐｕｎｔ）等
、Ｇｅｎｅ、 １９ Ｂ ？、５６．１１７−１２４
）を１ｌｉｎｄ■で消化した。このサイトに、ＡＧ＝遺
伝子の３′にあるｐＡＢ６−１（Ｆｉｇ、２＞からの５
ａｌｌ十Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを結合した。該結
合の前にＳａｌ ｌサイトをＴ４ポリメラーゼで閉鎖
した。この構築体（ｐＡＮ７６−１ ；Ｆｉ呂、４）か
ら、ＨｙｇＢ遺伝子＋３′フランキングＡＣフラグメン
トを、Ｓｔｕ Ｉ ＋ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとし
て単離した。
、Ｇｅｎｅ、 １９ Ｂ ？、５６．１１７−１２４
）を１ｌｉｎｄ■で消化した。このサイトに、ＡＧ＝遺
伝子の３′にあるｐＡＢ６−１（Ｆｉｇ、２＞からの５
ａｌｌ十Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを結合した。該結
合の前にＳａｌ ｌサイトをＴ４ポリメラーゼで閉鎖
した。この構築体（ｐＡＮ７６−１ ；Ｆｉ呂、４）か
ら、ＨｙｇＢ遺伝子＋３′フランキングＡＣフラグメン
トを、Ｓｔｕ Ｉ ＋ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとし
て単離した。
ファージｍＡＢ６４−０
調節配列とΔＧ−プロモータとを含む、プラスミドｐＡ
Ｂ６−２Ａ由来の小さなＥｃｏ Ｒｒ ＋ＮｒｕＩフラ
グメントを単離し、これを、牛キモシンＣＤＮＡを含む
プラスミドｐＲＣＨ４の塾±Ｉ＋Ｂｃｊ２■フラグメン
トと共に、Ｅｃｏ ＲｌおよびＤａｍ ＨＩで消化した
ファージＭ１３ｍｐＨ［メツシング＆ビエイラ（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ） 、Ｇｅｎｅ、 １
９８２．１９．２６９−２７６；例えばスウェーデンの
ファルマシア インコーボレーテッ）’ （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａＩｎｃ、）から入手可能〕に結合し、かつＳａ
ｔ ＩサイトにおいてＴ４ポリメラーゼで処理した。
Ｂ６−２Ａ由来の小さなＥｃｏ Ｒｒ ＋ＮｒｕＩフラ
グメントを単離し、これを、牛キモシンＣＤＮＡを含む
プラスミドｐＲＣＨ４の塾±Ｉ＋Ｂｃｊ２■フラグメン
トと共に、Ｅｃｏ ＲｌおよびＤａｍ ＨＩで消化した
ファージＭ１３ｍｐＨ［メツシング＆ビエイラ（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ） 、Ｇｅｎｅ、 １
９８２．１９．２６９−２７６；例えばスウェーデンの
ファルマシア インコーボレーテッ）’ （Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａＩｎｃ、）から入手可能〕に結合し、かつＳａ
ｔ ＩサイトにおいてＴ４ポリメラーゼで処理した。
生成した構築体、ファージｍＡＢ６４−０はＡＧとプレ
プロキモシンとの融合タンパクを含み（Ｆｉｇ、 ５
）、これをイン ビトロでの変異形成にかけた。
プロキモシンとの融合タンパクを含み（Ｆｉｇ、 ５
）、これをイン ビトロでの変異形成にかけた。
Ｂ、特定の表現カセット
牛キモシン用の３種の表現力セブ）をｍＡＢ６４−０か
ら作製した。各々はＡＧ調節領域と牛キモシンｃＤＮＡ
との異る融合サイトを含んでいる。
ら作製した。各々はＡＧ調節領域と牛キモシンｃＤＮＡ
との異る融合サイトを含んでいる。
この目的のために、以下の３種のオリゴヌクレオチドを
消化した。
消化した。
＃１５’ −ＡＴ ＴＡＣＡＣＣＴＣ八 ＧＣＡ
八ＴＧ 八ＧＧ ＴＧＴ ＣＴＣＧＴＧ Ｇ
ＴＧ ３’＃２：５’ −ＴＧＣＡＣＡ ＧＧＧ
ＴＴＧ Ｇ［：Ａ ＧＣ’ｒ ＧＡＣＡＴ［
： 八ＣＣ＾ＧＧ ＡＴ［： ＣＣＴ＃３：５’
−八ＣＧ ＧＡＴ ＡへＣ［：ＣＧ ＧＡＣ
ＧＣＴ ＧＡＣ八ＴＣＡＣＣ八ＧＧ ３’これらオ
リゴヌクレオチドはＡＧ−プロモータをプレプロキモシ
ン（＃１）にあるいはΔＧ−プロモータとシグナルペプ
チドとをプロキモシン（＃２）に接合するのに用いた。
八ＴＧ 八ＧＧ ＴＧＴ ＣＴＣＧＴＧ Ｇ
ＴＧ ３’＃２：５’ −ＴＧＣＡＣＡ ＧＧＧ
ＴＴＧ Ｇ［：Ａ ＧＣ’ｒ ＧＡＣＡＴ［
： 八ＣＣ＾ＧＧ ＡＴ［： ＣＣＴ＃３：５’
−八ＣＧ ＧＡＴ ＡへＣ［：ＣＧ ＧＡＣ
ＧＣＴ ＧＡＣ八ＴＣＡＣＣ八ＧＧ ３’これらオ
リゴヌクレオチドはＡＧ−プロモータをプレプロキモシ
ン（＃１）にあるいはΔＧ−プロモータとシグナルペプ
チドとをプロキモシン（＃２）に接合するのに用いた。
オリゴ＃３を用いて、成熟ＡＧ−遺伝子の７１アミノ酸
とプロキモシンとの間で融合タンパクを得た。
とプロキモシンとの間で融合タンパクを得た。
これら構築体の同定は生成構築体（ｍＡＢ６４−２、ｍ
ＡＢ６４−３、およびｍＡＢ６４−５）の５ｓＤＮＡの
配列決定により行った。これらの構築体から所定の遺伝
子融合体を含むＥｃｏ ＲＩフラグメントを単離し、ｐ
ＡＢ６４−４０に挿入して、夫々ｐＡＢ６４−４２、ｐ
ＡＢ６４−４３およびｐＡＢ６４−４５を得た。これら
プラスミドＣＴ ３’ ｐＡＢ６４−４２、ｐＡＢ６４−４３およびｐＡＢ６４
−４５に、ｐＡＮ７６−１から単離したＳｔｕ Ｉ＋
旧ｎｄＩ［Ｉフラグメントを挿入した。このフラグメン
トはＡＧ−遺伝子のｕｙｇ Ｂ遺伝子＋３′フランキン
グエレメントを含んでいた。最終的な構築体はｐＡＢ６
４−７２、ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７５で
ある。これらは該表現カセットに固有のｌ１ｉｎｄ［ｎ
サイト３′と３′フランキング領域とを含む（Ｆｉｇ、
６ ）。
ＡＢ６４−３、およびｍＡＢ６４−５）の５ｓＤＮＡの
配列決定により行った。これらの構築体から所定の遺伝
子融合体を含むＥｃｏ ＲＩフラグメントを単離し、ｐ
ＡＢ６４−４０に挿入して、夫々ｐＡＢ６４−４２、ｐ
ＡＢ６４−４３およびｐＡＢ６４−４５を得た。これら
プラスミドＣＴ ３’ ｐＡＢ６４−４２、ｐＡＢ６４−４３およびｐＡＢ６４
−４５に、ｐＡＮ７６−１から単離したＳｔｕ Ｉ＋
旧ｎｄＩ［Ｉフラグメントを挿入した。このフラグメン
トはＡＧ−遺伝子のｕｙｇ Ｂ遺伝子＋３′フランキン
グエレメントを含んでいた。最終的な構築体はｐＡＢ６
４−７２、ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７５で
ある。これらは該表現カセットに固有のｌ１ｉｎｄ［ｎ
サイト３′と３′フランキング領域とを含む（Ｆｉｇ、
６ ）。
実施例２：アスペルギルスニガーを形質転換することに
よる 子置換 本発明によるＡ、ニガーの形質転換は、ファンハルチン
グスベルツ等およびイニルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）等の上
