JPH02174699A - Ｈｌａ型判別法及び試薬 - Google Patents
Ｈｌａ型判別法及び試薬Info
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- JPH02174699A JPH02174699A JP63311979A JP31197988A JPH02174699A JP H02174699 A JPH02174699 A JP H02174699A JP 63311979 A JP63311979 A JP 63311979A JP 31197988 A JP31197988 A JP 31197988A JP H02174699 A JPH02174699 A JP H02174699A
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- Japan
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- hla
- antigen
- restriction enzyme
- allospecificity
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
ヒトの主要組織適合性複合体である白血球膜抗原（ＨＬ
Ａ）は、臓器等の移植に重要なかかわりを持つ。本発明
は、この）ＩＬＡの型判別方法及びそれに用いられる試
薬にに関する。
Ａ）は、臓器等の移植に重要なかかわりを持つ。本発明
は、この）ＩＬＡの型判別方法及びそれに用いられる試
薬にに関する。
〈従来の技術〉
ＨＬ Ａの型判別法は、従来、血清学的又は細胞学的方
法によって行われている。すなわち、ＨＬＡのクラス１
抗原であるＡ、Ｂ及びＣ並びにクラス■抗原のうちＤＲ
とＤＱの各抗原は血清学的方法、換言すれば特異抗体と
補体を用いたリンパ球障害テストにより型判別が行われ
ている。またクラ、Ｚ、 ［１抗原のうちＤ抗原は、Ｍ
Ｌ Ｃ（Ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌ
ｔｕｒｅ）法でＤＰ膜抗は、Ｐ Ｌ Ｔ （Ｐｒｉｍｅ
ｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）法でそれぞ
れ判定されている。しかしながら、これらの方法は、判
定に要する時間及び手間が大きく、又、判定の精度も必
ずしも満足できるものではなかった。
法によって行われている。すなわち、ＨＬＡのクラス１
抗原であるＡ、Ｂ及びＣ並びにクラス■抗原のうちＤＲ
とＤＱの各抗原は血清学的方法、換言すれば特異抗体と
補体を用いたリンパ球障害テストにより型判別が行われ
ている。またクラ、Ｚ、 ［１抗原のうちＤ抗原は、Ｍ
Ｌ Ｃ（Ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌ
ｔｕｒｅ）法でＤＰ膜抗は、Ｐ Ｌ Ｔ （Ｐｒｉｍｅ
ｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｅｓｔｉｎｇ）法でそれぞ
れ判定されている。しかしながら、これらの方法は、判
定に要する時間及び手間が大きく、又、判定の精度も必
ずしも満足できるものではなかった。
最近、ＨＬＡに関する研究が進展し、ＨＬＡの遺伝子の
同定、さらには遺伝子のクローニングが行われるように
なった。ＨＬＡは高度の遺伝的冬型性を持つ抗原である
ので、クローニングされた遺伝子をプローブとして用い
、遺伝子ＤＮＡの制限酵素切断パターンの違いからＨＬ
Ａ型の判別をする試みがなされた（例えば、ＨＬＡク
ラスＩＩＤＲ抗原に対して試みた特開昭５８−１３００
００号）。これはいわゆるＲ ＦＬ ｌ）法といイつれ
る方法である。
同定、さらには遺伝子のクローニングが行われるように
なった。ＨＬＡは高度の遺伝的冬型性を持つ抗原である
ので、クローニングされた遺伝子をプローブとして用い
、遺伝子ＤＮＡの制限酵素切断パターンの違いからＨＬ
Ａ型の判別をする試みがなされた（例えば、ＨＬＡク
ラスＩＩＤＲ抗原に対して試みた特開昭５８−１３００
００号）。これはいわゆるＲ ＦＬ ｌ）法といイつれ
る方法である。
ＲＦＬ、 Ｐ法は比較的複雑な方法であって、制限酵素
切断、Ｉ） Ｎ Ａの固定化及び固定化されたＤＮＡ制
限断片の電気泳動的に分離された列への標識されたプロ
ーブのハイブリダイゼーションを必要とする。これらの
操作は繁雑であり、全工程で１〜２週間を要する。
切断、Ｉ） Ｎ Ａの固定化及び固定化されたＤＮＡ制
限断片の電気泳動的に分離された列への標識されたプロ
ーブのハイブリダイゼーションを必要とする。これらの
操作は繁雑であり、全工程で１〜２週間を要する。
また、Ｉ−Ｉ Ｌ Ａクラス■抗原遺伝子内で多望性に
富む部分を２つのオリゴヌクレオチドプライマーとＴ
ａ ｑ ｌ） Ｎ Ａポリメラーゼを用いて、変性（９
５℃）、アニーリング（５５℃）、ＤＮＡ伸長（７０℃
）反応のサイクルを繰り返し、増幅後、アロ抗原特異的
オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーシヨン
を行ない、ＨＬ Ａの型判別をする試みもなされている
（特開昭６２−２１４３５５）。しかし、この方法では
、プローブ毎にハイブリダイゼーションや、その後の洗
浄の条件を変える必要か生ずる（Ｓｃｈａｒｆ等、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ、
Ａ、８５：３５０４−３５０８（＋９８８））。
富む部分を２つのオリゴヌクレオチドプライマーとＴ
ａ ｑ ｌ） Ｎ Ａポリメラーゼを用いて、変性（９
５℃）、アニーリング（５５℃）、ＤＮＡ伸長（７０℃
）反応のサイクルを繰り返し、増幅後、アロ抗原特異的
オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーシヨン
を行ない、ＨＬ Ａの型判別をする試みもなされている
（特開昭６２−２１４３５５）。しかし、この方法では
、プローブ毎にハイブリダイゼーションや、その後の洗
