JPH0480680B2 - - Google Patents
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- JPH0480680B2 JPH0480680B2 JP57023584A JP2358482A JPH0480680B2 JP H0480680 B2 JPH0480680 B2 JP H0480680B2 JP 57023584 A JP57023584 A JP 57023584A JP 2358482 A JP2358482 A JP 2358482A JP H0480680 B2 JPH0480680 B2 JP H0480680B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- culture
- iaa
- promoter
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明はβ−インターフエロン（以下β−IFN
と略記する）などの真核細胞由来の生理活性ペプ
チドの発酵法による製造方法に関する。 近年、急速に発展した遺伝子操作技術の利用に
より、β−IFN等の真核細胞由来の有用生理活性
ペプチドをコードする遺伝子がクローニングさ
れ、またそれらを微生物由来のプロモーターと連
結させ、微生物内で目的とする生理活性ペプチド
を効率的に生産させることが可能になつている
（T.タニグチら：Proc.Jap.J.Acad.serB55巻、464
〜469（1979）、特開昭57−77654、特開昭58−
110600）。このようにして得られた組換えプラス
ミドを有する微生物をその性質に応じて効率よく
培養し、目的とする生理活性ペプチドを高収率で
発酵生産させる技術は極めて重要である。 一般に菌体で生成される蛋白質、酵素の至適生
成条件は必らずしも菌自体の至適生育条件と同一
というわけではなく、培養温度、PH、通気撹拌と
いつた培養条件、培地条件により大きく変動す
る。また目的とする蛋白質、酵素が誘導型である
か、構成型であるかによつてもその生産方法は大
きく異なり、例えば誘導型の場合、誘導物質の添
加の条件等で生産量は大きく変動する。また目的
とする蛋白質、酵素が不安定である場合、その安
定な生産方法について検討する必要がある。 本発明者らは、β−IFN等を生産する組換えプ
ラスミドを有する微生物を用いて、目的とする生
産活性ペプチドを高収率で発酵生産させるため、
上述したような種々の培養条件について検討を行
ない、極めて効率よくβ−IFN等の生産活性ペプ
チドを生産させる条件を見い出すことに成功し、
本発明を完成するに到つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は、エツシエリヒア属に属し、真核細胞
由来のペプチドをコードする遺伝子、ペクターお
よびプロモーターからなる組換えDNAを含有し、
かつ該ペプチド生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中に該ペプチドを蓄積せしめ、該培
養物から該ペプチドを採取するに際し、培養を15
〜27℃の温度で行うことを特徴とするペプチドの
製造法を提供する。 現在まで多くの生理活性ペプチドが微生物中で
発現されているが、それらのほとんどの場合、微
生物として大腸菌が用いられている。大腸菌の場
合通常用いられる培養温度としては37℃が多く、
また実際にこれらの生理活性ペプチドを生産させ
る場合も37℃で行なわれている場合が多い。本発
明方法によれば、この通常培養温度よりも10〜25
℃低い温度、より好ましくは15〜20℃低い温度で
培養を行ない、ペプチドを効率よく生産すること
ができる。例えば大腸菌の場合、15〜30℃より好
ましくは20〜25℃で培養することにより良い結果
が得られる。 本発明の真核細胞由来のペプチドとしてはイン
シユリン、インターフエロン、成長ホルモンな
ど、好適にはヒトのβ−インターフエロンのペプ
チドがあげられる。ベクターとしては大腸菌由来
のベクター、枯算菌由来のベクター、酵母由来の
ベクターが用いられるが、好ましくは大腸菌由来
のpBR322、pBR313、pMB9などが用いられる。
プロモーターとしてはlacプロモーター、phoAプ
ロモーター、trpプロモーターなど、好適にはtrp
プロモーターが用いられる。 本発明方法の培地としては宿主微生物の培養に
通常用いられる培地が用いられる。一般に菌の生
育を良くするためには富裕培地の方が良いが、例
えばプロモーターとしてtrpプロモーターを使用