記文献記載の方法を用いて行った。
よる 子置換 本発明によるＡ、ニガーの形質転換は、ファンハルチン
グスベルツ等およびイニルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）等の上
記文献記載の方法を用いて行った。
Ａ、ニガーＤＳ２９７５ （この株のサンプルを１９８
８年８月１０日付でＣＢＳに、第５１３．８８号として
寄託した）を３４℃にて２４時間あるいは必要ならばそ
れ以上育生した。この菌糸体を滅菌ナイロン布を通して
濾過することにより収穫し、０、６ ＭＭｇＳＯ４で洗
浄した（最大、１００ｍ１培養液当たり１２．５ ｍ
ｌ ）。この菌糸体を、次に滅菌チューブに移し、秤量
し、１ｇ当たり（湿潤重量）５ｍｌの浸透培地（１，２
ＭＭｇＳＯ，，１０ｍＭの燐酸塩で緩衝、ρ８５．８）
中に再懸濁した。ノボジイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ） ２３
４ （ノボ（ＮＯＢＯ）社、デンマーク；浸透培地中２
０ｍｇ／ｍりを湿潤重量で１ｇ当たり１ｍｆおよびＢＳ
Ａ （シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、オランダ、浸透培地中
で１２ｎ＋ｇ／ｍｉ’）を湿潤重量で１ｇにつき００５
ｍ１加えた後、プロトプラストを形成させ、一方で２５
−２７℃にておだやかに（５０ｒｐｍ）振盪した。プロ
トプラスト形成を規則的な間隔で顕微鏡観察することに
よりモニタした。プロトプラスト形成完了後、１５ｍ１
のプロトプラスト溶液を３Ｏｒ？＋ｊ！のコレックス（
ＣｏｒｅＸ）チューブに移し、１０ｒｒ＋ｊ！のトラッ
プバッファ（ｔｒａｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ） （０
，６Ｍソルビトール、１００ｍＭ）リス／ ｔｌｃｊ２
ｐｔ１７．０ ）のオーバーレイ （ｏｖｅｒｌａｙ
）を該プロトプラス）ＬＪ濁液上に注意深く展開した。
８年８月１０日付でＣＢＳに、第５１３．８８号として
寄託した）を３４℃にて２４時間あるいは必要ならばそ
れ以上育生した。この菌糸体を滅菌ナイロン布を通して
濾過することにより収穫し、０、６ ＭＭｇＳＯ４で洗
浄した（最大、１００ｍ１培養液当たり１２．５ ｍ
ｌ ）。この菌糸体を、次に滅菌チューブに移し、秤量
し、１ｇ当たり（湿潤重量）５ｍｌの浸透培地（１，２
ＭＭｇＳＯ，，１０ｍＭの燐酸塩で緩衝、ρ８５．８）
中に再懸濁した。ノボジイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ） ２３
４ （ノボ（ＮＯＢＯ）社、デンマーク；浸透培地中２
０ｍｇ／ｍりを湿潤重量で１ｇ当たり１ｍｆおよびＢＳ
Ａ （シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、オランダ、浸透培地中
で１２ｎ＋ｇ／ｍｉ’）を湿潤重量で１ｇにつき００５
ｍ１加えた後、プロトプラストを形成させ、一方で２５
−２７℃にておだやかに（５０ｒｐｍ）振盪した。プロ
トプラスト形成を規則的な間隔で顕微鏡観察することに
よりモニタした。プロトプラスト形成完了後、１５ｍ１
のプロトプラスト溶液を３Ｏｒ？＋ｊ！のコレックス（
ＣｏｒｅＸ）チューブに移し、１０ｒｒ＋ｊ！のトラッ
プバッファ（ｔｒａｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ） （０
，６Ｍソルビトール、１００ｍＭ）リス／ ｔｌｃｊ２
ｐｔ１７．０ ）のオーバーレイ （ｏｖｅｒｌａｙ
）を該プロトプラス）ＬＪ濁液上に注意深く展開した。
このチューブをスイングロータ （ｓｗｉｎｇ−ｏｕｔ
ｒｏｔｅｒ）で４℃にて５０００ ｒｐｍで１５分間
遠心した、プロトプラストをその剪断を防ぐために、広
い開口をもつ無菌パスツールピペットで開期から注意し
て集めた。この相分離は遠心後に大きなペレットがみら
れるようになるまで繰返した。この場合、ベレットを注
意深く浸透培地に再懸濁し、新たなトラップバッファの
オーバーレイを設け、遠心を繰返した。プロトプラスト
を集め、これを冷５ＴＣ（１，２Ｍソルビトール；１０
ｍＭ）リスＦＩＣｊ！ ； ｐＨ７，５； ５０ ｍＭ
ｃａｃ７！ｚ）に再懸濁し、４℃で３００Ｏｒｐｍにて
１０分間遠心することにより注意深く洗浄した。この洗
浄は、汚染粒子を含まないプロトプラスト処方物が得ら
れるまで繰返した。このプロトプラストペレットを冷Ｓ
ＴＣに最終濃度ｌＸｌ０”プロトプラスト（ｐｐｓ）
／ ｍ Ｉｌとなるように懸濁させた。
ｒｏｔｅｒ）で４℃にて５０００ ｒｐｍで１５分間
遠心した、プロトプラストをその剪断を防ぐために、広
い開口をもつ無菌パスツールピペットで開期から注意し
て集めた。この相分離は遠心後に大きなペレットがみら
れるようになるまで繰返した。この場合、ベレットを注
意深く浸透培地に再懸濁し、新たなトラップバッファの
オーバーレイを設け、遠心を繰返した。プロトプラスト
を集め、これを冷５ＴＣ（１，２Ｍソルビトール；１０
ｍＭ）リスＦＩＣｊ！ ； ｐＨ７，５； ５０ ｍＭ
ｃａｃ７！ｚ）に再懸濁し、４℃で３００Ｏｒｐｍにて
１０分間遠心することにより注意深く洗浄した。この洗
浄は、汚染粒子を含まないプロトプラスト処方物が得ら
れるまで繰返した。このプロトプラストペレットを冷Ｓ
ＴＣに最終濃度ｌＸｌ０”プロトプラスト（ｐｐｓ）
／ ｍ Ｉｌとなるように懸濁させた。
プロトプラストは即座に使用するか、あるいは４℃にて
一夜保存した。保存した場合、プロトプラストを翌日冷
ＳＴＣで再度洗浄した。
一夜保存した。保存した場合、プロトプラストを翌日冷
ＳＴＣで再度洗浄した。
形質転換のために、１０７ブロトプラストを２５μｉの
ＳＴＣ中の１０μｇのＤＮＡあるいは１０μρのＴＥ
（ＴＥは１０ｍＭのトリス−Ｈ（Ｊ、１ｍＭのＥＤＴＡ
、を含み、ｐＨは８．０）中にＤＮＡに加えた。遺伝子
置換達成のため、プラスミド構築体ｐＡＢ６４−７２、
ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７５を、これらす
べての選別マーカーおよびＡＧ−遺伝子（第６図）の３
′フランキング領域の直く下流にある固有旧ｎｄｌＩ［
制限サイトで切断することにより線状化した。
ＳＴＣ中の１０μｇのＤＮＡあるいは１０μρのＴＥ
（ＴＥは１０ｍＭのトリス−Ｈ（Ｊ、１ｍＭのＥＤＴＡ
、を含み、ｐＨは８．０）中にＤＮＡに加えた。遺伝子
置換達成のため、プラスミド構築体ｐＡＢ６４−７２、
ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７５を、これらす
べての選別マーカーおよびＡＧ−遺伝子（第６図）の３
′フランキング領域の直く下流にある固有旧ｎｄｌＩ［
制限サイトで切断することにより線状化した。
このプロトプラストとＤＮＡとの混合物を室温にて２５
