DK175196B1 - Transformeret filamentös fungusvært med en ekspressionskassette, DNA-konstruktion med en sådan ekspressionskassette og fremgangsmåde til fremstilling af et protein under anvendelse af en sådan transformert filamentös fungusvært - Google Patents

Description

i DK 175196 B1

Opfindelsen angår en transformeret filamentøs fun-gusvært omfattende en ekspressionskassette stammende fra in vitro rekombination og omfattende en transkriptionsi-nitieringsregulerende region, en åben læseramme kodende 5 for en signalsekvens til udskillelse, i læseramme med et strukturgen af interesse og en transkriptionstermine-ringsregulerende region. Opfindelsen angår yderligere en DNA konstruktion med en som ovenfor nævnt ekspressionskassette, og endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde 10 til fremstilling af et protein af interesse.·

Muligheden for at transformere levedygtige celler med DNA, der er i stand til at eksprimeres, har åbnet mange veje til nye og forbedrede produkter. Denne mulighed har tilladt produktion af en lang række patte-15 dyrsproteiner, der ellers ikke uden videre var tilgængelige. I andre tilfælde, især når det drejede sig om blodproteiner, var nødvendigheden af at benytte naturlige kilder til produktionen af sådanne proteiner efterhånden blevet mere og mere uakceptabel på grund af de udbredte problemer med hepatitis og AIDS. Ud over 20 pattedyrsproteiner til medicinsk anvendelse eksisterer en række andre proteiner, især enzymer, der finder, anvendelse i en række kommercielle processer. Chymosin kan anvendes ved ostefremstilling, lipaser kan blandt andet anvendes ved transesterificeringsreaktioner, pro-25 teaser kan bl.a. anvendes i forbindelse med fødevarer og medicinvarer og lignende.

ved produktionen af sådanne forskellige produkt-ter er der en stærk interesse i produktionsøkonomien.

Det første, man bør betragte, er ekspressionsniveauet for det ønskede produkt. Derefter er stabiliteten af produktet i den udvalgte vært af betydning. Et tredie problem er isolering og rensning af produktet, især når dette skal være et additiv til medicinalvarer eller fødevarer .

I DK 175196 B1 I

I I

I Afhængig af en funktionel signalsekvens vil ved I

I produktion af proteinproduktet produktet kunne blive I

I tilbageholdt i cytoplasmaet eller blive udskilt i næ- I

ringsmediet. Forskellige værter har forskellige udskil-

I 5 lelsesprodukter samt forskellige niveauer for udskil- I

I lelsese, idet udskillelse kan være inducibel eller ikke I

I inducibel. I de fleste situationer har udskillelse man- I

I ge fordele, da produktet kan isoleres fra næringsmediet I

I i det væsentlige fri for intracellulære proteiner og I

I 10 celleaffald. Den nødvendige adskillelse vil således kun I

I skulle foregå fra andre proteiner udskilt af værten og I

I de små mængder protein, der kan skyldes lysering eller I

I nedbrydning af celler. Det er derfor af betydelig in- I

I teresse at tilvejebringe systemer, der fører til effek- I

I tiv eksprimering og udskillelse af produkter af inter- I

I 15 esse under betingelser, der tillader let isolering og I

I oprensning. I

I Transformering af filamentøse fungi findes be- I

I skrevet af mange forfattere (Tilburn et al., Gene 26

I (1983) 205-221; John og Peberdy, Enzyme Microb. I

I 20 Technol. 6 (1984) 386-389; Ballance og Turner, Gene 36^ I

I (1985) 321-331; Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. I

I Genet. 206 (1987 ) 71-75; Goosen et al., Curr. Genet. 1_1 I

I (1987) 499-503); i EP-A-0134438 og 0238023 og Interna- I

I tional Patentansøgning (PCT) WO 86/06097. I

I 25 Fungale specier såsom Aspergillus niqer, Asper- „ I

I qillus oryzae, Mucor miehei, og Trichoderma reesei be- I

I nyttes i høj grad til industriel produktion af enzymer I

I f.eks. til anvendelse i fødevareindustrien (se f.eks.

I Strijkert, Antonie van Leeuwenhoek !53 ( 1987 ) 357-362 ). I

I Deres anvendelse er baseret på udskillelseskapaciteten I

I 30 af sådanne mikroorganismer. A. niqer og A. oryzae be- I

I nyttes i store mængder og i kommerciel skala til denne I

I industrielle produktion og er som følge deraf godt ka- I

3 DK 175196 B1 rakteriserede mikroorganismer, hvad angår deres fermenteringsopførsel, Man har benyttet forskellige former for genteknologi på Asperqilli og har opnået transfor-manter, der syntetiserer yderligere nyttige produkter.

5 {Cullen et al., Bio/technology S (1987) 369-376; Gwynne et al., Bio/technology 5 (1987) 713-719). I disse tilfælde er det udvalgte protein blevet eksprimeret ud o-ver de proteiner, der normalt udskilles af værten, og således, skal det udvalgte protein adskilles fra disse.

1Q Generstatning findes beskrevet for Asperqilli (f.eks.. Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 1721;

Van Hartingsveldt et al., se ovenfor; Goosen et al.,

Curr. Genet. 1_1 (1987) 499-503; Wernars et al., Mol.

Gen. Genet. 209 (1987) 71-77). For A. nidulans, har _ _ man for gener, der koder for enzymer, der danner dele af biosynteseveje, f.eks. for aminosyrer og nucleoti-der, benyttet forskellige fremgangsmåder. Miller et al.

(se ovenfor) benytter enten en ét-trins generstatning af TrpC-genet med et restriktionsfragment, der kun indeholder et modificeret homologt gen eller en to-trins-20 proces under anvendelse af et cirkulært plasmid. "Et-trins" generstatning kræver en forekomst af to overkrydsninger ved en enkelt generstatning (sammenlign figur 7); ved en to-trinsproces er det første trin et enkelt integreringsforløb fulgt af rekombinering, der 25 bevarer den integrerede genkopi og fjerner den oprindelige. (andet trin). Forekomsten af det andet trin udvælges, idet man gennemsøger for at finde fænotypen af den integrede genkopi.

Man ved, at det naturlige niveau for eksprime^ ^ ring af mange gener i det metaboliske forløb for aminosyrer, f.eks. TrpC og ArgB, kun når et moderat niveau. Enzymerne, som disse gener koder for, udgør kun en meget lille brøkdel af den totale mængde af celleprotein. Imidlertid er disse gener absolut nødvendige,

I DK 175196 B1 I

i 4 I

I idet tabet af sådanne gener fører til auxotrofi og nød- I

I vendighed af at tilføre metabolitten eller aminosyren I

I til vækstmediet. Derfor kan man let udføre erstatning I

I af begge disse gener og foretage generstatning af ana- * I

I 5 loge gener, og man kan let isolere transformanter. (Es- I

I ser og Mohr, Process Biochemistry (1986) 153-159). I

I For A. niqer findes tilsvarende resultater pub- I

I liceret af Van Hartingsveldt et al., se ovenfor og Goo- I

I sen et al., se ovenfor, hvad angår pyrG locus. pyrG ge- I

I net koder for et enzym i biosyntesevejen, der fører til I

I uridin. I disse eksempler blev generstatningen igen fo- I

I retaget i et let udvælgeligt gen, f.eks. i det gen, der I

I blev benyttet som udskillelsesmarkør ved transformatio- I

I nen. I

I 15 Det bør bemærkes, at ingen af de proteiner, der I

I blev opnået ifølge de ovenfor nævnte referencer, blev I

I udskilt, hverken af A. nidulans eller af A. niqer. I

I Der er således et behov for at tilvejebringe I

I generstatningssystemer for genetiske loci, der ekspri- I

I meres aktivt og koder for proteiner, der udgør en væ- I

I ΟΛ

u sentlig del af den totale mængde celleprotein, og for I

I genetiske loci, der koder for proteiner, der aktivt ud- I

I skilles af cellen. I

I Der tilvejebringes ekspressionssystemer for fila- I

I mentøse fungi under anvendelse af værter med effektiv I

I 25 udskillelse, med kassetter konstrueret for homolog re- - I

I kombinering ved placeringen af en sekvens, der koder for

I et højt eksprimeret og udskilt protein. I

I Mere detaljeret er den ovenfor definerede trans- I

I formerede filamentøse fungusvært ifølge opfindelsen I

I 30 ejendommelig ved, at ekspressionskassetten er integreret I

I i et kromosom fra den transformerede filamentøse fun- I

I gusvært ved et på forhånd bestemt mållocus omfattende et I

I gen, hvis ekspressionsprodukt udskilles til en koncen- I

5 DK 175196 B1 tration på mindst ca. 0,1 g/1, og hvor genet i mållocus yderligere er ejendommeligt ved, at det er blevet inaktivere t .

