JPH02174678A - Ｄｎａ配列の改良方法及び改良されたｄｎａ配列を用いる蛋白質又はペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列
（以下単にＤＮＡ配列と記す）の塩基配列の一部を置換
することからなるＤＮＡ配列の改良方法に関し、更には
改良されたＤＮＡ配列を用いる蛋白質又はペプチドの製
造方法に関するものである。

（発明の背景） 近年、多（の生理活性物質等の蛋白質又はペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列がクローン化され、これらクローン
化ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ配列）を大腸菌、枯草菌、放線
菌、カビ、酵母菌、動物細胞、植物細胞等を宿主として
発現させることが可能となっている。

以Ｆの様な遺伝子学的手法においては、組込まれたＤＮ
Ａ配列の発現を調整するため、例えば用いる宿主それぞ
れについて適当なプロモーターオペレーター系をベクタ
ーに導入して使用する。更に、プロモーターオペレータ
ー系がインヒビター蛋白質との関係において目的とする
ＤＮＡ配列の発現を調整可能な場合には、このインヒビ
ター蛋白質をコードするＤＮＡ配列をも利用する。

１］的とするＤＮＡ配列の発現の調整は、例えば（１）
ＤＮＡ配列の発現を抑制状態に維持する場合 （２）ＤＮＡ配列の発現を抑制状態に維持し、後に抑制
状態を解除する場合 （３）ＤＮＡ配列を発現状態に維持する場合等に行われ
る。

（１）の場合としては、例えば、目的とするＤＮＡ配列
をクローニングする場合、ＤＮＡ配列を組込んだ宿主を
継代的に維持する場合等が、（２）の場合としては、目
的とするＤＮＡ配列の発現が宿主の生育に有害であり、
目的とする蛋白質又はペプチドを効率良く製造するため
に、その発現に先立って、まず宿主を十分な量に生育さ
せる必要がある場合等が、（３）の場合としては、［１
的とするＤＮＡ配列の発現が宿主の生育に無害である場
合等がある。

ところでＤＮＡ配列の発現とは、該ＤＮＡ配列が転写さ
れてｍＲＮＡが生産される過程と、生産されたｍＲＮＡ
が翻訳されて、もとのＤＮＡ配列がコードしていた蛋白
質又はペプチドが製造される過程からなる。ここで、前
記したプロモーターオペレーター系は、ＤＮＡ配列のｍ
ＲＮＡへの転写開始の促進又は抑制に関するのみであり
、ＤＮＡ配列それ自体のｍＲＮＡへの転写され易さある
いは転写され難さ、史には生産されたｍ　ＲＮ　Ａ自体
の翻訳され易さあるいは転写され難さ等を調整するもの
ではない。

以上の様な状況に鑑みて、本発明者らは、ＤＮＡ配列の
発現において、従来のプロモーターオペレーター系によ
るユツ整に加えて前記した様なりＮＡ配列自体の発現し
易さ、あるいは発現し難さを改良することにより、プロ
モーターオペレーター系により発現を調整することに比
較して、例えば（１）ＤＮＡ配列の発現を抑制状態に維
持する場合に、ＤＮＡ配列自体を発現し難い様に改良す
ることでより安定的、効率的に抑制状態を維持できる （２）ＤＮＡ配列の発現を抑制状態に維持し、後に抑制
状態を解除する場合には、ＤＮＡ配列自体の発現し易さ
又は発現し難さを改良することで、より安定的、効率的
に抑制状態又は発現状態を維持できる （３）ＤＮＡ配列を発現状態に維持する場合に、ＤＮＡ
配列自体を発現し易い様に改良することでより安定的、
効率的に発現状態を維持できると考え、鋭意研究を行っ
た。その結果、ＤＮＡ配列中の２次構造を形成し得る塩
基配列が二次構造を形成すると、該ＤＮＡ配列のｍＲＮ
Ａへの転写が抑制されること及び／又は、該ＤＮＡ配列
の転写により生産されたｍＲＮＡ中の二次もη造を形成
し１−）る塩基配列が二次構造を形成すると、該ｍＲＮ
Ａの蛋白質又はペプチドへの翻訳も抑制されることを見
い出し、このＬｌな二次構造を形成し得る又は形成し得
ない塩基配列を人為的に置換することで発現の３３整が
可能であるとの結論に至った。

