JPH09224683A - グリコシルトランスフェラーゼをコードする対立遺伝子のタイプ分け - Google Patents
グリコシルトランスフェラーゼをコードする対立遺伝子のタイプ分けInfo
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- JPH09224683A JPH09224683A JP9016318A JP1631897A JPH09224683A JP H09224683 A JPH09224683 A JP H09224683A JP 9016318 A JP9016318 A JP 9016318A JP 1631897 A JP1631897 A JP 1631897A JP H09224683 A JPH09224683 A JP H09224683A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＡＢＯ型血液分類をより正確に実施するため
の方法及び試薬に関する。 【解決手段】 ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺
伝子におけるヌクレオチド配列多型現象、すなわちヌク
レオチド配列に見られる対立遺伝子配列変異体を検出す
ることにより、一層正確な血液型分類を実施できること
に関する。
の方法及び試薬に関する。 【解決手段】 ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺
伝子におけるヌクレオチド配列多型現象、すなわちヌク
レオチド配列に見られる対立遺伝子配列変異体を検出す
ることにより、一層正確な血液型分類を実施できること
に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分子生物学及び核
酸化学の分野に関する。より詳細には、本発明は、Ａ，
Ｂ及びＨ抗原血液型を決定するグリコシルトランスフェ
ラーゼ酵素をコードする対立遺伝子を遺伝子型分類する
ための方法及び試薬に関する。
酸化学の分野に関する。より詳細には、本発明は、Ａ，
Ｂ及びＨ抗原血液型を決定するグリコシルトランスフェ
ラーゼ酵素をコードする対立遺伝子を遺伝子型分類する
ための方法及び試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＡＢＯ型分類は法医学者により実施され
る最とも古い従来の血清学である。Ｋａｒｌ Ｌａｎｄ
ｓｔｅｉｎｅｒは、１９０１年にＡＢＯ式血液システム
を発見し、そして疑わしい父系の場合への使用のための
血液分類方法を開発した。この試験のための基礎は、赤
血球及び他の細胞型（たとえば上皮）上に見出される
Ａ，Ｂ及びＨ抗原との抗体反応性である。法医学者は、
Ａ，Ｂ，Ｏ及びＡＢ表現型を区別するために直接的（完
全な血液）又は間接的（乾燥された染料）凝集アッセイ
のいづれかにおいてＡ型−及びＢ型−抗原に対するポリ
クローナル抗体を用いる。通常、タイプＨ−抗原のため
の抗血清は使用されず；Ｏ型個人からの血液はＡ型−又
はＢ型−抗血清のいづれとも凝集しない。Ｈ型−抗原の
ための特定の抗血清が存在しなければ、ＡＡ表現型はＡ
Ｏ表現型から区別され得ず、そしてＢＢ表現型はＢＯ表
現型から区別され得ない。
る最とも古い従来の血清学である。Ｋａｒｌ Ｌａｎｄ
ｓｔｅｉｎｅｒは、１９０１年にＡＢＯ式血液システム
を発見し、そして疑わしい父系の場合への使用のための
血液分類方法を開発した。この試験のための基礎は、赤
血球及び他の細胞型（たとえば上皮）上に見出される
Ａ，Ｂ及びＨ抗原との抗体反応性である。法医学者は、
Ａ，Ｂ，Ｏ及びＡＢ表現型を区別するために直接的（完
全な血液）又は間接的（乾燥された染料）凝集アッセイ
のいづれかにおいてＡ型−及びＢ型−抗原に対するポリ
クローナル抗体を用いる。通常、タイプＨ−抗原のため
の抗血清は使用されず；Ｏ型個人からの血液はＡ型−又
はＢ型−抗血清のいづれとも凝集しない。Ｈ型−抗原の
ための特定の抗血清が存在しなければ、ＡＡ表現型はＡ
Ｏ表現型から区別され得ず、そしてＢＢ表現型はＢＯ表
現型から区別され得ない。
【０００３】Ａ，Ｂ及びＨ抗原の分子的基礎は知られて
いる。抗原Ａ及びＢは、２種のグリコシルトランスフェ
ラーゼの作用によりＨオリゴ糖から誘導される。血液型
Ａを有する個人は、Ｎ−アセチルガラクトサミンをＨ抗
原に輸送してＡ抗原を形成するトランスフェラーゼＢ活
性を発現する。血液型Ｏを有する個人は、機能的グリコ
シルトランスフェラーゼを欠いており、そして細胞表面
上に変性されていないＨ抗原のみを発現する。
いる。抗原Ａ及びＢは、２種のグリコシルトランスフェ
ラーゼの作用によりＨオリゴ糖から誘導される。血液型
Ａを有する個人は、Ｎ−アセチルガラクトサミンをＨ抗
原に輸送してＡ抗原を形成するトランスフェラーゼＢ活
性を発現する。血液型Ｏを有する個人は、機能的グリコ
シルトランスフェラーゼを欠いており、そして細胞表面
上に変性されていないＨ抗原のみを発現する。
【０００４】ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ多型
現象の遺伝子基礎もまた知られている。Ｙａｍａｍｏｔ
ｏなど（１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４５（１７）：２
２９−２３３）は、既知のＡＢＯ型の個人から単離され
たｃＤＮＡの配列分析を報告している。Ａ及びＢトラン
スフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、１０６２個の長
さの塩基対であり、そして３５３個のアミノ酸のタンパ
ク質をコードする。Ａ及びＢ対立遺伝子配列は、７個の
ヌクレオチドでお互い異なっており、そして４個のアミ
ノ酸で異なるタンパク質をコードしており、これらはＡ
及びＢトランスフェラーゼの異なった特異性を説明す
る。コード配列の位置２５８で、Ｏ対立遺伝子は単一の
塩基対欠失によりＡ及びＢ対立遺伝子と異なり、これは
その得られる翻訳のフレームシフトのために、ヌクレオ
チド３４９〜３５１で停止コドンを創造する。Ｏ対立遺
伝子によりコードされる、切断された１５５個のアミノ
酸のタンパク質はトランスフェラーゼの機能的ドメイン
を欠いている。
現象の遺伝子基礎もまた知られている。Ｙａｍａｍｏｔ
ｏなど（１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４５（１７）：２
２９−２３３）は、既知のＡＢＯ型の個人から単離され
たｃＤＮＡの配列分析を報告している。Ａ及びＢトラン
スフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、１０６２個の長
さの塩基対であり、そして３５３個のアミノ酸のタンパ
ク質をコードする。Ａ及びＢ対立遺伝子配列は、７個の
ヌクレオチドでお互い異なっており、そして４個のアミ
ノ酸で異なるタンパク質をコードしており、これらはＡ
及びＢトランスフェラーゼの異なった特異性を説明す
る。コード配列の位置２５８で、Ｏ対立遺伝子は単一の
塩基対欠失によりＡ及びＢ対立遺伝子と異なり、これは
その得られる翻訳のフレームシフトのために、ヌクレオ
チド３４９〜３５１で停止コドンを創造する。Ｏ対立遺
伝子によりコードされる、切断された１５５個のアミノ
酸のタンパク質はトランスフェラーゼの機能的ドメイン
を欠いている。
【０００５】ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、すなちわ
核酸の特定配列を増幅するための方法の発明は、これま
で検出されない低い量でサンプルに存在する核酸の急速
な検出を可能にする（アメリカ特許第４，６８３，１９
５号；第４，６８３，２０２号；及び第４，９６５，１
８８号を参照のこと）。増幅された核酸配列の分析は、
種々の手段により実施され得る。
核酸の特定配列を増幅するための方法の発明は、これま
で検出されない低い量でサンプルに存在する核酸の急速
な検出を可能にする（アメリカ特許第４，６８３，１９
５号；第４，６８３，２０２号；及び第４，９６５，１
８８号を参照のこと）。増幅された核酸配列の分析は、
種々の手段により実施され得る。
【０００６】たとえば、ＰＣＲ−増幅された核酸を用い
てのＡＢＯ遺伝子型の検出は、制限酵素切断パターンに
より（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９９２，Ｊ．Ｆ
ｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＪＦＳＣＡ １７
（５）：１２６９〜１２７５；及びＯ’ｋｅｅｆｅ ａ
ｎｄ Ｄｏｂｒｏｖｉｃ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｍｕ
ｔａｔｉｏｎ ２：６７〜７０を参照のこと）、及び変
性グラジエントゲル電気泳動により（Ｊｏｈｎｓｏｎ
ａｎｄ Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ，１９９２，Ｈｕｍａｎ
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１（５）：３４１〜３４４を参照のこ
と）実施され得る。対立遺伝子−特異的ＰＣＲ増幅を用
いてのＡＢＯ遺伝子型の検出は、Ｕｇｏｚｚｏｌｉ ａ
ｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
１２：６７０〜６７４により記載された。
てのＡＢＯ遺伝子型の検出は、制限酵素切断パターンに
より（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９９２，Ｊ．Ｆ
ｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＪＦＳＣＡ １７
（５）：１２６９〜１２７５；及びＯ’ｋｅｅｆｅ ａ
ｎｄ Ｄｏｂｒｏｖｉｃ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｍｕ
ｔａｔｉｏｎ ２：６７〜７０を参照のこと）、及び変
性グラジエントゲル電気泳動により（Ｊｏｈｎｓｏｎ
ａｎｄ Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ，１９９２，Ｈｕｍａｎ
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１（５）：３４１〜３４４を参照のこ
と）実施され得る。対立遺伝子−特異的ＰＣＲ増幅を用
いてのＡＢＯ遺伝子型の検出は、Ｕｇｏｚｚｏｌｉ ａ
ｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
１２：６７０〜６７４により記載された。
【０００７】
【発明の概要】本発明は、ＡＢＯグリコシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子における新規に発見されたヌクレオチド
配列多型現象に関する。以前に定義されたＯ型対立遺伝
子及びＢ型対立遺伝子は、新規に発見された多型部位に
存在する変異核酸配列に基づいて再分される。本発明
は、新規に発見された対立遺伝子配列変異体を検出する
ための方法及び試薬を提供する。
ェラーゼ遺伝子における新規に発見されたヌクレオチド
配列多型現象に関する。以前に定義されたＯ型対立遺伝
子及びＢ型対立遺伝子は、新規に発見された多型部位に
存在する変異核酸配列に基づいて再分される。本発明
は、新規に発見された対立遺伝子配列変異体を検出する
ための方法及び試薬を提供する。
【０００８】本発明の１つの観点は、ＡＢＯグリコシル
トランスフェラーゼ遺伝子のコード配列のヌクレオチド
位置２３９の上流に存在するこれまで知られていないイ
ントロン配列に関する。５８個の塩基対配列（その内の
塩基２２〜５８が新規に発見された）がＡＢＯ対立遺伝
子間に保持されているが、但し、位置２９，３２及び３
３での多型部位を除く。ヌクレオチド位置２９の多型部
位での単一の塩基対の変化がＯ対立遺伝子の共通のサブ
タイプに見出される。ヌクレオチド位置３３の多型部位
での単一の塩基対の変化は、Ｏ対立遺伝子の共通性の低
いサブタイプを識別する。ヌクレオチド位置３２の多型
部位での単一の塩基対の変化は、Ｂ対立遺伝子のサブタ
イプを識別する。
トランスフェラーゼ遺伝子のコード配列のヌクレオチド
位置２３９の上流に存在するこれまで知られていないイ
ントロン配列に関する。５８個の塩基対配列（その内の
塩基２２〜５８が新規に発見された）がＡＢＯ対立遺伝
子間に保持されているが、但し、位置２９，３２及び３
３での多型部位を除く。ヌクレオチド位置２９の多型部
位での単一の塩基対の変化がＯ対立遺伝子の共通のサブ
タイプに見出される。ヌクレオチド位置３３の多型部位
での単一の塩基対の変化は、Ｏ対立遺伝子の共通性の低
いサブタイプを識別する。ヌクレオチド位置３２の多型
部位での単一の塩基対の変化は、Ｂ対立遺伝子のサブタ
イプを識別する。
【０００９】本発明のもう１つの観点は、本発明により
提供される新規に発見されたＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子イントロン配列に含まれる、少なくと
も１０個の長さのヌクレオチドの配列を含んで成る単離
されたオリゴヌクレオチドに関する。それらのオリゴヌ
クレオチドは、増幅プライマー、検出プローブ、及び既
知の標的配列を提供するために反応に添加される陽性の
対照配列として有用である。陽性の対照配列として使用
するためには、オリゴヌクレオチドは好ましくは、ＤＮ
Ａベクター、たとえばプラスミドに含まれる。
提供される新規に発見されたＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子イントロン配列に含まれる、少なくと
も１０個の長さのヌクレオチドの配列を含んで成る単離
されたオリゴヌクレオチドに関する。それらのオリゴヌ
クレオチドは、増幅プライマー、検出プローブ、及び既
知の標的配列を提供するために反応に添加される陽性の
対照配列として有用である。陽性の対照配列として使用
するためには、オリゴヌクレオチドは好ましくは、ＤＮ
Ａベクター、たとえばプラスミドに含まれる。
【００１０】本発明のもう１つの観点は、新規に発見さ
れた多型部位を包含する遺伝子の領域における新規に発
見された変異ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝
子のいづれかの鎖に対して正確に又は実質的に相補的で
あり、そして前記多型部位で正確に相補的である単離さ
れたオリゴヌクレオチドに関する。それらのオリゴヌク
レオチドは、配列特異的増幅プライマー、配列特異的検
出プローブ、及び既知の標的配列を提供するために反応
に添加される陽性の対照配列として有用である。
れた多型部位を包含する遺伝子の領域における新規に発
見された変異ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝
子のいづれかの鎖に対して正確に又は実質的に相補的で
あり、そして前記多型部位で正確に相補的である単離さ
れたオリゴヌクレオチドに関する。それらのオリゴヌク
レオチドは、配列特異的増幅プライマー、配列特異的検
出プローブ、及び既知の標的配列を提供するために反応
に添加される陽性の対照配列として有用である。
【００１１】検出プローブとして使用される場合、オリ
ゴヌクレオチドは核酸ハイブリダイゼーションによる変
異対立遺伝子配列の検出を可能にする。増幅プライマー
として使用される場合、オリゴヌクレオチドは変異対立
遺伝子からの核酸の配列特異的増幅を可能にする。配列
特異的増幅又は検出への使用のためには、オリゴヌクレ
オチドは好ましくは、約15〜約35個の長さのヌクレオチ
ドである。
ゴヌクレオチドは核酸ハイブリダイゼーションによる変
異対立遺伝子配列の検出を可能にする。増幅プライマー
として使用される場合、オリゴヌクレオチドは変異対立
遺伝子からの核酸の配列特異的増幅を可能にする。配列
特異的増幅又は検出への使用のためには、オリゴヌクレ
オチドは好ましくは、約15〜約35個の長さのヌクレオチ
ドである。
【００１２】本発明のもう１つの観点は、個人から得ら
れた核酸を含むサンプルからＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子の対立遺伝子配列変異体を検出するた
めの方法に関し、ここでこの方法は１又は複数の新規に
発見された多型部位に存在する塩基対を検出することを
含んで成る。本発明の好ましい態様においては、多型部
位に存在する塩基対は、多型部位を包含する遺伝子の領
域中に新規に発見された変異ＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子のいづれかの鎖に対して正確に又は実
質的に相補的であり、そして前記変異配列に対して多型
部位で正確に相補的であるオリゴヌクレオチドとサンプ
ル核酸とをハイブリダイズさせることによって同定され
る。
れた核酸を含むサンプルからＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子の対立遺伝子配列変異体を検出するた
めの方法に関し、ここでこの方法は１又は複数の新規に
発見された多型部位に存在する塩基対を検出することを
含んで成る。本発明の好ましい態様においては、多型部