する場合にはペプトン系の培地は好ましくない。 trpプロモーターによりペプチドの発現が制御
されている場合には、誘導物質としてIAAを添
加することは知られている。 本発明はまた、このIAA添加効果を飛躍的に
向上させる方法を提供する。すなわち、微生物の
培養中対数増殖期の後半から最高増殖を示すとき
まで、大腸菌を使用する場合は乾燥菌体濃度で３
〜30mg／mlの範囲に微生物が増殖したときに、培
地にIAAを添加することにより該ペプチドの生
産を向上させることができる。添加するIAAは
10〜200mg／の範囲で用いられる。さらにペプ
チドの生産を向上させるためには、上記IAAの
添加後さらにIAAを連続的もしくは間穴的に添
加する。連続的に添加するときは全量で200mg／
を越えない濃度で添加し、間穴的に添加すると
きは３〜10回、各５〜50mg／の範囲で添加すれ
ばよい。 上記のごとき培養法の改良、すなわち、低温培
養、IAA添加時期の選択、IAAの追加補充によ
るペプチド生産の向上は、一般の微生物による生
産は勿論組換えDNA技法を用いるペプチド生産
において知られておらず本発明者らにより始めて
見出されたものである。 以下本発明の実施例を示す。 実施例 １ ヒトβ−IFN遺伝子をtrpプロモーター（以下
Ptrpと略記する）の下流に組みこみ、造成した
組換え体プラスミドpLT−１を含有する大腸菌
Ｋ−12株HB101すなわち Escherichia coli ILV−１ ATCC39025（特開昭
58−110600）を用いて次に述べる方法で培養し、
ヒトβ−IFNの生産性を調べる。 上記菌体をLG培地（トリプトン10ｇ、酵母エ
キス５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース２ｇを水１に
とかしNaOHにてPHを7.0とする）で30℃、17時
間培養する。この培養液50mlを１のMGC培地
（Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NaCl0.5％、
NH4Cl0.1％、グルコース0.5％、カザミノ酸0.5
％、MgSO41ｍＭ、サイアミン４mg／）を含む
２容ミニジヤーフアーメンターに接種して本培
養を行なう。なお培養液は50mg／の濃度でアン
ピシリンを添加する。750rpm、1vvmの通気撹拌
条件で、PHは6.5に制御し、15〜37℃の種々の温
度で培養を行う。グルコース濃度はグルコースア
ナライザーで調べながら０〜1.0％の範囲になる
ようにフイードし調節する。またカザミノ酸もグ
ルコースと等量フイードする。 乾燥菌体濃度で３mg／mlに菌が生育した時点で
20mg／mlのIAA（和光純薬社製）を添加し、さら
に12〜72時間培養を続ける。 β−IFNの菌体からの抽出は次のように行な
う。培養液１mlを8000rpm、10分間遠心分離して
集菌し、30ｍMNaCl、30ｍＭ、Tris−HCl（PH
7.0）緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を上記緩衝液
に懸濁し、100μｇのリゾチーム、0.25M、
EDTA25μを加え１ml懸濁液とし30分間０℃に
放置した後、凍結、融解を３回繰り返して菌体を
破壊する。これを15000rpm30分間遠心して上清
を得、上清中のβ−IFNの量をアームストロング
の方法に従つて定量する〔アームストロングら：
Appl.Microbiol.、21巻、723−725（1971）〕〔ただ
し、ウイルスとしてはVesicular Stomatitis
Virus、動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来の
Wish cellを用いる〕。 結果を第１表に示す。
と略記する）などの真核細胞由来の生理活性ペプ
チドの発酵法による製造方法に関する。 近年、急速に発展した遺伝子操作技術の利用に
より、β−IFN等の真核細胞由来の有用生理活性
ペプチドをコードする遺伝子がクローニングさ
れ、またそれらを微生物由来のプロモーターと連
結させ、微生物内で目的とする生理活性ペプチド
を効率的に生産させることが可能になつている
（T.タニグチら：Proc.Jap.J.Acad.serB55巻、464
〜469（1979）、特開昭57−77654、特開昭58−
110600）。このようにして得られた組換えプラス
ミドを有する微生物をその性質に応じて効率よく
培養し、目的とする生理活性ペプチドを高収率で
発酵生産させる技術は極めて重要である。 一般に菌体で生成される蛋白質、酵素の至適生