DNA konstruktionen ifølge opfindelsen er ejendom-5 melig ved at den omfatter a) en ekspressionskassette med en transkriptionsinitieringsregulerende region fulgt nedstrøms af et gen af interesse under transkrip-tionskontrol af den transkriptionsinitieringsregulerende region, fulgt nedstrøms af en transkriptionstermine-10 ringsregulerende region, hvor genet af interesse er forsynet med en DNA sekvens kodende for en signalsekvens til udskillelse af produktet kodet for af genet af interesse, b) et udvælgeligt markørgen til valg af transformerede værter, og c) 5'- og 3'-flankerende regioner, der 15 er homologe til 5'- og 3'-regioner i et forudbestemt mållocus omfattende et gen, hvis ekspressionsprodukt udskilles til en koncentration på mindst ca. 0,1 g/1, idet dette locus er endogent for en filamentøs fungus, og hvor DNA konstruktionen yderligere er ejendommelig ved, 20 at komponenterne under a) og b) er anbragt sammen mellem de 5'- og 3'-flankerende regioner.

Endelig er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et protein af interesse ejendommelig ved, at den omfatter i et næringsmiddel at dyrke en 25 transformeret filamentøs fungusvært ifølge opfindelsen.

Integrationen kan bekvemt inkludere et markørprotein, hvor ekspressionskasetten er afgrænset af de 5'- og 3'- ikke-kodende regioner af det gen, der er målet. Transformationen tilvejebringer høje ekspressions-30 niveauer og en effektiv udskillelse. Man opretholder e-ventuelt en proteaseinhibitor i næringsmediet for at forhindre proteolyse af det ønskede produkt.

I DK 175196 B1 I

i 6 I

I På tegningen viser: I

I Figur 1 de oligonucleotider, der benyttes til at I

I isolere A. niqer glucoamylase (AG) genet; I

I Figur 2 et kort over A. niqer glucoamylase (AG) I

I 5 genet, over konstruerede underkloner og over en hybri- I

I diseringsonde, der benyttes i eksperimenterne; I

I Figur 3 konstruktionen af pAB64-40; I

I Figur 4 en skematisk repræsentation af pAN76-l; I

I Figur 5 en skematisk repræsentation af mAB64-0; I

I Figur 6 skematiske repræsentationer af pAB64-72, I

I 10 I pAB64-73 og pAB64-75; og

I Figur 7 en skematisk repræsentation af gener- I

I statning ved glucoamylase locus. I

I Der tilvejebringes effektive ekspressionssyste- I

I mer under anvendelse af filamentøse fungi. Systemerne I

I 15 benytter værter til udskillelse til integrering af eks- I

I pressionskonstruktionerne. Sådanne ekspressionskon- I

I struktioner omfatter genet af interesse, der til homo- I

I log rekombinering er flankeret af 5'- og 3'- ikke ko- I

I dende regioner af mållocus, til integrering. Mållocus I

I 20 omfatte et gen, der koder for et protein til ud- I skillelse. vækst og induktion af transformantværten fø-

I rer til effektiv eksprimering og udskillelse af det øn- I

I skede produkt samt til en let isolering på grund af I

I fravær af ekspressionsprodukterne fra mållocus i næ- I

I ringsmediet.

I 25 I Værter af interesse er sadanne filamentøse fun- I gi, der besidder effektive udskillelsesniveauer for de-

I res endogene proteiner. Industrielle produktionsstammer I

I af Aspergillus, især niqer, awamori eller oryzae er af I

I særlig interesse. Alternativt kan man benytte Tricho-

I 30 derma reesei, M. miehei og aspergilli, såsom A. fi- I

I cuum.

7 DK 175196 B1

Ekspressionskonstruktionen vil omfatte genet af interesse sædvanligvis besiddende en signalsekvens, der fungerer i værten og tilvejebringer udskillelse af ekspressionsproduktet. Til homolog rekombinering vil sig-5 nalsekvensen oftest være homolog eller i det væsentlige være homolog med signalsekvensen for genet ved mållocus. Imidlertid kan man konstruere signalsekvenser, der giver udskillelse. Se f.eks. von Heijne, Eur.

J. Biochem. 133 (1983) 17-21; og Perlman og Halvorson J. Mol. Biol. 1§2 (1983) 391-409- Ekspressionsproduktet eller genet af interesse kan være homologt eller heterologt i værten, ved "homolog" menes et protein, der er nativt for værten af vild type, hvorimod "heterolog" skal betyde et protein, der er fremmed for værten og inkluderer mutanter, der ikke mødes i naturen.

3-5 Genet af interesse kan have sin egen signalsek vens eller være føjet til en signalsekvens fra værten eller til en syntetisk signalsekvens, efter behov. Den særligt udvalgte signalsekvens kan variere afhængig af genet af interesse og mållocus. Af særlig interesse er 20 det at anvende signalsekvensen fra mållocus, der tilve-jebringer en yderligere homologiregion til integration på dette sted, og som vides at give effektiv udskillelse. Den DNA-sekvens, der koder for signalsekvensen, kan føjes direkte via sekvensen, der koder for processignalet (restriktionsgenkendelsessted), til den sekvens,

« O

der koder for det færdige protein, eller via en kort bro, sædvanligvis bestående af mindre end ti kodo ner.

Den region, der er 5'-stillet til den åbne læseramme for genet af interesse, vil omfatte den trans-skriptionsinitieringsregulerende region. Man kan benytte en hvilken som helst region, der virker i værten.