位に存在する塩基対は、多型部位を包含する遺伝子の領
域中に新規に発見された変異ＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子のいづれかの鎖に対して正確に又は実
質的に相補的であり、そして前記変異配列に対して多型
部位で正確に相補的であるオリゴヌクレオチドとサンプ
ル核酸とをハイブリダイズさせることによって同定され
る。
【００１３】ハイブリダイゼーションは、サンプル核酸
が変異標的対立遺伝子配列を含む場合にのみ安定したハ
イブリッド複合体を形成するために、オリゴヌクレオチ
ドが核酸に結合するような十分な緊縮（ストリンジエン
ト）条件下で実施される。サンプル中の変異対立遺伝子
配列の存在は、オリゴヌクレオチドとサンプル核酸との
間に形成される安定したハイブリッド複合体の存在又は
不在を検出することによって決定される。本発明の好ま
しい態様においては、対立遺伝子配列変異体の検出は、
ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子座で個人の
遺伝子型を決定するために実施される。
が変異標的対立遺伝子配列を含む場合にのみ安定したハ
イブリッド複合体を形成するために、オリゴヌクレオチ
ドが核酸に結合するような十分な緊縮（ストリンジエン
ト）条件下で実施される。サンプル中の変異対立遺伝子
配列の存在は、オリゴヌクレオチドとサンプル核酸との
間に形成される安定したハイブリッド複合体の存在又は
不在を検出することによって決定される。本発明の好ま
しい態様においては、対立遺伝子配列変異体の検出は、
ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子座で個人の
遺伝子型を決定するために実施される。
【００１４】安定したハイブリッド複合体の存在は、当
業界において知られているいづれかの手段により実施さ
れ得る。標的核酸又はハイブリッド複合体の検出を可能
にするためのオリゴヌクレオチドプローブのいづれかに
結合される検出可能なラベルを利用する種々の検出アッ
セイ型は良く知られている。典型的には、ハイブリダイ
ゼーション複合体はハイブリダイズされていない核酸か
ら分離され、そして次に、その複合体に結合されるラベ
ルが検出される。他方、増幅反応は、安定したハイブリ
ダイゼーション複合体が存在する場合でのみ、増幅が生
じるような条件下でプライマーの１つとしてオリゴヌク
レオチドを用いて実施され得る。増幅されたＤＮＡの存
在は、安定したハイブリダイズ複合体の存在、及び続い
て、サンプル中の標的配列の存在のインジケーターとし
て機能する。
業界において知られているいづれかの手段により実施さ
れ得る。標的核酸又はハイブリッド複合体の検出を可能
にするためのオリゴヌクレオチドプローブのいづれかに
結合される検出可能なラベルを利用する種々の検出アッ
セイ型は良く知られている。典型的には、ハイブリダイ
ゼーション複合体はハイブリダイズされていない核酸か
ら分離され、そして次に、その複合体に結合されるラベ
ルが検出される。他方、増幅反応は、安定したハイブリ
ダイゼーション複合体が存在する場合でのみ、増幅が生
じるような条件下でプライマーの１つとしてオリゴヌク
レオチドを用いて実施され得る。増幅されたＤＮＡの存
在は、安定したハイブリダイズ複合体の存在、及び続い
て、サンプル中の標的配列の存在のインジケーターとし
て機能する。
【００１５】十分な核酸がサンプルに存在する場合、オ
リゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションによ
る検出が、標的配列の従来の増幅を伴わないで実施され
得る。しかしながら、本発明の好ましい態様において
は、サンプルは増幅された核酸を含み、ここでプローブ
ハイブリダイゼーションを包含するＡＢＯグリコシルト
ランスフェラーゼ遺伝子の領域が増幅される。インビト
ロでの核酸の領域のコピー数を高めるための既知の方法
のいづれかが、核酸を増幅するために使用され得る。ポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は好ましい増幅反応であ
る。本発明のもう１つの観点は、本明細書に提供される
新規に発見されたイントロン配列にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅反応を実施
することを含んで成るＡＢＯグリコシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子の領域を増幅するための方法である。
リゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションによ
る検出が、標的配列の従来の増幅を伴わないで実施され
得る。しかしながら、本発明の好ましい態様において
は、サンプルは増幅された核酸を含み、ここでプローブ
ハイブリダイゼーションを包含するＡＢＯグリコシルト
ランスフェラーゼ遺伝子の領域が増幅される。インビト
ロでの核酸の領域のコピー数を高めるための既知の方法
のいづれかが、核酸を増幅するために使用され得る。ポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は好ましい増幅反応であ
る。本発明のもう１つの観点は、本明細書に提供される
新規に発見されたイントロン配列にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅反応を実施
することを含んで成るＡＢＯグリコシルトランスフェラ
ーゼ遺伝子の領域を増幅するための方法である。
【００１６】本発明のもう１つの方法は、個人のＡＢＯ
遺伝子型を決定するのに有用なキットに関する。それら
のキットは、種々の形を取り、そして１又は複数のプロ
ーブを含んで成り、そして１つの態様においては、ＡＢ
Ｏ遺伝子型を決定するために十分なプローブのパネルを
含んで成る。キットはまた、１又は複数の増幅試薬、た
とえばプライマー、ポリメラーゼ、緩衝液、及びヌクレ
オシド三リン酸も含むことができる。本発明のもう１つ
の観点は、生物学的サンプルのプローブできる起源を決
定するための法廷上の方法に関する。追加の対立遺伝子
の発見は、ＡＢＯ ＤＮＡ型決定法の識別力を実質的に
改良する。
遺伝子型を決定するのに有用なキットに関する。それら
のキットは、種々の形を取り、そして１又は複数のプロ
ーブを含んで成り、そして１つの態様においては、ＡＢ
Ｏ遺伝子型を決定するために十分なプローブのパネルを
含んで成る。キットはまた、１又は複数の増幅試薬、た
とえばプライマー、ポリメラーゼ、緩衝液、及びヌクレ
オシド三リン酸も含むことができる。本発明のもう１つ
の観点は、生物学的サンプルのプローブできる起源を決
定するための法廷上の方法に関する。追加の対立遺伝子
の発見は、ＡＢＯ ＤＮＡ型決定法の識別力を実質的に
改良する。
【００１７】
【発明の具体的記載】本発明を理解するために、いくつ
かの用語が下記に定義される。用語“ＡＢＯグリコシル
トランスフェラーゼ遺伝子”、“ＡＢＯグリコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子座”、“ＡＢＯ遺伝子”、及び
“ＡＢＯ遺伝子座”は、ＡＢＯグリコシルトランスフェ
ラーゼタンパク質をコードする翻訳される配列及び翻訳
されない介在配列を包含するゲノム核酸配列を意味す
る。本明細書において使用される場合、遺伝子のヌクレ
オチド配列は、エキソンとして言及されるコード領域及
びイントロンとして言及される介在非コード領域の両者
を包含する。
かの用語が下記に定義される。用語“ＡＢＯグリコシル
トランスフェラーゼ遺伝子”、“ＡＢＯグリコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子座”、“ＡＢＯ遺伝子”、及び
“ＡＢＯ遺伝子座”は、ＡＢＯグリコシルトランスフェ
ラーゼタンパク質をコードする翻訳される配列及び翻訳
されない介在配列を包含するゲノム核酸配列を意味す
る。本明細書において使用される場合、遺伝子のヌクレ
オチド配列は、エキソンとして言及されるコード領域及
びイントロンとして言及される介在非コード領域の両者
を包含する。
【００１８】用語“対立遺伝子”とは、遺伝子のヌクレ
オチド配列のバリアントを意味する。ＡＢＯグリコシル
トランスフェラーゼ遺伝子“Ａ”対立遺伝子は、Ｎ−ア
セチルガラクトサミノシルトランスフェラーゼ活性を有
するタンパク質をコードする配列バリアントを意味す
る。“Ｂ”対立遺伝子は、ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列バリアン
トを意味する。“Ｏ”対立遺伝子は、グリコシルトラン
スフェラーゼ活性を欠いているタンパク質をコードする
ＡＢＯ遺伝子の配列バリアントを意味する。Ｏ対立遺伝
子は、得られる翻訳フレームシフトにより、ヌクレオチ
ド３４９〜３５１で停止コドンを創造する、Ａ及びＢ対
立遺伝子に関する位置２５８で単一の塩基対欠失を含
む。Ｏ対立遺伝子によりコードされる切断された１５５
個のアミノ酸のタンパク質は、トランスフェラーゼの機
能的ドメインを欠いている。
オチド配列のバリアントを意味する。ＡＢＯグリコシル
トランスフェラーゼ遺伝子“Ａ”対立遺伝子は、Ｎ−ア
セチルガラクトサミノシルトランスフェラーゼ活性を有
するタンパク質をコードする配列バリアントを意味す
る。“Ｂ”対立遺伝子は、ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列バリアン
トを意味する。“Ｏ”対立遺伝子は、グリコシルトラン
スフェラーゼ活性を欠いているタンパク質をコードする
ＡＢＯ遺伝子の配列バリアントを意味する。Ｏ対立遺伝
子は、得られる翻訳フレームシフトにより、ヌクレオチ
ド３４９〜３５１で停止コドンを創造する、Ａ及びＢ対
立遺伝子に関する位置２５８で単一の塩基対欠失を含
む。Ｏ対立遺伝子によりコードされる切断された１５５
個のアミノ酸のタンパク質は、トランスフェラーゼの機
能的ドメインを欠いている。
【００１９】用語“遺伝子型”とは、個人又はサンプル
に含まれる遺伝子の対立遺伝子の記載に言及する。用語
“多型性”及び“多型現象”とは、本明細書で使用され
る場合、特定のゲノム配列の複数のバリアントが集団で
見出され得る状態を意味する。多型領域又は多型部位と
は、多型現象が生じる核酸の領域を意味する。
に含まれる遺伝子の対立遺伝子の記載に言及する。用語
“多型性”及び“多型現象”とは、本明細書で使用され
る場合、特定のゲノム配列の複数のバリアントが集団で
見出され得る状態を意味する。多型領域又は多型部位と
は、多型現象が生じる核酸の領域を意味する。
【００２０】用語“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”
とは、検出されるべきプライマー、プローブ及びオリゴ
マーフラグメントを意味し、そしてポリデオキシリボヌ
クレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポ
リリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリ
ン又はピリミジン塩基、又は変性されたプリン又はピリ
ミジン塩基のＮ−グリコシドである他のタイプのポリヌ
クレオチドを総称する。用語“核酸”と“オリゴヌクレ
オチド”との間に長さの意図された区別は存在せず、そ
してそれらの用語は交換可能的に使用されるであろう。
とは、検出されるべきプライマー、プローブ及びオリゴ
マーフラグメントを意味し、そしてポリデオキシリボヌ
クレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポ
リリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリ
ン又はピリミジン塩基、又は変性されたプリン又はピリ
ミジン塩基のＮ−グリコシドである他のタイプのポリヌ
クレオチドを総称する。用語“核酸”と“オリゴヌクレ
オチド”との間に長さの意図された区別は存在せず、そ
してそれらの用語は交換可能的に使用されるであろう。
【００２１】それらの用語は分子の一次構造のみに言及
する。従って、それらの用語は、二及び一本鎖ＤＮＡ、
及び二及び一本鎖ＲＮＡを包含する。オリゴヌクレオチ
ドは、いづれかの適切な方法、たとえば適切な配列のク
ローニング及び制限酵素処理、及び直接的な化学合成
法、たとえばＮａｒａｎｇなど．，１９７９，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９のホスホトリエ
ステル法；Ｂｒｏｗｎなど．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１のホスホジエステ
ル法；Ｂｅａｕｃａｇｅなど．，１９８１，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２の
ジエチルホスホラミジット法；及びアメリカ特許第４，
４５８，０６６号の固体支持法により調製され得る。
する。従って、それらの用語は、二及び一本鎖ＤＮＡ、
及び二及び一本鎖ＲＮＡを包含する。オリゴヌクレオチ
ドは、いづれかの適切な方法、たとえば適切な配列のク
ローニング及び制限酵素処理、及び直接的な化学合成
法、たとえばＮａｒａｎｇなど．，１９７９，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９のホスホトリエ
ステル法；Ｂｒｏｗｎなど．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１のホスホジエステ
ル法；Ｂｅａｕｃａｇｅなど．，１９８１，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２の
ジエチルホスホラミジット法；及びアメリカ特許第４，
４５８，０６６号の固体支持法により調製され得る。
【００２２】合成法のレビューは、Ｇｏｏｄｃｈｉｌ
ｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １（３）：１６５〜１８７に提供される。Ｄ
ＮＡベクター中にオリゴヌクレオチドを導入するため
の、たとえば陽性の対照として使用するための方法は当
業界において良く知られており、そして引用により本明
細書に記載される。
ｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １（３）：１６５〜１８７に提供される。Ｄ
ＮＡベクター中にオリゴヌクレオチドを導入するため
の、たとえば陽性の対照として使用するための方法は当
業界において良く知られており、そして引用により本明
細書に記載される。
【００２３】用語“ハイブリダイゼーション”とは、相
補的塩基対による２つの一本鎖核酸による複合構造体の
形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相
補的な核酸鎖間で、又はミスマッチのマイナーな領域を
含む核酸鎖間で生じ得る。本明細書で使用される場合、
用語“実質的に相補的な”とは、ミスマッチされたヌク
レオチドの合計数が約３よりも多くないミスマッチのマ
イナーな領域を除いて相補的である配列を意味する。正
確に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、
“緊縮”又は“配列特異的”ハイブリダイゼーション条
件として言及される。
補的塩基対による２つの一本鎖核酸による複合構造体の
形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相
補的な核酸鎖間で、又はミスマッチのマイナーな領域を
含む核酸鎖間で生じ得る。本明細書で使用される場合、
用語“実質的に相補的な”とは、ミスマッチされたヌク
レオチドの合計数が約３よりも多くないミスマッチのマ
イナーな領域を除いて相補的である配列を意味する。正
確に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイズする条件は、
“緊縮”又は“配列特異的”ハイブリダイゼーション条
件として言及される。
【００２４】実質的に相補的な核酸の安定した複合体
は、低い緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で達成
され得る。核酸技法の当業者は、多くの変数、たとえば
オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強
度、及びミスマッチされた塩基対の出現率を実験的に考
慮して複合体の安定性を決定することができる。複合体
の安定性を計算するためのコンピューターソフトウェア
はＮａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎ
ｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）から市販されており；
ＯＬＩＧＯバージョン５参照マニュアルは引用により本
明細書に組込まれている。
は、低い緊縮性のハイブリダイゼーション条件下で達成
され得る。核酸技法の当業者は、多くの変数、たとえば
オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強