本発明はこの結論に基づき完成されたものである。

即ち、本発明は、 蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列中の一部分
であって該ＤＮＡ配列中の他の部分と二次構造を形成し
得るか又は形成し得ない塩基配列の少なくとも一部分を
該ＤＮＡ配列が有する遺伝暗号を変化させることなしに
他の塩基又は塩基配列に置換することを特徴とするＤＮ
Ａ配列の改良方法である。特に、 蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列中の塩基配
列の少なくとも一部分を、該ＤＮＡ配列がａする遺伝暗
号を変化させることなしに、該塩】Ｊ、配列が該ＤＮＡ
配列において二次構造を形成しｉりる塩ノλ配列である
場合には、二次構造を形成し得ない塩基又は塩基配列に
置換し、又は、 該塩基配列が該ＤＮＡ配列において二次構造を形成しｉ
−１：ない塩基配列である場合には二次構造を形成し得
る塩基又は塩基配列に置換する、ことを特徴とするＤＮ
Ａ配列の改良方法である。

更に本発明は、前記改良方法により改良されたＤＮＡ配
列を用いることを特徴とする蛋白質又はペプチドの製造
方法を提供するものである。以下本発明の詳細な説明す
る。

（発明の構成） 本発明が提供するＤＮＡ配列の改良方法は、２つの異な
る側面からなる。第１に、ＤＮＡ配列を発現し易い様に
改良する方法であり、第２にＤＮＡ配列を発現し難い様
に改良する方法である。

以下まず第１の方法から説明する。

本発明が提供するＤＮＡ配列を発現し易い様に改良する
、ＤＮＡ配列の改良方法は、 ■二次構造を形成し得ない塩基配列の自由エネルギーを
、該ＤＮＡ配列が有する遺伝暗号を変化させることなし
に該塩基配列を置換し、増加せしめる、 ■ＤＮＡ配列中の二次構造を形成し得る塩基配列を該Ｄ
ＮＡ配列が有する遺伝情報を変化することなしに二次構
造を形成し得ない塩基配列に置換する、ことからなる。

ここで、二次構造を形成し得る塩基配列とは、それぞれ
２０塩基以下、好ましくは１５塩基以下の、対合し得な
い塩基を挟むか又は挾まない、完全に又は不完全に対合
し得る塩基を含む塩基配列であって（ここで対合とは、
アデニンを有する塩基とチミンを有する塩基の、又はグ
アニンを有する塩基とシトシンを有する塩基の水素結合
を意味する）、二次構造を形成した場合の自由エネルギ
ーか一１０ｋｃａｉ／ｍｏ１以下、好：！　Ｌ　＜　ｌ
ｅｔ　−１５ｋｃａｌ／ｍｏ１以下の塩基配列である。

塩ＪＪ、配列の自由エネルギーは、Ｔｉｎｏｃｏ、Ｉら
の　ノｊ＃Ａ（Ｎａｔｕｒｅ　　　　２４６　　　４０
−４１　　　１９７３年）により算出することができ、
また簡便な算出方法として、例えばＧＥＮＩＡＳ　（三
井情報株式会ｒＬ製）等のプログラム・ソフトを用いる
ことが出来る。

二次構造を形成し得る塩基配列の二次構造を形成し得な
い塩基配列への置換は、二次構造を形成し得る塩基配列
の少なくとも一方の塩基配列中の塩基の一部又は全部を
目的とするＤＮＡ配列がコードする蛋白質又はペプチド
のアミノ酸配列を変化させない範囲で置換し、それぞれ
の塩基配列間の自由エネルギーが一１０ｋｃａｌ／ｍｏ
１以上、好ましくは一７ｋｃａｌ／ｍｏ１以上になるよ
うに行えば良い。この置換のためには、ＤＮＡ配列中に
変異を導入するための、例えばＭ１３系ファージを用い
る等の通常の方法が使用出来る。

ＤＮＡ配列中に前記したような、二次構造を形成し得る
塩基配列が存在しない場合においても、その自由エネル
ギーが一１０ｋｃａｌ／ｍθ！に近い配列が存在すると
きは、それら配列の少くとも一方について置換を行い、
自由エネルギーを増加させることで、該ＤＮＡ配列を発
現し易いように改良することができる。

本発明の方法では、ＤＮＡ配列中の二次構造を形成しｉ
する、全ての塩基配列について実施する必要はなく、Ｄ
ＮＡ配列をどの程度発現し易く改良するか等の条件によ
り、適宜置換を行う部位の数、その他どの程度自由エネ
ルギーを変化させるか等の諸条件を決定すれば良い。