浄の条件を変える必要か生ずる（Ｓｃｈａｒｆ等、Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ、
Ａ、８５：３５０４−３５０８（＋９８８））。
〈発明か解決しようとしている問題点〉従って、本発明
の目的は、従来のＨＬＡ型判別法よりも簡便でかつ十分
に精度の高い、新規なＩ（ＬＡ型判別方法及びそれに用
いられる試薬を提供することである。
の目的は、従来のＨＬＡ型判別法よりも簡便でかつ十分
に精度の高い、新規なＩ（ＬＡ型判別方法及びそれに用
いられる試薬を提供することである。
本願発明者等は鋭意研究の結果、ＨＬＡ抗原のアロタイ
プに特異的な制限酵素が存在することを見出し、かっ、
このような酵素でＰＣＲ法により増幅させたＤＮＡを切
断した後に、電気泳動を行なってＤＮＡの断片をその長
さに従って分離することによってＨＬＡ ＤＲ，ＤＱ
、Ｄ及びＤＰ膜抗の型判別を行なうことができることを
見出しこの発明を完成した。
プに特異的な制限酵素が存在することを見出し、かっ、
このような酵素でＰＣＲ法により増幅させたＤＮＡを切
断した後に、電気泳動を行なってＤＮＡの断片をその長
さに従って分離することによってＨＬＡ ＤＲ，ＤＱ
、Ｄ及びＤＰ膜抗の型判別を行なうことができることを
見出しこの発明を完成した。
すなわち、この発明は、ＰＣＲ法によって増幅したＤＮ
Ａを、ＨＬ Ａ抗原アロ特異性に特異的な制限酵素で切
断し、その断片の長さを電気泳動で分別、検出した後、
その長さの違いによってＨＬＡの型判別を行なうことか
ら成るＨＬＡ型判別方法を提供する。
Ａを、ＨＬ Ａ抗原アロ特異性に特異的な制限酵素で切
断し、その断片の長さを電気泳動で分別、検出した後、
その長さの違いによってＨＬＡの型判別を行なうことか
ら成るＨＬＡ型判別方法を提供する。
また、本発明は、ＨＬＡ抗原アロ特異性に特異的な制限
酵素から成るＨＬＡ型判別試薬を提供する。
酵素から成るＨＬＡ型判別試薬を提供する。
〈発明の効果〉
１） ＣＲ法で増幅したＤＮＡをＤＮＡプローブを用い
て検出する従来の方法と比較して、本発明の方法は制限
酵素の反応を利用するため、塩基配列の変化をより高精
度で識別することか可能である。
て検出する従来の方法と比較して、本発明の方法は制限
酵素の反応を利用するため、塩基配列の変化をより高精
度で識別することか可能である。
また、放射性物質又は非放射性物質で標識された各種の
型特異的オリゴヌクレオチドプローブを用意する必要が
なく、より簡便なＨＬＡの型判別が可能になる。
型特異的オリゴヌクレオチドプローブを用意する必要が
なく、より簡便なＨＬＡの型判別が可能になる。
〈発明の詳細な説明〉
本発明の方法の第１段階はｆＪ ＣＲ法によるＩ）ＮＡ
の増幅である。ＰＣＲ法はオリゴヌクレオチドプライマ
ーとＤＮＡポリメラーゼを用いて、変性、アニーリング
、ＤＮＡ伸長反応のサイクルを繰り返し、ＤＮＡを短時
間の間に急速に増幅させる方法であり、特開昭６２−２
１４３５５に記載されている。
の増幅である。ＰＣＲ法はオリゴヌクレオチドプライマ
ーとＤＮＡポリメラーゼを用いて、変性、アニーリング
、ＤＮＡ伸長反応のサイクルを繰り返し、ＤＮＡを短時
間の間に急速に増幅させる方法であり、特開昭６２−２
１４３５５に記載されている。
ＨＬ Ａ型判別にＰＣＲ法を適用する場合には、例えば
約２ Ｘ １０’個の血球を集め、リン酸緩衝溶液に分
散させたちのに、３催量の緩衝液（５０ｍλ１）・すス
ー塩酸、ｐＨ８，０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １００ｍ
Ｍ ＮａＣ１！ＳＩ％５ＤＳ）を加えて細胞を溶解させ
、プロテアーゼ処理、フェノール抽出によりタンパク質
を除いた後、２倍量の冷エタノールを添加して不溶化し
た高分子ＤＮＡを得、このＤＮＡのうち、ＨＬＡ抗原遺
伝子、特にＤＲ，ＤＱ及びＤＰ抗抗原遺伝山内多量性に
富む部分に上記ＰＣＲ法を適用して増幅させる。
約２ Ｘ １０’個の血球を集め、リン酸緩衝溶液に分
散させたちのに、３催量の緩衝液（５０ｍλ１）・すス
ー塩酸、ｐＨ８，０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １００ｍ
Ｍ ＮａＣ１！ＳＩ％５ＤＳ）を加えて細胞を溶解させ
、プロテアーゼ処理、フェノール抽出によりタンパク質
を除いた後、２倍量の冷エタノールを添加して不溶化し
た高分子ＤＮＡを得、このＤＮＡのうち、ＨＬＡ抗原遺
伝子、特にＤＲ，ＤＱ及びＤＰ抗抗原遺伝山内多量性に
富む部分に上記ＰＣＲ法を適用して増幅させる。
次に、ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡをＨＬＡ抗原アロ特異
性に特異的な制限酵素で切断する。
性に特異的な制限酵素で切断する。
＋（Ｌ Ａ抗原アロ特異的な制限酵素の例及びその制限
酵素を適用した場合に生じるＤＮＡ断片の大きさを、酵
素処理されるＨＬＡ ＤＲ，ＤＱ、Ｄ。
酵素を適用した場合に生じるＤＮＡ断片の大きさを、酵
素処理されるＨＬＡ ＤＲ，ＤＱ、Ｄ。
ＤＰＰ原アロタイプと共に以下に示す。もっとも、トＩ
ＬＡ ＤＲ，ＤＱ、Ｄ及びＤＰ膜抗アロ持異的制限酵
素はこれらに限定されるものではない。
ＬＡ ＤＲ，ＤＱ、Ｄ及びＤＰ膜抗アロ持異的制限酵
素はこれらに限定されるものではない。
１、ＤＲＩ鎖
（Ｄｉ（ｐｈｉ
■１２１ｂｐ、１１８ｂｐ、７１ｂｐ ＤＲ４■１８
９ｂｐ、１２１ｂｐ ＤＲＩ、ＤＲ２，ＤＲ３，
ＤＲ５ＤＲＷ６ ＤＲ７ＤＲｗ８ ＤＩ？ｗ９（２
）ｌｌｈａｌ ■ ＋４６ｂｐ、１ｏ１ｂｐ、６３ｂｐ ＤＲ２■
１６４ｂｐ、１４６ｂｐ ＤＩＩｌ Ｄ！
ン３ ＤＲ４ＤＲ５ＤＲｗ６．ＤＲ７，ＤＲｗ８
ＤＲｗ９（３）Ａｐａ １ ■ ２４９ｂｐ、６１ｂｐ ■ ３＋１）ｂｐ （４）Ｋｐｎ １ ■ ２０２ｂｐ、１０８ｂｐ ■ ３１０ｂｐ （５）Ｓａｃ ＩＴ ■ ２５１ｂｐ、５９ｂｐ ■ ３ｔＯｂｐ （６）Ｆｏｋ Ｉ Ｒｗ８ ＤＲＩ ＤＲ２ＤＲ７３Ｄｌｉ４ ＤＲ５，ＤＲｗ６．ＤＲ７，ＤＲｗ９ Ｒ３ Ｉ）ＲＩ ＤＲ２ＤＲ４ＤＲ５ ＤＲｗ６．ＤＲ７，ＤＲｗ８ ＤＲＷ９ＤＲＩ、ＤＲ
２，ＤＩ＋５゜ ＤＲ４Ｄｖ１３ ＤＲ３Ｄｆ？ｗ６ ＤＩ？７ Ｄｆ？ｗ９Ｄ Ｉｌ
４ Ｄ Ｗ ４ Ｄ １＋ ４ Ｄ Ｗ ｌ ０Ｄ