度、及びミスマッチされた塩基対の出現率を実験的に考
慮して複合体の安定性を決定することができる。複合体
の安定性を計算するためのコンピューターソフトウェア
はＮａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎ
ｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）から市販されており；
ＯＬＩＧＯバージョン５参照マニュアルは引用により本
明細書に組込まれている。
【００２５】オリゴヌクレオチドが正確に相補的な標的
配列にのみハイブリダイズするであろう緊縮性の配列特
異的ハイブリダイゼーション条件は当業界において良く
知られている（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１
９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参
照のこと）。緊縮条件は、配列依存性であり、そして異
なった環境下で異なるであろう。
配列にのみハイブリダイズするであろう緊縮性の配列特
異的ハイブリダイゼーション条件は当業界において良く
知られている（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１
９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参
照のこと）。緊縮条件は、配列依存性であり、そして異
なった環境下で異なるであろう。
【００２６】一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン
強度及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よ
りも約５℃低くなるように選択される。そのＴｍは、塩
基対の５０％が解離される温度である（定義されたイオ
ン強度及びpH下で）。ハイブリダイズする条件の緊縮性
の緩和は配列ミスマッチの耐性化を可能にし；耐性化さ
れるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件の
安定した調節により制御され得る。
強度及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よ
りも約５℃低くなるように選択される。そのＴｍは、塩
基対の５０％が解離される温度である（定義されたイオ
ン強度及びpH下で）。ハイブリダイズする条件の緊縮性
の緩和は配列ミスマッチの耐性化を可能にし；耐性化さ
れるミスマッチの程度はハイブリダイゼーション条件の
安定した調節により制御され得る。
【００２７】用語“プローブ”とは、適切な条件下で標
的核酸に選択的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオ
チドを意味する。プローブは標的配列に対して正確に又
は実質的に相補的な“ハイブリダイズ領域”を含み、そ
して多型部位で標的配列に対して正確に相補的であろ
う。十分に緊縮したハイブリダイゼーション条件下でプ
ローブを用いて実施されるハイブリダイゼーションアッ
セイは、特定の標的配列の選択的検出を可能にする。配
列における単一のヌクレオチドの差異の区別のためのハ
イブリダイゼーションアッセイへの使用のためには、プ
ローブハイブリダイズ領域は好ましくは、約１５個〜約
３５個の長さのヌクレオチドである。
的核酸に選択的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオ
チドを意味する。プローブは標的配列に対して正確に又
は実質的に相補的な“ハイブリダイズ領域”を含み、そ
して多型部位で標的配列に対して正確に相補的であろ
う。十分に緊縮したハイブリダイゼーション条件下でプ
ローブを用いて実施されるハイブリダイゼーションアッ
セイは、特定の標的配列の選択的検出を可能にする。配
列における単一のヌクレオチドの差異の区別のためのハ
イブリダイゼーションアッセイへの使用のためには、プ
ローブハイブリダイズ領域は好ましくは、約１５個〜約
３５個の長さのヌクレオチドである。
【００２８】当業者は、一般的に、一定のプローブの正
確な相補体がプローブとして同等に有用であることを認
識している。プローブオリゴヌクレオチドはハイブリダ
イズ領域から成り、又はプローブの検出又は固定化を可
能にするが、しかしハイブリダイズ領域のハイブリダイ
ゼーション特徴を有意に変えない追加の特徴を含むこと
ができる。たとえば、プローブハイブリダイズ領域は、
逆ドット−ブロットアッセイへの使用のために固体支持
体にプローブを固定化するために使用されるポリ−Ｔ
“末端”に結合され得る。
確な相補体がプローブとして同等に有用であることを認
識している。プローブオリゴヌクレオチドはハイブリダ
イズ領域から成り、又はプローブの検出又は固定化を可
能にするが、しかしハイブリダイズ領域のハイブリダイ
ゼーション特徴を有意に変えない追加の特徴を含むこと
ができる。たとえば、プローブハイブリダイズ領域は、
逆ドット−ブロットアッセイへの使用のために固体支持
体にプローブを固定化するために使用されるポリ−Ｔ
“末端”に結合され得る。
【００２９】用語“プライマー”とは、核酸鎖に対して
相補的なプライマー伸張生成物の合成が誘発される条件
下で、すなわち４種の異なったヌクレオシド三リン酸及
び適切な緩衝液において及び適切な温度での重合剤（す
なわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下
でＤＮＡ合成の開始の点として使用することができるオ
リゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましく
は、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プ
ライマーは、標的配列に対して正確に又は実質的に相補
的である“ハイブリダイズ領域”を含み、そして多型部
位で標的配列に対して正確に相補的であろう。
相補的なプライマー伸張生成物の合成が誘発される条件
下で、すなわち４種の異なったヌクレオシド三リン酸及
び適切な緩衝液において及び適切な温度での重合剤（す
なわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下
でＤＮＡ合成の開始の点として使用することができるオ
リゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましく
は、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プ
ライマーは、標的配列に対して正確に又は実質的に相補
的である“ハイブリダイズ領域”を含み、そして多型部
位で標的配列に対して正確に相補的であろう。
【００３０】プライマー伸張が十分に緊縮なハイブリダ
イゼーション条件下で実施されるプライマーを用いて実
施される増幅は、特定の標的配列の選択的な増幅を可能
にする。配列における単一のヌクレオチド変化の区別の
ために配列特異的増幅への使用のためには、プライマー
ハイブリダイズ領域は好ましくは、約１５〜約３５ヌク
レオチドの長さを有する。プライマー伸張はオリゴヌク
レオチドの３’端で生じるので、多型部位は好ましく
は、配列の区別を促進するためにプライマーの３’端で
位置する。
イゼーション条件下で実施されるプライマーを用いて実
施される増幅は、特定の標的配列の選択的な増幅を可能
にする。配列における単一のヌクレオチド変化の区別の
ために配列特異的増幅への使用のためには、プライマー
ハイブリダイズ領域は好ましくは、約１５〜約３５ヌク
レオチドの長さを有する。プライマー伸張はオリゴヌク
レオチドの３’端で生じるので、多型部位は好ましく
は、配列の区別を促進するためにプライマーの３’端で
位置する。
【００３１】プライマーオリゴヌクレオチドは、全体と
してハイブリダイズ領域から成るか、又は増幅された生
成物の検出、固定化又は操作を可能にするが、しかしＤ
ＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの塩基性質
を変えない追加の特徴を含むことができる。たとえば、
増幅された生成物のクローニングを促進するためには、
制限酵素切断部位を含む短い核酸配列はプライマーの
５’端に結合され得る。
してハイブリダイズ領域から成るか、又は増幅された生
成物の検出、固定化又は操作を可能にするが、しかしＤ
ＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの塩基性質
を変えない追加の特徴を含むことができる。たとえば、
増幅された生成物のクローニングを促進するためには、
制限酵素切断部位を含む短い核酸配列はプライマーの
５’端に結合され得る。
【００３２】用語“標的領域”は、分析される予定であ
り、そして通常、多型領域を含む核酸の領域を意味す
る。分子生物学及び核酸化学の従来の技法は文献に十分
に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋな
ど．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。本明細書に言及される
すべての特許、特許出願及び出版物は引用により本明細
書に組込まれる。
り、そして通常、多型領域を含む核酸の領域を意味す
る。分子生物学及び核酸化学の従来の技法は文献に十分
に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋな
ど．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。本明細書に言及される
すべての特許、特許出願及び出版物は引用により本明細
書に組込まれる。
【００３３】ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝
子ヌクレオチド配列 ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の領域のヌ
クレオチド配列は、配列番号１として提供され、そして
下記表１において５’から３’の方向で示されている。
配列番号１に使用される塩基コードは次の通りである：
Ａ＝アデニン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアニン；Ｔ＝チミ
ン；Ｒ＝アデニン又はグアニン；Ｙ＝シトシン又はチミ
ン。表１中にイタリック体で示される配列番号１の位置
１〜５８から成る領域はイントロン領域である。
子ヌクレオチド配列 ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の領域のヌ
クレオチド配列は、配列番号１として提供され、そして
下記表１において５’から３’の方向で示されている。
配列番号１に使用される塩基コードは次の通りである：
Ａ＝アデニン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアニン；Ｔ＝チミ
ン；Ｒ＝アデニン又はグアニン；Ｙ＝シトシン又はチミ
ン。表１中にイタリック体で示される配列番号１の位置
１〜５８から成る領域はイントロン領域である。
【００３４】配列番号１の位置５９〜１６１はＯ対立遺
伝子の完全なコード配列のヌクレオチド２３９〜３４
１、及びＡ及びＢ対立遺伝子の完全なコード配列のヌク
レオチド２３９〜２５７及び２５９〜３４２に対応す
る。Ｏ対立遺伝子内の多型部位（位置２９，３２及び１
１３で“Ｒ”；位置３３での“Ｙ”）は下線で示されて
いる。太字で示される位置２２〜５８から成るイントロ
ン配列が新規に発見されている。
伝子の完全なコード配列のヌクレオチド２３９〜３４
１、及びＡ及びＢ対立遺伝子の完全なコード配列のヌク
レオチド２３９〜２５７及び２５９〜３４２に対応す
る。Ｏ対立遺伝子内の多型部位（位置２９，３２及び１
１３で“Ｒ”；位置３３での“Ｙ”）は下線で示されて
いる。太字で示される位置２２〜５８から成るイントロ
ン配列が新規に発見されている。
【００３５】Ｏ対立遺伝子核酸の１本鎖のみが表１に示
されているが、当業者は配列番号１は二本鎖ゲノム核酸
の領域を特定し、そして両鎖の配列は提供される配列情
報により十分に特定されることを現解するであろう。表
示の便利さのために、二本鎖ゲノムＤＮＡの相補的塩基
対がコロンにより分離されてここで示されている。相補
的対の第１のヌクレオチドは、表１に示される一本鎖に
存在するヌクレオチドを言及する。
されているが、当業者は配列番号１は二本鎖ゲノム核酸
の領域を特定し、そして両鎖の配列は提供される配列情
報により十分に特定されることを現解するであろう。表
示の便利さのために、二本鎖ゲノムＤＮＡの相補的塩基
対がコロンにより分離されてここで示されている。相補
的対の第１のヌクレオチドは、表１に示される一本鎖に
存在するヌクレオチドを言及する。
【００３６】
【表１】
【００３７】上記に示されるように、Ｏ対立遺伝子は、
コード配列のヌクレオチド位置２５８でＡ及びＢ対立遺
伝子のコード配列に関して１つの塩基対欠失を含む。Ａ
及びＢ対立遺伝子は、Ａ及びＢ対立遺伝子のコード配列
のヌクレオチド２５８に対応する、配列番号１の位置７
７と７８との間に追加のＧ：Ｃ塩基対を含む。結果的
に、配列番号１の塩基７８〜１６１は、Ｏ対立遺伝子の
コード配列のヌクレオチド位置２５８〜３４１、及びＡ
及びＢ対立遺伝子のコード配列のヌクレオチド位置２５
９〜３４２に対応する。
コード配列のヌクレオチド位置２５８でＡ及びＢ対立遺
伝子のコード配列に関して１つの塩基対欠失を含む。Ａ
及びＢ対立遺伝子は、Ａ及びＢ対立遺伝子のコード配列
のヌクレオチド２５８に対応する、配列番号１の位置７
７と７８との間に追加のＧ：Ｃ塩基対を含む。結果的
に、配列番号１の塩基７８〜１６１は、Ｏ対立遺伝子の
コード配列のヌクレオチド位置２５８〜３４１、及びＡ
及びＢ対立遺伝子のコード配列のヌクレオチド位置２５
９〜３４２に対応する。
【００３８】配列番号１内の多型部位に存在する特定の
塩基対により区別される、ＡＢＯグリコシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子の７個のヌクレオチド配列バリアント
（対立遺伝子）が観察された。それらの７個の対立遺伝
子は、本明細書においてＯ1 ，Ｏ2 ，Ｏ3 ，Ｏ4 ，Ａ，
Ｂ1 及びＢ2 として命名される。本明細書において使用
される対立遺伝子の名称は、位置２９，３２，３３及び
１１３の多型部位に存在する特定の塩基対、及び配列番
号１の位置７７と７８との間での追加のＧ：Ｃ塩基対の
存在又は不在（表２において“Ｇ：Ｃ？”により示され
る）により下記表２に定義される。多型部位の位置は、
配列番号１で番号付けされている。
塩基対により区別される、ＡＢＯグリコシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子の７個のヌクレオチド配列バリアント
（対立遺伝子）が観察された。それらの７個の対立遺伝
子は、本明細書においてＯ1 ，Ｏ2 ，Ｏ3 ，Ｏ4 ，Ａ，
Ｂ1 及びＢ2 として命名される。本明細書において使用
される対立遺伝子の名称は、位置２９，３２，３３及び
１１３の多型部位に存在する特定の塩基対、及び配列番
号１の位置７７と７８との間での追加のＧ：Ｃ塩基対の
存在又は不在（表２において“Ｇ：Ｃ？”により示され
る）により下記表２に定義される。多型部位の位置は、
配列番号１で番号付けされている。
【００３９】
【表２】
【００４０】配列番号１のイントロン配列中の位置２９
に存在するＡ：Ｔ／Ｇ：Ｃ多型現象は次のようにＯ対立
遺伝子を２つのグループに再分割する：位置２９でＡ：
Ｔ塩基対を含むＯ1 及びＯ4 対立遺伝子、並びに位置２
９でＧ：Ｃ塩基対を含むＯ2及びＯ3 対立遺伝子。位置
２９を包含する配列番号１の領域は、Ｏ対立遺伝子間を
区別するために使用され得る新規の核酸配列を提供す
る。Ａ及びＢ対立遺伝子におけるそれらの対応する位置
は多型性ではなく、そしてＧ：Ｃ塩基対を含む。
に存在するＡ：Ｔ／Ｇ：Ｃ多型現象は次のようにＯ対立
遺伝子を２つのグループに再分割する：位置２９でＡ：
Ｔ塩基対を含むＯ1 及びＯ4 対立遺伝子、並びに位置２
９でＧ：Ｃ塩基対を含むＯ2及びＯ3 対立遺伝子。位置
２９を包含する配列番号１の領域は、Ｏ対立遺伝子間を
区別するために使用され得る新規の核酸配列を提供す
る。Ａ及びＢ対立遺伝子におけるそれらの対応する位置
は多型性ではなく、そしてＧ：Ｃ塩基対を含む。
【００４１】配列番号１のイントロン配列中の位置３２
に存在するＡ：Ｔ／Ｇ：Ｃ多型現象はＢ対立遺伝子をＢ
1 （Ａ：Ｔ）及びＢ2 （Ｇ：Ｃ）対立遺伝子に再分割す
る。従って、位置３２を包含する配列番号１の領域はＢ
対立遺伝子間を区別するために使用され得る新規の核酸
標的配列を提供する。Ａ及びＯ対立遺伝子のイントロン
配列におけるそれらの対応する位置は多型性ではなく、
そしてＡ：Ｔ塩基対を含む。
に存在するＡ：Ｔ／Ｇ：Ｃ多型現象はＢ対立遺伝子をＢ
1 （Ａ：Ｔ）及びＢ2 （Ｇ：Ｃ）対立遺伝子に再分割す
る。従って、位置３２を包含する配列番号１の領域はＢ
対立遺伝子間を区別するために使用され得る新規の核酸
標的配列を提供する。Ａ及びＯ対立遺伝子のイントロン
配列におけるそれらの対応する位置は多型性ではなく、