第１の方法により塩基配列を置換することで、他の二次
構造を形成し１りるか又はし得ない塩基配列が形成され
る可能性が有ることから、本節１の方法の実施に先立っ
て置換後のＤＮＡ配列について考慮しておくことが望ま
しい。

以下続いて第２の方法について説明する。

本発明が提供する、ＤＮＡ配列を発現し難い様に改良す
る改良方法は、 ■二次構造を形成し得る塩基配列の自由エネルギーを、
該ＤＮＡ配列が存する遺伝暗号を変化させることなしに
該塩基配列を置換し、減少せしめる、 ■ＤＮＡ配列中の二次構造を形成し得ない塩基配列を該
ＤＮＡ配列が存する遺伝暗号を変化させることなく、二
次構造を形成し得ない塩基配列に置換する、ことからな
る。

二次構造を形成し得ない塩基配列とは、前記第１の方法
において示した、二次構造を形成し得る旭川配列以外の
塩基配列を意味する。これらの二次構造を形成し得ない
塩基配列の二次構造を形成し得る塩基配列への置換は、
該２０塩基以下好ましくは１５塩基以下の塩基配列の一
部又は全部を、目的とするＤＮＡ配列がコードする蛋白
質又はペプチドのアミノ酸配列に変化を与えない範囲で
置換し、対合し得ない塩基配列を挟むか又は挟まずに存
在するもう一方の塩基配列と完全に又は不完全に対合す
るように置換すれば良い。このとき置換は二次構造を形
成する塩基配列の一方に対して行われても良いし、両方
に対して行われても良く、置換により、完全に又は不完
全に対合する塩基配列が二次構造を形成した場合の自由
エネルギーが−１０ｋｃａｌ／ｍｏ１以下好ましくは−
１５ｋ　ｃ　ａ　Ｉ　／　ｍ　ｏ　１以下になるようで
あれば良い。

ＤＮＡ配列中に二次構造を形成し得ない塩基配列が存？
■、シない場合においても、その自由エネルギーが大き
な塩基配列が存在するときは、それらの配列の一方又は
両方を置換して自由エネルギーを減少させることで、該
ＤＮＡ配列を発現し難いように改良することができる。

この第２の方法についても、第１の方法で説明した様に
、ＤＮＡ配列中の全ての二次もが造を形成し得ない塩基
配列について実施する必要はない。

史に、本箱２の方法によって他の二次構造を形成し得る
又はし得ない塩基配列が形成される可能性があるため、
本箱２の方法の実施に先立っても置換後のＤＮＡ配列を
考慮しておくことが望ましい。

以上説明した第１、第２の方法からなるＤＮＡ配列の改
良方法は、目的とするＤＮＡ配列を発現し易い様に改良
するのか、又はＤＮＡ配列を発現し難い様に改良するの
かに応じて適宜選択して使用すれば良い。

本発明が提供する蛋白質又はペプチドの製造方法につい
て説明する。

まず、前記のＤＮＡ配列の改良方法により改良されたＤ
ＮＡ配列は、宿主との関係において適宜決定された、プ
ロモーター系等を有するベクター等にｉ９人される。こ
のとき、二本ｆｆ１ＤＮＡ配列のベクターを用いる場合
には、改良されたＤＮＡ配列を鋳型として該配列に相捕
的な配列を作製し、これらをアニーリングさせて二本鎖
ＤＮＡ配列としてベクターに導入すれば良い。

ＤＮＡ配列の改良をＭ１３系ファージを用いて行った場
合には、ベクターＤＮＡ配列が一本鎖、又は二本鎖の状
態を適宜選択することが出来る。

従って、ベクターとして一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列の
いずれを用いる場合であっても必要に応じて選択するこ
とができ、都合が良い。

また、遺伝暗号の担い手としてＲＮＡ配列を有する例え
ばレトロウィルス等を用いる場合には、改良されたＤＮ
Ａ配列に相捕的なりＮＡ配列を鋳型としてＲＮＡ配列を
作製して用いれば良い。