Ｒ４ＤＷ１４ ＤＲ４ＤＷＩ５ ■ ２１４ｂｐ、！１８ｂｐ ■ ３１０ｂｐ （７）Ｉ（ｉｎｆ ［ ■ ｌ１８ｂｐ、１０５ｂｐ、８９ｂｐ■ ２０５ｂｐ
、 １０５ｂｐ ■ １７４ｂｐ、 １３６ｂｐ ■ ３１０ｂｐ ■ ＤＱ α鎖 （１）ｉｌａｅｌｌＴ ■ ］１４ｂｐ、７６ｂｐ、３５ｂｐ ■ １９０ｂｐＪ５ｂｐ ■ ２２５ｂｐ （２）Ｄｄｅ １ ＤＢ２ＡＩＨ，ＤＲ７ ＤＲ５ＬＤＶ口、ＤＲ４ＤｗｌＯ ＤＲｌ、ＤＲ３，ＤＩ？４ ＤＲ５ ＤＲｖ８．ＤＲｗ９ ＤＲ２Ｄｖ２ ＤＲ２Ｄｗ１２ ＤＲ？ Ｒｖ９ ＤＲＩ、ＤＲ２ＡＺＨ ＤＲ３ＤＲ４，ＤＲ５，ＤＲＷ６ ＤＲ冑８ ＤＲ２Ｄｖ２ ＤＲ２Ｄｖｉ２ ＤＲＩＤＱｗｌ、１．ＤＲ２ＤＱｗ１．ＩＤＲ６ＤＱｖ
＋、１．ＤＲｗ８ＤＱｖ ＤＲ３，ＤＱｖ２．ＤＲ７ＤＱｗ２ ＤＲ５ＤＱ豐３ ＤＲ４ＤＱｖ３．ＤＲｗ９ＤＱｗ３ ■ ｌｌ３ｂｌ） ７１ｂｐ、４１ｂｐ ■ Ｉ［８ｂｐ、ｌ０７ｂｐ ■ １２７ｂＰ、９８ｂｐ ■ ２２５ｂｐ （３）Ｍｂ○口 ■ ＋４３ｂｐ、８２ｂｐ ■ ２２５ｂｐ （４）ＳｃｒＦ Ｉ ■ １２３ｂｐ、８２ｂｐ、２０ｂｒｌ■ ２２５ｂｐ （５）Ｆｏｋ （ ■ １７５ｂｐ、５０ｂｐ ＤＲＩＤＱｗｌ、ｌ ＤＲ２Ｄｆｈ１．ＩＤＲｗ６ＤＱ
ｗ１．！ ＤＲ３ＤＱｗ２．υＲ５ＤＱｗ３ ＤＲｖ８ＤＱｗ ＤＲ７ＤＱｗ２ ＤＲ４ＤＱｗ３．ＤＲｗ９ＤＱｗ３ ＤＲ４ＤＱｗ３．Ｄ？９ＤＱｗ３ ＤＲＩＤＱｗｌ、ｔ、ＤＲ２ＤＱｗｌ ＤＲ３ＤＱｖ２．Ｉ’ｌｌｉ５ＤＱｗ３ＤＲｗ６ＤＱｖ
１．、ｌ、ＤＲ７Ｄ（ｈ２ＤＲｗ８ＤＱｗ ＤＲＩＤＱｗｌ、Ｉ 、ＯＲ２ＤＱｗ１．ＩＤＲｗ６Ｄ
Ｑｗ１．Ｉ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ４ＤＱｗ３ ＤＲ５ＤＱｗ：！、、ＤＲ７ＤＱｄ ＤＲｗ８ＤＱｗ−、ＤＲｖ９ＤＱｗ３ ＤＲ４ＤＱｗ３．ＤＲ？ＤＱｗ２ ■ ２２５ｂｐ ＩＩｌ、 ＤＱβ鎖 （１）ｌｌａｅＩ［Ｉ ■ １２９ｂｐ、４６ｂｐ、３９ｂｐ ■ １２９ｂｐ、８５ｂｐ ■ １２６ｂｐ、８８ｂｐ ■ ２＋４ｂＰ （２）Ｆｏｋ １ ■ ＋４８ｂｐ、６６ｂｐ ■ ２１４ｂｐ ＤＲｗ８ＤＱｖ− ＤＲＩＤＱｗｌ、１．ＤＲ２ＤＱｗ１．ＩＤＲ３ＤＱｗ
２．ＤＲ５ＤＱｗ２ ＤＲ６ＤＱｗ１．ｌ、ＤＲ９ＤＱｖ３ （３）Ｓａｕ３Ａ １ ■ １４３ｂｐ、７１ｂｐ ■ ２１４ｂｐ ＤＲＩＤＱｗｌ、１．ＤＲ２ＤＱｗ１．ＩＡ２Ｈ，ＤＲ
ｗ６ＤＱｗ１．Ｉ ＤＲ２Ｄｖ２．ＤＲ２Ｄｖ１２ ＤＲ４ＤＱｗ３．１．ＤＲ４ＤＱｗ３．２ＤＲ５ＤＱｗ
３．ｌ、ＤＲｖ９ＤＱｖ３．３ＤＲ４ＤＱｗ−、ＤＲｖ
８ＤＱｖ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ７ＤＱｗ２ （４）ＢｓｓｌｌＩＩ ■ １３８ｂｐ、７８ｂｐ ■ ２１４ｂｐ ＤＲ２Ｄｗ２．ＤＲ２Ｄｖ！２ ＤＲ４ＤＱｗ−、ＤＲｖ８ＤＱｖ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ７ＤＱｖ２ ＤＲＩＤＴｏｌ、ｌ、ＤＲ２ＡＺＨ ＤＲｖ８ＤＱｖ１．１．ＤＲ４ＤＱｖ３．ＩＤＲ４ＤＱ
ｖ（，２，ＤＲ５ＤＱｖ３．１（５）ｋｌａｅ Ｉ ■ １６６ｂｐ、４８ｂｐ ＤＲｗ９ＤＱｗ３．３ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ７ＤＱｗ２ ＤＲＩＤＱｖｌ、ｌ ＤＲ２Ｄｖ２ ＤＲ２Ｄｗ１２ ＤＲ２ＡＺＨ ＤＲ４ＤＱｗ３．１．ＤＲ４ＤＱｗ３．２ＤＲ４ＤＱｗ
−、ＤＲ５ＤＱｗ３．Ｉ ＤＲｖ６ＤＱｖ１．Ｉ Ｄｋｖ８ＤＱｗ−、ＤＲｖ９ＤＱｗ３．３Ｒ２Ｄｖ２ ＤＲ４ＤＱｗ−、ＤＲｗ８ＤＱｖ ＤＲＩＤＱｖｌ、１゜ ＤＲ２Ｄｖ１２．ＤＲ２ＡＺＨ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ４ＤＱｗ３．Ｉ ＤＲ４ＤＱｗ３．２．ＤＲ５ＤＱｗ３．１ＤＲｖ６ＤＱ
ｗ１．ｌ、ＤＲ７ＤＱｖ２ＤＲｗ９ＤＱｗ３．３゜ ＤＲｖ６ＤＱｖ１．１ ■ ２＋４ｂｐ ■ ＤＰβ鎖 （１）ＳｃｒＦ Ｉ ■７８ｈｐ、５８ｂｐ ■７１ｂｐ、５８ｂｐ （２）Ｓａｕ １ ■９７ｂｐ、３９ｂｐ ■１３６ｂｐ （３）Ｍａｅｌｎ ■８１ｂｐ、６２ｂｐ、２７ｂｐ ■８９ｂｐ、８１ｂｐ （４）ＢｓｔＵＵ ■１１４ｂｐ、５４ｂｐ ■ｔ７０ｂｐ （５）＾ｖａＩＩ ＤＲＩＤＱｗｌ、１゜ ＤＲ２Ｄｖ２．ＤＲ２Ｄｗ１２ ＤＲ２Ａ２■、ＤＲ３ＤＱｗ２ ＤＲ４ＤＱｗ３．１．ＤＲ４ＤＱｗ３．２ＤＲ５ＤＱｖ
３．１．ＤＲ７ＤＱｖ２ ＤＲｄＤＱｗ３Ｊ。
９ｂｐ、１２１ｂｐ ＤＲＩ、ＤＲ２，ＤＲ３，
ＤＲ５ＤＲＷ６ ＤＲ７ＤＲｗ８ ＤＩ？ｗ９（２
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１６４ｂｐ、１４６ｂｐ ＤＩＩｌ Ｄ！
ン３ ＤＲ４ＤＲ５ＤＲｗ６．ＤＲ７，ＤＲｗ８
ＤＲｗ９（３）Ａｐａ １ ■ ２４９ｂｐ、６１ｂｐ ■ ３＋１）ｂｐ （４）Ｋｐｎ １ ■ ２０２ｂｐ、１０８ｂｐ ■ ３１０ｂｐ （５）Ｓａｃ ＩＴ ■ ２５１ｂｐ、５９ｂｐ ■ ３ｔＯｂｐ （６）Ｆｏｋ Ｉ Ｒｗ８ ＤＲＩ ＤＲ２ＤＲ７３Ｄｌｉ４ ＤＲ５，ＤＲｗ６．ＤＲ７，ＤＲｗ９ Ｒ３ Ｉ）ＲＩ ＤＲ２ＤＲ４ＤＲ５ ＤＲｗ６．ＤＲ７，ＤＲｗ８ ＤＲＷ９ＤＲＩ、ＤＲ
２，ＤＩ＋５゜ ＤＲ４Ｄｖ１３ ＤＲ３Ｄｆ？ｗ６ ＤＩ？７ Ｄｆ？ｗ９Ｄ Ｉｌ
４ Ｄ Ｗ ４ Ｄ １＋ ４ Ｄ Ｗ ｌ ０Ｄ
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、 １０５ｂｐ ■ １７４ｂｐ、 １３６ｂｐ ■ ３１０ｂｐ ■ ＤＱ α鎖 （１）ｉｌａｅｌｌＴ ■ ］１４ｂｐ、７６ｂｐ、３５ｂｐ ■ １９０ｂｐＪ５ｂｐ ■ ２２５ｂｐ （２）Ｄｄｅ １ ＤＢ２ＡＩＨ，ＤＲ７ ＤＲ５ＬＤＶ口、ＤＲ４ＤｗｌＯ ＤＲｌ、ＤＲ３，ＤＩ？４ ＤＲ５ ＤＲｖ８．ＤＲｗ９ ＤＲ２Ｄｖ２ ＤＲ２Ｄｗ１２ ＤＲ？ Ｒｖ９ ＤＲＩ、ＤＲ２ＡＺＨ ＤＲ３ＤＲ４，ＤＲ５，ＤＲＷ６ ＤＲ冑８ ＤＲ２Ｄｖ２ ＤＲ２Ｄｖｉ２ ＤＲＩＤＱｗｌ、１．ＤＲ２ＤＱｗ１．ＩＤＲ６ＤＱｖ