Oftest vil regionen til anvendelse imidlertid være homolog med regionen fra mållocus. Det har den virkning at

I DK 175196 B1 I

I I

I erstatte ekspressionsproduktet fra mållocus med eks- I I pressionsproduktet af interesse. Hvis ekspressionsni- I I veauet og udskillelsen af det endogene protein giver en I

effektiv produktion, vil denne transskriptioninitie- I I 5 ringsregulerende region normalt kunne betragtes som I I tilfredsstillende. Man kan i visse tilfælde imidlertid I I ønske et højere transskriptionsniveau end ved genet af I I vild type, eller man kan ønske at have inducerbar eks- I

pression, idet man anvender et særligt inducerende mid- I I del. I sådanne tilfælde vil man benytte en transskrip- I I tionsinitieringregulerende region, der er forskellig I I fra regionen ved mållocus. Man kender en lang række I I transskriptionsinitieringsregulerende regioner, der I I virker i filamentøse fungi. Disse regioner inkluderer I

gener, der koder for glucoamylase, fungal amylase, sur I I 15 phosphatase, GAPDH, TrpC, AmdS, AlcA, AldA, histron I I H2A, Pyr4, PyrG, isopenicillin N syntetase, PGK, sur I I protease, acyltransferase, og lignende. I I Mållocus skal foretrukket kode for et højt eks- I I primeret proteingen, dvs. et gen, hvis ekspressionspro- I I 20 udskilles til opnåelse af en koncentration på i I I det mindste 0,1 g/1 ved slutningen af fermenteringen. I

Varigheden af denne proces kan variere bl.a. afhængig I I af det ønskede proteinprodukt. Et eksempel på et sådan I I gen er genet, der koder for glucoamylase (AG). Andre I I gener af interesse inkluderer fungal α-amylase, sur I I phosphatase, protease, sur protease, lipase, og cello- I I biohydrolase. I I Genet af interesse kan være et hvilket som helst I I gen med en planlagt anvendelse. Udvalgte proteiner der I I er heterologe til Aspergillus, er f.eks. chymosin, in- I I 30 terleukiner, blodkoagulerende faktorer, såsom faktor I I VIII eller IX, phosphorlipaser, lipaser og cellevækst- I I nedbrydende enzymer (enzymer, der er i stand til at I I spalte polysaccharider, der findes i plantecellevægge). I

9 DK 175196 B1

Eksempler på proteiner, der er homologe til Asperqil-lus er phytaser, phosphataser, xylanaser, β-galactosi-daser, forskellige typer løbe, glucoseoxidaser og amyl-aser.

5 Den transskriptionstermineringsregulerende re gion kan være fra et gen af interesse, fra mållocus eller være en hvilken som helst anden passende sekvens.

Når konstruktionen inkluderer yderligere sekvenser af interesse nedstrøms i transskriptionsretningen fra ge-^ net af interesse, bør den transskriptionsterminerings-regulerende region, hvis den er homolog med mållocus, være betydelig mindre end den homologe flankerende region.

Man benytter normalt en udvælgelsesmarkør, der kan være en del af ekspressionkonstruktionen eller være adskilt fra ekspressionskonstruktionen, så den kan integreres på et sted, der afviger fra genet af interesse. Da de rekombinante molekyler ifølge opfindelsen foretrukket transformeres til en værtsstamme, der kan benyttes ved industriel produktion, er udvælgelsesmarkø-20 rer til kontrol af transformationen. foretrukket dominante udvælgelsesmarkører, dvs der skal ikke indføres nogen mutationer i værtsstammen, hvis man skal benytte sådanne udvælgelsesmarkører. Eksempler på sådanne er markører, der tillader transformanter at vokse på veldefinerede næringskilder (f.eks. tillader A. nidulans amdS genet A. niqer transformanter at vokse på acetamid som eneste nitrogenkilde) eller markører, der overfører antibiotikaresistens {f.eks. overfører ble genet phleo-mycin resistens eller hph genet overfører hygromycin B resistens).

30 Udvælgelsesgenet vil besidde sine egne trans skriptions- og translationsinitierings- og termine-ringsregulerende regioner for at tillade uafhængig eks-primering af markøren. Man kender et stort antal trans-

I DK 175196 B1 I

I io I

I skriptionsinitieringsregulerende regioner, som tidlige- I

I re beskrevet, og disse kan benyttes i forbindelse med I

koncentrationen af det anvendte antibiotikum til ud- I

vælgelse variere afhængig af antibiotikumet, men vil I

I 5 sædvanligvis være ca. 30-300 pg/ml af antibiotikumet. I

I De forskellige sekvenser kan føjes til hinanden I

I ved kendt teknik såsom ved restriktion, sammenføjning I

I . af komplementære restriktionssteder og ligering, afrun- I

I ding ved udfyldning af overhængende ender og stump li- I

I 10 9erin9' Bal31 gennemskæring, primerreparation, in vitro I

I mutagenese eller lignende. Man kan benytte polylinkere I

I og adaptorer efter behov, og disse kan indføjes eller I

I fjernes ved kendt teknik for at lette samlingen af eks- I

I pressionskonstruktionen. På ethvert trin af syntesen af I

I konstruktionen kan fragmentet klones, analyseres ved I

15 fordøjelse med restriktionsenzymer, ved sekvensopde- I

I ling, ved hybridisering eller lignende. En. lang række I

I vektorer er tilgængelige til kloning og det specielle I

I valg af en sådan er ikke kritisk for opfindelsen. Man - I

I vil normalt foretage kloningen i E. coli. I

I 20 De Mankerende regioner kan inkludere i det I

I mindste en del af den åbne læseramme for mållocus, især I

I signalsekvensen, de regulerende regioner, der er 5'- og I

I 3’- stillet til genet for mållocus eller kan strække I

I sig ud over de regulerende regioner. Proteinerne fra de I

I flankerende regioner, der omfatter den åbne læseramme, I

I 25 I

vil normalt ikke kode for et helt gen, der kan ekspri- I

I mere et funktionelt produkt. Normalt vil en flankerende I

region være på mindst 100 bp, sædvanligvis i det mind- I

I ste 200 bp, og den kan være på 500 bp eller mere. Man I

vælger de flankerende regioner for at forstyrre målgen- I

I 30 et og forhindre dets ekspression. Dette kan opnås ved I

I at indsætte ekspressionskasetten i den åbne læseramme I

I umiddelbart op ad 5'- regionen, ved at substituere hele I

eller en del af målgenet med ekspressionskonstruktionen I

11 DK 175196 B1 eller ved at lade ekspressionskonstruktionen indgå mellem den transskriptionsregulerende region ved mållocus og den åbne læseramme. Som allerede antydet bør, når den termineringsregulerende region er homolog med regi-5 onen ved mållocus, den 3'-flankerende region være betydeligt større end en termineringsregulerende region, der findes i konstruktionen.

Konstruktionen kan transformeres ind i værten som den klonende vektor, enten lineær eller ringformig, eller kan fjernes fra den klonende vektor efter ønske.

10

Plasmidet skal sædvanligvis lineariseres inden for ca.

1 kbp fra enden af ekspressionskonstruktionen. Man kender en række fremgangsmåder til transformation af filamentøse fungi. Disse fremgangsmåder inkluderer proto-plastfusion eller transformation, elektroporering og be-15 skydning af cellerne med mikroprojektiler. Man har med held benyttet protoplasttransformation, og denne anbefales. Man omdanner først myceliet fra den fungale stamme af interesse til protoplaster ved enzymatisk fordøjelse af cellevæggen under tilstedeværelse af en 2o osmotisk stabilisator, såsom KC1 eller sorbitol. DNA optag af protoplasterne ophjælpes ved tilsætning af CaCl2 og en koncentreret opløsning af polyethylengly-col; den sidste forbindelse fører til sammenklumpning af protoplasterne, hvorved det transformerende DNA indgår i aggregaterne og optages af protoplasterne. Der 25 efter lader man protoplasterne regenerere på et fast medium med indhold af en osmotisk stabilisator og efter behov et udvælgelsesmiddel, idet det transformerende DNA koder for resistens mod dette.