以下に、二重鎖ＤＮＡ配列を用いる、大腸菌を宿主とす
るＤＮＡ配列の発現について説明する。

改良されたＤＮＡ配列とその相捕的なりＮＡ配列からな
る二重鎖ＤＮＡ配列のｍＲＮＡへの転写開始の促進又は
抑制のため、該ＤＮＡ配列の上流側にプロモーターオペ
レーター系を導入する。大腸菌を宿主とした場合に用い
られるプロモーターオペレーター系としては、例えばラ
クトースプロモーターオペレーター系、トリプトファン
プロモーターオペレーター系、β−ラクタマーゼプロモ
ーターオペレーター系、人工的に作製されたｔａｃプロ
モーターオペレーター系等が知られている。これらのプ
ロモーター系さレータ−系に附随して、そのインヒビタ
ー蛋白質をコードする例えば１ａｃｉ、１ａｃｌｑ等の
ＤＮＡ配列を導入しても良い。以上、改良されたＤＮＡ
配列、プロモーター系等を導入したベクターで大腸菌を
形質転換し、培養し、ＤＮＡ配列を発現させ、目的とす
る蛋白質又はペプチドを製造すれば良い。

なお、遺伝子組換え操作それ自体、その条件更には大腸
菌の培養条件等は、通常の方法に従えば良く、格別の制
限はない。

（発明の効果） 本発明のＤＮＡ配列の改良方法によれば、プロモーター
オペレーター系による発現の調整に加えて、ＤＮＡ配列
自体の発現し品さ又はし難さ及び／又は該ＤＮＡ配列の
転写により製造されるｍＲＮＡ配列の翻訳され易さ又は
され難さを改良することができる。

本発明が提供する改良方法により、例えばＤＮＡ配列を
発現し易い様に改良した場合には、同一のプロモーター
オペレーター系を使用した場合に比べて、目的とする蛋
白質又はペプチド生産量を増大させることができ、また
、ＤＮＡ配列を発現し難いように改良した場合にはその
生産量を減少させることができる。このことは、有用な
蛋白質又はペプチドを遺伝子学的に生産する本来の目的
を達成するうえで極めて有用である。

本発明が提供するＤＮＡ配列の改良方法により改良され
たＤＮＡ配列においては、更に、ブロモターオペレータ
ー系のみを使用した場合には難しい、微妙なりＮＡ配列
から蛋白質への発現の調整を行うことが出来る。

以下本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例において、以下（１）〜（４）の操作は特に記載
しない限り次の方法に従った。

（１）制限酵素によるＤＮＡ配列の切断と回収制限酵素
によるＤＮＡ配列の切断に際しては、次の切１１ｉ用緩
衝液を用いた。また、切断は、２単位／μｇＤＮＡの制
限酵素を使用し、３７℃で９０分間の処理を行った。

（ａ）生塩濃度緩衝液 ５０ｍＭのＮａＣ１、ｆＯｍＭのトリス塩酸（ｐ、Ｈ７
，４）　、１０ｍＭの硫酸マグネシウム及び１ｍＭのジ
チオスレイトールからなり、ＨｉｎｄｌＩＩ、Ｈｐａｆ
によるＤＮＡ配列の切断に使用。

（ｂ）高塩濃ｒｆｉ緩衝液 １００ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７
，４）及び１０ｍＭの硫酸マグネシウムからなり、Ｂｇ
ｌＩＩ、ＴａｃｌによるＤＮＡ配列の切１１ｉに使用。

切断したＤＮＡ配列は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス
塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡを含む）で飽和したフェノール
で抽出し、エーテルを添加してフェノール層を除去し、
更に２倍量のエーテルを添加して一２０℃で３０分間放
置した後、遠心分離して回収した。

（２）切断したＤＮＡ配列の連結 連結する２個のＤＮＡ配列を、５μｌの緩衝液（６−５
ｒｎ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２を含む１００ｍ）リス塩
酸（ｐＨ７，６））に溶解させ、市販のＤＮＡ連結試薬
（宝酒造株式会社製、Ｌｌｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）を用
いて１６℃で３０分間反応させた。

（３）大腸菌の形質転換 大腸菌（ＪＭ１０３株）を４ｍｌのＬＢ−ブロス（０，
１％トリプトファン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣ１）に殖菌し、−晩培養した後、５０ｍ１のＬＢ−
ブロスに移し２時間培養した。集菌後、２５ｍ１の塩化
カルシウム溶液に懸濁して３０分間水冷後、集菌して５
ｍｌの５０ｍＭ塩化カルシウム溶液に懸濁してコンピテ
ントセルとＤＮＡ配列を溶解した０、１Ｍのトリス塩酸
（ｐＨ７，２）１０μｍを混合し、４０分間水冷後４２
℃で２分間熱処理し、１．５ｍｌのＬＢ−ブロスを加え
、３７℃で２時間培養した。得られた菌体懸濁液０．１
ｍｌをアンピシリン５０μ！　／　ｍ　１を含むＬＢ寒
天培地（ＬＢ−ブロス＋２．０％寒天）で−晩培養し、
形質転換菌を得た。