＋、１．ＤＲｗ８ＤＱｖ ＤＲ３，ＤＱｖ２．ＤＲ７ＤＱｗ２ ＤＲ５ＤＱ豐３ ＤＲ４ＤＱｖ３．ＤＲｗ９ＤＱｗ３ ■ ｌｌ３ｂｌ） ７１ｂｐ、４１ｂｐ ■ Ｉ［８ｂｐ、ｌ０７ｂｐ ■ １２７ｂＰ、９８ｂｐ ■ ２２５ｂｐ （３）Ｍｂ○口 ■ ＋４３ｂｐ、８２ｂｐ ■ ２２５ｂｐ （４）ＳｃｒＦ Ｉ ■ １２３ｂｐ、８２ｂｐ、２０ｂｒｌ■ ２２５ｂｐ （５）Ｆｏｋ （ ■ １７５ｂｐ、５０ｂｐ ＤＲＩＤＱｗｌ、ｌ ＤＲ２Ｄｆｈ１．ＩＤＲｗ６ＤＱ
ｗ１．！ ＤＲ３ＤＱｗ２．υＲ５ＤＱｗ３ ＤＲｖ８ＤＱｗ ＤＲ７ＤＱｗ２ ＤＲ４ＤＱｗ３．ＤＲｗ９ＤＱｗ３ ＤＲ４ＤＱｗ３．Ｄ？９ＤＱｗ３ ＤＲＩＤＱｗｌ、ｔ、ＤＲ２ＤＱｗｌ ＤＲ３ＤＱｖ２．Ｉ’ｌｌｉ５ＤＱｗ３ＤＲｗ６ＤＱｖ
１．、ｌ、ＤＲ７Ｄ（ｈ２ＤＲｗ８ＤＱｗ ＤＲＩＤＱｗｌ、Ｉ 、ＯＲ２ＤＱｗ１．ＩＤＲｗ６Ｄ
Ｑｗ１．Ｉ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ４ＤＱｗ３ ＤＲ５ＤＱｗ：！、、ＤＲ７ＤＱｄ ＤＲｗ８ＤＱｗ−、ＤＲｖ９ＤＱｗ３ ＤＲ４ＤＱｗ３．ＤＲ？ＤＱｗ２ ■ ２２５ｂｐ ＩＩｌ、 ＤＱβ鎖 （１）ｌｌａｅＩ［Ｉ ■ １２９ｂｐ、４６ｂｐ、３９ｂｐ ■ １２９ｂｐ、８５ｂｐ ■ １２６ｂｐ、８８ｂｐ ■ ２＋４ｂＰ （２）Ｆｏｋ １ ■ ＋４８ｂｐ、６６ｂｐ ■ ２１４ｂｐ ＤＲｗ８ＤＱｖ− ＤＲＩＤＱｗｌ、１．ＤＲ２ＤＱｗ１．ＩＤＲ３ＤＱｗ
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３．ｌ、ＤＲｖ９ＤＱｖ３．３ＤＲ４ＤＱｗ−、ＤＲｖ
８ＤＱｖ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ７ＤＱｗ２ （４）ＢｓｓｌｌＩＩ ■ １３８ｂｐ、７８ｂｐ ■ ２１４ｂｐ ＤＲ２Ｄｗ２．ＤＲ２Ｄｖ！２ ＤＲ４ＤＱｗ−、ＤＲｖ８ＤＱｖ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ７ＤＱｖ２ ＤＲＩＤＴｏｌ、ｌ、ＤＲ２ＡＺＨ ＤＲｖ８ＤＱｖ１．１．ＤＲ４ＤＱｖ３．ＩＤＲ４ＤＱ
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−、ＤＲ５ＤＱｗ３．Ｉ ＤＲｖ６ＤＱｖ１．Ｉ Ｄｋｖ８ＤＱｗ−、ＤＲｖ９ＤＱｗ３．３Ｒ２Ｄｖ２ ＤＲ４ＤＱｗ−、ＤＲｗ８ＤＱｖ ＤＲＩＤＱｖｌ、１゜ ＤＲ２Ｄｖ１２．ＤＲ２ＡＺＨ ＤＲ３ＤＱｗ２．ＤＲ４ＤＱｗ３．Ｉ ＤＲ４ＤＱｗ３．２．ＤＲ５ＤＱｗ３．１ＤＲｖ６ＤＱ
ｗ１．ｌ、ＤＲ７ＤＱｖ２ＤＲｗ９ＤＱｗ３．３゜ ＤＲｖ６ＤＱｖ１．１ ■ ２＋４ｂｐ ■ ＤＰβ鎖 （１）ＳｃｒＦ Ｉ ■７８ｈｐ、５８ｂｐ ■７１ｂｐ、５８ｂｐ （２）Ｓａｕ １ ■９７ｂｐ、３９ｂｐ ■１３６ｂｐ （３）Ｍａｅｌｎ ■８１ｂｐ、６２ｂｐ、２７ｂｐ ■８９ｂｐ、８１ｂｐ （４）ＢｓｔＵＵ ■１１４ｂｐ、５４ｂｐ ■ｔ７０ｂｐ （５）＾ｖａＩＩ ＤＲＩＤＱｗｌ、１゜ ＤＲ２Ｄｖ２．ＤＲ２Ｄｗ１２ ＤＲ２Ａ２■、ＤＲ３ＤＱｗ２ ＤＲ４ＤＱｗ３．１．ＤＲ４ＤＱｗ３．２ＤＲ５ＤＱｖ
３．１．ＤＲ７ＤＱｖ２ ＤＲｄＤＱｗ３Ｊ。
ＤＰｗ２．ＤＰｗ４
ＤＰｗｌ、ＤＰｖ３．ＤＰｖ５
ＤＰｖ２．ＤＰｗ４
ＤＰｖｌ、ＤＰｖ３．ＤＰｖ５
ｐ６３
ＤＰｗ２．ＤＰｖ３．ＤＰｖ４
ＤＰ曹４
ＤＰｗ２．ＤＰｖ４．Ｃｐ６３
■１３７ｂｐ、３３ｂｐ ＤＰｖ３■１
７０ｂｐ ＤＰｗ２．ＤＰｗ４．
Ｃｐ６３（６）口ＩＩ ■１０６ｂｐ、６４ｂｐ Ｃｐ６３．Ｄ
Ｐｗ２．ＤＰｗ３■１７０ｂｐ
ＤＰｗ４これらの制限酵素自体は市販されており、Ｄ
ＮＡの消化もその指示書に基づいて行なうことができる
。
７０ｂｐ ＤＰｗ２．ＤＰｗ４．
Ｃｐ６３（６）口ＩＩ ■１０６ｂｐ、６４ｂｐ Ｃｐ６３．Ｄ
Ｐｗ２．ＤＰｗ３■１７０ｂｐ
ＤＰｗ４これらの制限酵素自体は市販されており、Ｄ
ＮＡの消化もその指示書に基づいて行なうことができる
。
次に、このようなＨＬＡ抗原特異性にアロ特異的な制限
酵素で消化したＤＮＡを電気泳動法により、ＤＮＡ断片
の長さに基づいて分離する。ＤＮＡの分離のための電気
泳動法自体はこの分野において周知であり、種々の方法
が可能であるが、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により行なうことができる。
酵素で消化したＤＮＡを電気泳動法により、ＤＮＡ断片
の長さに基づいて分離する。ＤＮＡの分離のための電気
泳動法自体はこの分野において周知であり、種々の方法
が可能であるが、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により行なうことができる。
電気泳動法により分離したＤＮＡ断片の長さから、ＨＬ
Ａ抗原のアロタイプを判別する。すなわち、各制限酵素
を用いた場合に、上述のようにどの）′ロタイブであれ
ばどのような大きさの断片が生じるかわかっているので
、電気泳動法により検出されたＤＮＡ断片の大きさから
そのＨＬＡ型を判別することができる。なお、上述のよ
うに、ある制限酵素を用いた場合に、複数のアロタイプ
において同じ大きさのＤＮＡ断片を生じる場合が多いが
、複数の制限酵素を併用して適用することによりＨＬＡ
型判別を行なうことができる。
Ａ抗原のアロタイプを判別する。すなわち、各制限酵素
を用いた場合に、上述のようにどの）′ロタイブであれ
ばどのような大きさの断片が生じるかわかっているので
、電気泳動法により検出されたＤＮＡ断片の大きさから
そのＨＬＡ型を判別することができる。なお、上述のよ
うに、ある制限酵素を用いた場合に、複数のアロタイプ
において同じ大きさのＤＮＡ断片を生じる場合が多いが
、複数の制限酵素を併用して適用することによりＨＬＡ
型判別を行なうことができる。
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明するが
、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
〈実施例１〉
下記の細胞株を増幅のために利用した。
ＪＥＳＴＨＯＭ株 ＤＲＩＤＱｗｌ
ＭＧＡＲ株 ＤＲ２ＤＱｖｌ
ＡＫＩＢＡ 株 ＤＲ２ＤＱｖｌＬ ０
０８１７８５ 株 ＤＲ３ＤＱｗ２１３
Ｍ＋４ 株 ＤＲ４ＤＱｗ３ＭＯＵ
株 ＤＲ７ＤＱｗ２ＭＡＤＵＲ