Efter udvælgelse af transformanter kan man be-30 stemme tilstedeværelsen af genet af interesse på forskellige måder. Man kan benytte antistoffer, hvor ekspressionsproduktet er heterologt til værten, og herved påvises tilstedeværelse af eksprimering af genet af in-

I DK 175196 B1 I

I 12' I

I teresse. Man kan alternativt benytte Southern eller I

I Northern Blotting til at påvise tilstedeværelse af det I

I integrerede gen eller dets transskriptionsprodukt. I

I Derefter kan man dyrke cellerne i et passende I

I 5 næringsmedium. Man kan benytte små koncentrationer af I

I en proteaseinhibitor såsom phenylmethylsulfonsylfluo- I

I rid, a2-macroglobuliner, pepstatin eller lignende. Sæd- I

I vanligvis vil koncentrationen af dette være cirka l \ig/ I

I ml - 1 mg/ml. Proteasegenet eller -generne kan inakti- I

I ^ veres for at undgå eller reducere nedbrydning af det I

I ønskede protein. I

I Målloci, der med fordel kan anvendes, er glyco- I

I amylasegenet- fra A. niqer eller A. awamori, det fungale I

I amylasegen fra A. oryzae, cellobiohydrolasegenerne fra . I

I 5!· reesei eller det sure proteasegen fra Mucor miehei. I

I 15 Transformanterne kan dyrkes portionsvis eller I

I kontinuert i reaktionsbeholdere, hvorfra man isolerer I

I næringsmediet og ekstraherer det ønskede produkt. Man I

I kan efter behov benytte forskellige fremgangsmåder til I

I oprensning af produktet såsom chromatografi, f.eks. I

I 20 HPLC eller præparativ tyndtlagschromatografi, solvent- I

I solvent-ekstraktion, elektroforese, kombinationer deraf I

I eller lignende. I

I De følgende eksempler gives som illustration.- I

I Eksempel l I

I 25 I

I Konstruktion af forskellige ekspressionskassetter. I

I A. Fremgangsmåder. I

I Alle konstruktioner blev fremstillet under an- I

I vendelse af standardfremgangsmåder fra molekylærbiologi I

I som f.eks. beskrevet i Maniatis et al. (1982) Molecular I

I Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo- I

I ratory, N.Y. I

13 DK 175196 B1

Plasmiderne ρΑΒβ-l, pAB6-2A, pAB6-3 og pAB6-4

Man isolerede glucoamylasegenet fra A. niqer fra plasmldbiblioteker indeholdende 3-4 kb EcoRI fragmenter 5 eller 13-15 kb Hindlll fragmenter i puC19 (Yanisch-Per- ron et al.. Gene 21 (1985) 103-119, tilgængelig f.eks.

fra Boehringer Mannheim, Tyskland) under anvendelse af oligonucleotidsonder (fig. 1) baseret på nucleotidse- kvensen publiseret for niqer (Boel et al., EMBO J, 3 (1984) 1097-1102; Boel et al., Mol. and Cell. Biol. 4 10 ~ (1984) 2306-2315). Oligonucletidsonderne blev afledt fra sekvensen, der omgiver intron 2; den 42-mere står i 3'-stilling for intronen og har en polaritet, der er i-dentisk med AG-mRNA. Man finder den 24-mere opstrøms for intron 2, og den vælges antiparallelt til mRNA.

15 Plasmid pAB6-l indeholder AG-genet på et 14,5 kb Hind III fragment. I plasmid pAB6-2A findes hele AG-genet på et 3,4 kb EcoRI fragment. Plasmid pAB6-3 indeholder et 1,8 kb EcoRI fragment, der findes netop opstrøms for AG-genet; dette fragment indeholder sandsynligvis regu-2o lerende sekvenser, og er blevet underklonet fra pAB6-l.

Plasmid pAB6-4, en anden underklon af pAB6-l, indeholder et 4,6 kb Hindlll-Bglll fragment omfattende regionen opstrøms for AG-genet og en del af 5'-enden af dette gen (se kortet på fig. 2). Alle fragmenter blev klonet i puci9.

25

Plasmid pAB64-40

Man behandlede plasmid pAB6-2A (fig. 2) med Accl og T4 polymerase til dannelse af Accl fragmenter med 30 stumpe ender. Man isolerede 1,2 kb fragmentet, der indeholder de 3'-flankerende sekvenser fra AG-genet, deriblandt terminatoren.· Plasmid pUR1524 med indhold af bovin chymosin cDNA (se EP-A-077109) blev delvis fordø-

I DK 175196 B1 I

I 14 I

I jet med Sall og EcoRI. Man isolerede fragmentet med I

I indhold af chymosin cDNA, udfyldte klæbende ender med I

I T4-DNA polymerase og ligerede det stumpendede fragment I

I med Sall linkere. Man fordøjede dette fragment med Sall I

I 5 plus Hindlll og ligerede det i pPA153-209 (Van Putten I

I et al., J. Bacteriol. 168 (1986) 728-733), der var for- I

I døjet med Sall og Hindlll. Den opnåede konstruktion, I

I pRCH4, blev gennemskåret med Bell og behandlet med T4 I

I polymerase til opnåelse af stumpe ender. Derefter lige- I

I rede man Accl fragmentet med indhold af AG-terminatoren I

I i dette sted til opnåelse af ρΑΒ64-10. I denne kon- I

I struktion er det udfyldte Bell sted, der er 3'-stillet I

I til chymosingenet. genoprettet.

I Derefter fordøjede man plasmid pAB6-3 (fig. 2) I

I delvis med EcoRI og behandlede det med T4 polymerase.

I 15 I denne vektor ligerede man Hindlll plus EcoRI fragmen-

I tet af plasmid pAB6-4, igen efter behandling med T4 po- I

I lymerase. Den opnåede konstruktion er pAB6-31; denne I

I konstruktion indeholder et 3,6 kb opstrømsfragment af I

I AG-genet med et ødelagt EcoRI sted i midten og et unikt I

I 20 EcoRI sted nær ved AG-genet. I dette unikke EcoRI sted I

I ligerede man et delvis EcoRI fordøjet fragment fra

I pAB64-lO med indhold af chymosin cDNA plus AG-termina- I

I toren; den opnåede konstruktion hedder pAB64-20. Man I

I ødelagde EcoRI stedet, der fandtes mellem terminatoren I

I og vektoren, ved delvis fordøjelse med EcoRI, hvorefter I

I 25 I

man behandlede med T4 polymerase og ligerede. Den nye I

I konstruktion er pAB64-40; denne konstruktion indeholder I

I igen et unikt EcoRI sted, nu ved sammenføjningen af AG- I

I opstrømssekvenser og chymosin cDNA (fig. 3). I

I 30 Plasmid pAN76-l I

I Man fordøjede plasmid pAN7-l (Punt et al., Gene I

I 56 (1987) 117-124) med Hindlll. I dette sted ligerede I

15 DK 175196 B1 man Sall plus Hindlll fragmentet fra pAB6-l (fig. 2), der findes 3'-stillet til AG-genet efter udfyldning af Sall stedet med T4 polymerase. Fra denne konstruktion PAN76-1 (fig. 4) isolerede man HygB genet plus det 3'-5 flankerende AG-fragment som et Stul plus Hindlll fragment .

Fag mAB64-0

Man isolerede det lille EcoRI plus Nrul fragment fra plasmid pAB6-2A med indhold af AG-promotor og regulerende sekvenser og ligerede det i fag M13mpll (Messing og Vieira, Gene lji (1982) 269-276, f.eks. tigænge-lig fra Pharmacia Inc., Sverige) fordøjet med EcoRI og BamHI, sammen med Sall plus Bell fragmentet fra plasmid 15 pRCH4 med indhold af bovin chymosin cDNA og behandlede det ved Sall stedet med T4 polymerase. Den opnåede konstruktion fag mAB64-0 indeholder en proteinfusion mellem AG og præprochymosin (fig. 5); denne konstruktion blev underkastet in vitro mutagenese.

20 B. Specifikke ekspressionskassetter.

Man konstruerede tre ekspressionskassetter for bovin chymosin fra mAB-64-0, hver indeholdende et forskelligt fusionssted mellem den AG regulerende region 25 og bovin chymosin cDNA.