そしてＡ：Ｔ塩基対を含む。
【００４２】配列番号１のイントロン配列中の位置３３
に存在するＣ：Ｇ／Ｔ：Ａ多型現象は次のようにＯ対立
遺伝子を２つのグループに再分割する：位置３３でＣ：
Ｇ塩基対を含むＯ1 ，Ｏ2 及びＯ3 対立遺伝子、並びに
位置３３でＴ：Ａ塩基対を含むＯ4 対立遺伝子。従っ
て、位置３３を包含する配列番号１の領域は、Ｏ4 対立
遺伝子を同定するために使用され得る新規の核酸標的配
列を提供する。Ａ及びＢ対立遺伝子のイントロン配列に
おけるそれらの対応する位置は、多型性ではなく、そし
てＣ：Ｇ塩基対を含む。配列番号１のイントロン配列中
の位置１〜２７及び３４〜５８はＡＢＯ対立遺伝子間に
保存される。それらの領域は、対立遺伝子タイプにかか
わらず、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の
検出又は増幅のための新規の核酸標的配列を提供した。
に存在するＣ：Ｇ／Ｔ：Ａ多型現象は次のようにＯ対立
遺伝子を２つのグループに再分割する：位置３３でＣ：
Ｇ塩基対を含むＯ1 ，Ｏ2 及びＯ3 対立遺伝子、並びに
位置３３でＴ：Ａ塩基対を含むＯ4 対立遺伝子。従っ
て、位置３３を包含する配列番号１の領域は、Ｏ4 対立
遺伝子を同定するために使用され得る新規の核酸標的配
列を提供する。Ａ及びＢ対立遺伝子のイントロン配列に
おけるそれらの対応する位置は、多型性ではなく、そし
てＣ：Ｇ塩基対を含む。配列番号１のイントロン配列中
の位置１〜２７及び３４〜５８はＡＢＯ対立遺伝子間に
保存される。それらの領域は、対立遺伝子タイプにかか
わらず、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の
検出又は増幅のための新規の核酸標的配列を提供した。
【００４３】配列番号１のコード領域中の位置１１３に
存在するＧ：Ｃ／Ａ：Ｔ多型現象は、Ｏ1 ，Ｏ3 及びＯ
4 対立遺伝子とＯ2 対立遺伝子を区別し、そしてまた、
ＡとＢ対立遺伝子とを区別する。Ｏ1 ，Ｏ3 及びＯ4 対
立遺伝子は位置１１３でＧ：Ｃ塩基対を含み、そしてＢ
対立遺伝子はその対応する位置でＧ：Ｃ塩基対を含む。
Ｏ2 対立遺伝子は位置１１３でＡ：Ｔ塩基対を含み、そ
してＡ対立遺伝子はその対応する位置でＡ：Ｔ塩基対を
含む。従って、位置１１３を包含する領域はＡ：Ｔ塩基
対を含むＡ及びＯ2 対立遺伝子とＧ：Ｃ塩基対を含む
Ｂ，Ｏ1 ，Ｏ3 及びＯ4 対立遺伝子のすべてとを区別す
るために使用され得る。
存在するＧ：Ｃ／Ａ：Ｔ多型現象は、Ｏ1 ，Ｏ3 及びＯ
4 対立遺伝子とＯ2 対立遺伝子を区別し、そしてまた、
ＡとＢ対立遺伝子とを区別する。Ｏ1 ，Ｏ3 及びＯ4 対
立遺伝子は位置１１３でＧ：Ｃ塩基対を含み、そしてＢ
対立遺伝子はその対応する位置でＧ：Ｃ塩基対を含む。
Ｏ2 対立遺伝子は位置１１３でＡ：Ｔ塩基対を含み、そ
してＡ対立遺伝子はその対応する位置でＡ：Ｔ塩基対を
含む。従って、位置１１３を包含する領域はＡ：Ｔ塩基
対を含むＡ及びＯ2 対立遺伝子とＧ：Ｃ塩基対を含む
Ｂ，Ｏ1 ，Ｏ3 及びＯ4 対立遺伝子のすべてとを区別す
るために使用され得る。
【００４４】本発明の方法においては、対立遺伝子配列
変異体は、１又は複数の上記多型部位に存在する塩基対
を検出することによって同定される。存在する塩基対
は、１又は複数の多型部位を包含する遺伝子の領域を配
列決定することによって、又は配列変異体間を区別する
いづれかの手段により決定され得る。たとえば、ゲル電
気泳動により測定される移動度の変化は、対立遺伝子配
列を区別するために使用され得る。
変異体は、１又は複数の上記多型部位に存在する塩基対
を検出することによって同定される。存在する塩基対
は、１又は複数の多型部位を包含する遺伝子の領域を配
列決定することによって、又は配列変異体間を区別する
いづれかの手段により決定され得る。たとえば、ゲル電
気泳動により測定される移動度の変化は、対立遺伝子配
列を区別するために使用され得る。
【００４５】好ましいハイブリダイゼーション検出法
は、相補性の程度で異なる、対立遺伝子核酸とプライマ
ー又はプローブオリゴヌクレオチドとの間で形成され
る、ハイブリダイゼーション複合体の安定性の差異に基
づかれている。十分に緊縮した条件下で、プローブ又は
プライマーオリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成
される複合体のみが安定しているであろう。安定したハ
イブリダイゼーション複合体の存在は、多くの良く知ら
れた方法のいづれかにより、たとえばラベルされたプロ
ーブにより又は増幅反応のために必要なプライマー伸張
を実施する能力により検出され得る。
は、相補性の程度で異なる、対立遺伝子核酸とプライマ
ー又はプローブオリゴヌクレオチドとの間で形成され
る、ハイブリダイゼーション複合体の安定性の差異に基
づかれている。十分に緊縮した条件下で、プローブ又は
プライマーオリゴヌクレオチドと標的配列との間で形成
される複合体のみが安定しているであろう。安定したハ
イブリダイゼーション複合体の存在は、多くの良く知ら
れた方法のいづれかにより、たとえばラベルされたプロ
ーブにより又は増幅反応のために必要なプライマー伸張
を実施する能力により検出され得る。
【００４６】本発明の１つの態様において、特定の多型
部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を包含する、
配列番号１の標的領域又は配列番号１の相補体に対して
正確に相補的なオリゴヌクレオチドによる配列特異的ハ
イブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーショ
ンにより同定される。配列特異的ハイブリダイゼーショ
ン条件下で、多型部位を包含する領域における変異対立
遺伝子に対して正確に相補的なオリゴヌクレオチドは変
異対立遺伝子のみにハイブリダイズするであろう。従っ
て、多型部位を包含する領域における対立遺伝子配列に
対して正確に相補的である長さ約１５〜約３５個のヌク
レオチドのオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内であ
る。
部位に存在するヌクレオチドは、多型部位を包含する、
配列番号１の標的領域又は配列番号１の相補体に対して
正確に相補的なオリゴヌクレオチドによる配列特異的ハ
イブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーショ
ンにより同定される。配列特異的ハイブリダイゼーショ
ン条件下で、多型部位を包含する領域における変異対立
遺伝子に対して正確に相補的なオリゴヌクレオチドは変
異対立遺伝子のみにハイブリダイズするであろう。従っ
て、多型部位を包含する領域における対立遺伝子配列に
対して正確に相補的である長さ約１５〜約３５個のヌク
レオチドのオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内であ
る。
【００４７】本発明の他の態様において、特定の多型部
位に存在するヌクレオチドは、配列番号１の標的領域に
対して又は配列番号１の相補体に対して実質的に相補的
である、すなわち約３個よりも多くのミスマッチを含
ず、多型部位を包含し、そしていづれかの多型部位で標
的配列に対して正確に相補的であるオリゴヌクレオチド
との、十分な緊縮ハイブリダイゼーション条件下でのハ
イブリダイゼーションにより同定される。
位に存在するヌクレオチドは、配列番号１の標的領域に
対して又は配列番号１の相補体に対して実質的に相補的
である、すなわち約３個よりも多くのミスマッチを含
ず、多型部位を包含し、そしていづれかの多型部位で標
的配列に対して正確に相補的であるオリゴヌクレオチド
との、十分な緊縮ハイブリダイゼーション条件下でのハ
イブリダイゼーションにより同定される。
【００４８】非多型部位に存在するミスマッチはすべて
の対立遺伝子配列とのミスマッチであるので、標的配列
と共に形成される複合体及び対応する非標的対立遺伝子
配列と共に形成される複合体におけるミスマッチの数の
差異は、標的配列に対して正確に相補的であるオリゴヌ
クレオチドが使用される場合、同じである。この態様に
おいて、ハイブリダイゼーション条件は、非標的配列と
の安定した複合体の形成を妨げるために十分な緊縮性を
維持しながら、標的配列との安定した複合体の形成を可
能にするために十分に緩和される。
の対立遺伝子配列とのミスマッチであるので、標的配列
と共に形成される複合体及び対応する非標的対立遺伝子
配列と共に形成される複合体におけるミスマッチの数の
差異は、標的配列に対して正確に相補的であるオリゴヌ
クレオチドが使用される場合、同じである。この態様に
おいて、ハイブリダイゼーション条件は、非標的配列と
の安定した複合体の形成を妨げるために十分な緊縮性を
維持しながら、標的配列との安定した複合体の形成を可
能にするために十分に緩和される。
【００４９】そのような十分に緊縮なハイブリダイゼー
ション条件下で、いづれかの多型部位で標的配列に対し
て正確に相補的であり、多型部位を包含する領域におい
てバリアント対立遺伝子に対して実質的に相補的である
オリゴヌクレオチドは、バリアント対立遺伝子に対して
のみハイブリダイズするであろう。従って、多型部位を
包含する領域における対立遺伝子配列に対して実質的に
相補的であり、そしていづれかの多型部位で対立遺伝子
配列に対して正確に相補的である長さ約１５〜約３５個
のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲
内である。
ション条件下で、いづれかの多型部位で標的配列に対し
て正確に相補的であり、多型部位を包含する領域におい
てバリアント対立遺伝子に対して実質的に相補的である
オリゴヌクレオチドは、バリアント対立遺伝子に対して
のみハイブリダイズするであろう。従って、多型部位を
包含する領域における対立遺伝子配列に対して実質的に
相補的であり、そしていづれかの多型部位で対立遺伝子
配列に対して正確に相補的である長さ約１５〜約３５個
のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲
内である。
【００５０】正確にではなくむしろ実質的に相補的なオ
リゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条
件の最適化が制限されるアッセイ型においては所望され
る。たとえば、典型的な固定されたプローブアッセイ型
においては、下記のように、複数のプローブが単一の固
体支持体上に固定されている。ハイブリダイゼーション
は、固体支持体と標的ＤＮＡを含む溶液とを接触するこ
とによって同時に実施される。個々のハイブリダイゼー
ションは同一の条件下で実施されるので、ハイブリダイ
ゼーション条件は個々のプローブのために別々に最適化
され得ない。従って、プローブ配列は、プローブ／標的
複合体の安定性が同じハイブリダイゼーション条件下で
類似するように選択される。
リゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条
件の最適化が制限されるアッセイ型においては所望され
る。たとえば、典型的な固定されたプローブアッセイ型
においては、下記のように、複数のプローブが単一の固
体支持体上に固定されている。ハイブリダイゼーション
は、固体支持体と標的ＤＮＡを含む溶液とを接触するこ
とによって同時に実施される。個々のハイブリダイゼー
ションは同一の条件下で実施されるので、ハイブリダイ
ゼーション条件は個々のプローブのために別々に最適化
され得ない。従って、プローブ配列は、プローブ／標的
複合体の安定性が同じハイブリダイゼーション条件下で
類似するように選択される。
【００５１】ミスマッチはプローブ／標的ハイブリダイ
ゼーション複合体の安定性を低め、そして従ってアッセ
イのための十分な緊縮性を提供するために必要とされる
ハイブリダイゼーション条件を変えるので、プローブの
設計へのミスマッチの導入は、アッセイ型がハイブリダ
イゼーション条件を調整することを妨げる場合、複合体
の安定性を調整するために使用され得る。複合体安定性
に対する特定の導入されるミスマッチの効果は良く知ら
れており、そして複合体安定性は上記のように、日常的
に推定され、そして実験的に決定され得る。
ゼーション複合体の安定性を低め、そして従ってアッセ
イのための十分な緊縮性を提供するために必要とされる
ハイブリダイゼーション条件を変えるので、プローブの
設計へのミスマッチの導入は、アッセイ型がハイブリダ
イゼーション条件を調整することを妨げる場合、複合体
の安定性を調整するために使用され得る。複合体安定性
に対する特定の導入されるミスマッチの効果は良く知ら
れており、そして複合体安定性は上記のように、日常的
に推定され、そして実験的に決定され得る。
【００５２】好ましいオリゴヌクレオチドプローブ 検出されるべき多型現象は、単一の塩基対の差異から成
る。配列における単一の塩基の差異はオリゴヌクレオチ
ドプローブの分別ハイブリダイゼーションにより検出さ
れ得る。プローブハイブリダイゼーション配列及び配列
特異的ハイブリダイゼーション条件は、多型部位での単
一のミスマッチが効果的に形成されないように十分にハ
イブリダイゼーション複合体を不安定化するよう選択さ
れる。
る。配列における単一の塩基の差異はオリゴヌクレオチ
ドプローブの分別ハイブリダイゼーションにより検出さ
れ得る。プローブハイブリダイゼーション配列及び配列
特異的ハイブリダイゼーション条件は、多型部位での単
一のミスマッチが効果的に形成されないように十分にハ
イブリダイゼーション複合体を不安定化するよう選択さ
れる。
【００５３】従って、本発明の方法においては、特定の
多型部位に存在するヌクレオチドは、配列番号１の標的
領域に対して又は配列番号１の相補体に対して実質的に
相補的なハイブリダイズする領域を含み、多型部位を含
みそして多型部位で正確に相補的であるオリゴヌクレオ
チドプローブとの十分に緊縮したハイブリダイゼーショ
ン条件下でのハイブリダイゼーションにより同定され
る。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの正確な
大きさ及び配列に依存し、そして本明細書及び従来技術
に提供されるガイドを用いて実験的に選択され得る。配
列における単一の塩基対差異を検出するためへのオリゴ
ヌクレオチドプローブの使用は、Ｃｏｎｎｅｒなど．，
１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８０：２７８〜２８１に記載される。
多型部位に存在するヌクレオチドは、配列番号１の標的
領域に対して又は配列番号１の相補体に対して実質的に
相補的なハイブリダイズする領域を含み、多型部位を含
みそして多型部位で正確に相補的であるオリゴヌクレオ
チドプローブとの十分に緊縮したハイブリダイゼーショ
ン条件下でのハイブリダイゼーションにより同定され
る。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの正確な
大きさ及び配列に依存し、そして本明細書及び従来技術
に提供されるガイドを用いて実験的に選択され得る。配
列における単一の塩基対差異を検出するためへのオリゴ
ヌクレオチドプローブの使用は、Ｃｏｎｎｅｒなど．，
１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８０：２７８〜２８１に記載される。
【００５４】位置２９，３２及び３３での多型部位の接
近性のために、位置２９〜３３を包含するプローブは、
位置２９，３２及び３３に存在する塩基対のパターンを
検出するために使用され得る。表２に示されるように、
すべての７つの対立遺伝子は位置２９〜３３の領域に４
つの明確なバリアント配列の１つを含む。従って、塩基
対の個々の可能な組合せを検出するために１つのプロー
ブを使用する場合、４つのプローブが位置２９〜３３を
包含する領域内の個々の対立遺伝子を検出するために十
分である。たとえば、個々の対立遺伝子における位置２
９，３２及び３３で存在する塩基対を決定するために十
分な４種のプローブの組が例に提供される。
近性のために、位置２９〜３３を包含するプローブは、
位置２９，３２及び３３に存在する塩基対のパターンを
検出するために使用され得る。表２に示されるように、
すべての７つの対立遺伝子は位置２９〜３３の領域に４
つの明確なバリアント配列の１つを含む。従って、塩基
対の個々の可能な組合せを検出するために１つのプロー
ブを使用する場合、４つのプローブが位置２９〜３３を
包含する領域内の個々の対立遺伝子を検出するために十
分である。たとえば、個々の対立遺伝子における位置２
９，３２及び３３で存在する塩基対を決定するために十
分な４種のプローブの組が例に提供される。
【００５５】好ましくマッチされた及び単一塩基ミスマ
ッチされたハイブリダイゼーション複合体間での安定性
の比例した変化はハイブリダイズされたオリゴヌクレオ
チドの長さに依存する。より短いプローブ配列により形
成される複合体は、ミスマッチの存在によりより比例し
て不安定化される。実際的には、長さ約１５〜約３５個
のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが配列特異的検出
のために好ましい。さらに、ハイブリダイズされるオリ
ゴヌクレオチドの末端は熱エネルギーによる連続したラ