（４）枯草菌の形質転換 枯草菌の形質転換は、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒｌｌａｅｔ
ＯｒｌｏＩｏｇ）’　（８１巻、７４１頁、１９６１年
）に記載された方法に従った。５ｐｉｚｌｚｅｎ最少培
地（０，６％リン酸−カリウム、１．４％リン酸二カリ
ウム、０．２％硫酸アンモニウム、０．１％クエン酸ナ
トリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、０．５％グル
コース）に０．０２％カザミノ酸、５０μｇ　／　ｍ　
１のＬ−１リブトフアン及び５０μｇ　／　ｍ　１のし
一ロイシンを添加した培地２ｍｌに枯苧菌を殖菌し、対
数増殖期終了後１時間まで培養した後、培養懸濁液５ｐ
ｌｚｌｚｏｎ最少培地に０．０１％カザミノ酸、５μｇ
／ｍｌのし一トリプトファン、５μｇ　／　ｍ　１のＬ
−ロイシンを添加した培地に移し、培養を続けた。培養
開始後およそ９０分後、コンピテント状態になった培養
液０．９ｍｌに０，１ｍｌのＤＮＡ溶液を添加し、３７
℃で３０分間振湯し、ＬＢ−ブロス３ｍｌを添加して更
に３７℃で２時間培養した。得られた懸濁液をカマナイ
シン５μｇ／ｍｌを含む寒天培地で３７℃にて一晩培養
し、形質転換菌を得た。

実施例　１ 図１に示される、耐熱性中性プロテアーゼ（以下ｎｐｒ
Ｍとする）をコードするＤＮＡ配列（以下、ｎｐｒＭ−
ＤＮＡとする）について、２０塩基以内で自由エネルギ
ーが−Ｉ５Ｋｃａｌ／ｍｏ１以下の、二次構造を形成し
得る塩基配列をＧＥＮＩＡＳ　（三井情報株式会社製）
を用いて探索した。その結果、第９１３番口の塩基から
第９１８番口の塩基にかけての６塩基配列（ＣＣＡＧＣ
Ｇ）が見い出された。

この塩基配列は、対合しない９１９番口から９３５番目
にかけての１７塩基配列を挟んで９３６番目から９４１
番口にかけての６塩基配列と−１６．３Ｋｃａ　１／ｍ
ｏ　ｌの自由エネルギーを持って対合する（図２）。

尚、ｎｐｒＭ−ＤＮＡは、昭和６１年９月３０口に微工
研菌寄第８９８２号として寄託されたバチルス・ズブチ
リスＭＴ−２／ｐＴＺ２３２中のプラスミドｃｐＴｚ　
２３２）のベクターＤＮＡから取得した。また、バチル
ス・ズブチリスＭＴ−２／ｐＴＺ　２３２については、
特願昭６１−２３３７３１号中に記載されている。

このｐ’ｒｚ　２３２巾のベクターＤＮＡのプロモータ
ーオペレーター配列を変えることなしにｎｐｒＭの発現
口を増加させるため、先に示した二次構造を形成し得る
６塩基配列を二次配列を形成しｉ−）ない塩基配列に置
換した。尚、この操作は大腸菌７Ｍ１０３株を用いて行
った。

先ず、ｎｐｒＭ−ＤＮＡをＭｌ　３ｍｐ　１８フアジ（
Ｇｃｌｌ（３％　３３巻、１０３頁、１９８５年）を用
いてサブクローニングした。続いて、以下に示す塩基配
列を合成し、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　１８フアージ巾の一本
鎖ＤＮＡ配列（図１に示すＤＮＡ配列に相補的なりＮＡ
配列）中の二次構造を形成し得る塩基配列部分にライゲ
ーションさせ、Ｏｌｌｇｏｎｕｃｌｏｏｔｌｄｏ−旧ｒ
ｏｃｔｃｄ　Ｉｎ　ｖｌｔｒｏ　ｍｕｔａｇｏｎｏｓｌ
ｓ　ｓｙｓｔｅｍ　（アマ−ジャムｉｔ、　＊　）を用
いて、この合成された塩基配列を含む、改良ｎｐｒＭ−
ＤＮＡ配列を作製した。