成条件は必らずしも菌自体の至適生育条件と同一
というわけではなく、培養温度、PH、通気撹拌と
いつた培養条件、培地条件により大きく変動す
る。また目的とする蛋白質、酵素が誘導型である
か、構成型であるかによつてもその生産方法は大
きく異なり、例えば誘導型の場合、誘導物質の添
加の条件等で生産量は大きく変動する。また目的
とする蛋白質、酵素が不安定である場合、その安
定な生産方法について検討する必要がある。 本発明者らは、β−IFN等を生産する組換えプ
ラスミドを有する微生物を用いて、目的とする生
産活性ペプチドを高収率で発酵生産させるため、
上述したような種々の培養条件について検討を行
ない、極めて効率よくβ−IFN等の生産活性ペプ
チドを生産させる条件を見い出すことに成功し、
本発明を完成するに到つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は、エツシエリヒア属に属し、真核細胞
由来のペプチドをコードする遺伝子、ペクターお
よびプロモーターからなる組換えDNAを含有し、
かつ該ペプチド生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中に該ペプチドを蓄積せしめ、該培
養物から該ペプチドを採取するに際し、培養を15
〜27℃の温度で行うことを特徴とするペプチドの
製造法を提供する。 現在まで多くの生理活性ペプチドが微生物中で
発現されているが、それらのほとんどの場合、微
生物として大腸菌が用いられている。大腸菌の場
合通常用いられる培養温度としては37℃が多く、
また実際にこれらの生理活性ペプチドを生産させ
る場合も37℃で行なわれている場合が多い。本発
明方法によれば、この通常培養温度よりも10〜25
℃低い温度、より好ましくは15〜20℃低い温度で
培養を行ない、ペプチドを効率よく生産すること
ができる。例えば大腸菌の場合、15〜30℃より好
ましくは20〜25℃で培養することにより良い結果
が得られる。 本発明の真核細胞由来のペプチドとしてはイン
シユリン、インターフエロン、成長ホルモンな
ど、好適にはヒトのβ−インターフエロンのペプ
チドがあげられる。ベクターとしては大腸菌由来
のベクター、枯算菌由来のベクター、酵母由来の
ベクターが用いられるが、好ましくは大腸菌由来
のpBR322、pBR313、pMB9などが用いられる。
プロモーターとしてはlacプロモーター、phoAプ
ロモーター、trpプロモーターなど、好適にはtrp
プロモーターが用いられる。 本発明方法の培地としては宿主微生物の培養に
通常用いられる培地が用いられる。一般に菌の生
育を良くするためには富裕培地の方が良いが、例
えばプロモーターとしてtrpプロモーターを使用
する場合にはペプトン系の培地は好ましくない。 trpプロモーターによりペプチドの発現が制御
されている場合には、誘導物質としてIAAを添
加することは知られている。 本発明はまた、このIAA添加効果を飛躍的に
向上させる方法を提供する。すなわち、微生物の
培養中対数増殖期の後半から最高増殖を示すとき
まで、大腸菌を使用する場合は乾燥菌体濃度で３
〜30mg／mlの範囲に微生物が増殖したときに、培
地にIAAを添加することにより該ペプチドの生
産を向上させることができる。添加するIAAは
10〜200mg／の範囲で用いられる。さらにペプ
チドの生産を向上させるためには、上記IAAの
添加後さらにIAAを連続的もしくは間穴的に添
加する。連続的に添加するときは全量で200mg／
を越えない濃度で添加し、間穴的に添加すると
きは３〜10回、各５〜50mg／の範囲で添加すれ
ばよい。 上記のごとき培養法の改良、すなわち、低温培
養、IAA添加時期の選択、IAAの追加補充によ
るペプチド生産の向上は、一般の微生物による生
産は勿論組換えDNA技法を用いるペプチド生産
において知られておらず本発明者らにより始めて
見出されたものである。 以下本発明の実施例を示す。 実施例 １ ヒトβ−IFN遺伝子をtrpプロモーター（以下
Ptrpと略記する）の下流に組みこみ、造成した
組換え体プラスミドpLT−１を含有する大腸菌
Ｋ−12株HB101すなわち Escherichia coli ILV−１ ATCC39025（特開昭
58−110600）を用いて次に述べる方法で培養し、
ヒトβ−IFNの生産性を調べる。 上記菌体をLG培地（トリプトン10ｇ、酵母エ
キス５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース２ｇを水１に