Til dette formål konstruerede man følgende tre oligonucleotider: nr 1: 5'- AT TAC ACC TCA GCA ATG AGG TGT CTC GTG GTG 30 3' nr 2: 5'- TGC ACA GGG TTG GCA GOT GAG ATC ACC AGG ATC CCT CT 3’ nr 3: 5’- ACG GAT AAC CCG GAC GCT GAG ATC ACCC AGG 3·.

I DK 175196 B1 I

i 16 I

I Disse oligonucleotider blev benyttet til at sam- I

I menbinde AG-promotoren med præprochymosin (nr 1) eller I

I at binde AG-promotoren og signalpeptidet til prochymo- I

I sin (nr. 2). Under anvendelse af oligo nr. 3 fremstil- I

I 5 ler man en proteinfusion mellem aminosyre 71 i det fær- I

I dige AG-gen og prochymosin.

I Identiteten af konstruktionerne blev fastslået I

I ved sekvensanalyse af ssDNA af de opnåede konstruktio- I

I ner (mAB64-2, mAB64-3 og mAB64-5). I

I Pra disse konstruktioner isolerede man EcoRI I

I 10 I fragmenterne med indhold af de ønskede genfusioner og

I indsatte i pAB64-40 til opnåelse af henholdsvis pAB64- I

I 42, pAB64-43 og pAB64-45. I disse plasmider pAB64-42, I

I pAB64-43 og pAB64-45 indsatte man et Stul plus Hindlll I

I fragment isoleret fra pAN76-l, hvilket fragment inde- I

I holdt HygB-genet på et 3'-flankerende element af AG-ge- I

I net. Slutkonstruktionerne benævnes pAB64-72, pAB64-73 I

I og pAB64-75. Disse konstruktioner indeholder et unikt I

I Hindlll sted 31-stillet til ekspressionskassetten og I

I den 31-flankerende region (fig. 6). I

I 20 I

I Eksempel 2 I

I Transformation af Aspergillus niqer til opnåelse af I

I generstatninq I

I 25 I

I Man udførte transformationen af A^ niqer ifølge I

I opfindelsen under anvendelse af fremgangsmåder beskre- I

I vet af Van Hartingsveldt et al., (se ovenfor) og Velton I

I et al. (se ovenfor). I

I Man dyrkede A^ niqer DS 2975 (en prøve af denne I

I 30 stamme blev deponeret hos CBS den 10. august 1988 med I

I deponeringsnummer 513.8?) i 24 timer eller længere, I

I hvis det var nødvendigt, ved 34 C. Man indhøstede myce- I

I liet ved filtrering gennem et sterilt nylonklæde og I

17 DK 175196 B1 vaskede det med 0,6 M MgS04 (højst 1,25 ml pr. 100 ml kultur). Derefter overførte man myceliet til et sterilt reagensglas, vejede det og suspenderede det igen i 5 ml osmotisk medium (1,2 M MgS04, pufret med 10 mM phosphat 5pH 5,8) pr. gram våd vægt. Efter tilsætning af Novozym 234 (NOVO, Danmark; 20 mg pr. ml i osmotisk medium) med en mængde på 1 ml pr. gram våd vægt og BSA (Sigma, Holland; 12 mg/ml i osmotisk medium) med 0,5 ml pr. gram våd vægt, lod man protoplasterne dannes under forsigtig omrystning (50 o/m) ved 25-27°C. Man kontrollerede dannelsen af protoplaster ved mikroskopkontrol med regelmæssige mellemrum. Efter fuldstændig dannelse af protoplaster overførte man 15 ml af protoplastopløsningen til et 30 ml sterilt Corexrør og anbragte et øvre lag på 10 ml indfangende puffer (0,6 M sorbitol, 100 mM 15Tris/HCl pH 7,0) forsigtigt ovenpå protoplastsuspensio-nen. Man centrifugerede rørene ved 5000 o/m, 4 C, i 15 minutter i en rotor med udsving. Man kunne forsigtigt indsamle protoplasterne fra mellemfasen med en steril Pasteurpipette med bred åbning til undgåelse af beska-2o digelse ved forskydningspåvirkninger af protoplasterne.

Man gentog faseadskillelsen, hvis man opnåede et stort centrifugebundfald, i dette tilfælde suspenderede man igen centrifugebundfaldet i osmotisk medium, foretog en ny overlægning af indfangende puffer og gentog centrifugeringen. Man samlede protoplasterne og vaskede 2 5

dem omhyggeligt ved at udsuspendere dem i kold STC

(1,2 M sorbitol, 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 50 mM CaCl2) 0 og centrifugerede dem ved 3000 o/m, 4 C i 10 minutter.

Man gentog vasken, indtil man opnåede et protoplastpræ-parat, der var fri for kontaminerende partikler. Man 30 udsuspenderede protoplastbundfaldet i kold STC til en slutkoncentration på l x 108 protoplaster (pps)/ml.

I DK 175196 B1 I

I I

I Man benyttede enten protoplasterne øjeblikkeligt I

I I

I eller lagrede dem natten over ved 4 C. Hvis protoplas-

I terne blev lagrede, blev de vasket igen næste dag i I

I kold STC. ' I

I 5 Med henblik på transformation satte man 107 pro- I

I toplaster til 10 ug DNA i 25 μΐ STC eller i 10 μΐ TE I

I (TE indeholder 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Til I

I opnåelse af generstatning lineariserede man plasmidkon- I

I struktionerne pA64-72, pA64-73 og pA64-75 ved at skære I

I 1Q dem ved det unikke Hind III restriktionssted, der fin-

I des i alle 3 konstruktioner netop nedstrøms for udvæl- I

I gelsesmarkøren og den 3'-flankerende region i AG-genet I

I (figur 6). I

I Man inkuberede blandingen af protoplaster og DNA I

I ved stuetemperatur i 25 minutter. Dernæst tilsatte man I

I ^ PEG-opløsning, (60% polyethylenglycol 4000, Brocacef/ I

I BDH; 10 mM Tris/HCl pH 5,7, 50 mM CaCl2) i portioner på I

I 200 μΐ, 200 μΐ og 850 μΐ. Man homogeniserede blandingen I

I omhyggeligt efter tilsætningen af hver portion PEG og I

I inkuberede ved stuetemperatur i 20 minutter efter til- I

I 20 sætning af den sidste portion PEG. Der foregik af og I

I til udfældning af store plasmider (>18 kb). Dette kunne I

I forhindres ved at erstatte 60% PEG opløsning med en 25% .1

I PEG opløsning. Man vaskede de transformerede protoplas- I

I ter med 10-15 ml kold STC ved blid sammenblanding og I

I

25 centrifugering ved 5000 o/m ved 4 C i 10 minutter. Der-

I efter suspenderede man protoplasterne i 100 μΐ STC og I

I udplattede dem omhyggeligt på selektive plader med ind- I

I hold af 200 yg/ml hygromycin B (Sigma H 2638). Hygromy- I

I cinresistente kolonier blev analyseret yderligere, i- I

I det man begyndte med enkelte isolerede sporer. I

19 DK 175196 B1

Eksempel 3 Påvisning af qenerstatninq 5 a. Southern blotting

Til påvisning af, om generstatning overhovedet var forekommet i transformanterne, benyttede man den teknik, der kaldes Southern Blotting, til at påvise fravær af glucoamylasespecifik DNA fra transformanterne. Man gjorde et DNA fragment, der var homologt til glucoamylasegenet, radioaktivt og hybridiserede det til DNA fra transformanterne, efter adskillelse af DNA ved elektroforese og fiksering af det kromosomale DNA til en nylonmembran. Man kan påvise meget små mængder homo-15 log DNA ved denne fremgangsmåde. DNA blev isoleret fra adskillige transformanter fra hver af de tre konstruktioner, der blev, benyttet til transformation. DNA blev isoleret efter formaling af myceliet i flydende nitrogen under anvendelse af standardfremgangsmåder. Man fordø-20 jede genomisk DNA med EcoRl, adskilte ved elektorforese og plottede på "Gene Screen Plus" nylonmembran (Dupont, USA). Først hybridiserede man blottende med en radioaktiv AG-specifik sonde, det AG-interne BamHI plus Bglll fragment (figur 2). Transformanter, der ikke gav noget 25 hybridiseringssignal med denne sonde (der ventes et 3,4 kybic EcoRl fragment, hvis AG-genet stadig findes i transformanterne), blev gennemsøgt med andre sonder for at bekræfte, at generstatning havde fundet sted. Med henblik på dette blev EcoRl fordøjelsesprodukter hybri-diseret både med radioaktivt pAB64-75 til bekræftelse af tilstedeværelse af alle væsentlige plasmidafledte fragmenter, og med radioaktivt pU19 til at bekræfte fravær af bakteriel DNA. Resultatet af disse eksperimenter viste tilstedeværelse af alle forventede plasmidafledte