Ａ 株 ＤＲ８ＤＱｗＤＸＢ
株 ＤＲ９ＤＱ豐３培養細胞を約２ Ｘ ｔｏ
’個集め、リン酸緩衝溶液に分散させたしのに、３倍量
の緩衝液（５０ｆｆ１Ｍトリスー塩酸、ｐＨ８，０１２
０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １００ｍＭ ＮａＣ（１，１％５
ＤＳ）を加えて細胞を溶解させた。常法に従い、プロテ
アーゼ処理、フェノール抽出によりタンパク質を除いた
後、リボヌクレアーゼ処理してＲＮＡを除いた。これに
２倍量の冷エタノールを添加して不溶化した高分子ＤＮ
Ａを得た。このＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりＨＬＡ
−ＤＱα遺伝子の第２エクソンを増幅した。下記のＤＮ
Ａ及び反応液を混合しミネラルオイルを数滴重層した反
応混合液中で増幅を行った。
０８１７８５ 株 ＤＲ３ＤＱｗ２１３
Ｍ＋４ 株 ＤＲ４ＤＱｗ３ＭＯＵ
株 ＤＲ７ＤＱｗ２ＭＡＤＵＲ
Ａ 株 ＤＲ８ＤＱｗＤＸＢ
株 ＤＲ９ＤＱ豐３培養細胞を約２ Ｘ ｔｏ
’個集め、リン酸緩衝溶液に分散させたしのに、３倍量
の緩衝液（５０ｆｆ１Ｍトリスー塩酸、ｐＨ８，０１２
０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １００ｍＭ ＮａＣ（１，１％５
ＤＳ）を加えて細胞を溶解させた。常法に従い、プロテ
アーゼ処理、フェノール抽出によりタンパク質を除いた
後、リボヌクレアーゼ処理してＲＮＡを除いた。これに
２倍量の冷エタノールを添加して不溶化した高分子ＤＮ
Ａを得た。このＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりＨＬＡ
−ＤＱα遺伝子の第２エクソンを増幅した。下記のＤＮ
Ａ及び反応液を混合しミネラルオイルを数滴重層した反
応混合液中で増幅を行った。
高分子 ＤＮＡ ＋ １μｌ（ｌμｌ
）オリゴヌクレオチドブライマー、 ＱＡ−１（５−
ＧＧＴＧＴＡ＾＾ＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣ−３’ ）
： ｌμｌ（１００μＭ）オリゴヌクレオチドブラ
イマー、 Ｑ１２（５’ −ＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＧ
ＴＡＧＡＧＴＴＧＧ−３’ ） ＋ ｌμｌ（１００
μＭ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（５
００μＭずっｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ
ＴＰを含む）４０μｌ ゼラチン ： ｌμｌ（２０ｍｇ
／ｍ１）Ｔａｑ ＤＮ＾ポリメラーゼ： ｌ
μｌ（２，５ｕ）水
４５μｌ増幅は、変性（９５℃）、アニーリング（
５５℃）、ＤＮＡ伸長（７０℃）をそれぞれ１分間ずっ
３０サイクル行なった。
）オリゴヌクレオチドブライマー、 ＱＡ−１（５−
ＧＧＴＧＴＡ＾＾ＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＣ−３’ ）
： ｌμｌ（１００μＭ）オリゴヌクレオチドブラ
イマー、 Ｑ１２（５’ −ＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＧ
ＴＡＧＡＧＴＴＧＧ−３’ ） ＋ ｌμｌ（１００
μＭ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（５
００μＭずっｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ
ＴＰを含む）４０μｌ ゼラチン ： ｌμｌ（２０ｍｇ
／ｍ１）Ｔａｑ ＤＮ＾ポリメラーゼ： ｌ
μｌ（２，５ｕ）水
４５μｌ増幅は、変性（９５℃）、アニーリング（
５５℃）、ＤＮＡ伸長（７０℃）をそれぞれ１分間ずっ
３０サイクル行なった。
増幅したＤＮＡ約２００ｎｇ（８μｌ）を制限酵素Ｄｄ
ｅｌ。
ｅｌ。
およびＨａｅｌ［ｌでそれぞれ切断した。常法に従い、
１２％アクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロ
マイド染色してバンドを検出した。
１２％アクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロ
マイド染色してバンドを検出した。
その結果第１図に示すようにＤｄｅ Ｉで切断した場合
、ＤＱｖｌでは１１３ｂｐ、７１ｂｐ、４１ｂｐの３本
のバンドが、ＤＱｗ３では２２５ｂｐのバンドが検出さ
れた。
、ＤＱｖｌでは１１３ｂｐ、７１ｂｐ、４１ｂｐの３本
のバンドが、ＤＱｗ３では２２５ｂｐのバンドが検出さ
れた。
ＤＱｗ２・ＤＲ３では、１１８ｂｐと１０７ｂｐの２本
のバンドが、ＤＱｖ２・ＤＲ７では１２７ｂｐと９８ｂ
ｐの２本のバンドが検出され、ＤＱｖ抗原及びＤＲ抗原
アロ特異性によって区別ができた。
のバンドが、ＤＱｖ２・ＤＲ７では１２７ｂｐと９８ｂ
ｐの２本のバンドが検出され、ＤＱｖ抗原及びＤＲ抗原
アロ特異性によって区別ができた。
また第２図に示すようにＨａｅｍで切断した場合、ＤＱ
ｗｌでは１１４ｂｐ、７６ｂｐ、３５ｂｐの３本のバン
ドが、ＤＱｖ２では１９０ｂｐと３５ｂｐの２本のバン
ドが、ＤＱｖ３では２２５ｂｐのバンドが、ＤＱｖ抗原
アロ特異性に従ってそれぞれ検出された。
ｗｌでは１１４ｂｐ、７６ｂｐ、３５ｂｐの３本のバン
ドが、ＤＱｖ２では１９０ｂｐと３５ｂｐの２本のバン
ドが、ＤＱｖ３では２２５ｂｐのバンドが、ＤＱｖ抗原
アロ特異性に従ってそれぞれ検出された。
〈実施例２〉
ＤＲアロ抗原特異性が既知の細胞を約２ Ｘ １０’個
集め、リン酸緩衝溶液に分散さけたものに、３倍１１（
７）緩衝液（５０ＩＩＩＭトリスー塩酸、ｐｔ＋８．０
．２０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １００ｍＭ ＮａＣＱ、
１％５ＤＳ）を加えて細胞を溶解させた。常法に従い、
プロテアーゼ処理、フェノール抽出によりタンパク質を
除いた後、リボヌクレアーゼ処理してＲＮＡを除いた。