分間インキニーヘットした。次に、ＰＥＣ−？容ン夜（
６０％ポリエチレングリコール４０００、プロカセフ（
［１ｒｏｃａｃｅｆ） ／ Ｂ Ｄ Ｈ； １０ ｍ
Ｍ ）リス／ＨＣＡｐＨ５，７； ５０ｍＭ ＣａＣ７
！ｚ）を一部づつ、２００μｍ、２００μｌおよび８５
０μｌというように転化した。各部分のＰＥＧを添加し
た後、該混合物を注意深くホモジナイズし、ＰＥＧの最
後の部分を添加した後室温にて２０分間インキュベート
した。大きなプラスミド（＞１．８ｋｂ）の沈殿がしば
しばみられた。これは６０％ＰＥＧ溶液を２５％ＰＥＧ
溶液で替えることにより防止された。
分間インキニーヘットした。次に、ＰＥＣ−？容ン夜（
６０％ポリエチレングリコール４０００、プロカセフ（
［１ｒｏｃａｃｅｆ） ／ Ｂ Ｄ Ｈ； １０ ｍ
Ｍ ）リス／ＨＣＡｐＨ５，７； ５０ｍＭ ＣａＣ７
！ｚ）を一部づつ、２００μｍ、２００μｌおよび８５
０μｌというように転化した。各部分のＰＥＧを添加し
た後、該混合物を注意深くホモジナイズし、ＰＥＧの最
後の部分を添加した後室温にて２０分間インキュベート
した。大きなプラスミド（＞１．８ｋｂ）の沈殿がしば
しばみられた。これは６０％ＰＥＧ溶液を２５％ＰＥＧ
溶液で替えることにより防止された。
形質転換されたプロトプラストを冷ＳＴＣＩ Ｏ〜１５
ｍｊ！で、穏やかに混合し、５０００ ｒｐｍで４℃に
て１０分間遠心することにより洗浄した。
ｍｊ！で、穏やかに混合し、５０００ ｒｐｍで４℃に
て１０分間遠心することにより洗浄した。
このプロトプラストを１００μｌのＳＴＣに再懸濁し、
２００μｇ ／ ｍ １のハイグロマイシンＢ（シダ？
（Ｓｉｇｍａ）Ｈ２６３８）を含む選別プレート上
で注意深く平板分離した。ハイグロマイシン耐性コロニ
ーを、単一の単離芽胞から出発して、更に分析した。
２００μｇ ／ ｍ １のハイグロマイシンＢ（シダ？
（Ｓｉｇｍａ）Ｈ２６３８）を含む選別プレート上
で注意深く平板分離した。ハイグロマイシン耐性コロニ
ーを、単一の単離芽胞から出発して、更に分析した。
実施例３：遺伝子置換の証明
Ａ、サインプロット法
実際に該形質転換体中で遺伝子置換が起こっているか否
かを確定するため、サインプロット法を用いて、該形質
転換体からのグルコアミラーゼ特異性ＤＮＡがないこと
を立証した。グルコアミラーゼ遺伝子に対して相同のＤ
ＮＡフラグメントを放射性とし、電気泳動によりＤＮＡ
を分離し、かつナイロン膜に染色体ＤＮＡを固定した後
、該形質転換体のＤＮＡにハイブリッド化する。極めて
少量の相同ＤＮＡがこの方法で検出できる。形質転換に
用いた３種の構築体格々の数種の形質転換体からＤＮＡ
を単離した。標準的手法で菌糸体を液体窒素中で粉砕し
た後に、ＤＮＡを単離した。
かを確定するため、サインプロット法を用いて、該形質
転換体からのグルコアミラーゼ特異性ＤＮＡがないこと
を立証した。グルコアミラーゼ遺伝子に対して相同のＤ
ＮＡフラグメントを放射性とし、電気泳動によりＤＮＡ
を分離し、かつナイロン膜に染色体ＤＮＡを固定した後
、該形質転換体のＤＮＡにハイブリッド化する。極めて
少量の相同ＤＮＡがこの方法で検出できる。形質転換に
用いた３種の構築体格々の数種の形質転換体からＤＮＡ
を単離した。標準的手法で菌糸体を液体窒素中で粉砕し
た後に、ＤＮＡを単離した。
ゲノムＤＮＡをＢｃｏ ＲＩで消化し、電気泳動で分離
し、ジーヌスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ ５ｃｒｅｅｎ
ＰＩｕｓ） （ＴＭ）ナイロン膜（米国デュポン（
ＤｕＦｏｎｔ）社）にプロットした。まず、このプロッ
トを放射性ＡＧ＝特異性プローブ（ΔＧ内部Ｂａｍ Ｈ
Ｉ ＋口ｇＩ ■フラグメント （Ｆｉｇ、２ ） ）
ハイブリッド化した。このプローブを用いても同等ハイ
ブリット化信号を示さない形質転換体（ＡＧ−遺伝子が
いまだ形質転換体中に存在すると３．４ｋｂのＥｃｏ
Ｒ１フラグメントの存在が予想される）は他のプローブ
でのスクリーニングに付されて、遺伝子置換の発生が確
認される。このため、Ｂｃｏ ＲＩ消化物を放射性ｐＡ
Ｂ６４−７５ （あらゆる必須のプラスミド由来のフラ
グメントの存在を確認するためのもの）および放射性ｐ
Ｕｃ１９（バクテリアＤＮＡのないことを立証するため
のもの）両者とハイブリッド化した。これらの実験の結
果は、すべての予想されたプラスミド由来のフラグメン
トの存在（牛キモシンｃＤＮＡを含む）およびはじめに
分析された３６形質転換体のうちの７種におけるバクテ
リアＤＮＡの不在を示した。すべての選別された形質転
換体の単一のキモシン表現カセットを含む。
し、ジーヌスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ ５ｃｒｅｅｎ
ＰＩｕｓ） （ＴＭ）ナイロン膜（米国デュポン（
ＤｕＦｏｎｔ）社）にプロットした。まず、このプロッ
トを放射性ＡＧ＝特異性プローブ（ΔＧ内部Ｂａｍ Ｈ
Ｉ ＋口ｇＩ ■フラグメント （Ｆｉｇ、２ ） ）
ハイブリッド化した。このプローブを用いても同等ハイ
ブリット化信号を示さない形質転換体（ＡＧ−遺伝子が
いまだ形質転換体中に存在すると３．４ｋｂのＥｃｏ
Ｒ１フラグメントの存在が予想される）は他のプローブ
でのスクリーニングに付されて、遺伝子置換の発生が確
認される。このため、Ｂｃｏ ＲＩ消化物を放射性ｐＡ
Ｂ６４−７５ （あらゆる必須のプラスミド由来のフラ
グメントの存在を確認するためのもの）および放射性ｐ
Ｕｃ１９（バクテリアＤＮＡのないことを立証するため
のもの）両者とハイブリッド化した。これらの実験の結
果は、すべての予想されたプラスミド由来のフラグメン
トの存在（牛キモシンｃＤＮＡを含む）およびはじめに
分析された３６形質転換体のうちの７種におけるバクテ
リアＤＮＡの不在を示した。すべての選別された形質転
換体の単一のキモシン表現カセットを含む。
Ｂ、ウェスタンプロット法
生物体のゲノムから選別された遺伝子のないことは様々
な方法で確証できる。上記節Ａで記載したサザンブロソ
トハイブリッド化は用いたプローブと相同の遺伝物質の
ないことを立証するための強力な手段の一つである。特
定の遺伝子がないことを明らかにするためのもう一つの
方法は対象とする遺伝子（この場合グルコアミラーゼ遺
伝子）の生成物でないことを明らかにすることである。
な方法で確証できる。上記節Ａで記載したサザンブロソ
トハイブリッド化は用いたプローブと相同の遺伝物質の
ないことを立証するための強力な手段の一つである。特
定の遺伝子がないことを明らかにするためのもう一つの
方法は対象とする遺伝子（この場合グルコアミラーゼ遺
伝子）の生成物でないことを明らかにすることである。
ある処方中におけるタンパクの存在または不在を立証す
る極めて高感度の技法はウェスタンプロット法である。
る極めて高感度の技法はウェスタンプロット法である。
この方法においては、対象とするタンパクに対して生成