（５′側） １：　　零 ＧＡＴＧＣＴ（ＣＣＴＧＣ＾）ＧＴＴＧＡＴＧＣ（３′
側） （但し、ロｐｒＭ−ＤＮＡ配列中の、先に示した二次構
造形成を形成し得る６塩基配列部分と相；１（ｉ的な部
分へ特異的にライゲーションをさせるため、５゛側に６
塩基配列、３゛側に８塩基配列、ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列
と同様の塩基配列を倚する塩基配列を用いた。（）内は
、実施例１の６塩基配列に対応する６塩基配列を示す。

図中の＊は、実施例１の６塩基配列を二次構造を形成し
得ない塩基配列に改良するために置換された塩基を示す
。

改良ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列では、９１３番口から９１８
番口にかけての塩基配列と、９３６番目から９４１番口
にかけての塩基配列の間の自由エネルギーは０Ｋｃａｌ
／ｍｏｌである。）　次に作製した改良ｎｐｒＭ−ＤＮ
Ａを制限酵素Ｈｉｎｄ■及びＨｐａｌで消化し、前記し
た合成した塩基配列を含む断片を得た。続いてｐ”ｒｚ
　２３２のベクターＤＮＡを同様に制限酵素ＨｉｎｄＩ
ＩＩ及びＨｐａｌで消化し、二次構造を形成し得る塩基
配列を含まないベクターＤＮＡ断片を得た。合成した塩
基配列を含む改良ｎｐｒＭ−ＤＮＡ断片及び二次構造を
形成しｉｉ；る塩基配列を含まないベクターＤＮＡ断片
をつなぎ合せ、全長の改良ｎ　ｐ　ｒ　Ｍ　−ＤＮＡ配
列を有するプラスミド（以下　ｐ’ｒｚ　２３２−１と
する）を得た。ｐ’ｒｚ　２３２のベクタＤＮＡの制限
地図を図３に示す。

実施例　２ 実施例１で１すたプラスミドｐＴＺ２３２−１及びプラ
スミドｐＴＺ２３２を用いて、枯ａ菌、バチルス・サチ
ルス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｌｌｌｓ）　Ｍ　
１１１２株（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　ｂａｃｔｏｒｌｏ
ｌｏｇｙ　１５４巻・１１３１頁、１９８３年）を形質
転換した。

形質転換した枯草菌をそれぞれ、１％トリプトン、０．
５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ１からなる培地で通常
の方法に従って培養し、約１０時間後にｎｐｒＭ−ＤＮ
Ａ配列を発現させた。

培養開始から２４時間経過した時点で、ｎｐｒＭ−ＤＮ
Ａ配列の発現により製造され、培地に分泌されたｎｐｒ
Ｍをゲルｍ；Ａ　（東ソー株式会社製Ｔｏｙｏｐｃａｒ
ｌ　ＩＩＷ−５５；商品名を使用）１．：ヨｔ）分ＭＬ
、カゼインを用いて活性を測定した結果、改良されてい
ないｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＴｚ　２
３２で形質転換された枯草菌が分泌した口ｐｒＭ活性は
培地１ｍｌ当り５２００ｕであったのに対し、ｐＴＺ２
３２−１で形質転換された枯草菌が分泌したｎｐｒＭ活
性は培地１ｍｌ当り５６００ｕと、約１０％発現量が増
加していた。

なお、いずれのプラスミドで形質転換された枯草菌も、
その増殖に差は認められなかった。ｐＴＺ２３２で形質
転換された枯草菌の、培養中の増殖と培地１ｍｌ当りの
分泌されたｎｐｒＭ活性の関係を図５に、ｐｒｚ２３２
−１で形質転換された枯草菌についての同様の結果を図
６に示す。

実施例　３ ｐＴｚ　２３２中のベクターＤＮＡのプロモーターオペ
レーター配列を変えることなしにｎｐｒＭの発現巳を減
少させるため、図１で示されるｎｐｒＭ−ＤＮＡ中の９
０５番目から９１２番目にかけての８塩基配列（ＡＴＧ
ＡＴにＣＴ）を、該配列が９４２番目から９４９番目に
かけての８塩基配列とより二次構造を形成し昌い塩基配
列に置換した。なお、。ｐ　ｒ　Ｍ　−Ｄ　Ｎ　Ａ配列
では、これら塩基配列は−１６，３Ｋｃ　ａ　ｌ／ｍｏ
　ｌの自由エネルギーを持って二次構造を形成する。