とかしNaOHにてPHを7.0とする）で30℃、17時
間培養する。この培養液50mlを１のMGC培地
（Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NaCl0.5％、
NH4Cl0.1％、グルコース0.5％、カザミノ酸0.5
％、MgSO41ｍＭ、サイアミン４mg／）を含む
２容ミニジヤーフアーメンターに接種して本培
養を行なう。なお培養液は50mg／の濃度でアン
ピシリンを添加する。750rpm、1vvmの通気撹拌
条件で、PHは6.5に制御し、15〜37℃の種々の温
度で培養を行う。グルコース濃度はグルコースア
ナライザーで調べながら０〜1.0％の範囲になる
ようにフイードし調節する。またカザミノ酸もグ
ルコースと等量フイードする。 乾燥菌体濃度で３mg／mlに菌が生育した時点で
20mg／mlのIAA（和光純薬社製）を添加し、さら
に12〜72時間培養を続ける。 β−IFNの菌体からの抽出は次のように行な
う。培養液１mlを8000rpm、10分間遠心分離して
集菌し、30ｍMNaCl、30ｍＭ、Tris−HCl（PH
7.0）緩衝液で洗浄する。洗浄菌体を上記緩衝液
に懸濁し、100μｇのリゾチーム、0.25M、
EDTA25μを加え１ml懸濁液とし30分間０℃に
放置した後、凍結、融解を３回繰り返して菌体を
破壊する。これを15000rpm30分間遠心して上清
を得、上清中のβ−IFNの量をアームストロング
の方法に従つて定量する〔アームストロングら：
Appl.Microbiol.、21巻、723−725（1971）〕〔ただ
し、ウイルスとしてはVesicular Stomatitis
Virus、動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来の
Wish cellを用いる〕。 結果を第１表に示す。
【表】
第１表から明らかなように、β−IFN生産性は
培養温度により著しく異なり、20℃近辺の温度で
培養を行なうことにより極めて高いβ−IFN生産
性が得られる。 実施例 ２ 菌株ILV−１を用い、培養温度は20℃に固定
し、IAAを第２表に示した時期に添加する以外
は実施例１と同様の培養条件で培養しIAAの添
加時期について検討を行う。添加したIAA濃度
は20mg／である。結果を第２表に示す。
培養温度により著しく異なり、20℃近辺の温度で
培養を行なうことにより極めて高いβ−IFN生産
性が得られる。 実施例 ２ 菌株ILV−１を用い、培養温度は20℃に固定
し、IAAを第２表に示した時期に添加する以外
は実施例１と同様の培養条件で培養しIAAの添
加時期について検討を行う。添加したIAA濃度
は20mg／である。結果を第２表に示す。
【表】
第２表から明らかなように、β−IFN生産性は
IAAを添加する時期の菌体濃度により著しく異
なり、対数生育期後半から生育がピークとなる時
点までに添加することにより極めて高いβ−IFN
生産性が得られる。 実施例 ３ 菌体ILV−１を用い、培養温度20℃で、乾燥菌
体濃度３mg／mlの時期にIAA20mg／を添加し、
一部はそのまま、一部は12時間ごとに計５回、各
20mg／の濃度でIAAを追加添加して培養する
以外は実施例１と同様に培養し、β−IFNの生産
性を調べる。結果を第３表に示す。
IAAを添加する時期の菌体濃度により著しく異
なり、対数生育期後半から生育がピークとなる時
点までに添加することにより極めて高いβ−IFN
生産性が得られる。 実施例 ３ 菌体ILV−１を用い、培養温度20℃で、乾燥菌
体濃度３mg／mlの時期にIAA20mg／を添加し、
一部はそのまま、一部は12時間ごとに計５回、各
20mg／の濃度でIAAを追加添加して培養する
以外は実施例１と同様に培養し、β−IFNの生産
性を調べる。結果を第３表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ エツシエリヒア属に属し、真核細胞由来のペ
プチドをコードする遺伝子、ペクターおよびプロ
モーターからなる組換えDNAを含有し、かつ該
ペプチド生産能を有する微生物を培地に培養し、
培養物中に該ペプチドを蓄積せしめ、該培養物か
ら該ペプチドを採取するに際し、培養を15〜27℃
の温度で行うことを特徴とするペプチドの製造
法。 ２ 該プロモーターがトリプトフアンプロモータ
ーであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３ 該微生物の培養中対数増殖期の後半から最高
増殖を示すときまでに培地に３−インドールアク