される特定の抗体を用いて、該特定のタンパクの存在、
不在を明らかにする。
される特定の抗体を用いて、該特定のタンパクの存在、
不在を明らかにする。
これらの抗体は該タンパクに結合するが、該抗体はニト
ロセルロース膜に固定されている。次いで、第１の抗体
処方に対して生成される第２の抗体処方が使用される。
ロセルロース膜に固定されている。次いで、第１の抗体
処方に対して生成される第２の抗体処方が使用される。
この第２の抗体処方は酵素と結合する。この酵素は無色
の基質を着色生成物に変えることができる。着色バンド
は免疫源性物質が存在するスポット上に出現する。該物
質は第１抗体処方と反応できる。
の基質を着色生成物に変えることができる。着色バンド
は免疫源性物質が存在するスポット上に出現する。該物
質は第１抗体処方と反応できる。
牛キモシン遺伝子で置換されたＡＧ−遺伝子をもつもの
としてサインプロット法で選別された形質転換体は殿粉
の存在下で生育して、ＡＧ調節領域を誘発し、かつ発酵
上澄はウェスタンプロット法で分析され、宿主菌株の発
酵上澄と比較された。
としてサインプロット法で選別された形質転換体は殿粉
の存在下で生育して、ＡＧ調節領域を誘発し、かつ発酵
上澄はウェスタンプロット法で分析され、宿主菌株の発
酵上澄と比較された。
各２０μｌの上澄を７．５％ポリアクリルアミド−３Ｄ
Ｓゲル上に重層し、タンパクバンドを電気泳動で分離し
た。このゲルを標準的プロトコールで、ニトロセルロー
ス膜上で電気泳動によりプロットした。このニトロセル
ロース膜を、市販の処方をＨＰＬＣカラムクロマトグラ
フィーで精製して得た、グルコアミラーゼに対して生成
するポリクローナル抗血清で数回洗浄した後インキュベ
ートした。この膜の第２抗体接合処方物での処理は該形
質転換体処方物に着色バンドを示さなかったが、宿主処
方物ではほぼグルコアミラーゼサイズのバンドがあった
。この実験は、選別された形質転換体において、抗ＡＧ
−血清と反応し得る物質は合成されないことを示してお
り、従ってＡＧ−遺伝子は牛キモシン遺伝子で置換され
たことが結論付けられる。
Ｓゲル上に重層し、タンパクバンドを電気泳動で分離し
た。このゲルを標準的プロトコールで、ニトロセルロー
ス膜上で電気泳動によりプロットした。このニトロセル
ロース膜を、市販の処方をＨＰＬＣカラムクロマトグラ
フィーで精製して得た、グルコアミラーゼに対して生成
するポリクローナル抗血清で数回洗浄した後インキュベ
ートした。この膜の第２抗体接合処方物での処理は該形
質転換体処方物に着色バンドを示さなかったが、宿主処
方物ではほぼグルコアミラーゼサイズのバンドがあった
。この実験は、選別された形質転換体において、抗ＡＧ
−血清と反応し得る物質は合成されないことを示してお
り、従ってＡＧ−遺伝子は牛キモシン遺伝子で置換され
たことが結論付けられる。
Ｃ１分泌タンパクの量に及ぼす遺伝子置換の影響グルコ
アミラーゼはＡ、ニガーによって分泌される全タンパク
の実質的部分をなす（例えばカレン（（：ｕｌｌｅｎ）
等の上記文献）。従って、グルコアミラーゼ遺伝子の他
のタンパク遺伝子による置換は、Ａ、ニガー形質転換体
により分泌されるタンパクの量に影響し、発酵ブロスの
タンパク含量における減少は、他の分泌タンパクの精製
を容易にする。
アミラーゼはＡ、ニガーによって分泌される全タンパク
の実質的部分をなす（例えばカレン（（：ｕｌｌｅｎ）
等の上記文献）。従って、グルコアミラーゼ遺伝子の他
のタンパク遺伝子による置換は、Ａ、ニガー形質転換体
により分泌されるタンパクの量に影響し、発酵ブロスの
タンパク含量における減少は、他の分泌タンパクの精製
を容易にする。
更に、分泌経路の能力が制限されていれば、細胞からの
グルコアミラーゼの除去は、他のタンパクに対して該分
泌経路を開放する。
グルコアミラーゼの除去は、他のタンパクに対して該分
泌経路を開放する。
分泌タンパクの量に与える遺伝子置換の効果を調べるた
めに、発酵上澄のタンパク含有率を標準的方法で測定し
、宿主のデータと比較した。第１表はかくして得た結果
を総めたものである。
めに、発酵上澄のタンパク含有率を標準的方法で測定し
、宿主のデータと比較した。第１表はかくして得た結果
を総めたものである。
爪上表：発酵プロスのタンパク含量
（１４参 ）
菌 株 タンパク濃度（■／ｍｊり＾、ニガ
ー０５２９７５ ０．１４３Ａ、ニガ
ー０５２９７５ ＋ ｐＡＢ６４−７２ ０．０９
６Ａ、ニガー０Ｓ２９７５ ＋ ｐＡＢ６４−７３
０．０８２Ａ、ニガーＤＳ２９７５ ＋ ｐＡＢ６４
−７５ ０．０７にの実験で得られた結果は、分析
された形質転換体中に高度に表現されたグルコアミラー
ゼ遺伝子がないことと一致している。
ー０５２９７５ ０．１４３Ａ、ニガ
ー０５２９７５ ＋ ｐＡＢ６４−７２ ０．０９
６Ａ、ニガー０Ｓ２９７５ ＋ ｐＡＢ６４−７３
０．０８２Ａ、ニガーＤＳ２９７５ ＋ ｐＡＢ６４
−７５ ０．０７にの実験で得られた結果は、分析
された形質転換体中に高度に表現されたグルコアミラー
ゼ遺伝子がないことと一致している。
実施例４＝キモシンおよびＡＧ−シグナルペプチドを用
いたＡ、ニガーによる牛キモシ ンの 現および 実施例２記載の如く、線状化したｐＡＢ６４−７２およ
びｐＡＢ６４−７３でＡ、ニガーを形質転換した。この
形質転換体中での遺伝子置換の出現は実施例３のように
して確認した。単一の芽胞単離体から始めて、選別され
た形質転換体をキモシンの産生および分泌につき分析し
た。キモシンは通常チモーゲンとして分泌され、この分
泌された酵素は短いＮ−末端ペプチド（プロキモシン）
の存在のために不活性である。このチモーゲンは、例え
ば酵素を用いた開裂によってこの短いＮ−末端ペプチド
を除去することにより、またはキモシンの場合には低ｐ
Ｈの下でインキュベートすることにより活性化される。
いたＡ、ニガーによる牛キモシ ンの 現および 実施例２記載の如く、線状化したｐＡＢ６４−７２およ
びｐＡＢ６４−７３でＡ、ニガーを形質転換した。この
形質転換体中での遺伝子置換の出現は実施例３のように
して確認した。単一の芽胞単離体から始めて、選別され
た形質転換体をキモシンの産生および分泌につき分析し
た。キモシンは通常チモーゲンとして分泌され、この分
泌された酵素は短いＮ−末端ペプチド（プロキモシン）
の存在のために不活性である。このチモーゲンは、例え
ば酵素を用いた開裂によってこの短いＮ−末端ペプチド
を除去することにより、またはキモシンの場合には低ｐ
Ｈの下でインキュベートすることにより活性化される。
従って、分泌されたキモシンの活性を正確に測定するこ
めには、すべての分泌されたプロキモシンを低ｐＨ処理
によってその活性型に転化する。
めには、すべての分泌されたプロキモシンを低ｐＨ処理
によってその活性型に転化する。
Ａ、ＡＧ＝遺伝子の遺伝子置換を含むＡ、ニガーの形質
転換体の発酵 選別された形質転換体の約１０７個の芽胞を、液状予備