ンダムな解離及び再アニーリングを受けるので、いづれ
かの端でのミスマッチは内部的に存在するミスマッチよ
りもハイブリダイゼーション複合体を不安定化する。好
ましくは、標的配列における単一の塩基対の変化の区別
のためには、多型部位がプローブの内部領域に生じるよ
うに標的配列とハイブリダイズするプローブ配列が選択
される。
ッチされたハイブリダイゼーション複合体間での安定性
の比例した変化はハイブリダイズされたオリゴヌクレオ
チドの長さに依存する。より短いプローブ配列により形
成される複合体は、ミスマッチの存在によりより比例し
て不安定化される。実際的には、長さ約１５〜約３５個
のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが配列特異的検出
のために好ましい。さらに、ハイブリダイズされるオリ
ゴヌクレオチドの末端は熱エネルギーによる連続したラ
ンダムな解離及び再アニーリングを受けるので、いづれ
かの端でのミスマッチは内部的に存在するミスマッチよ
りもハイブリダイゼーション複合体を不安定化する。好
ましくは、標的配列における単一の塩基対の変化の区別
のためには、多型部位がプローブの内部領域に生じるよ
うに標的配列とハイブリダイズするプローブ配列が選択
される。
【００５６】配列番号１にハイブリダイズするプローブ
配列を選択するための上記基準は、プローブのハイブリ
ダイズする領域、すなわち標的配列とのハイブリダイズ
に包含されるプローブの部分に適用する。プローブは、
追加の核酸配列、たとえばプローブのハイブリダイゼー
ション特徴を有意に変えないで、プローブを固定するた
めに使用されるポリ−Ｔ端に結合され得る。当業者は、
本発明の方法に使用するためには、標的配列に対して相
補的でなく、そして従ってハイブリダイゼーションに包
含されない追加の核酸配列に結合されるプローブは結合
されていないプローブに実質的に同等であることを理解
するであろう。
配列を選択するための上記基準は、プローブのハイブリ
ダイズする領域、すなわち標的配列とのハイブリダイズ
に包含されるプローブの部分に適用する。プローブは、
追加の核酸配列、たとえばプローブのハイブリダイゼー
ション特徴を有意に変えないで、プローブを固定するた
めに使用されるポリ−Ｔ端に結合され得る。当業者は、
本発明の方法に使用するためには、標的配列に対して相
補的でなく、そして従ってハイブリダイゼーションに包
含されない追加の核酸配列に結合されるプローブは結合
されていないプローブに実質的に同等であることを理解
するであろう。
【００５７】好ましいオリゴヌクレオチド増幅プライマ
ー 本発明の好ましい態様において、ＡＢＯ遺伝子型を決定
するための方法は、多型部位を含むＡＢＯ遺伝子から核
酸配列を増幅し、配列特異的ハイブリダイゼーション条
件下でオリゴヌクレオチドプローブを用いて個々の多型
部位に存在するヌクレオチドを同定し、そして増幅され
た標的配列へのプローブの結合のパターンからＡＢＯ遺
伝子型を推定することを含んで成る。この態様におい
て、プローブハイブリダイゼーションによる分析のため
に十分な核酸を提供するために増幅が実施される。従っ
て、プライマーは、サンプルに存在する対立遺伝子にか
かわらず多型部位を包含するＡＢＯ遺伝子の領域が増幅
されるように企画される。対立遺伝子−非依存性増幅
は、ＡＢＯ遺伝子の保存された領域にハイブリダイズす
るプライマーを用いて達成される。
ー 本発明の好ましい態様において、ＡＢＯ遺伝子型を決定
するための方法は、多型部位を含むＡＢＯ遺伝子から核
酸配列を増幅し、配列特異的ハイブリダイゼーション条
件下でオリゴヌクレオチドプローブを用いて個々の多型
部位に存在するヌクレオチドを同定し、そして増幅され
た標的配列へのプローブの結合のパターンからＡＢＯ遺
伝子型を推定することを含んで成る。この態様におい
て、プローブハイブリダイゼーションによる分析のため
に十分な核酸を提供するために増幅が実施される。従っ
て、プライマーは、サンプルに存在する対立遺伝子にか
かわらず多型部位を包含するＡＢＯ遺伝子の領域が増幅
されるように企画される。対立遺伝子−非依存性増幅
は、ＡＢＯ遺伝子の保存された領域にハイブリダイズす
るプライマーを用いて達成される。
【００５８】本発明の他の態様においては、配列特異的
増幅は、多型部位を包含するＡＢＯ遺伝子の領域にハイ
ブリダイズするプライマーを用いて実施される。増幅条
件は、標的の対立遺伝子配列がサンプルに存在する場合
でのみ増幅が生じるように選択される。この態様におい
ては、存在するヌクレオチドは増幅生成物の存在又は不
在により同定され；増幅された生成物のさらなる配列分
析は必要とされない。増幅された生成物の検出は、当業
界において良く知られたいづれかの方法、たとえばゲル
電気泳動による分析により実施され得る。
増幅は、多型部位を包含するＡＢＯ遺伝子の領域にハイ
ブリダイズするプライマーを用いて実施される。増幅条
件は、標的の対立遺伝子配列がサンプルに存在する場合
でのみ増幅が生じるように選択される。この態様におい
ては、存在するヌクレオチドは増幅生成物の存在又は不
在により同定され；増幅された生成物のさらなる配列分
析は必要とされない。増幅された生成物の検出は、当業
界において良く知られたいづれかの方法、たとえばゲル
電気泳動による分析により実施され得る。
【００５９】プライマーのハイブリダイゼーション特異
性は、配列特異的増幅を可能にするプライマーの決定的
性質である。一般的に、プライマー伸張部位である３’
端はプライマーの特異性に対してより決定的である。な
ぜならば、３’端でのミスマッチは３’端を不安定化
し、そしてプライマーの５’部分が標的配列にハイブリ
ダイズされたとしてもプライマー伸張を妨害するからで
ある。従って、配列における単一のヌクレオチド変化の
区別のためには、好ましくは、プライマー配列は、多型
部位がプライマーの３’端で又はその近くでハイブリダ
イズするよう標的配列にハイブリダイズする。
性は、配列特異的増幅を可能にするプライマーの決定的
性質である。一般的に、プライマー伸張部位である３’
端はプライマーの特異性に対してより決定的である。な
ぜならば、３’端でのミスマッチは３’端を不安定化
し、そしてプライマーの５’部分が標的配列にハイブリ
ダイズされたとしてもプライマー伸張を妨害するからで
ある。従って、配列における単一のヌクレオチド変化の
区別のためには、好ましくは、プライマー配列は、多型
部位がプライマーの３’端で又はその近くでハイブリダ
イズするよう標的配列にハイブリダイズする。
【００６０】対立遺伝子−特異的増幅及びプライマーミ
スマッチの効果は、Ｕｇｏｚｚｏｌｉなど．，１９９
１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：４
２〜４８；Ｋｗｏｋなど．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：９９９〜１０
０５；及びＫｗｏｋなど．，１９９４，ＰＣＲ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３：
Ｓ：３９〜４７に記載されている。
スマッチの効果は、Ｕｇｏｚｚｏｌｉなど．，１９９
１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：４
２〜４８；Ｋｗｏｋなど．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：９９９〜１０
０５；及びＫｗｏｋなど．，１９９４，ＰＣＲ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３：
Ｓ：３９〜４７に記載されている。
【００６１】制限酵素切断部位（制限部位）を含む追加
の配列は、伸張されるべきプライマーの能力に影響を及
ぼさないで、プライマーの５’端に付加され得る。増幅
された生成物中に導入される制限部位は、たとえば配列
決定への使用のために増幅された生成物のクローニング
を促進する（アメリカ特許第４，６８３，１９５号を参
照のこと）。典型的には、標的配列に対して相補的でな
い長さ約２〜約１０個の塩基の配列が、ＡＢＯ対立遺伝
子の特異的増幅を触媒するためのプライマーの能力を有
意に変えないで、プライマーハイブリダイズ領域の５’
端に付加され得る。
の配列は、伸張されるべきプライマーの能力に影響を及
ぼさないで、プライマーの５’端に付加され得る。増幅
された生成物中に導入される制限部位は、たとえば配列
決定への使用のために増幅された生成物のクローニング
を促進する（アメリカ特許第４，６８３，１９５号を参
照のこと）。典型的には、標的配列に対して相補的でな
い長さ約２〜約１０個の塩基の配列が、ＡＢＯ対立遺伝
子の特異的増幅を触媒するためのプライマーの能力を有
意に変えないで、プライマーハイブリダイズ領域の５’
端に付加され得る。
【００６２】付加された５’末端配列の正確な長さ及び
配列は、所望される制限部位により決定されるであろ
う。当業者は、増幅条件のマイナーな最適化は付加され
る配列に依存して必要であることを十分に理解するであ
ろう。しかしながら、当業者はまた、本発明の方法への
使用のためには、制限酵素切断部位を含む５’端での追
加の配列により延長されたプライマーは、延長されてい
ないプライマーに実質的に同等であることも理解するで
あろう。
配列は、所望される制限部位により決定されるであろ
う。当業者は、増幅条件のマイナーな最適化は付加され
る配列に依存して必要であることを十分に理解するであ
ろう。しかしながら、当業者はまた、本発明の方法への
使用のためには、制限酵素切断部位を含む５’端での追
加の配列により延長されたプライマーは、延長されてい
ないプライマーに実質的に同等であることも理解するで
あろう。
【００６３】増幅及び検出方法 ＡＢＯ核酸を含むいづれかのタイプの組織が、個人のＡ
ＢＯ遺伝子型を決定するために使用され得る。ＰＣＲの
ためのサンプルを調製するための単純且つ迅速な方法
は、Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載される。好まし
い方法は、Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍなど．，１９８９，Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ３：１１及びＷａｌｓｈ
など．，１９９１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０
（４）：５０６〜５１３に記載されるＣｈｅｌｅｘ抽出
方法である。
ＢＯ遺伝子型を決定するために使用され得る。ＰＣＲの
ためのサンプルを調製するための単純且つ迅速な方法
は、Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載される。好まし
い方法は、Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍなど．，１９８９，Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ３：１１及びＷａｌｓｈ
など．，１９９１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０
（４）：５０６〜５１３に記載されるＣｈｅｌｅｘ抽出
方法である。
【００６４】本発明の遺伝子型分類法は増幅された核酸
を利用することができるので、そしてＰＣＲ技法はひじ
ょうに少量の核酸を増幅することができるので、ＡＢＯ
遺伝子型は、数コピーのＡＢＯ遺伝子のみを含むサンプ
ルから均等に決定され得る。たとえば、一本の髪の根端
さえ、Ｈｉｇｕｃｈｉなど．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ
３３２：５４３〜５４６により記載されるＤＱａｌｐ
ｈ ＤＮＡ型決定法により明らかなように、本発明の目
的のための十分なＤＮＡを含む。ＤＮＡ型決定のために
単一の精子を用いる可能性は、Ｌなど．，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３５：４４１〜４１７に示されている。
を利用することができるので、そしてＰＣＲ技法はひじ
ょうに少量の核酸を増幅することができるので、ＡＢＯ
遺伝子型は、数コピーのＡＢＯ遺伝子のみを含むサンプ
ルから均等に決定され得る。たとえば、一本の髪の根端
さえ、Ｈｉｇｕｃｈｉなど．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ
３３２：５４３〜５４６により記載されるＤＱａｌｐ
ｈ ＤＮＡ型決定法により明らかなように、本発明の目
的のための十分なＤＮＡを含む。ＤＮＡ型決定のために
単一の精子を用いる可能性は、Ｌなど．，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３５：４４１〜４１７に示されている。
【００６５】ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅方法
は、当業界において良く知られており、そしてアメリカ
特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号
及び第４，９６５，１８８号に記載されている。Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）は、ＰＣ
Ｒ試薬を市販しており、そしてＰＣＲ方法を公開してい
る。ＰＣＲの要約は下記に提供される。
は、当業界において良く知られており、そしてアメリカ
特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号
及び第４，９６５，１８８号に記載されている。Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）は、ＰＣ
Ｒ試薬を市販しており、そしてＰＣＲ方法を公開してい
る。ＰＣＲの要約は下記に提供される。
【００６６】ＰＣＲ増幅の個々のサイクルにおいては、
二本鎖の標的配列が変性され、プライマーが変性された
標的の個々の鎖にアニールされ、そしてプライマーがＤ
ＮＡポリメラーゼの作用により延長される。この工程は
典型的には、２５〜４０回、反復される。２つのプライ
マーは、標的核酸配列の反対端に及び個々のプライマー
の延長生成物が標的配列の相補的コピーであるような配
向でアニールし、そしてその補体から分離される場合、
他のプライマーにハイブリダイズすることができる。個
々のサイクルは、１００％効果的である場合、存在する
標的配列の数の二倍化をもたらす。
二本鎖の標的配列が変性され、プライマーが変性された
標的の個々の鎖にアニールされ、そしてプライマーがＤ
ＮＡポリメラーゼの作用により延長される。この工程は
典型的には、２５〜４０回、反復される。２つのプライ
マーは、標的核酸配列の反対端に及び個々のプライマー
の延長生成物が標的配列の相補的コピーであるような配
向でアニールし、そしてその補体から分離される場合、
他のプライマーにハイブリダイズすることができる。個
々のサイクルは、１００％効果的である場合、存在する
標的配列の数の二倍化をもたらす。
【００６７】ＰＣＲ方法により可能な摸大な増幅のため
に、高レベルのＤＮＡを有するサンプル、陽性の対照鋳
型又は前での増幅からの低レベルのＤＮＡ汚染が、目的
の添加された鋳型ＤＮＡの不在においてさえ、ＰＣＲ生
成物をもたらすことができる。障害汚染を最少にするで
あろう実験装置及び技法は、Ｋｗｏｋ ａｎｄ Ｈｉｇ
ｕｃｈｉ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：２３７〜
２３８及びＫｗｏｋａｎｄ Ｏｒｒｅｇｏ，Ｉｎｎｉｓ
など．，ｅｄｓ．，１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに論ぜら
れている。前の反応からの増幅された核酸によるＰＣＲ
の汚染の問題を減じるための酵素方法は、ＰＣＴ特許出
願第ＵＳ９１／０５２１０号及びアメリカ特許第５，４
１８，１４９号及び第５，０３５，９９６号に記載され
ている。
に、高レベルのＤＮＡを有するサンプル、陽性の対照鋳
型又は前での増幅からの低レベルのＤＮＡ汚染が、目的
の添加された鋳型ＤＮＡの不在においてさえ、ＰＣＲ生
成物をもたらすことができる。障害汚染を最少にするで
あろう実験装置及び技法は、Ｋｗｏｋ ａｎｄ Ｈｉｇ
ｕｃｈｉ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：２３７〜
２３８及びＫｗｏｋａｎｄ Ｏｒｒｅｇｏ，Ｉｎｎｉｓ
など．，ｅｄｓ．，１９９０，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに論ぜら
れている。前の反応からの増幅された核酸によるＰＣＲ
の汚染の問題を減じるための酵素方法は、ＰＣＴ特許出
願第ＵＳ９１／０５２１０号及びアメリカ特許第５，４
１８，１４９号及び第５，０３５，９９６号に記載され
ている。
【００６８】増幅反応混合物は典型的には、室温、すな
わちプライマーハイブリダイゼーション特異性を保証す
るために必要とされる温度よりも十分に低い温度でアセ
ンブルされる。非特異的増幅は、室温でプライマーは非
特異的に他に結合することができるので、部分的に相補