I DK 175196 B1 I

I 20 I

I fragmenter deriblandt bovin chymosin cDNA, og fravær af I

I bakteriel DNA i 7 af de 36 oprindeligt analyserede I

I transformanter. Alle udvalgte transformanter indeholdt I

I én enkelt chymosinekspressionskassette. I

I

I B. Western blotting I

I Fraværet af et udvalgt gen i genomet på en organisme I

I kan fastslås på forskellig måder. Southern Blot hybri- I

I 10 disering som beskrevet ovenfor under A er en effektiv I

I måde til at fastslå fravær af genetisk materiale, der I

I er homologt til den anvendte sonde. En anden måde at I

I påvise fraværet af et specifik gen er at påvise fravæ- I

I ret af produktet fra genet af interesse, i dette til- I

I fælde glucoamylasegenet. En meget følsom fremgangsmåde I

til påvisning af tilstedeværelse eller fravær af en I

I protein i et præparat er Western Blotting. Ved denne I

teknik benytter man specifikke antistoffer mod protei- I

I net af interesse til at påvise tilstedeværelse eller

I fravær af dette specifikke protein. Sådanne antistoffer I

I 2 0 I

binder til proteinet, der er blevet fikseret på en ni-

I trocellulosemembran. Derefter benytter man et andet I

I antistofpræparat, der er frembragt mod det første anti- I

I stofpræparat. Dette andet antistof præparat er konjuge- I

I ret med et enzym, der kan bearbejde et farveløst sub- I

I 25 strat til opnåelse af et farvet produkt. Man vil se et I

I farvet bånd på de steder, hvor der findes immunogent I

I materiale, der kan reagere med det første antistofpræ- I

I parat. I

I De transformanter, som man ifølge Southern Blot I

I 3Q ting resultaterne mente havde AG-genet erstattet med I

I bovin-chymosingenet, blev dyrket under tilstedeværelse I

I af stivelse for at inducere den AG-regulerende region, I

I og man analyserede supernatanten fra Western Blotting I

I og sammenlignede med en fermenteringssupernant fra I

21 DK 175196 B1 værtsstammen. Man lagde 20 μΐ af hver supernantant på en 7,5% polyacrylamid-SDS-gel og adskilte proteinbåndene ved elektroforese. Gelerne blev overført elektroforetisk til en nitrocellulosemembran ved kendt teknik.

5 Efter adskillige vasketrin inkuberede man nitrocellulosemembranen med et polyklonalt antiserum, frembragt mod glucoamylase, der var oprenset fra et kommercielt præparat ved hjælp af HPLC søjlekromatografi. Behandling af membranen med det andet antistof-konjugat-præparat ^ gav ingen farvede bånd i præparaterne fra transformanterne, hvorimod der i præparatet fra værten sås et bånd omtrent, hvor man ventede at finde glucoamylase. Dette eksperiment viser, at der ikke i de udvalgte transfor-manter syntetiseres materiale, der kan reagere med an-ti-AG-serum, og det sluttes heraf, at AG-genet er blevet 15 erstattet med bovin-chymosin-genet.

C. Indflydelse af qenerstatninq på mængden af ud-udskilt protein. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Glucoamylase udgør en væsentlig del af den tota 2 le proteinmængde, der udskilles af A. niqer (se f.eks.

3

Cullen et al., ovenfor). Af denne grund kan erstatning af glucoamylasegenet med et andet proteingen påvirke 4 mængden af protein, der udskilles af A. niqer transfor- 5 manter; et fald i proteinindholdet i fermenteringsurten 6 7 kan lette oprensningen af andre udskilte proteiner.

8

Hvis desuden kapaciteten af udskillelsesvejen er begrænset, vil fjernelse af glucoamylase fra cellen åbne 9 udskillelsesvejen mere for andre proteiner. Til under 10 søgelse af virkningen af generstatningen på mængden af 11 udskilt protein bestemte man proteinindholdet af su-pernatanter fra fermenteringer ved standardfremgangsmåder og sammenlignede med data fra værtsorganismen. De opnåede resultater ses i tabel 1.

I DK 175196 B1 I

I 22 I

I Tabel 1 I

I Proteinindhold af fermenterinqsurt (se eksempel 4) I

I 5 ---' I

I Stamme Proteinkoncentration I

I (mg/ml)

I 10 A. niqer DS 2975 0.143 I

I A. niqer DS 2975 + pAB64-72 0,096 I

I A. niqer DS 2975 + pAB64-73 0,082 I

I A. niqer DS 2975 + pAB64-75 0,076 I

I 15 I

I Resultater opnået i dette eksperiment er konsi- I

I stente med fraværet af det højt eksprimerede glucoamy- I

I lasegen i de analyserede transformanter. I

I Eksempel 4 I

20 -c-

I Eksprimerinq og udskillelse af bovin chymosin af A. ni- I

I ger under anvendelse af chymosin og AG-siqnalpeptid. I

I Man transformerede A. niger med lineariseret pAB64-72 I

I 25 og pAB64-73 som beskrevet i eksempel 2. Man kontrolle- I

I rede forekomsten af generstatning i transformanterne, I

I som beskrevet i eksempel 3. Udvalgte transformanter I

I blev analyseret for produktion oq udskillelse af chymo- I

I sin, idet man begyndte med enkeltsporeisolater. Chymo- I

I 30 sin udskilles normalt som zymogen: Det udskilte enzym I

I er inaktivt på grund af tilstedeværelse af et kort N- I

I terminalt peptid (prochymosin). Dette zymogen aktiveres I

I ved fjernelse af det korte N-terminale peptid, f.eks. I

23 DK 175196 B1 ved enzymatisk spaltning eller i tilfælde af chymosin, ved inkubering ved en lav pH-værdi. Af denne grund omdanner man for nøjagtigt at kunne måle aktiviteten af det udskilte chymosin alt udskilt prochymosin til aktiv 5 form ved behandling ved lav pH.

A. Fermentering af transformanter af A. niqer med indhold af en qenerstatninq for AG-genet.

Man inokulerede ca. 107 sporer af udvalgte 10 transformanter i rystekolber med indhold af 100 ml flydende prækulturmedium indeholdende KH2P04 (1 g/1), maltose (30 g/1), gærekstrakt (5 g/1), hydrolyseret casein (10 g/1), MgS04, 7H20 (0,5 g/1) og Tween 80 (3 g/1).