培養培地１００ｒｒ＋ｆを含む振盪フラスコ内でインキ
ュベートした。この培地はＫＨ２ＰＯ４（１ｇ／ｌ）、
マルトース（３０ｇ／β）、酵母抽出物（５ｇ／ｊ２）
、氷解カゼイン（１０ｇ／ｆ）ＭｇＳ０４ ・７１１
□０（０，５ｇ／Ｉｌ）およびツイーン８０（Ｔｗｅｅ
ｎ ８０） （３ｇ／ ｆ）を含んでいた。これら培
養物を３４℃にて４８時間育生した。サンプルををキモ
シン産生の分析のため、およびｍＲＮＡ単離のために採
取した。この培養物１０ｍＡを１００ｍ（ｌの発酵培地
に接種した。この発酵培地はに１１２ＰＯ４（１ｇ／ｊ
り 、コーンスターチ（７０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（１
２，５ｇ／ｊ）、氷解カゼイン（２５ｇ／ｌ）、ＭｇＳ
Ｏ４（２ｇ／ｊり、Ｍｇ５Ｏ。
転換体の発酵 選別された形質転換体の約１０７個の芽胞を、液状予備
培養培地１００ｒｒ＋ｆを含む振盪フラスコ内でインキ
ュベートした。この培地はＫＨ２ＰＯ４（１ｇ／ｌ）、
マルトース（３０ｇ／β）、酵母抽出物（５ｇ／ｊ２）
、氷解カゼイン（１０ｇ／ｆ）ＭｇＳ０４ ・７１１
□０（０，５ｇ／Ｉｌ）およびツイーン８０（Ｔｗｅｅ
ｎ ８０） （３ｇ／ ｆ）を含んでいた。これら培
養物を３４℃にて４８時間育生した。サンプルををキモ
シン産生の分析のため、およびｍＲＮＡ単離のために採
取した。この培養物１０ｍＡを１００ｍ（ｌの発酵培地
に接種した。この発酵培地はに１１２ＰＯ４（１ｇ／ｊ
り 、コーンスターチ（７０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（１
２，５ｇ／ｊ）、氷解カゼイン（２５ｇ／ｌ）、ＭｇＳ
Ｏ４（２ｇ／ｊり、Ｍｇ５Ｏ。
・７８２０ （０，５ｇ／ １） 、ＺｎＣｊ！ｔ
（０，０３ｇ／ ｊり、Ｃａｌ！ｚ （０，０２ｇ
／ １） 、ＭｇＳＯ４・４１１２０（０，０１ｇ／ｊ
りおよびＦｅ５Ｏａ （０，３ｇ／ Ａ’）を含んで
いた。これら培養物を３４℃にて４８時間インキュベー
トした。再び、サンプルをキモシン産生分析のため、お
よびｍＲＮＡ単離のために採取した。
（０，０３ｇ／ ｊり、Ｃａｌ！ｚ （０，０２ｇ
／ １） 、ＭｇＳＯ４・４１１２０（０，０１ｇ／ｊ
りおよびＦｅ５Ｏａ （０，３ｇ／ Ａ’）を含んで
いた。これら培養物を３４℃にて４８時間インキュベー
トした。再び、サンプルをキモシン産生分析のため、お
よびｍＲＮＡ単離のために採取した。
Ｂ９菌糸体サンプル中のｍＲＮＡ濃度の測定菌糸体を収
穫し、蒸留水で洗浄し、ＲＮアーゼを含まない乳鉢と乳
棒とを用いて、液体窒素中で微粉末に粉砕した。この粉
末をホモゲナイズ用バッファ （４Ｍのグアニジンイソ
チオシアネート、５ｍＭナトリウムシトレートｐＨ７，
Ｏ；０、ＩＭのβ−メルカプトエタノール；０．５％（
ｗ／ｖ）のＮラウロイルザルコシンナトリウム塩（シグ
マ（Ｓｉｇｍａ）社Ｌ−５１２５）に２ ｍ Ｉ！ ／
ｇ ”’Ｑ溶解し、３７℃にて３０分間インキュベー
トした。５０００ｒｐＩＴＩで１５分間遠心した後の上
澄に０．４ｇ／ｒｒｌのＲＮアーゼを含まないＣｓＣ１
を加えた。この溶液を、５．７ Ｍ［：ｓＣｊ！クツシ
ョンを０．１ＭＥＤＴＡに溶したものの上に注意深く重
層し、Ｔｉ４２．１０−タ中で２０℃にて３８０００
ｒｐｍで１７時間遠心した。透明なＲＮＡペレットを、
グアニジンイソチオシアネート溶液を除去した後に、Ｒ
Ｎアーゼを含まないバッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ２ｐＨ７，４； ５ ｍＭのＥＤＴＡ ； １％５Ｄ
Ｓ）中に溶解した。等量のクロロホルム−ブタノール（
４：１）混合物により抽出した後、ＲＮＡをナトリウム
アセテートおよびエタノールで沈殿させ、ＲＮアーゼを
含まない水に溶解した。
穫し、蒸留水で洗浄し、ＲＮアーゼを含まない乳鉢と乳
棒とを用いて、液体窒素中で微粉末に粉砕した。この粉
末をホモゲナイズ用バッファ （４Ｍのグアニジンイソ
チオシアネート、５ｍＭナトリウムシトレートｐＨ７，
Ｏ；０、ＩＭのβ−メルカプトエタノール；０．５％（
ｗ／ｖ）のＮラウロイルザルコシンナトリウム塩（シグ
マ（Ｓｉｇｍａ）社Ｌ−５１２５）に２ ｍ Ｉ！ ／
ｇ ”’Ｑ溶解し、３７℃にて３０分間インキュベー
トした。５０００ｒｐＩＴＩで１５分間遠心した後の上
澄に０．４ｇ／ｒｒｌのＲＮアーゼを含まないＣｓＣ１
を加えた。この溶液を、５．７ Ｍ［：ｓＣｊ！クツシ
ョンを０．１ＭＥＤＴＡに溶したものの上に注意深く重
層し、Ｔｉ４２．１０−タ中で２０℃にて３８０００
ｒｐｍで１７時間遠心した。透明なＲＮＡペレットを、
グアニジンイソチオシアネート溶液を除去した後に、Ｒ
Ｎアーゼを含まないバッファ（１０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ２ｐＨ７，４； ５ ｍＭのＥＤＴＡ ； １％５Ｄ
Ｓ）中に溶解した。等量のクロロホルム−ブタノール（
４：１）混合物により抽出した後、ＲＮＡをナトリウム
アセテートおよびエタノールで沈殿させ、ＲＮアーゼを
含まない水に溶解した。
ＲＮＡサンプルを電気泳動に付し、標準的方法を用いて
ジーヌスクリーンプラス（ＴＭ）上にプロットした。こ
のプロットをＡＧおよびキモシンｍＲＮＡに相同のオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド化した。
ジーヌスクリーンプラス（ＴＭ）上にプロットした。こ
のプロットをＡＧおよびキモシンｍＲＮＡに相同のオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリッド化した。
このために、該オリゴヌクレオチド配列をＡＧ−リーダ
から選別した。
から選別した。
該ＡＧ−リーダはＡＧ−ｍＲＮＡおよびキモシン−ＡＧ
融合ｍＲＮＡ （すべての構築体において、ＡＧ−キモ
シン融合体は翻訳開始（ｐＡＢ６４７２）位置あるいは
翻訳開始位置を越えた位置（ｐＡＢ６４−７３および７
５）にある）両者に存在する。従って、あらゆる転写体
はＡ Ｇ −Ｕ −ダを含む。
融合ｍＲＮＡ （すべての構築体において、ＡＧ−キモ
シン融合体は翻訳開始（ｐＡＢ６４７２）位置あるいは
翻訳開始位置を越えた位置（ｐＡＢ６４−７３および７
５）にある）両者に存在する。従って、あらゆる転写体
はＡ Ｇ −Ｕ −ダを含む。
殿粉含有培地中で菌糸様を培養した後、ハイブリッド化
ＲＮＡ分子はすべてのサンプル中に検出され、最大収率
はｐＡＢ６４−７３について得られた。宿主内で、この
ハイブリッド化ｍ ＲＮ ＡはＡＧ−ｍＲＮＡに予想さ
れる長さを有し、形質転換体中のハイブリッド化ｍＲＮ
Δは種々の表現カセットに対し期待される長さであった
。宿主中のＡＧに対するｍＲＮＡの濃度はｐＡＢ６４−
７３形質転換体中のキモシンｍＲＮＡ濃度と同じであっ
た。このことはこれら形質転換体中のＡＧ座におけるハ