的な核酸配列のみをもたらすことができ、そして所望し
ない核酸配列の合成を示す。それらの新しく合成され
た、所望しない配列は、増幅反応の間、所望する標的配
列と競争することができ、そして所望する配列の増幅効
能を有意に低めることができる。非特異的増幅は、温度
が必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するため
に十分に高められるまで、プライマー延長が妨げられる
“ホット−スタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）”を用いて
減じられ得る。
わちプライマーハイブリダイゼーション特異性を保証す
るために必要とされる温度よりも十分に低い温度でアセ
ンブルされる。非特異的増幅は、室温でプライマーは非
特異的に他に結合することができるので、部分的に相補
的な核酸配列のみをもたらすことができ、そして所望し
ない核酸配列の合成を示す。それらの新しく合成され
た、所望しない配列は、増幅反応の間、所望する標的配
列と競争することができ、そして所望する配列の増幅効
能を有意に低めることができる。非特異的増幅は、温度
が必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するため
に十分に高められるまで、プライマー延長が妨げられる
“ホット−スタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）”を用いて
減じられ得る。
【００６９】１つのホット−スタート法においては、温
度が必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するた
めに十分に高められるまで、１又は複数の試薬が反応混
合物から抑えられる。熱不安定材料、たとえばワックス
を、反応成分を分離し又は隔離するために使用するホッ
ト−スタート法は、アメリカ特許第５，４１１，８７６
号及びＣｈｏｕなど．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（７）：１７１７〜
１７２３に記載されている。他のホット−スタート法に
おいては、増幅の前又は増幅の第１段階として高温イン
キュベーションにより不活性化されるまで、プライマー
延長を触媒しない可逆的に不活性化されたＤＮＡポリメ
ラーゼが使用される。
度が必要なハイブリダイゼーション特異性を提供するた
めに十分に高められるまで、１又は複数の試薬が反応混
合物から抑えられる。熱不安定材料、たとえばワックス
を、反応成分を分離し又は隔離するために使用するホッ
ト−スタート法は、アメリカ特許第５，４１１，８７６
号及びＣｈｏｕなど．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（７）：１７１７〜
１７２３に記載されている。他のホット−スタート法に
おいては、増幅の前又は増幅の第１段階として高温イン
キュベーションにより不活性化されるまで、プライマー
延長を触媒しない可逆的に不活性化されたＤＮＡポリメ
ラーゼが使用される。
【００７０】そのような可逆的に不活性化されたＤＮＡ
ポリメラーゼの例は、ＡｍｐｌｉＴａｑTM ＧＯＬＤで
ある（レビューのためには、Ｂｉｒｃｈなど．，１９９
６，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４４５〜４４６を参照のこ
と）。非特異的増幅はまた、アメリカ特許第５，４１
８，１４９号に記載されるように、増幅の初期の高温段
階の前に形成される延長生成物を酵素的に変性すること
によっても減じられ得る。
ポリメラーゼの例は、ＡｍｐｌｉＴａｑTM ＧＯＬＤで
ある（レビューのためには、Ｂｉｒｃｈなど．，１９９
６，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４４５〜４４６を参照のこ
と）。非特異的増幅はまた、アメリカ特許第５，４１
８，１４９号に記載されるように、増幅の初期の高温段
階の前に形成される延長生成物を酵素的に変性すること
によっても減じられ得る。
【００７１】ポリメラーゼ鎖反応は好ましい増幅方法で
あるけれども、サンプルにおける標的配列の増幅は、い
づれかの既知の方法、たとえばリガーゼ鎖反応（Ｗｕ
ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ １９８８，Ｇｅｎｏｎｉｃｓ
４：５６０〜５６９）、ＴＡＳ増幅システム（Ｋｗｏ
ｈなど．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７）、及び自
立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉなど．，１９９０，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
７：１８７４〜１８７８；及びＷＯ９２／０８８００）
により達成され得、ここでそれらの個々は、標的配列が
検出され得るよう十分な増幅を提供する。
あるけれども、サンプルにおける標的配列の増幅は、い
づれかの既知の方法、たとえばリガーゼ鎖反応（Ｗｕ
ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ １９８８，Ｇｅｎｏｎｉｃｓ
４：５６０〜５６９）、ＴＡＳ増幅システム（Ｋｗｏ
ｈなど．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３〜１１７７）、及び自
立した配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉなど．，１９９０，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
７：１８７４〜１８７８；及びＷＯ９２／０８８００）
により達成され得、ここでそれらの個々は、標的配列が
検出され得るよう十分な増幅を提供する。
【００７２】他方、検出できるレベルにプローブを増幅
する方法、たとえばＯβ−レプリカーゼ増幅法（Ｋｒａ
ｍｅｒ ａｎｄ Ｌｉｚａｒｄｉ，１９８９，Ｎａｔｕ
ｒｅ３３９：４０１〜４０２及びＬｏｍｅｌｉなど．，
１９８９，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６〜１８
３１）が使用され得る。既知の増幅方法のレビューは、
Ａｂｒａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ４：４１〜４７に提供される。
する方法、たとえばＯβ−レプリカーゼ増幅法（Ｋｒａ
ｍｅｒ ａｎｄ Ｌｉｚａｒｄｉ，１９８９，Ｎａｔｕ
ｒｅ３３９：４０１〜４０２及びＬｏｍｅｌｉなど．，
１９８９，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６〜１８
３１）が使用され得る。既知の増幅方法のレビューは、
Ａｂｒａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ４：４１〜４７に提供される。
【００７３】サンプルに存在するＡＢＯ対立遺伝子は、
配列特異的増幅により、又は対立遺伝子の領域をまず増
幅し、そして次に、増幅された領域の配列を分析するこ
とにより存在するヌクレオチド配列を同定することによ
って同定され得る。配列分析は、増幅された核酸に見出
される配列変動を識別できるいづれかの手段により行な
われ得る。配列分析は好ましくは、本発明の方法のオリ
ゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション
により実施されるが、但し、他の方法、たとえば増幅さ
れた核酸の直接的な配列決定及びゲル電気泳動による移
動度の変化の検出が使用され得る。
配列特異的増幅により、又は対立遺伝子の領域をまず増
幅し、そして次に、増幅された領域の配列を分析するこ
とにより存在するヌクレオチド配列を同定することによ
って同定され得る。配列分析は、増幅された核酸に見出
される配列変動を識別できるいづれかの手段により行な
われ得る。配列分析は好ましくは、本発明の方法のオリ
ゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション
により実施されるが、但し、他の方法、たとえば増幅さ
れた核酸の直接的な配列決定及びゲル電気泳動による移
動度の変化の検出が使用され得る。
【００７４】サンプルにおける標的核酸配列とプローブ
との間に形成されるハイブリッドを検出するための適切
なアッセイ型は、当業界において知られておりドット−
ブロット型及び固定されたプローブアッセイ型、たとえ
ば逆ドット−ブロットアッセイを包含する。ドットブロ
ット及び逆ドットブロットアッセイ型は、アメリカ特許
第５，３１０，８９３号；第５，４５１，５１２号；及
び第５，４６８，６１３号に記載されている。
との間に形成されるハイブリッドを検出するための適切
なアッセイ型は、当業界において知られておりドット−
ブロット型及び固定されたプローブアッセイ型、たとえ
ば逆ドット−ブロットアッセイを包含する。ドットブロ
ット及び逆ドットブロットアッセイ型は、アメリカ特許
第５，３１０，８９３号；第５，４５１，５１２号；及
び第５，４６８，６１３号に記載されている。
【００７５】ドット−ブロット型においては、増幅され
た標的ＤＮＡが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固
定される。膜−標的複合体は適切なハイブリダイゼーシ
ョン条件下でラベルされたプローブと共にインキュベー
トされ、ハイブリダイズされていないプローブは適切な
緊縮条件下で洗浄することによって除去され、そして膜
が結合されたプローブの存在についてモニターされる。
好ましいドット−ブロット検出アッセイは、例に記載さ
れる。
た標的ＤＮＡが固体支持体、たとえばナイロン膜上に固
定される。膜−標的複合体は適切なハイブリダイゼーシ
ョン条件下でラベルされたプローブと共にインキュベー
トされ、ハイブリダイズされていないプローブは適切な
緊縮条件下で洗浄することによって除去され、そして膜
が結合されたプローブの存在についてモニターされる。
好ましいドット−ブロット検出アッセイは、例に記載さ
れる。
【００７６】逆ドット−ブロット型においては、プロー
ブが固体支持体；たとえばナイロン膜又はマイクロタイ
タープレート上に固定される。標的ＤＮＡが、典型的に
は、ラベルされたプライマーの導入による増幅の間、ラ
ベルされる。プライマーの１つ又は両者がラベルされ得
る。膜−プローブ複合体は、適切なハイブリダイゼーシ
ョン条件下でラベルされた増幅された標的ＤＮＡと共に
インキュベートされ、ハイブリダイズされていない標的
ＤＮＡが適切な緊縮条件下で洗浄することによって除去
され、そして膜が結合された標的ＤＮＡの存在について
モニターされる。
ブが固体支持体；たとえばナイロン膜又はマイクロタイ
タープレート上に固定される。標的ＤＮＡが、典型的に
は、ラベルされたプライマーの導入による増幅の間、ラ
ベルされる。プライマーの１つ又は両者がラベルされ得
る。膜−プローブ複合体は、適切なハイブリダイゼーシ
ョン条件下でラベルされた増幅された標的ＤＮＡと共に
インキュベートされ、ハイブリダイズされていない標的
ＤＮＡが適切な緊縮条件下で洗浄することによって除去
され、そして膜が結合された標的ＤＮＡの存在について
モニターされる。
【００７７】５’−ヌクレアーゼアッセイとして言及さ
れるもう１つの適切なアッセイは、アメリカ特許第５，
２１０，０１５号及びＨｏｌｌａｎｄなど．，１９９
１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：７２７６〜７２８０に記載されており、ここでラ
ベルされた検出プローブはＰＣＲ増幅工程の間に添加さ
れる。プローブは、ＤＮＡ合成のためのプライマーとし
て作用することからプローブを妨げるために変性され
る。個々の合成段階の間、すなわちプライマー伸張の
間、標的ＤＮＡにハイブリダイズするいづれかのプロー
ブが、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性に
より変性される。
れるもう１つの適切なアッセイは、アメリカ特許第５，
２１０，０１５号及びＨｏｌｌａｎｄなど．，１９９
１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：７２７６〜７２８０に記載されており、ここでラ
ベルされた検出プローブはＰＣＲ増幅工程の間に添加さ
れる。プローブは、ＤＮＡ合成のためのプライマーとし
て作用することからプローブを妨げるために変性され
る。個々の合成段階の間、すなわちプライマー伸張の
間、標的ＤＮＡにハイブリダイズするいづれかのプロー
ブが、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性に
より変性される。
【００７８】次に、プローブからの変性生成物が検出さ
れる。従って、プローブ変性生成物の存在は、プローブ
と標的ＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーションが生
じ、そして増幅反応が生じたことを示唆する。上記 '０
１５特許の方法においてプローブとして機能するよう変
性されたオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内であ
る。増幅による汚染を生じるプローブの変性を検出する
ための方法は、 '０１５特許及びアメリカ特許第５，４
９１，０６３号及び第５，５７１，６７３号に記載され
ている。
れる。従って、プローブ変性生成物の存在は、プローブ
と標的ＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーションが生
じ、そして増幅反応が生じたことを示唆する。上記 '０
１５特許の方法においてプローブとして機能するよう変
性されたオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内であ
る。増幅による汚染を生じるプローブの変性を検出する
ための方法は、 '０１５特許及びアメリカ特許第５，４
９１，０６３号及び第５，５７１，６７３号に記載され
ている。
【００７９】上記アッセイ型は、ハイブリッド複合体の
検出を促進するためにラベルされたオリゴヌクレオチド
を典型的には利用する。オリゴヌクレオチドは、分光、
光化学、生化学、免疫化学又は化学手段により検出可能
なラベルを導入することによりラベルされ得る。有用な
ラベルは、32Ｐ、螢光染料、電子−濃試薬、酵素（通
常、ＥＬＩＳＡＳに使用されるような）、ビオチン又は
ハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用で
きるタンパク質を包含する。本発明のラベルされたオリ
ゴヌクレオチドは合成され得、そしてオリゴヌクレオチ
ドを合成するために上記技法を用いてラベルされ得る。
検出を促進するためにラベルされたオリゴヌクレオチド
を典型的には利用する。オリゴヌクレオチドは、分光、
光化学、生化学、免疫化学又は化学手段により検出可能
なラベルを導入することによりラベルされ得る。有用な
ラベルは、32Ｐ、螢光染料、電子−濃試薬、酵素（通
常、ＥＬＩＳＡＳに使用されるような）、ビオチン又は
ハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用で
きるタンパク質を包含する。本発明のラベルされたオリ
ゴヌクレオチドは合成され得、そしてオリゴヌクレオチ
ドを合成するために上記技法を用いてラベルされ得る。
【００８０】本発明の好ましい態様においては、ドット
−ブロットアッセイは、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃ
ｈａｎｇ，１９８９，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓなど．，ｅｄｓ．，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），
９９〜１１２ページに記載されるように、ビオチンによ
りラベルされたプローブを用いて実施される。配列特異
的条件下でビオチニル化されたプローブによる固定され
た標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションに続いて、結合
したまま存続するプローブが、まずアビジン−ホースラ
ディシュペルオキシダーゼ（Ａ−ＨＲＰ）又はストレプ
トアビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＳＡ
−ＨＲＰ）にビオチンに結合し、次にＨＲＰがクロモゲ
ンの色の変化を触媒する反応を実施することによって検
出される。
−ブロットアッセイは、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃ
ｈａｎｇ，１９８９，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓなど．，ｅｄｓ．，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），