先ず、ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列を実施例１と同様の方法で
Ｍｌ　３ｍｐ　１８フアージを用いてサブクローニング
した。続いて、以下に示す塩基配列を合成し、Ｍ１３ｍ
ｐ１ｇファージ中の一本鎖ＤＮＡ配列（図１のＤＮＡ配
列に相補的なりＮＡ配列）中の９０１番目から９１９番
目の塩基配列部分にライゲーションさせＯｌｌｇｏｎｕ
ｃｌａｏｔｉｄｅ−ｄｌｒｏｃｔｅｄＩｎ　ｖｌｔｒｏ
　ｍｕｔａｇｏｎｏｓｌｓ　ｓｙｓｔｅｍ　（アマ−ジ
ャム社製）を用いて、この合成された塩基配列を含む、
改良ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列を作製した。

（５゛側） 本　　　本 ＡＧＣＴ（＾ＴＧＡＣＧＣＡ）ＣＣＡＧＣＧＧ（３″側
） （但し、ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列中の、９０５番目から９
１２番目の塩基配列部分に相補的な部分へ特異的にライ
ゲーションをさせるため、５′側に４塩基配列、３゛側
に７塩基配列、ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列と同様の塩基配列
を有する塩基配列を用いた。（）内は、９０５番目から
９１２番目までの８塩基配列に対応する８塩基配列を示
す。配列中の本は、９４２番口から９４９番目にかけて
の塩基配列と二次構造を形成し易いように置換された塩
基を示す。改良ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列では、９０５番目
から９４９番目にかけての塩基配列の間の自由エネルギ
ーは−３０，８Ｋｃａｌ／ｍ。

凰である。） 改良ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列９０１番目配列９０１香目」
の塩基配列部分を図４に示す。

次に作製した改良ｎｐｒＭ−ＤＮＡを制限酵素Ｈ３ｎｄ
ｍ及びＨｐａｌで消化し、前記した合成した塩基配列を
含むＤＮＡ断片を得た。続いてｐＴＺ２３２のベクター
ＤＮＡを同様に制限酵素Ｈｉｎｄｎｌ及びＨｐａｌで消
化し、ＤＮＡ断片を得な。合成した塩基配列を含む改良
ｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列断片及びｐＴＺ２３２のベクター
ＤＮＡ断片をつなぎ合せ、全長の改良ｎｐｒＭ−ＤＮＡ
配夕１１を有するプラスミド（以下ｐＴＺ２３２−４）
を１りた。

実施例　４ 実施例３と同様に、ｐ”ｒｚ　２３２及びｐ”ｒｚ２３
２−４を用いて枯草菌Ｍ１１１２株を形質転換し、形質
転換した枯４’ｉ菌を培養し、ｎｐｒＭを製造して、培
地１　ｍ　ｌ当りのｎｐｒＭの活性を測定した結果、改
良されていないｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列を含むプラスミド
ｐＴＺ２３２で形質転換したｔ−６草菌が分泌したｎｐ
ｒＭ活性が約５１０Ｑｕであったのに対し、改良された
ＤＮＡ配列を含むｐＺＴ２３２−４で形質転換された枯
草菌が分泌したｎｐｒｍ活性は３ＱＯＯｕと、約４０９
６減少した。なお、いずれのプラスミドで形質転換され
たｔｌ’ｌ　／、を菌も、その増殖に差は認められなか
った。

１）　Ｔ　Ｚ　２３２　４で形質転換された枯′Ｉ：ｉ
菌の、培養中の増殖と培地１ｍｌ当りの分泌された口ｐ
「Ｍ活性の関係を図７に示す。

実施例　５ 以上の実施例で得られた、１）ＴＺ２３２、ｐＴＺ２３
２−１及びｐＴＺ２３２−４ｔ’形質転換された枯草菌
について、菌体内のｎｐｒＭをコードするｍＲＮＡの口
を測定した。