イブリッド遺伝子が元のＡＧ−遺伝子の効率と同じ効率
で転写されることを示している。
ＲＮＡ分子はすべてのサンプル中に検出され、最大収率
はｐＡＢ６４−７３について得られた。宿主内で、この
ハイブリッド化ｍ ＲＮ ＡはＡＧ−ｍＲＮＡに予想さ
れる長さを有し、形質転換体中のハイブリッド化ｍＲＮ
Δは種々の表現カセットに対し期待される長さであった
。宿主中のＡＧに対するｍＲＮＡの濃度はｐＡＢ６４−
７３形質転換体中のキモシンｍＲＮＡ濃度と同じであっ
た。このことはこれら形質転換体中のＡＧ座におけるハ
イブリッド遺伝子が元のＡＧ−遺伝子の効率と同じ効率
で転写されることを示している。
Ｃ，Ａ、ニガーによる牛キモシンの分泌の証明形質転換
体および宿主両者の発酵ブロスのサンプルを１２．５％
ポリアクリルアミド−３ＯＳゲル中で電気泳動した。次
いで、このゲルを標準的方法ヲ用イてニトロセルロース
上にプロットした。
体および宿主両者の発酵ブロスのサンプルを１２．５％
ポリアクリルアミド−３ＯＳゲル中で電気泳動した。次
いで、このゲルを標準的方法ヲ用イてニトロセルロース
上にプロットした。
精製キモシンに対して生成するモノクローナル抗体を用
いて、キモシンの免疫的検出を行った。
いて、キモシンの免疫的検出を行った。
対照として、精製キモシンをも電気泳動し、同じ実験に
おいてプロットした。すべての形質転換体サンプル中に
おける正確な長さのバンドの存在（ただし宿主サンプル
にはない）は、テストした２種の構築体のいずれを用い
ても牛キモシンの表現および分泌を示している。最大キ
モシン収率は構築体ｐΔＢ６Ｌ−７３について得られた
が、ｐＡＢ６１−７２形質転換体によるキモシンの分泌
も、Ａ、ニガー中で該キモシンシグナルペプチドが機能
性であることを示している。
おいてプロットした。すべての形質転換体サンプル中に
おける正確な長さのバンドの存在（ただし宿主サンプル
にはない）は、テストした２種の構築体のいずれを用い
ても牛キモシンの表現および分泌を示している。最大キ
モシン収率は構築体ｐΔＢ６Ｌ−７３について得られた
が、ｐＡＢ６１−７２形質転換体によるキモシンの分泌
も、Ａ、ニガー中で該キモシンシグナルペプチドが機能
性であることを示している。
凝固活性を、基質として脱水スキムミルク（デイフコ（
Ｄ Ｉ ＦＣＯ）社）を用い、かつ標準として公知力価
の牛しネソトを用い、標準的プロトコールに従って測定
した。ｐＡＢ６４−７３について、収率は１８〜４５Ｍ
ＣＵ／ｍｆであり、ｐＡＢ６４−７２では７〜１５ＭＣ
ＬＩ／ｍｊ！であった。
Ｄ Ｉ ＦＣＯ）社）を用い、かつ標準として公知力価
の牛しネソトを用い、標準的プロトコールに従って測定
した。ｐＡＢ６４−７３について、収率は１８〜４５Ｍ
ＣＵ／ｍｆであり、ｐＡＢ６４−７２では７〜１５ＭＣ
ＬＩ／ｍｊ！であった。
（ここでＩＭＣＵは３５℃にて４０分以内に１ｍｌのミ
ルクを凝固させるキモシンの量である。）発酵ブロス中
に得られたキモシンの量は１１．５ａｇ／ｌまでであり
、これは人、ニデユランスの形質転換体につき報告され
ている値よりも実質的に大きく、これは恐らく類似のキ
モシン表現カセ・ノドのコピーを多量にもっていると思
われる（０．５〜２．５ｗ／Ａ；クラン（ｃｕｌｌａｎ
）等、上記文献およびＯ〜７ｍｇ／ｆ！ ； ＥＰ−Ａ
−０２１５５９４号）。
ルクを凝固させるキモシンの量である。）発酵ブロス中
に得られたキモシンの量は１１．５ａｇ／ｌまでであり
、これは人、ニデユランスの形質転換体につき報告され
ている値よりも実質的に大きく、これは恐らく類似のキ
モシン表現カセ・ノドのコピーを多量にもっていると思
われる（０．５〜２．５ｗ／Ａ；クラン（ｃｕｌｌａｎ
）等、上記文献およびＯ〜７ｍｇ／ｆ！ ； ＥＰ−Ａ
−０２１５５９４号）。
実施例５；人、ニガー由来のＡＧ−プロキモシン融八タ
ンパクの および 線状化したｐＡＢ６４−７５を人、ニガーに形質転換さ
せた。上記実施例記載のように、選別形質転換体を分析
した。キモシン特異的ｍＲＮＡがこの形質転換体につき
立証され、その表現レベルはｐＡＢ６１−７２とｐＡＢ
６４−７３との中間的値を示した。これら形質転換体に
よるキモシンの分泌はウェスタンプロット法および凝固
アッセイ両方で立証され、その活性は１７〜２９ＭＣＵ
／ ｍ ｉ！であった。
ンパクの および 線状化したｐＡＢ６４−７５を人、ニガーに形質転換さ
せた。上記実施例記載のように、選別形質転換体を分析
した。キモシン特異的ｍＲＮＡがこの形質転換体につき
立証され、その表現レベルはｐＡＢ６１−７２とｐＡＢ
６４−７３との中間的値を示した。これら形質転換体に
よるキモシンの分泌はウェスタンプロット法および凝固
アッセイ両方で立証され、その活性は１７〜２９ＭＣＵ
／ ｍ ｉ！であった。
実施例６：形質転換体中でのキモシン表現および宿主中
でのＡＧ−遺伝子表現の調節 ＡＧ−プロモータの機能性を、唯一の炭素源としてキシ
ロースを含む培地で菌糸体を育生することにより、宿主
および選別形質転換体中で検定した。この場合、ＡＧ−
プロモータは誘起されず（ヌンベルグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ
）等、Ｍｏ！、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、。
でのＡＧ−遺伝子表現の調節 ＡＧ−プロモータの機能性を、唯一の炭素源としてキシ
ロースを含む培地で菌糸体を育生することにより、宿主
および選別形質転換体中で検定した。この場合、ＡＧ−
プロモータは誘起されず（ヌンベルグ（Ｎｕｎｂｅｒｇ
）等、Ｍｏ！、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、。
１９８４．４．２３０６−２３１５）かつＡＧ−ブロモ
−６夕の制御下にあるＡＧ−遺伝子および牛キモシン遺
伝子いずれによっても表現は期待されない。次に、菌糸
体を、ＡＧ−プロモータの誘起が生ずることが知られて
いる殿粉含有培地（ヌンベルグ等の上記文献）に接種す
る。この予想された誘発は、キシロース生育菌糸体中に
おける特異的ｍＲＮＡの不在に反して、殿粉上で育成し
た場合には、宿主中のＡＧ−特異的ｍＲＮＡおよび形質
転換体中のキモシン特異的ｍＲＮＡの存在により、ノー
ザンプロツティング実験から立証された。
−６夕の制御下にあるＡＧ−遺伝子および牛キモシン遺
伝子いずれによっても表現は期待されない。次に、菌糸
体を、ＡＧ−プロモータの誘起が生ずることが知られて
いる殿粉含有培地（ヌンベルグ等の上記文献）に接種す
る。この予想された誘発は、キシロース生育菌糸体中に
おける特異的ｍＲＮＡの不在に反して、殿粉上で育成し
た場合には、宿主中のＡＧ−特異的ｍＲＮＡおよび形質
転換体中のキモシン特異的ｍＲＮＡの存在により、ノー
ザンプロツティング実験から立証された。
また、誘発条件下でのキモシンの分泌は発酵ブロスのイ