９９〜１１２ページに記載されるように、ビオチンによ
りラベルされたプローブを用いて実施される。配列特異
的条件下でビオチニル化されたプローブによる固定され
た標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションに続いて、結合
したまま存続するプローブが、まずアビジン−ホースラ
ディシュペルオキシダーゼ（Ａ−ＨＲＰ）又はストレプ
トアビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＳＡ
−ＨＲＰ）にビオチンに結合し、次にＨＲＰがクロモゲ
ンの色の変化を触媒する反応を実施することによって検
出される。
【００８１】配列特異的増幅に基づくＡＢＯ型決定の他
の方法においては、特定の配列の存在の同定は、増幅さ
れた標的配列の存在又は不在の検出のみを必要とする。
増幅された標的配列の検出方法は当業界において良く知
られている。たとえば、ゲル電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋなど．，１９８９、前記を参照のこと）及び上記プロ
ーブハイブリダイゼーションアッセイは、核酸の存在を
検出するために広く使用されて来た。
の方法においては、特定の配列の存在の同定は、増幅さ
れた標的配列の存在又は不在の検出のみを必要とする。
増幅された標的配列の検出方法は当業界において良く知
られている。たとえば、ゲル電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋなど．，１９８９、前記を参照のこと）及び上記プロ
ーブハイブリダイゼーションアッセイは、核酸の存在を
検出するために広く使用されて来た。
【００８２】反応混合物における二本鎖ＤＮＡの合計量
の上昇をモニターすることにより核酸の増幅を検出する
ための他の方法は、Ｈｉｇｕｃｈｉなど．，１９９２，
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３〜４１
７；Ｈｉｇｕｃｈｉなど．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６〜１０３０；及びヨー
ロッパ特許公開第４８７，２１８号及び第５１２，３３
４号に記載されている。二本鎖の標的ＤＮＡの検出は、
臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合ラベル
が、二本鎖ＤＮＡに結合される場合を示す高められた螢
光に依存する。標的配列の合成に起因する二本鎖ＤＮＡ
の上昇は、螢光の検出できる上昇をもたらす。
の上昇をモニターすることにより核酸の増幅を検出する
ための他の方法は、Ｈｉｇｕｃｈｉなど．，１９９２，
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３〜４１
７；Ｈｉｇｕｃｈｉなど．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６〜１０３０；及びヨー
ロッパ特許公開第４８７，２１８号及び第５１２，３３
４号に記載されている。二本鎖の標的ＤＮＡの検出は、
臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合ラベル
が、二本鎖ＤＮＡに結合される場合を示す高められた螢
光に依存する。標的配列の合成に起因する二本鎖ＤＮＡ
の上昇は、螢光の検出できる上昇をもたらす。
【００８３】本発明のオリゴヌクレオチドがサンプル中
のＡＢＯ対立遺伝子配列に選択的にハイブリダイズする
ことを決定するための方法が何人であっても、型決定方
法の中心的特徴は、存在する変異配列を検出することに
よるサンプルに存在するＡＢＯ対立遺伝子の同定を包含
する。プローブがパネルにおいて使用される特定の適用
が使用される。たとえば、特定の対立遺伝子の存在又は
不在のみが興味あるものである場合、特定の対立遺伝子
に対して特異的な１つのプローブが適切である。
のＡＢＯ対立遺伝子配列に選択的にハイブリダイズする
ことを決定するための方法が何人であっても、型決定方
法の中心的特徴は、存在する変異配列を検出することに
よるサンプルに存在するＡＢＯ対立遺伝子の同定を包含
する。プローブがパネルにおいて使用される特定の適用
が使用される。たとえば、特定の対立遺伝子の存在又は
不在のみが興味あるものである場合、特定の対立遺伝子
に対して特異的な１つのプローブが適切である。
【００８４】個々の対立遺伝子をユニークに同定するよ
りもむしろ、対立遺伝子のクラスを同定する配列−特異
的プローブの組が選択され得ることは当業者に明白であ
ろう。いくつかの用途においては、すべての対立遺伝子
の同定は必要ではない。たとえば、本発明の方法は、血
清学的方法により区別できない対立遺伝子変異体を検出
するために使用され得る。しかしながら、血清学的タイ
プのみが検出される予定である用途においては、個々の
血清学的タイプに対応する対立遺伝子の組の間を区別す
るが、しかし個々の血清学的タイプ内の対立遺伝子間を
区別しない１組のプローブを使用することが所望され
る。そのような１組のプローブの使用は、必要とされる
プローブの数の有意な低下を可能にすることができる。
りもむしろ、対立遺伝子のクラスを同定する配列−特異
的プローブの組が選択され得ることは当業者に明白であ
ろう。いくつかの用途においては、すべての対立遺伝子
の同定は必要ではない。たとえば、本発明の方法は、血
清学的方法により区別できない対立遺伝子変異体を検出
するために使用され得る。しかしながら、血清学的タイ
プのみが検出される予定である用途においては、個々の
血清学的タイプに対応する対立遺伝子の組の間を区別す
るが、しかし個々の血清学的タイプ内の対立遺伝子間を
区別しない１組のプローブを使用することが所望され
る。そのような１組のプローブの使用は、必要とされる
プローブの数の有意な低下を可能にすることができる。
【００８５】本発明の方法によるＡＢＯ対立遺伝子のＤ
ＮＡ型決定は、血液バンク及び個人の同定のために血液
型決定を包含する多くの異なった目的のために有用であ
る。たとえば、ＤＮＡ型決定法は、犯罪者又は犠牲者の
同定が犯罪の現場で放置された出来事と個人とを連結す
ることによって確立される場合のように犯罪を解決する
ために、又は生物学的物質が個人の母性又は父性を決定
するために使用される場合のように非犯罪性質の他の論
点を解決するために、個人の同定の重要な分野において
有意な役割を演じる（たとえば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ａ
ｎｄ Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ １９９１，Ａｎａｌ．Ｃ
ｈｅｍ．６３：２〜１５を参照のこと）。
ＮＡ型決定は、血液バンク及び個人の同定のために血液
型決定を包含する多くの異なった目的のために有用であ
る。たとえば、ＤＮＡ型決定法は、犯罪者又は犠牲者の
同定が犯罪の現場で放置された出来事と個人とを連結す
ることによって確立される場合のように犯罪を解決する
ために、又は生物学的物質が個人の母性又は父性を決定
するために使用される場合のように非犯罪性質の他の論
点を解決するために、個人の同定の重要な分野において
有意な役割を演じる（たとえば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ａ
ｎｄ Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ １９９１，Ａｎａｌ．Ｃ
ｈｅｍ．６３：２〜１５を参照のこと）。
【００８６】ＤＮＡ遺伝子型アッセイの識別力は、遺伝
子座で見出される対立遺伝子の数及び頻度に依存する。
新規に発見された対立遺伝子を決定するために本明細書
に提供される方法及び試薬と共に、前に定義されたＯ対
立遺伝子を再分割する追加のＡＢＯ遺伝子座多型現象の
発見は、ＡＢＯ ＤＮＡ型決定アッセイの識別力を実質
的に改良し、そしてそれにより、個人の同定のためへの
その利用性を改良する。
子座で見出される対立遺伝子の数及び頻度に依存する。
新規に発見された対立遺伝子を決定するために本明細書
に提供される方法及び試薬と共に、前に定義されたＯ対
立遺伝子を再分割する追加のＡＢＯ遺伝子座多型現象の
発見は、ＡＢＯ ＤＮＡ型決定アッセイの識別力を実質
的に改良し、そしてそれにより、個人の同定のためへの
その利用性を改良する。
【００８７】本発明はまた、本発明の方法を実施するた
めの有用な成分を含んで成るキット、複数容器ユニット
にも関する。有用なキットは、ＡＢＯ対立遺伝子に対し
て特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含むことがで
きる。多くの場合、プローブは適切な支持体膜上に固定
され得る。キットはまた、本発明の好ましい態様におい
て有用であるＰＣＲ増幅のためのプライマーも含むこと
ができる。それらのプライマーは、ＡＢＯ対立遺伝子の
多型領域を増幅するであろう。
めの有用な成分を含んで成るキット、複数容器ユニット
にも関する。有用なキットは、ＡＢＯ対立遺伝子に対し
て特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含むことがで
きる。多くの場合、プローブは適切な支持体膜上に固定
され得る。キットはまた、本発明の好ましい態様におい
て有用であるＰＣＲ増幅のためのプライマーも含むこと
ができる。それらのプライマーは、ＡＢＯ対立遺伝子の
多型領域を増幅するであろう。
【００８８】キットの他の任意の成分は、たとえばプラ
イマー伸張生成物の合成を触媒するための剤、基質のヌ
クレオシド三リン酸、ラベルするために使用される手段
（たとえば、アビジン−酵素接合体及び酵素基質及びラ
ベルがビオチンである場合、クロモゲン）、ＰＣＲ又は
ハイブリダイゼーション反応のための適切な緩衝液、及
び本発明を実施するための説明を包含する。
イマー伸張生成物の合成を触媒するための剤、基質のヌ
クレオシド三リン酸、ラベルするために使用される手段
（たとえば、アビジン−酵素接合体及び酵素基質及びラ
ベルがビオチンである場合、クロモゲン）、ＰＣＲ又は
ハイブリダイゼーション反応のための適切な緩衝液、及
び本発明を実施するための説明を包含する。
【００８９】下記に示される本発明の例は、例示的のた
めのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
特許請求の範囲内の発明の多くの態様は、前述のテキス
ト及び続く例を読む当業者に明らかであろう。
めのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
特許請求の範囲内の発明の多くの態様は、前述のテキス
ト及び続く例を読む当業者に明らかであろう。
【００９０】
【実施例】例１ ．ＡＢＯ増幅 ヒトゲノムＤＮＡサンプルからのＡＢＯグリコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子の領域の増幅が下記に記載されて
いる。
ンスフェラーゼ遺伝子の領域の増幅が下記に記載されて
いる。
【００９１】増幅プライマー 本発明に記載される多型部位含む、配列番号１のヌクレ
オチド２−１６１に対応するＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子の領域の増幅を、下記に示されるプラ
イマーを用いて実施した。 GZ23 配列番号２ 5'-ATGTGGGTGGCACCCTGC GZ21 配列番号３ 5'-GGTGGTGTTCTGGAGCCTGAA
オチド２−１６１に対応するＡＢＯグリコシルトランス
フェラーゼ遺伝子の領域の増幅を、下記に示されるプラ
イマーを用いて実施した。 GZ23 配列番号２ 5'-ATGTGGGTGGCACCCTGC GZ21 配列番号３ 5'-GGTGGTGTTCTGGAGCCTGAA
【００９２】上流のプライマーＧＺ２３（配列番号２）
は、配列番号１の位置２〜１９でイントロンの領域にハ
イブリダイズする。下流のプライマーＧＺ２１（配列番
号３）は、配列番号１の位置１４１〜１６１でコード配
列の領域にハイブリダイズする。一緒に、それらのプラ
イマーは、Ｏ対立遺伝子からの１６０個のヌクレオチド
生成物及びＡ及びＢ対立遺伝子からのその対応する１６
１個のヌクレオチド生成物の増幅を触媒する。両プライ
マーハイブリダイゼーション領域は、ＡＢＯ対立遺伝子
間に保存される。従って、プライマーは、同じ条件下で
個々のＡＢＯ対立遺伝子からの核酸配列の増幅を可能に
する。
は、配列番号１の位置２〜１９でイントロンの領域にハ
イブリダイズする。下流のプライマーＧＺ２１（配列番
号３）は、配列番号１の位置１４１〜１６１でコード配
列の領域にハイブリダイズする。一緒に、それらのプラ
イマーは、Ｏ対立遺伝子からの１６０個のヌクレオチド
生成物及びＡ及びＢ対立遺伝子からのその対応する１６
１個のヌクレオチド生成物の増幅を触媒する。両プライ
マーハイブリダイゼーション領域は、ＡＢＯ対立遺伝子
間に保存される。従って、プライマーは、同じ条件下で
個々のＡＢＯ対立遺伝子からの核酸配列の増幅を可能に
する。
【００９３】増幅 個々のＰＣＲ増幅を、１００μｌの合計反応体積で実施
した。最終試薬濃度は次の通りであった： ２ngの精製されたヒトゲノムＤＮＡ ２００nMの個々のプライマー ２００μＭの個々のｄＮＴＰ ５０mMのＫＣｌ １０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８．３ ２．５mMのＭｇＣｌ2 ２．５単位のＴａｑ ＤＮポリメラーゼ* * Ｈｏｆｔｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅｒより開発さ
れ、そして製造され、そしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。
した。最終試薬濃度は次の通りであった： ２ngの精製されたヒトゲノムＤＮＡ ２００nMの個々のプライマー ２００μＭの個々のｄＮＴＰ ５０mMのＫＣｌ １０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８．３ ２．５mMのＭｇＣｌ2 ２．５単位のＴａｑ ＤＮポリメラーゼ* * Ｈｏｆｔｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅｒより開発さ
れ、そして製造され、そしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。
【００９４】増幅反応を、３２回の増幅サイクル（変
性、アニール及び拡張）、続く最終インキュベーション
（維持）をプログラムされた、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）により市販されるＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８０において行なっ
た。試薬の蒸発を排除するために、２滴の鉱物油を個々
の管に添加した。使用される特定温度サイクリングプロ
フィールは下記に示される。
性、アニール及び拡張）、続く最終インキュベーション
（維持）をプログラムされた、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）により市販されるＤＮＡ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８０において行なっ
た。試薬の蒸発を排除するために、２滴の鉱物油を個々
の管に添加した。使用される特定温度サイクリングプロ
フィールは下記に示される。
【００９５】
【００９６】ゲル電気泳動検出 増幅されたＤＮＡを、増幅が生じるかどうかを決定する
ためにアガロースゲル電気泳動により検出した。アガロ
ースゲル（１００mlの３％ ＮｕＳｉｅｖｅ及び１．５
％ ＳｅａＣｈｅｍ）及び０．５× ＴＢＥ（０．０４
５Ｍのトリス−硼酸塩及び０．００１Ｍの二ナトリウム
ＥＤＴＡ）緩衝液を使用した。臭化エチジウム（０．５
μｇ／ml）を、ゲル及び緩衝液の両者に添加した。電気
泳動を１００ボルトで約１時間、行なった。ゲルを水に
よりすばやく脱色し、そしてＤＮＡの臭化エチジウム染
色バンドをＵＶ照射を用いて可視化した。ゲル電気泳動
分析は、ヒトゲノムＤＮＡを含むサンプルからの標的の
核酸配列の成功した増幅を確認した。
ためにアガロースゲル電気泳動により検出した。アガロ
ースゲル（１００mlの３％ ＮｕＳｉｅｖｅ及び１．５
％ ＳｅａＣｈｅｍ）及び０．５× ＴＢＥ（０．０４
５Ｍのトリス−硼酸塩及び０．００１Ｍの二ナトリウム
ＥＤＴＡ）緩衝液を使用した。臭化エチジウム（０．５
μｇ／ml）を、ゲル及び緩衝液の両者に添加した。電気
泳動を１００ボルトで約１時間、行なった。ゲルを水に
よりすばやく脱色し、そしてＤＮＡの臭化エチジウム染
色バンドをＵＶ照射を用いて可視化した。ゲル電気泳動
分析は、ヒトゲノムＤＮＡを含むサンプルからの標的の
核酸配列の成功した増幅を確認した。
【００９７】例２．ドットブロット型におけるプローブ
ハイブリダイゼーションアッセイ プローブハイブリダイゼーションを、ゲノム核酸のサン
プルに存在する対立遺伝子を検出するためにドットブロ
ット型で行なった。ドットブロット型において、小量の
増幅された核酸を変性し、ナイロンフィルターに適用