各プラスミドを有する枯草菌を対数増殖後期まで培養し
、集菌後、Ｄｕｖａｌｌらの方法（Ｄｕｖａ！１．Ｅ、
Ｊａｔ　ａｔ、Ｊ、ＢａｃｔｏｒＩａｌｔ５ｇ巻、７４
８−７９０１９８４年）に従い全ＲＮＡを抽出した。プ
ローブとしてＢａｍＨｌ−Ｈｐａｌ断片（図３参照）を
用い、該プローブを放射性同位原素でラベルした（Ｔａ
ｋａｒａ！？ａｎｄｏｓ　ＤＮＡ　Ｒａｖｏｌｌｎｇ　
Ｋｉｔ使用）　。ｍＲＮＡＷはノーザンハイブリダイゼ
ーシジン法（＾１ｗｌ口ｏ　ｅｔａｌ　Ｍａｔｌｌｏｄ
ｓ　１Ｅｎｚｙｖｏ１．（ｉ８巻、２２０−２４２１９
７９年）により測定した。ノーザンハイブリダイゼーシ
ョンは全ＲＮＡを各６μｇ１１０μｇずつアガロースゲ
ル電気泳動により分画して行った。

電気泳動の結果を図８に示す。この結果、各プラスミド
を有する枯草菌からの、プローブとハイブリダイズする
ｍ　ＲＮ　Ａ　ｍはほぼ等しいことがわかる。この結果
と、本発明の実施例２．４の結果から、本発明の方法は
、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写をコントロールするので
はな（、ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳をコントロールす
ることが示唆される。

【図面の簡単な説明】

図１はｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列を示す。図２はｎｐｒＭ−
ＤＮＡ配列中の９１３番目から９４１番１１にかけての
塩基配列が形成する二次構造を示す。 図３はｐＴＺ２３２プラスミド・ベクターの制限酵素地
図を示し、図中、ＢはＢａｍＨＩの制限部位を、ＥはＥ
ｃｏＲ夏の制限部位を、ＨはＨｉｎｄｍの制限部位を、
）ｉｐはＨｐａ　Ｉの制限部位を、ＰはＩ’ｓｔｌの制
限部位を、ＰｖはＰｖｕｌＩの制限部位を、Ｓは５ａｌ
ｌの制限部位をそれぞれ示し、ｐは本発明の実施例で置
換を受けた塩基配列付近を示す。図４は、本発明の実施
例３で改良されたｎｐｒＭ−ＤＮＡ配列の９０１番目か
ら９５３番１“１にかけての塩基配列が形成する二次構
造を示し、図中の本は置換された塩基を示す。図５は本
発明の実施例２での、ｐ”ｒｚ　２３２で形質転換され
た枯草菌についての結果を示し、図中、（・）は培地中
の菌体口を６６０ｎｍでの吸収（ＯＤ６６０）により測
定した結果を、（Ｉｍ）は分泌された培地１ｍｌ当りの
ｎｐｒＭ活性を示す。図６、図７は、それぞれ本発明の
実施例２、実施例４での、ｐＴＺ２３２−１、ｐＴＺ２
３２−４で形質転換された枯草菌についての結果を示し
、その意味するところは図５と同様である。図８は本発
明の実施例５の結果を示し、レニン１〜４は６ｕｇの全
ＲＮＡ、５〜８は１０ｕｇの全ＲＮＡを使用したものを
示す。また、レーン１．５はｐＴＺ２３２、レーン２．
６はｐＴＺ２３２−４、レーン３．７はｐＴＺ２３２−
１、レーン４．８はｎｐｒＭＤＮＡ配列を有さないベク
ターについての結果をそれぞれ示す。図中、２３Ｓ、１
６Ｓは、ｒＲＮＡ　（リボゾームＲＮＡ）の位置を示す
。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列の一
   部分であって該ＤＮＡ配列中の他の部分と二次構造を形
   成し得るか又は形成し得ない塩基配列の少なくとも一部
   分を該ＤＮＡ配列が有する遺伝暗号を変化させることな
   しに他の塩基又は塩基配列に置換することを特徴とする
   ＤＮＡ配列の改良方法。
2. （２）蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列中の
   塩基配列の少なくとも一部分を該ＤＮＡ配列が有する遺
   伝暗号を変化させることなしに、（ａ）該塩基配列が該
   ＤＮＡ配列において二次構造を形成し得る塩基配列であ
   る場合には二次構造を形成し得ない塩基又は塩基配列に
   置換し、又は、 （ｂ）該塩基配列が該ＤＮＡ配列において二次構造を形
   成し得ない塩基配列である場合には二次構造を形成し得
   る塩基又は塩基配列に置換する、ことを特徴とする請求
   項第（１）項記載の方法。
3. （３）請求項第（１）項記載の改良方法により改良され
   たＤＮＡ配列を用いることを特徴とする蛋白質またはペ
   プチドの製造方法。