ム５ノブロツトあるいは発酵ブロスの凝固活性の測定に
より立証される。キシロース育生培養物中には、凝固検
定によってキモシン活性はみられず、またウェスタンプ
ロット実験の結果もこの場合には負であった。これらの
実験は、牛キモシン遺伝子の表現の調節がＡＧ−遺伝子
の調節に類似していることおよびグルコアミラーゼ遺伝
子の表現に関する一般的知見と一致していることを示し
ている。
ム５ノブロツトあるいは発酵ブロスの凝固活性の測定に
より立証される。キシロース育生培養物中には、凝固検
定によってキモシン活性はみられず、またウェスタンプ
ロット実験の結果もこの場合には負であった。これらの
実験は、牛キモシン遺伝子の表現の調節がＡＧ−遺伝子
の調節に類似していることおよびグルコアミラーゼ遺伝
子の表現に関する一般的知見と一致していることを示し
ている。
実施例７：プロテアーゼ阻害剤の存在下でのキモシンの
表 Ａ、ニガーにより分泌されるプロテアーゼに対するキモ
シンの感度をプロテアーゼ阻害剤の存在または不在下で
形質転換体を培養することにより調べた。
表 Ａ、ニガーにより分泌されるプロテアーゼに対するキモ
シンの感度をプロテアーゼ阻害剤の存在または不在下で
形質転換体を培養することにより調べた。
このために、構築体ｐＡＢ６４−７３ （実施例３Ａ）
を含む宿主菌株ＤＳ２９７５の形質転換体を実施例４記
載のようにして培養した。この培地にペブスクチンおよ
びα２−マクログロブリンを最終濃度ｌμｇ ／ ｍ
Ｉ！および５μｇ ／ ｍ Ａ’となるように加えじ＋
”）あるいはプロテアーゼ阻害剤を添加しなかった（“
−”）。数回に亘りある間隔でサンプルを採取し、分泌
されたキモシンの量を実施例３Ｂ記載のようにウェスタ
ンプロット法で検定した。結果を第２表に与える。
を含む宿主菌株ＤＳ２９７５の形質転換体を実施例４記
載のようにして培養した。この培地にペブスクチンおよ
びα２−マクログロブリンを最終濃度ｌμｇ ／ ｍ
Ｉ！および５μｇ ／ ｍ Ａ’となるように加えじ＋
”）あるいはプロテアーゼ阻害剤を添加しなかった（“
−”）。数回に亘りある間隔でサンプルを採取し、分泌
されたキモシンの量を実施例３Ｂ記載のようにウェスタ
ンプロット法で検定した。結果を第２表に与える。
星主衷ニブロチアーゼ阻害剤を含む（“＋”）または含
まない（′−″）培養物中 このデータは、発酵ブロス中に存在するプロテアーゼに
よる分解に対してキモシンは感受性であることを示して
いる。これらプロテアーゼの不活性化（プロテアーゼ阻
害剤の添加により例示される）はキモシンの収率の増大
に導き、プロテアーゼの存在下で、発酵ブロス中におけ
るキモシンの長期に亘る存在から判断すると、安定性も
増大することがわかる。
まない（′−″）培養物中 このデータは、発酵ブロス中に存在するプロテアーゼに
よる分解に対してキモシンは感受性であることを示して
いる。これらプロテアーゼの不活性化（プロテアーゼ阻
害剤の添加により例示される）はキモシンの収率の増大
に導き、プロテアーゼの存在下で、発酵ブロス中におけ
るキモシンの長期に亘る存在から判断すると、安定性も
増大することがわかる。
上記結果から、本発明の表現系はタンパクの高効率での
産生を与えることがわかる。更に、高濃度で産生される
分泌タンパクを表現する遺伝子を含む座に対象とする遺
伝子を導入することにより、該対象とする遺伝子の高濃
度での産生が得られる。
産生を与えることがわかる。更に、高濃度で産生される
分泌タンパクを表現する遺伝子を含む座に対象とする遺
伝子を導入することにより、該対象とする遺伝子の高濃
度での産生が得られる。
このように、宿主細胞の分泌負荷を減じて、所定の生成
物を高い分泌率で得ることができる。初めに、分泌の点
で有効な宿主を用いることにより、本発明の系を対象と
する生成物、例えば医薬、工業的酵素などの工業生産の
ために使用することができる。
物を高い分泌率で得ることができる。初めに、分泌の点
で有効な宿主を用いることにより、本発明の系を対象と
する生成物、例えば医薬、工業的酵素などの工業生産の
ために使用することができる。
本明細書で引用したすべての刊行物および特許出願を本
発明の参考文献とする。
発明の参考文献とする。
以上、本発明をその理解を容易にするために例示および
実施例によって詳細に記載してきたが、上記特許請求の
範囲または発明の精神を逸脱することなく、ある種の変
更並びに改良を施し得ることは、本発明の教示に照らし
て、当業者には明らかであろう。
実施例によって詳細に記載してきたが、上記特許請求の
範囲または発明の精神を逸脱することなく、ある種の変
更並びに改良を施し得ることは、本発明の教示に照らし
て、当業者には明らかであろう。
第１図はＡ、ニガーグルコアミラーゼ（ＡＧ）遺伝子を
単離するのに用いられたオリゴヌクレオチドを示した図
であり、 第２図は、実施例で用いられたＡ、ニガーグルコアミラ
ーゼ（ＡＧ）遺伝子、構築されたサブクローンおよびハ
イブリッド形式プローブの地図であり、 第３図は、ｐＡＢ６４−４０のＭＩｔ成を示す図であり
、 第４図はｐＡＮ７６−１の模式的な表示であり、第５図
はｍＡＢ６４−０の模式的な表示であり、第６図はｐＡ
Ｂ６４−７２、ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７
５の模式的表示であり、および 第７図はグルコアミラーゼ座での遺伝子置換の模式的表
示である。 図面の浄８（内容に変更なし） ５’−ＧＡＣ入ＡＴ ＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣ
ＣＧＣＡ ＡＣＧ ＧＡＣＡＴＴ ＧＴＴ Ｔ
ＧＧ ＣＣＣ−３（４２−マー） ５’−Ａ）、Ｇ ＣＡＧ ＣＣＡ ＴＴＧ Ｃ
ＣＣＧＭ ＧＣＣＧＡＴ−３’（２４−マー） 第５図 手 続 補 正 書く方式） ％式％ 【、事件の表示 平成１年特許願第２１ １２１０号 ２、発明の名称 アスペルギルス株４Ｙｉ５用手段としての遺伝子置換 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ４、代 理 人 ５、補正命令の日付 平成１年１１月２８日
単離するのに用いられたオリゴヌクレオチドを示した図
であり、 第２図は、実施例で用いられたＡ、ニガーグルコアミラ
ーゼ（ＡＧ）遺伝子、構築されたサブクローンおよびハ
イブリッド形式プローブの地図であり、 第３図は、ｐＡＢ６４−４０のＭＩｔ成を示す図であり
、 第４図はｐＡＮ７６−１の模式的な表示であり、第５図
はｍＡＢ６４−０の模式的な表示であり、第６図はｐＡ
Ｂ６４−７２、ｐＡＢ６４−７３およびｐＡＢ６４−７
５の模式的表示であり、および 第７図はグルコアミラーゼ座での遺伝子置換の模式的表
示である。 図面の浄８（内容に変更なし） ５’−ＧＡＣ入ＡＴ ＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣ
ＣＧＣＡ ＡＣＧ ＧＡＣＡＴＴ ＧＴＴ Ｔ
ＧＧ ＣＣＣ−３（４２−マー） ５’−Ａ）、Ｇ ＣＡＧ ＣＣＡ ＴＴＧ Ｃ
ＣＣＧＭ ＧＣＣＧＡＴ−３’（２４−マー） 第５図 手 続 補 正 書く方式） ％式％ 【、事件の表示 平成１年特許願第２１ １２１０号 ２、発明の名称 アスペルギルス株４Ｙｉ５用手段としての遺伝子置換 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ４、代 理 人 ５、補正命令の日付 平成１年１１月２８日
Claims (28)
- （１）￥インビトロ￥での組換えにより得られ、かつ転
写開始調節領域、対象となる構造遺伝子をもつ読取り枠
中に分泌すべきシグナル配列をコードするオープン読取
り枠および転写終結調節領域を含むＤＮＡ表現カケット
を含むクロモソームを含み、 該調節領域は糸状菌宿主内で機能性であり、該宿主は更
に非機能性分泌遺伝子をもつ ことを特徴とする糸状菌宿主。 - （２）該非機能性分泌遺伝子が、該分泌遺伝子と相同の
ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体との相同組換えのために
非機能性である請求項１記載の糸状菌宿主。 - （３）転写開始調節領域、対象とする構造遺伝子をもつ
読取り枠中に分泌すべきシグナル配列をコードするオー
プ読取り枠および転写終結調節領域を包含するＤＮＡ表
現カセットを含むクロクロモソームを含み、該カセット
は分泌されるタンパク生成物をコードし、かつ該内在性
タンパク生成物の表現を阻害する内在性遺伝子のある部
位に位置し、該調節領域が糸状菌宿主内で機能性である
ことを特徴とする糸状菌宿主。 - （４）該宿主が￥アスペルギルス￥（￥Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ￥）である請求項３記載の糸状菌宿主。 - （５）該内在性遺伝子がグルコアミラーゼ遺伝子である
請求項４記載の糸状菌宿主。 - （６）該￥アスペルギルス￥が￥アスペルギルス￥￥ニ
ガー￥（￥Ａ．ｎｉｇｅｒ￥）である請求項４記載の糸
状菌宿主。 - （７）該カセットが更にマーカーを含み、これにより該
マーカーを含む宿主が選別される請求項３記載の糸状菌
宿主。 - （８）該オープン読取り枠がキモシンまたはそのプリカ
ーサ形の一種をコードする請求項３記載の糸状菌宿主。 - （９）該シグナル配列がグルコアミラーゼシグナル配列
である請求項３記載の糸状菌宿主。 - （１０）転写開始調節領域と、対象とする構造遺伝子を
もつ読取り枠に分泌すべきグルコアミラーゼシグナル配
列をコードするオープン読取り枠と、転写終結調節領域
とを含むＤＮＡ表現カセットを含有するクロモソームを
含み、該カセットは該グルコアミラーゼ遺伝子座に位置
し、かつ該遺伝子生成物の表現を阻害し、該調節領域は
￥アスペルギルス￥糸状菌宿主内で機能性であることを
特徴とするアスペルギルス糸状菌宿主。 - （１１）該￥アスペルギルス￥が￥アスペルギルス￥￥
ニガー￥または￥アスペルギルス￥￥アワモリ￥である
請求項１０記載の糸状菌宿主。 - （１２）該表現カセットが更にマーカーを含み、それに
より該マーカーを含む宿主が選別される請求項１０記載
の糸状菌宿主。 - （１３）該オープン読取り枠がキモシンまたはそのプリ
カーサ形の一種をコードする請求項１０記載の糸状菌宿
主。 - （１４）シグナル配列を含み、かつ分泌される糸状菌タ
ンパクをコードする内在遺伝子座と相同のＤＮＡ配列と
、該内在遺伝子以外の対象とするタンパクをコードする
オープン読取り枠とを含み、該オープン読取り枠はある
領域と５′で境界をなし、該相同領域および該５′−領
域は糸状菌宿主内で機能性である転写開始調節領域と、
該オープン読取り枠をもつ読取り枠中のシグナル配列と
を含むことを特徴とするＤＮＡ構築体。 - （１５）該相同配列が、上記シグナル配列および上記内
在遺伝子の該開始調節領域の少なくとも一方のセグメン
トを含んでいる請求項１４記載のＤＮＡ構築体。 - （１６）該５′−領域が上記シグナル配列および上記内
在遺伝子の該開始調節領域の少なくとも一方のセグメン
トを含んでいる請求項１４記載のＤＮＡ構築体。 - （１７）該内在遺伝子がグルコアミラーゼ遺伝子である
請求項１４記載のＤＮＡ構築体。 - （１８）該オープン読取り枠がキモシンまたはそのプリ
カーサ形の一種をコードする請求項１４記載のＤＮＡ構
築体。 - （１９）該相同配列が該内在遺伝子の転写開始調節領域
の配列５′を含む請求項１４記載のＤＮＡ構築体。 - （２０）該構築体が更にマーカーを含み、そのため該マ
ーカーを含む宿主を選別できる請求項１４記載のＤＮＡ
構築体。 - （２１）栄養培地中で、 インビトロでの組換えにより得られ、かつ転写開始調節
領域と、対象となる構造遺伝子をもつ読取り枠中に分泌
すべきシグナル配列をコードするオープン読取り枠と、
転写終結調節領域とを含むＤＮＡ表現カセットを包含す
るクロモソームを含む糸状菌宿主であって、 該調節領域が該宿主内で機能性であり、該宿主は更に非
−機能性分泌遺伝子をもつことで特徴付けられ、かくし
て該対象とする遺伝子を表現かつ分泌する、上記糸状菌
宿主を育生し、かつ該栄養培地から該生成物を単離する 各工程を含む該対象とするタンパクの製法。 - （２２）該非−機能性分泌遺伝子が、該分泌遺伝子と相
同のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体との相同組換えのた
めに非−機能性である請求項２１記載の対象とするタン
パクの製法。 - （２３）転写開始調節領域と、対象とする構造遺伝子を
もつ読取り枠に分泌すべきシグナル配列をコードするオ
ープン読取り枠と、転写終結調節領域とを包含するＤＮ
Ａ表現カセットを含むクロモソームを含む糸状菌宿主で
あって、該カセットは分泌されたタンパク生成物をコー
ドし、かつ該内在タンパク生成物の表現を阻害する内在
遺伝子のある部位に位置し、かつ該調節領域は該宿主内
で機能性であり、かくして該対象とする遺伝子を表現し
かつ分泌する該糸状菌宿主を栄養培地中で育生し、かつ 該栄養培地から該生成物を単離する 各工程を含む対象とするタンパクの製法。 - （２４）該内在性遺伝子がグルコアミラーゼ遺伝子であ
る請求項２３記載の方法。 - （２５）該糸状菌が￥アスペルギルス￥である請求項２
３記載の方法。 - （２６）該￥アスペルギルス￥が￥アスペルギルス￥￥
ニガー￥または￥アスペルギルス￥￥アワモリ￥である
請求項２５記載の方法。 - （２７）該対象とする遺伝子がキモシンまたはそのプリ
カーサ形の一種をコードする遺伝子である請求項２６記
載の方法。 - （２８）該構築体がマーカーを含み、かつ該方法が更に
選別条件の下で該宿主を育生する工程を含む請求項２６
記載の方法。
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