Disse kulturer blev dyrket ved 34 C i 48 timer. Man 15 udtog prøver til analyse for chymosinproduktionen og isolering af mRNA; 10 ml af denne kultur blev inokule-ret i 100 ml fermenteringsmedium med indhold af KH2P04 (1 g/1), majsstivelse (70 g/1), gærekstrakt (12,5 g/1) hydrolyseret casein (25 g/1), K2S04 (2 g/1), MgS04, 20 7H20 (0,5 g/1, ZnCl2 (0,03 g/1), CaCl2 (0,02 g/1,

MnS04, 4H20 (0,01 g/1) og FeS04 (0,3 g/1). Disse kulturer blev inkuberet i 48 timer ved 34 C; igen udtog man prøver til analyse for chymosinproduktion og til isolering af mRNA.

B. Påvisning af mRNA niveauer i myceliumprøver

Man indhøstede mycelium, vaskede det med destilleret vand og knuste det til et fint pulver under flydende nitrogen under anvendelse af en RNasefri morter 30 og støder. Dette pulver blev opløst i 2 ml/g homogeniseringspuffer (4M guanidinisothiocyanat; 5 mM Nacitrat pH 7,0; 0,1 M β-mercaptoethanol; 0,5% (w/v) N-lauroyl-sarcosin, natriumsalt (Sigma L-5125)) og inkuberet ved

I DK 175196 B1 I

i 24 I

I

37 C i 30 minutter. Til supernatanten fra en 15 minut-

I ter 5000 o/m centrifugering satte man 0,4 g/ml af I

I RNasefri CsCl. Denne opløsning blev lagt omhyggeligt I

I ovenpå et 5,7 M CsCl tæppe i 0,1 M EDTA; centrifugerin- I

I 5 gen varede i 17 timer ved 38000 o/m, 20°C i en Ti 42,1 I

I centrifuge. Man opløste det klare RNA centrifugebund- I

I fald i RNasefri puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 5 mM ED- I

I TA; 1% SDS) efter fjernelse af guanidinisothiocyanatop- I

I løsningen. Efter ekstraktion med et ligeså stort rum- I

I fang af en chloroform/butanolblanding (4:1) udfældede I

I man RNA ved hjælp af natriumacetat og ethanol og opløs- I

I te det i RNasefrit vand. I

I Man underkastede RNAprøverne elektroforese og I

I blottede dem på Gene Screen Plus under anvendelse af I

I kendt teknik. Blottene blev hybridiseret under anven- I

I 15 delse af en oligonucleotidsonde, homolog både til AG I

I og til chymosin mRNA: til dette formål udvalgte man o- I

I ligonucleotidsekvensen fra AG-leaderen, der findes bå- I

I de i AG-mRNA og i chymosin-AG-fusion-mRNA (i alle kon-

I struktioner findes AG-chymosinfusionen ved translati- I

I 20 onsstarten (pAB64-72) eller efter translationsstarten I

I (pAB 64-73 og 75), hvorfor alle transkripter indeholder I

I AG-leaderen). I

I Efter dyrkning af myceliet i stivelseholdigt me- I

I .dium kunne man påvise hybridiserende RNA-molekyler i I

I alle prøver, udbyttet er højst for pAB64-73. I værten I var det hybridiserende mRNA af en længde, som man kunne I vente for AG/mRNA: De hybridiserende mRNA'er i trans-

I formanterne var af længder, der kunne ventes for de I

I forskellige ekspressionskasetter. Niveauet for mRNA for I

I AG i værten svarede til niveauet for chymosin mRNA i I

I 30 pAB64-7 3-transformanterne, et tegn på at hybridgenet I

I ved AG-locus i disse transformanter transskriberes med I

I en effektivitet, der svarer til effektiviteten for det I

I oprindelige AG-gen. I

25 DK 175196 B1 C. Påvisning af udskillelse af bovin chymosin af A, ni- ger.

Man underkastede prøver af fermentationsurt af 5 både transformanter og værten elektroforese på en 12,5% polyacrylamid-SDS-gel; derefter blottede man gelen på nitrocellulose ved kendt teknik. Et monoklonalt antistof frembragt mod renset chymosin blev benyttet til immunologisk påvisning af chymosin.

Som en kontrol underkastede man også renset chymosin elektroforese og blottede det i samme eksperiment. Tilstedeværelse af et bånd med korrekt længde i alle prøver fra transformanten, men ikke i prøver fra værten, tydede på ekspresion og udskillelse af bovin chymosin ved begge de to afprøvede konstruktioner. Det høje-15 ste chymosinudbytte blev opnået under anvendelse af konstruktionen pAB64-73, men udskillelse af chymosin ved pAB64-72 transformanter tyder også på, at chymosin-signalpeptidet virker i A. niger.

Man bestemte koagulerende aktivitet ved kendt 20 teknik, under anvendelse af dehydreret skummemælkspulver (DIFCO) sotn substrat og kalveløbe af kendt styrke som standard. For pAB64-73 var udbytterne 18-45 MCU/ml, og pAB64-72 udbytterne var 7-15 MCU/ml. (En MCU er den mængde chymosin, der fører til koagulering af 1 ml mælk ved 35°C i løbet af 40 minutter).

25 .

Mængden af chymosin opnået fra fermentationsurten var op til 11,5 mg/1, hvilket er væsentlig mere end, hvad der er meddelt for transformanter af A. nidu-lans, der sandsynligvis har et større antal kopier af tilsvarende chymosinekspressionskasetter (0,5-2,5 30 mg/1: Cullen et al. (se ovenfor) og 0-7 mg/1: EP-A-0215594 ) .

I DK 175196 B1

I 26 I

Eksempel 5 I

Ekspression og udskillelse af et AG-prochymosinfusions- I

protein fra A♦ niqer I

I 5 i

Man transformerede lineariseret pAB64-75 til A. I

niqer. Udvalgte transformanter blev analyseret som be- I

skrevet i de forrige eksempler. Man kunne påvise chymo- I

sinspecifik mRNA i transformanterne med et ekspressi- I

10 onsniveau, der lå mellem, hvad man fandt for pAB64-72 I

og pAB64-73. Udskillelse af chymosin af disse transfor- I

manter kunne påvises både ved Western blotting og for- I

søg med koagulation; aktiviteterne var på niveauet 17- I

I 29 MCU/ml. I

I 15

I Eksempel 6 I

Regulering af AG-genekspression i værten og af chymo- I

sinekspression i transformanter I

I 20

Man undersøgte funktionaliteten af AG promotoren I

I i værten og i de udvalgte transformanter ved at dyrke I

I mycelium i et medium med indhold af xylose som eneste I

carbonkilde. I dette tilfælde bliver AG-promotoren ikke 25 induceret (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4 (1984) Η 2306-2315), og man venter hverken ekspression af AG-ge- net eller bovin chymosingenet, der står under kontrol af AG-promotoren. Derefter inokulerede man mycelium i I et stivelsesholdigt medium, hvor man ved, at AG-promo- I 30 toren bliver induceret (Nunberg et al., se ovenfor).

Den forudsagte induktion blev påvist ved Northern I Blotting eksperimenter ved tilstedeværelse af AG-speci- I fikt mRNA i værten og af chymosinspecifik mRNA i trans- I formanterne, når de blev dyrket på stivelse modsat til I 35 fravær af specifikke mRNA'er i mycelium, der blev dyr- ket på xylose. Man kunne også påvise udskillelse af DK 175196 B1 27 chymosin, når der foregik induktion, enten ved immun-blotting af fermentationurt eller ved at male den koagulerende aktivitet af fermentationsurten. I kulturer dyrket på xylose kunne man ikke påvise nogen chymosin-5 aktivitet ved koaguleringsforsøget; også resultaterne af eksperimenterne med Western blotting var negative i dette tilfælde. Disse eksperimenter viser, at regulering af ekspressionen af bovin chymosingenet svarer til reguleringen af AG-genet, og svarer til den øjeblikke-10 lige viden om ekspression af glucoamylasegenet.