集め、リン酸緩衝溶液に分散さけたものに、３倍１１（
７）緩衝液（５０ＩＩＩＭトリスー塩酸、ｐｔ＋８．０
．２０ｍＭ ＥＤＴＡ、 １００ｍＭ ＮａＣＱ、
１％５ＤＳ）を加えて細胞を溶解させた。常法に従い、
プロテアーゼ処理、フェノール抽出によりタンパク質を
除いた後、リボヌクレアーゼ処理してＲＮＡを除いた。
これに２倍量の冷エタノールを添加して不溶化１、た高
分子ＤＮＡを得た。このＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によ
り１１ＬＡ−ＤＩ’（β遺伝子の第２エクソンを増幅し
た。
分子ＤＮＡを得た。このＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によ
り１１ＬＡ−ＤＩ’（β遺伝子の第２エクソンを増幅し
た。
下記のＤＮＡ及び反応液を混合しミネラルオイルを数滴
重層した反応混合液中で増幅を行った。
重層した反応混合液中で増幅を行った。
高分子 ＤＮＡ： １μｌ（ｌμｌ）
オリゴヌクレオチドブライマー ＲＢ−８（５’−Ｃ
ＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴ＾＾ＣＣＧＧ−３
°） ： ｌμｌ（１０ｈＭ）オリゴヌクレオチドブ
ライマー ＲＢ−９（５’−ＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴ
ＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＣ−３°） ： ｌμｌ（１
０ｈｉりデオキシリボヌクレ才ソドトリホスフェート（
５００μＭずつｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄ
ＴＴＰを含む）４０μｌ ゼラチン ： ｌμｌ（２０ｍｇ
／ｍ１）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： ｌ
μｌ（２，５ｕ）水：４５μｍ 増幅は、変性（９５°Ｃ）、アニーリング（５５°Ｃ）
、ＤＮＡ伸長（７０℃）をそれぞれ１分間ずつ３０サイ
クル行なった。
オリゴヌクレオチドブライマー ＲＢ−８（５’−Ｃ
ＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴ＾＾ＣＣＧＧ−３
°） ： ｌμｌ（１０ｈＭ）オリゴヌクレオチドブ
ライマー ＲＢ−９（５’−ＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴ
ＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＣ−３°） ： ｌμｌ（１
０ｈｉりデオキシリボヌクレ才ソドトリホスフェート（
５００μＭずつｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄ
ＴＴＰを含む）４０μｌ ゼラチン ： ｌμｌ（２０ｍｇ
／ｍ１）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： ｌ
μｌ（２，５ｕ）水：４５μｍ 増幅は、変性（９５°Ｃ）、アニーリング（５５°Ｃ）
、ＤＮＡ伸長（７０℃）をそれぞれ１分間ずつ３０サイ
クル行なった。
増幅したＤＮＡ約２００ｎｇ（８μｌ）を制限酵素Ｈｈ
ａｌ。
ａｌ。
１１ｐｈ＋およびＡｐａ Ｉでそれぞれ切断した。常法
に従い、１２％アクリルアミドゲル電気泳動後、エチジ
ウムブロマイド染色してバンドを検出した。
に従い、１２％アクリルアミドゲル電気泳動後、エチジ
ウムブロマイド染色してバンドを検出した。
その結果１！ｈａｌで切断するとＤＲ２については、１
４６ｂｐ、ｌ０１ｂｐ、６３ｂｐの３本のバンドが他の
アロ抗原タイプについては、１．６４ｂｐと１４６ｂｐ
の２本のバンドが検出された。また、Ｈｐｈ Ｉで切断
するとＤＲ４については、１２１ｂｐ、］１８ｂｐ、７
１ｂｐの３本のバンドが他のアロ抗原タイプについては
、１８９ｂｐと１２１ｂｐの２本のバンドが検出された
。＾ｐａ■で切断するとＤＲ８についてだけ２４８ｂ
ｐと６１ｂｐの２本のバンドが検出され、池の場合は切
断を生じなかった。
４６ｂｐ、ｌ０１ｂｐ、６３ｂｐの３本のバンドが他の
アロ抗原タイプについては、１．６４ｂｐと１４６ｂｐ
の２本のバンドが検出された。また、Ｈｐｈ Ｉで切断
するとＤＲ４については、１２１ｂｐ、］１８ｂｐ、７
１ｂｐの３本のバンドが他のアロ抗原タイプについては
、１８９ｂｐと１２１ｂｐの２本のバンドが検出された
。＾ｐａ■で切断するとＤＲ８についてだけ２４８ｂ
ｐと６１ｂｐの２本のバンドが検出され、池の場合は切
断を生じなかった。
〈実施例３〉
ヒトの血液から約２ Ｘ １０’血球を個集め、リン酸
緩衝溶液に分散させたらのに、３倍量の緩衝液（５０ｍ
Ｍ トリス−塩酸、ｐｌ＋８．０．２０ｍＭ ＥＤＴＡ
、 １００ｍＭ ＮａＣｅ、１％５ＤＳ）を加えて細胞
を溶解させた。常法に従い、プロテアーゼ処理、フェノ
ール抽出によりタンパク質を除いた後、リボヌクレアー
ゼ処理してＲＮＡを除いた。これに２倍量の冷エタノー
ルを添加して不溶化した高分子ＤＮＡを得た。このＤＮ
Ａを用いて、ＰＣＲ法によりＨＬ Ａ −Ｄ Ｐβ遺伝
子の第２エクソンを増幅した。下記のＤＮＡ及び反応液
を混合しミネラルオイルを数滴重層した反応混合液中で
増幅を行った。
緩衝溶液に分散させたらのに、３倍量の緩衝液（５０ｍ
Ｍ トリス−塩酸、ｐｌ＋８．０．２０ｍＭ ＥＤＴＡ
、 １００ｍＭ ＮａＣｅ、１％５ＤＳ）を加えて細胞
を溶解させた。常法に従い、プロテアーゼ処理、フェノ
ール抽出によりタンパク質を除いた後、リボヌクレアー
ゼ処理してＲＮＡを除いた。これに２倍量の冷エタノー
ルを添加して不溶化した高分子ＤＮＡを得た。このＤＮ
Ａを用いて、ＰＣＲ法によりＨＬ Ａ −Ｄ Ｐβ遺伝
子の第２エクソンを増幅した。下記のＤＮＡ及び反応液
を混合しミネラルオイルを数滴重層した反応混合液中で
増幅を行った。
高分子 ＤＮＡ ： １μｌ（ｌμｇ
）オリゴヌクレオチドブライマー １”１（５’−Ｃ
ＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＡ＾−３°
）；ｌμｌ（１００μＭ）オリゴヌクレオチドブライマ
ー Ｐ−３（５−ＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣ＾＾Ｃ
ＴＴＣＴＴＧＧＣ−３’） ： ｌμｌ（１００μＭ
）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（５００
μＭずつｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ
を含む）４０μｌ ゼラチン ： ｌμｌ（２０ｍｇ
／ｍ１）Ｔａｑ ＤＮ人ポリメラーゼ＋ ｌ
μｌ（２，５ｕ）水・ ４５μｌ 増幅は、変性（９５℃）、アニーリング（５５℃）、Ｄ
ＮＡ伸＆（７０６Ｃ）をそれぞれ１分間ずつ３０サイク
ル行なった。
）オリゴヌクレオチドブライマー １”１（５’−Ｃ
ＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＧＡＡ＾−３°
）；ｌμｌ（１００μＭ）オリゴヌクレオチドブライマ
ー Ｐ−３（５−ＣＴＧＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣ＾＾Ｃ
ＴＴＣＴＴＧＧＣ−３’） ： ｌμｌ（１００μＭ
）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（５００
μＭずつｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ
を含む）４０μｌ ゼラチン ： ｌμｌ（２０ｍｇ
／ｍ１）Ｔａｑ ＤＮ人ポリメラーゼ＋ ｌ
μｌ（２，５ｕ）水・ ４５μｌ 増幅は、変性（９５℃）、アニーリング（５５℃）、Ｄ
ＮＡ伸＆（７０６Ｃ）をそれぞれ１分間ずつ３０サイク
ル行なった。
増幅したＤＮＡ約２００ｎｇ（８μｌ）を制限酵素５ｅ
ｒｆ。
ｒｆ。
およびＳａｕ Ｉでそれぞれ切断した。常法に従い、１
２％アクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロマ
イド染色してバンドを検出した。
２％アクリルアミドゲル電気泳動後、エチジウムブロマ
イド染色してバンドを検出した。
結果を第３図及び第４図に示す。第３図に示すように、
Ｓａｕ ｌで切断した場合、ＤＰｖ２及びＤＰｗ４は９
７ｂｐと３９ｂｐ、 ＤＰｗｌＳＤＰｗ３及びＤＰｖ５
については１３６ｂｐのバンドが、また第４図に示ずよ
うに５ｃｒＦ Ｉで切断した場合ＤＰｗ２及びＤＰｖ４
については７８ｂｐと５８ｂｐ。
Ｓａｕ ｌで切断した場合、ＤＰｖ２及びＤＰｗ４は９
７ｂｐと３９ｂｐ、 ＤＰｗｌＳＤＰｗ３及びＤＰｖ５
については１３６ｂｐのバンドが、また第４図に示ずよ
うに５ｃｒＦ Ｉで切断した場合ＤＰｗ２及びＤＰｖ４
については７８ｂｐと５８ｂｐ。
ＤＰｗｌ、ＤＰＷ３及びＤＰｗ５については７１ｂｐと
５８ｂｐのバンドがＤＰ抗原アロ特異性に従って検出さ
れた。
５８ｂｐのバンドがＤＰ抗原アロ特異性に従って検出さ
れた。
〈実施例４〉
オリゴヌクレオチドブライマー
Ｐ −１４＋ ５−ＴＴＡＡＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＣＧ
ＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡ−３Ｐ −１５： ５−ＧＴＣ
ＣＧＧＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧ−
３を用いて実施例１．２及び３と同様な条件でＨＬＡ−
ＤＰβ遺伝子のβＩドメイン領域を増幅する。
ＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡ−３Ｐ −１５： ５−ＧＴＣ
ＣＧＧＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧ−
３を用いて実施例１．２及び３と同様な条件でＨＬＡ−
ＤＰβ遺伝子のβＩドメイン領域を増幅する。
増幅されたＤ Ｎ Ａ （１７０ｂｐ）に対して、下記
の制限酵素により切断を行なう。各制限酵素について次
のようなバンドが、おのおのアロ抗原タイプごとに検出
される。
の制限酵素により切断を行なう。各制限酵素について次
のようなバンドが、おのおのアロ抗原タイプごとに検出
される。
１１ａｅ ＩＩＩ
Ｃｐ６３ ： ８１ｂｐ、６２ｂｐ
、２７ｂｐＤＰｖ２．ＤＰｗ４．Ｃｐ６３
： ８９ｂｐ、８１ｂｐｓｔＵＩＩ ＤＰｗ４ ： １１４ｂｐ、５４
ｂｐＤＰｖ２．ＤＰｗ４．Ｃｐ６３ ：
１７０ｂｐ＾ｖａＩ［ Ｐｖ３ ： １３７ｔ＋ｐ、３３ｂｐ ＤＰｖ２．ＤＰｖ４ 、Ｃｐ６３ ７０ｂｐ ｎ１ｌ Ｃｐ６３．ＤＰｖ２．ＤＰｖ３ ： １０６ｂｐ、６４ｂｐ ＤＰｗ４ ： １７０ｂｐ〈実施
例５〉 オリゴヌクレオチドブライマー Ｑ Ｂ −１＋ ５” −ＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴ
ＴＣＡＣＣＡＡＴＧ−３Ｑ ！３−２ 、５’ −ＣＧ
ＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴ−３’及び
ＨＬ Ａ抗原既知の細胞を用いて実施例１．２３及び４
と同様な条件でＨＬＡ−ＤＱβ遺伝子の第２エクソン領
域を増幅する。増幅されたＤＮＡ（２１４ｂｐ）に対し
て、下記のような制限酵素により切断を行ない、各制限
酵素について次のようなバンドが、おのおのアロ抗原タ
イプごとに検出された。
、２７ｂｐＤＰｖ２．ＤＰｗ４．Ｃｐ６３
： ８９ｂｐ、８１ｂｐｓｔＵＩＩ ＤＰｗ４ ： １１４ｂｐ、５４
ｂｐＤＰｖ２．ＤＰｗ４．Ｃｐ６３ ：
１７０ｂｐ＾ｖａＩ［ Ｐｖ３ ： １３７ｔ＋ｐ、３３ｂｐ ＤＰｖ２．ＤＰｖ４ 、Ｃｐ６３ ７０ｂｐ ｎ１ｌ Ｃｐ６３．ＤＰｖ２．ＤＰｖ３ ： １０６ｂｐ、６４ｂｐ ＤＰｗ４ ： １７０ｂｐ〈実施
例５〉 オリゴヌクレオチドブライマー Ｑ Ｂ −１＋ ５” −ＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴＡＣＴ
ＴＣＡＣＣＡＡＴＧ−３Ｑ ！３−２ 、５’ −ＣＧ
ＴＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴ−３’及び
ＨＬ Ａ抗原既知の細胞を用いて実施例１．２３及び４
と同様な条件でＨＬＡ−ＤＱβ遺伝子の第２エクソン領
域を増幅する。増幅されたＤＮＡ（２１４ｂｐ）に対し
て、下記のような制限酵素により切断を行ない、各制限
酵素について次のようなバンドが、おのおのアロ抗原タ
イプごとに検出された。
１１ａｅｆＩＩ
ＤＱｗｌ、Ｉ
Ｑｗ３
ＤＩ？２Ｄ賓２
ＤＲ２Ｄｗ１２
ａｕ３ＡＩ
ＤＱ＆２
ＢｓｓＨ口
１２９ｂｐ、４６ｂｐ、３９ｂｐ
１２６ｂｐ、８８ｂｐ
： １２９ｂｐ、８５ｂｐ
１４３ｂｐ、７１ｂｐ
Ｒ２Ｄｗ２
＋ａｇｂｐ、７６ｂｐ
第１図、第２図、第３図及び第４図は、制限酵素処理後
のアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。
のアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。
Claims (9)
- （１）ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡを、ＨＬＡ抗原
アロ特異性に特異的な制限酵素で切断し、その断片の長
さを電気泳動で分別、検出した後、その長さの違いによ
ってＨＬＡの型判別を行う方法。 - （２）ＨＬＡのＤＲ抗原、ＤＱ抗原及びＤ抗原の型判別
を行う第１項記載の方法。 - （３）制限酵素Ａｐａ I 、ＢｓｓＨII、Ｄｄｅ I 、Ｆ
ｏｋ I 、ＨａｅIII、Ｈｈａ I 、Ｈｉｎｆ I 、Ｈｐｈ
I 、Ｋｐｎ I 、Ｍａｅ I 、ＭｂｏII、ＳａｃII、Ｓ
ａｕ３Ａ I またはＳｃｒＦ I である請求項４記載の方
法。 - （４）ＨＬＡのＤＰ抗原の型判別を行う第１項記載の方
法。 - （５）制限酵素Ｓａｕ I 、ＳｃｒＦ I 、ＭａｅIII、
ＢｓｔＵII、ＡｖａII、またはＭｎｌ I である請求項
２記載の方法。 - （６）ＨＬＡ抗原アロ特異性に特異的な制限酵素から成
るＨＬＡ型判別診断薬。 - （７）前記制限酵素は、ＡｖａII、Ｍｎｌ I 、Ａｐａ
I 、ＢｓｓＨII、Ｄｄｅ I 、Ｆｏｋ I 、ＨａｅIII、
Ｈｈａ I 、Ｈｉｎｆ I 、Ｈｐｈ I 、Ｋｐｎ I 、Ｍａ
ｅ I 、ＭｂｏII、ＳａｃII、Ｓａｕ３Ａ I 、ＳｃｒＦ
I 、Ｓａｕ I 、ＭａｅIIIまたはＢｓｔＵIIである請
求項１記載の試薬。 - （８）ＨＬＡ抗原アロ特異性に特異的な制限酵素を使用
量に応じてあらかじめ分注してある容器から成るＨＬＡ
型判別キット。 - （９）前記制限酵素が、ＡｖａII、Ｍｎｌ I 、Ａｐａ
I 、ＢｓｓＨII、Ｄｄｅ I 、Ｆｏｋ I 、ＨａｅIII、
Ｈｈａ I 、Ｈｉｎｆ I 、Ｈｐｈ I 、Ｋｐｎ I 、Ｍａ
ｅ I 、ＭｂｏII、ＳａｃII、Ｓａｕ３Ａ I 、ＳｃｒＦ
I 、Ｓａｕ I 、ＭａｅIII、またはＢｓｔＵIIである
第１項記載のＨＬＡ型判別用のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63311979A JPH02174699A (ja) | 1988-09-27 | 1988-12-12 | Ｈｌａ型判別法及び試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24200088 | 1988-09-27 | ||
| JP63-242000 | 1988-09-27 | ||
| JP63311979A JPH02174699A (ja) | 1988-09-27 | 1988-12-12 | Ｈｌａ型判別法及び試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02174699A true JPH02174699A (ja) | 1990-07-06 |
Family
ID=26535554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63311979A Pending JPH02174699A (ja) | 1988-09-27 | 1988-12-12 | Ｈｌａ型判別法及び試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02174699A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58130000A (ja) * | 1982-01-22 | 1983-08-03 | エフ、ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ＨＬＡ型判定法とそれに使用するｃＤＮＡプロ−ブ |
| JPS62214355A (ja) * | 1986-03-13 | 1987-09-21 | エフ．ホフマン―ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト | 核酸中に存在する特定のヌクレオチド変化及び遺伝的多型性の検出方法 |
-
1988
- 1988-12-12 JP JP63311979A patent/JPH02174699A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58130000A (ja) * | 1982-01-22 | 1983-08-03 | エフ、ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ＨＬＡ型判定法とそれに使用するｃＤＮＡプロ−ブ |
| JPS62214355A (ja) * | 1986-03-13 | 1987-09-21 | エフ．ホフマン―ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト | 核酸中に存在する特定のヌクレオチド変化及び遺伝的多型性の検出方法 |
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