リル酸（以下IAAと略記する）を添加すること
を特徴とする特許請求の範囲第１または２項記載
の方法。 ４ IAA添加後、さらにIAAを連続的もしくは
間穴的に添加することを特徴とする特許請求の範
囲第１、２または３項記載の方法。 ５ 該ペプチドがヒトβ型インターフエロンのペ
プチドであることを特徴とする特許請求の範囲第
１、２、３または４項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57023584A JPS58141796A (ja) | 1982-02-18 | 1982-02-18 | ペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57023584A JPS58141796A (ja) | 1982-02-18 | 1982-02-18 | ペプチドの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58141796A JPS58141796A (ja) | 1983-08-23 |
| JPH0480680B2 true JPH0480680B2 (ja) | 1992-12-21 |
Family
ID=12114621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57023584A Granted JPS58141796A (ja) | 1982-02-18 | 1982-02-18 | ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58141796A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS619282A (ja) * | 1984-06-22 | 1986-01-16 | Hitachi Ltd | 遺伝子組換え菌の培養方法 |
| JPH07110232B2 (ja) * | 1985-10-14 | 1995-11-29 | 株式会社日立製作所 | 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置 |
| JPH0775536B2 (ja) * | 1986-03-26 | 1995-08-16 | 猛 小林 | 遺伝子組み換え菌を用いた酵素生産装置 |
| US6706189B2 (en) | 1998-10-09 | 2004-03-16 | Zenon Environmental Inc. | Cyclic aeration system for submerged membrane modules |
| EP1358005B1 (en) | 2000-12-04 | 2006-12-27 | Kubota Corporation | Air diffuser and flushing method thereof |
| CA2398461C (en) | 2000-12-04 | 2007-10-30 | Kubota Corporation | Multistage immersion type membrane separator and high-concentration wastewater treatment facility using same |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| EP0041313B1 (en) * | 1980-04-03 | 1990-09-12 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon |
| JPS584798A (ja) * | 1981-07-01 | 1983-01-11 | Toray Ind Inc | 新規プラスミドおよびそれを使用したインタ−フエロンの製造法 |
| JPS58110600A (ja) * | 1981-12-25 | 1983-07-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド |
-
1982
- 1982-02-18 JP JP57023584A patent/JPS58141796A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58141796A (ja) | 1983-08-23 |
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