Eksempel 7

Ekspression af chymosin under tilstedeværelse af prote-15 aseinhibitorer

Man fastslog følsomheden af chymosin over for protease udskilt af A. niqer ved at dyrke transforman-ter under tilstedeværelse eller fravær af proteaseinhi-20 bitorer.

Med dette formål dyrkede man transformanter af værtsstammen DS 2975 med konstruktion pAB64-73 (Eksempel 3A), som beskrevet i eksempel 4. Til et sådant kulturmedium satte man enten ingen proteaseinhibitorer 25 ) eller pepstatin og a2-macroglobulin {" + ") til slutkoncentrationer på henholdsvis 1 pg/ml og 5 pg/ml.

Man udtog prøver efter adskillige tidsintervaller og analyserede for mængden af udskilt chymosin ved Western blot, som beskrevet i eksempel 3B. Resultaterne ses i 30 tabel 2.

I DK 175196 B1 I

I 28 I

I Tabel 2 I

I Relativ mængder af chymosin 1 kulturer uden og I

I med ("+") proteaseinhibitorer I

I 5 I

I Prøveudtagningstid "+" I

I (timer efter inokulering) I

I I

I I

I 24 1 3 I

I 32 1 3 I

I 48 0,5 5 I

I 15 72 0,3 4 I

I 96 0,2 2 I

I Data tyder på, at chymosin er følsomt over for I

20 nedbrydning ved proteaser, der findes i fermentations- I

I urten. Inaktivering af disse proteaser, hvorpå der I

I gives eksempel ved tilsætning af proteaseinhibitorer, I

I fører til et forøget udbytte af chymosin og, vurderet I

I ud fra den længere tilstedeværelse af chymosin i fer- I

I 25 menteringsurten ved tilstedeværelse af proteaser, også I

I til en forøget stabilitet. Det er tydeligt at se fra I

de ovenfor givne resultater, at det omhandlede ekspres- I

I sionssystems giver en effektiv produktion af proteiner. I

I Yderligere kan man ved at indføre et gen af interesse I

I 30 i et locus, der omfatter et gen, der eksprimerer et I

I protein til udskillelse, når dette protein produceres I

I med høje niveauer, tilvejebringe en produktion på højt I

I niveau ud fra genet af interesse. På denne måde kan man I

reducere udskillelsesbelastningen af værtscellen, så man I

I 35 kan opnå en effektiv udskillelse af det ønskede produkt. I

I Hvis man oprindeligt benytter værter, der har en effek- I

DK 175196 B1 29 tiv udskillelse, kan det omhandlede system benyttes til kommerciel produktion af produkt af interesse, såsom medicinalvarer, kommercielle enzymer og lignende.

Claims (15)

1. Transformeret filamentøs fungusvært omfat- I I tende en ekspressionskassette stammende fra in vitro I I rekombination og omfattende en transkriptionsinitie- I I 5 ringsregulerende region, en åben læseramme kodende I I for en signalsekvens til udskillelse, i læseramme med I I et strukturgen af interesse og en transkriptionster- I I mineringsregulerende region, hvor den transformerede I I filamentøse fungusvært er kendetegnet ved, I I 10 at ekspressionskassetten er integreret i et kromosom I I fra den transformerede filamentøse fungusvært ved et I I på forhånd bestemt mållocus omfattende et gen, hvis I I ekspressionsprodukt udskilles til en koncentration på I I mindst ca. 0,1 g/1, og hvor genet i mållocus yderli- I I 15 gere er kendetegnet ved, at det er blevet inaktive- I I ret. I

2. Transformeret filamentøs fungusvært ifølge I I krav 1, kendetegnet ved, at det stærkt I I eksprimerede gen i mållocus er blevet inaktiveret som I I 20 følge af integration af ekspressionskonstruktionen. I

3. Transformeret filamentøs fungusvært . ifølge I I krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at inte- I I grationen af ekspressionskonstruktionen ved mållocus I I er sket under et forløb med generstatning. I I 25

4. Transformeret filamentøs fungusvært ifølge I I et vilkårligt af kravene 1 til 3,kendeteg- I I net ved, at værten er Aspergillus. I

5. Transformeret filamentøs fungusvært ifølge I I et vilkårligt af kravene 1 til 4,kendeteg- I I 30 n e t ved, at værten er Aspergillus niger. I

6. Transformeret filamentøs fungusvært ifølge I I krav 5, kendetegnet ved, at det stærkt I I eksprimerede gen i mållocus er glucoamylasegenet. I DK 175196 B1 31

7. Transformeret filamentøs fungusvært ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 6, kendetegnet ved, at genet af interesse koder for en form for chymosin, et interleukin, en phospholipase, en 5 lipase, en phytase, en phosphatase, en xylanase, en amylase, en type løbe, en /S-galactosidase eller et cellevægsnedbrydende enzym.

8. Transformeret filamentøs fungusvært ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 7, kendeteg- 10. e t ved, at ekspressionskonstruktionen omfatter en markør til valg af værter omfattende denne markør.

9. DNA konstruktion, kendetegnet ved, at den omfatter a) en ekspressionskassette med en transkriptionsini- 15 tieringsregulerende region fulgt nedstrøms af et gen af interesse under transkriptionskontrol af den transkriptionsinitieringsregulerende region, fulgt nedstrøms af en transkriptionsterminerings-regulerende region, hvor genet af interesse er 20 forsynet med en DNA sekvens kodende for en sig nalsekvens til udskillelse af produktet kodet for af genet af interesse, b) et udvælgeligt markørgen til valg af transformerede værter, og 25 c) 5'- og 3'-flankerende regioner, der er homologe til 5'- og 3'-regioner i et forudbestemt mållocus omfattende et gen, hvis ekspressionsprodukt udskilles til en koncentration på mindst ca. 0,1 g/1, idet dette locus er endogent for en filamen-30 tøs fungus, og hvor DNA konstruktionen yderligere er kendetegnet ved, at komponenterne under a) og b) er anbragt sammen mellem de 5'- og 3'-flankerende regioner. I DK 175196 B1 I I 32 I

10. DNA konstruktion ifølge krav 9, k e n d e - I I tegnet ved, at en del af den 5'-flankerende re- I I gion er fælles med den transkriptionsinitieringsregu- I I lerende region, der kontrollerer transkriptionen af I I 5 genet af interesse. I

11. DNA konstruktion ifølge krav 10,kende- I I tegnet ved, at den fælles del af den 5^- I I flankerende region inkluderer en DNA sekvens kodende I I for en signalsekvens til udskillelse af produktet fra I I 10 genet af interesse. I

12. DNA konstruktion ifølge krav 9,kende- I I tegnet ved, at en del af den 3'-flankerende re- I I gion er fælles med den transkriptionstermineringsre- I I gulerende region for af genet af interesse. I I 15

13. DNA konstruktion ifølge et vilkårligt af I I kravene 9 til 12, kendetegnet ved, at det I I endogene mållocus er et glucoamylasegen. I

14. DNA konstruktion ifølge et vilkårligt af I I kravene 9 til 13, kendetegnet ved, at ge- I I 20 net af interesse koder for en form for chymosin, et I I interleukin, en phospholipase, en lipase, en phytase, I I en phosphatase, en xylanase, en amylase, en type lø- I I be, en /3-galactosidase eller et cellevægsnedbrydende I I enzym. I I 25

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein I I af interesse, kendetegnet ved, at den om- I I fatter i et næringsmiddel at dyrke en transformeret I I filamentøs fungusvært ifølge et vilkårligt af kravene I I 1 til 8. I I 30 I