し、そして下記のようにして固定した。次に、フィルタ
ーを、ラベルされたプローブを含む溶液に含浸し、ハイ
ブリダイゼーションの発生を可能にした。
ハイブリダイゼーションアッセイ プローブハイブリダイゼーションを、ゲノム核酸のサン
プルに存在する対立遺伝子を検出するためにドットブロ
ット型で行なった。ドットブロット型において、小量の
増幅された核酸を変性し、ナイロンフィルターに適用
し、そして下記のようにして固定した。次に、フィルタ
ーを、ラベルされたプローブを含む溶液に含浸し、ハイ
ブリダイゼーションの発生を可能にした。
【００９８】結合されていないプローブを配列特異的ハ
イブリダイゼーション条件下で洗浄することによって除
去し、そして固定された標的核酸に結合されるプローブ
を検出した。ハイブリダイゼーションに使用されるプロ
ーブを、Ｌｅｖｅｎｓｏｎａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９８
９，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
（Ｉｎｎｉｓなど．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），９２〜１１２ページ
に記載のようにしてビオチンによりラベルし、非アイソ
トープ検出を可能にした。このアッセイの詳細は下記に
示される。
イブリダイゼーション条件下で洗浄することによって除
去し、そして固定された標的核酸に結合されるプローブ
を検出した。ハイブリダイゼーションに使用されるプロ
ーブを、Ｌｅｖｅｎｓｏｎａｎｄ Ｃｈａｎｇ，１９８
９，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅｔｏ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
（Ｉｎｎｉｓなど．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ），９２〜１１２ページ
に記載のようにしてビオチンによりラベルし、非アイソ
トープ検出を可能にした。このアッセイの詳細は下記に
示される。
【００９９】検出プローブ 増幅されたＡＢＯ核酸に存在する対立遺伝子配列変異体
を同定するために使用されるプローブを下記に記載す
る。多型部位にハイブリダイズするプローブ配列内の特
定のヌクレオチドは下線が引かれている。表１に示され
る核酸鎖にハイブリダイズするプローブは星印により示
され；他のすべてのプローブは表１に示される鎖の補体
にハイブリダイズする。すべてのプローブオリゴヌクレ
オチドは、５’から３’の方向で示される。
を同定するために使用されるプローブを下記に記載す
る。多型部位にハイブリダイズするプローブ配列内の特
定のヌクレオチドは下線が引かれている。表１に示され
る核酸鎖にハイブリダイズするプローブは星印により示
され；他のすべてのプローブは表１に示される鎖の補体
にハイブリダイズする。すべてのプローブオリゴヌクレ
オチドは、５’から３’の方向で示される。
【０１００】配列番号１の位置２９での多型部位で存在
する塩基対を、プローブＧＺ２６（配列番号４）及びＧ
Ｚ２７（配列番号５）を用いて同定した。それらのプロ
ーブのハイブリダイズする領域はまた、多型位置３２及
び３３も包含する。プローブＧＺ２６（配列番号４）
は、位置２９及び３２でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３で
Ｃ：Ｇ塩基対を有するＯ1 対立遺伝子に対して特異的で
ある。プローブＧＺ２７（配列番号５）は、位置２９で
Ｇ：Ｃ塩基対、位置３２でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３で
Ｃ：Ｇ塩基対のすべてを有するＯ2 ，Ａ及びＢ1 対立遺
伝子に対して特異的である。プローブは、位置３２で
Ｇ：Ｃ塩基対を有するＢ2 対立遺伝子又は位置３３で
Ｔ：Ａ塩基対を有するＯ4 対立遺伝子にハイブリダイズ
しない。 GZ26 （配列番号４） ５’−ＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＣＡＣ GZ27* （配列番号５） ５’−ＣＧＴＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡ
する塩基対を、プローブＧＺ２６（配列番号４）及びＧ
Ｚ２７（配列番号５）を用いて同定した。それらのプロ
ーブのハイブリダイズする領域はまた、多型位置３２及
び３３も包含する。プローブＧＺ２６（配列番号４）
は、位置２９及び３２でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３で
Ｃ：Ｇ塩基対を有するＯ1 対立遺伝子に対して特異的で
ある。プローブＧＺ２７（配列番号５）は、位置２９で
Ｇ：Ｃ塩基対、位置３２でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３で
Ｃ：Ｇ塩基対のすべてを有するＯ2 ，Ａ及びＢ1 対立遺
伝子に対して特異的である。プローブは、位置３２で
Ｇ：Ｃ塩基対を有するＢ2 対立遺伝子又は位置３３で
Ｔ：Ａ塩基対を有するＯ4 対立遺伝子にハイブリダイズ
しない。 GZ26 （配列番号４） ５’−ＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＣＡＣ GZ27* （配列番号５） ５’−ＣＧＴＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡ
【０１０１】Ａ及びＢ対立遺伝子とＯ対立遺伝子とを区
別するために、Ａ及びＢ対立遺伝子とＯ対立遺伝子とを
区別する追加のＧ：Ｃ塩基対の位置を包含するＡＢＯグ
リコシルトランスフェラーゼ遺伝子の領域にハイブリダ
イズするプローブを用いた。プローブＧＺ２９（配列番
号６）はＯ対立遺伝子に対して特異的である。プローブ
ＧＺ３０（配列番号７）は、配列番号１の位置７７と７
８との間の位置に対応する追加のＧ：Ｃ塩基対を有する
Ａ及びＢ対立遺伝子に対して特異的である。 GZ29 （配列番号６） ＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧ GZ30 （配列番号７） ＧＴＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧ
別するために、Ａ及びＢ対立遺伝子とＯ対立遺伝子とを
区別する追加のＧ：Ｃ塩基対の位置を包含するＡＢＯグ
リコシルトランスフェラーゼ遺伝子の領域にハイブリダ
イズするプローブを用いた。プローブＧＺ２９（配列番
号６）はＯ対立遺伝子に対して特異的である。プローブ
ＧＺ３０（配列番号７）は、配列番号１の位置７７と７
８との間の位置に対応する追加のＧ：Ｃ塩基対を有する
Ａ及びＢ対立遺伝子に対して特異的である。 GZ29 （配列番号６） ＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧ GZ30 （配列番号７） ＧＴＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧ
【０１０２】配列番号１の位置１１３での多型部位で存
在するヌクレオチドを、プローブＧＺ３３（配列番号
８）及びＧＺ３４（配列番号９）を用いて同定した。プ
ローブＧＺ３３（配列番号８）は位置１１３でＡ：Ｔ塩
基対を有するＯ2 及びＡ対立遺伝子に対して特異的であ
る。プローブＧＺ３４（配列番号８）は、位置１１３で
Ｇ：Ｃ塩基対を有するＯ1 ，Ｏ3 ，Ｏ4 及びＢ対立遺伝
子に対して特異的である。 GZ33 （配列番号８） ＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴ GZ34* （配列番号９） ＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＣＴＣ
在するヌクレオチドを、プローブＧＺ３３（配列番号
８）及びＧＺ３４（配列番号９）を用いて同定した。プ
ローブＧＺ３３（配列番号８）は位置１１３でＡ：Ｔ塩
基対を有するＯ2 及びＡ対立遺伝子に対して特異的であ
る。プローブＧＺ３４（配列番号８）は、位置１１３で
Ｇ：Ｃ塩基対を有するＯ1 ，Ｏ3 ，Ｏ4 及びＢ対立遺伝
子に対して特異的である。 GZ33 （配列番号８） ＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴ GZ34* （配列番号９） ＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＧＴＧＣＣＣＴＣ
【０１０３】下記例３は、対立遺伝子を本明細書に記載
される７個の対立遺伝子のサブセットに分類するために
上記６個のプローブの組の使用を記載する。すべての対
立遺伝子は、Ｏ1 ，Ｏ2 ，Ａ及びＢ対立遺伝子として分
類された。例３に記載される遺伝子型決定が行なわれる
時点で、Ｏ1 ，Ｏ2 ，Ａ及びＢ対立遺伝子のみが観察さ
れた。追加の対立遺伝子の存在は、予期しないハイブリ
ダイゼーション結果の発生により示された。続く配列決
定は、Ｂ対立遺伝子を再分割する位置３２での多型現
象、Ｏ4 対立遺伝子を同定する位置３３での多型現象、
及びＯ3 対立遺伝子を同定する位置２９及び１１３での
塩基対の組合せの発見を導びいた。
される７個の対立遺伝子のサブセットに分類するために
上記６個のプローブの組の使用を記載する。すべての対
立遺伝子は、Ｏ1 ，Ｏ2 ，Ａ及びＢ対立遺伝子として分
類された。例３に記載される遺伝子型決定が行なわれる
時点で、Ｏ1 ，Ｏ2 ，Ａ及びＢ対立遺伝子のみが観察さ
れた。追加の対立遺伝子の存在は、予期しないハイブリ
ダイゼーション結果の発生により示された。続く配列決
定は、Ｂ対立遺伝子を再分割する位置３２での多型現
象、Ｏ4 対立遺伝子を同定する位置３３での多型現象、
及びＯ3 対立遺伝子を同定する位置２９及び１１３での
塩基対の組合せの発見を導びいた。
【０１０４】Ｂ2 ，Ｏ3 及びＯ4 対立遺伝子は比較的通
常ではないので、Ｏ1 ，Ｏ2 ，Ａ又はＢ対立遺伝子とし
て対立遺伝子を分類することがまだ所望される。位置３
２及び３３での多型現象が検出されない場合、Ｂ対立遺
伝子のサブタイプは区別されず、そしてＯ4 はＯ1 対立
遺伝子と区別されないが、しかしＯ3 対立遺伝子はまだ
区別される。プローブハイブリダイゼーションによる位
置２９，７７〜７８（欠失）及び１１３での多型現象の
みの検出はすべての二倍体遺伝子型の同定を可能にする
が、但し、Ｏ3 ，Ａ、及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型は同一の
ハイブリダイゼーション結果を与える。
常ではないので、Ｏ1 ，Ｏ2 ，Ａ又はＢ対立遺伝子とし
て対立遺伝子を分類することがまだ所望される。位置３
２及び３３での多型現象が検出されない場合、Ｂ対立遺
伝子のサブタイプは区別されず、そしてＯ4 はＯ1 対立
遺伝子と区別されないが、しかしＯ3 対立遺伝子はまだ
区別される。プローブハイブリダイゼーションによる位
置２９，７７〜７８（欠失）及び１１３での多型現象の
みの検出はすべての二倍体遺伝子型の同定を可能にする
が、但し、Ｏ3 ，Ａ、及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型は同一の
ハイブリダイゼーション結果を与える。
【０１０５】すべての７個の対立遺伝子が区別される遺
伝子型決定を、上記プローブの他に、位置３２及び３３
に存在する塩基対を同定するために追加のプローブを用
いて行な得る。位置２９，３２及び３３での多型部位の
近接性のために、存在する塩基対を、位置２９〜３３を
包含する領域にハイブリダイズし、そして位置２９，３
２及び３３に存在する塩基対の特異的パターンを検出す
るプローブを用いて検出することができる。すべての対
立遺伝子は位置２９〜３３を包含する領域内に４種の配
列バリアントの１つを含むので、位置２９〜３３を包含
し、そして個別の配列バリアントにハイブリダイズする
個々の４つのプローブは、個々の対立遺伝子において位
置２９，３２及び３３で存在する塩基対を決定するため
に十分である。
伝子型決定を、上記プローブの他に、位置３２及び３３
に存在する塩基対を同定するために追加のプローブを用
いて行な得る。位置２９，３２及び３３での多型部位の
近接性のために、存在する塩基対を、位置２９〜３３を
包含する領域にハイブリダイズし、そして位置２９，３
２及び３３に存在する塩基対の特異的パターンを検出す
るプローブを用いて検出することができる。すべての対
立遺伝子は位置２９〜３３を包含する領域内に４種の配
列バリアントの１つを含むので、位置２９〜３３を包含
し、そして個別の配列バリアントにハイブリダイズする
個々の４つのプローブは、個々の対立遺伝子において位
置２９，３２及び３３で存在する塩基対を決定するため
に十分である。
【０１０６】上記プローブＧＺ２６（配列番号４）及び
ＧＺ２７（配列番号５）は、４つの配列バリアントの２
つを検出する。プローブＧＺ２６（配列番号４）は、位
置２９及び３２でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３でＣ：Ｇ塩
基対を有する対立遺伝子を検出する。プローブＧＺ２７
（配列番号５）は、位置２９でＧ：Ｃ塩基対、位置３２
でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３でＣ：Ｇ塩基対を有する対
立遺伝子を検出する。下記に提供されるプローブＰ１
（配列番号１０）及びＰ２（配列番号１１）は、他の２
種のバリアントを検出する。プローブＰ１（配列番号１
０）は、位置２９でＡ：Ｔ塩基対、位置３２でＡ：Ｔ塩
基対及び位置３３でＴ：Ａ塩基対を有する対立遺伝子を
検出する。プローブＰ２（配列番号１１）は、位置２９
及び３２でＧ：Ｃ塩基対及び位置３３でＣ：Ｇ塩基対を
有する対立遺伝子を検出する。一緒に使用される場合、
それらの４種のプローブは、位置２９，３２及び３３で
存在する塩基対のすべての組合せを検出する。さらに、
上記に示される６個のプローブへのＰ１（配列番号１
０）及びＰ２（配列番号１１）の添加は、すべての７種
の対立遺伝子の遺伝子型決定を可能にする。 P1 （配列番号１０） ５’−ＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＣＧＣＡＣ P2 （配列番号１１） ５’−ＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＣ
ＧＺ２７（配列番号５）は、４つの配列バリアントの２
つを検出する。プローブＧＺ２６（配列番号４）は、位
置２９及び３２でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３でＣ：Ｇ塩
基対を有する対立遺伝子を検出する。プローブＧＺ２７
（配列番号５）は、位置２９でＧ：Ｃ塩基対、位置３２
でＡ：Ｔ塩基対及び位置３３でＣ：Ｇ塩基対を有する対
立遺伝子を検出する。下記に提供されるプローブＰ１
（配列番号１０）及びＰ２（配列番号１１）は、他の２
種のバリアントを検出する。プローブＰ１（配列番号１
０）は、位置２９でＡ：Ｔ塩基対、位置３２でＡ：Ｔ塩
基対及び位置３３でＴ：Ａ塩基対を有する対立遺伝子を
検出する。プローブＰ２（配列番号１１）は、位置２９
及び３２でＧ：Ｃ塩基対及び位置３３でＣ：Ｇ塩基対を
有する対立遺伝子を検出する。一緒に使用される場合、
それらの４種のプローブは、位置２９，３２及び３３で
存在する塩基対のすべての組合せを検出する。さらに、
上記に示される６個のプローブへのＰ１（配列番号１
０）及びＰ２（配列番号１１）の添加は、すべての７種
の対立遺伝子の遺伝子型決定を可能にする。 P1 （配列番号１０） ５’−ＡＧＣＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＣＧＣＡＣ P2 （配列番号１１） ５’−ＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＣ
【０１０７】５つの多型部位の個々で存在する塩基対を
同定するために企画された１組のプローブは、２８個の
可能な二倍体遺伝子型の２７個を検出することができ
る。Ｏ 3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型は、個々の多型部
位で存在する塩基対を独立して検出することによっては
区別され得ない。対立遺伝子が観察されたプローブハイ
ブリダイゼーションパターンに特定の塩基対を付与す
る、組合されたプローブハイブリダイゼーションパター
ンは示されないので、あいまいさが生じる。
同定するために企画された１組のプローブは、２８個の
可能な二倍体遺伝子型の２７個を検出することができ
る。Ｏ 3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型は、個々の多型部
位で存在する塩基対を独立して検出することによっては
区別され得ない。対立遺伝子が観察されたプローブハイ
ブリダイゼーションパターンに特定の塩基対を付与す
る、組合されたプローブハイブリダイゼーションパター
ンは示されないので、あいまいさが生じる。
【０１０８】Ｏ3 及びＯ2 対立遺伝子及びＡ及びＢ1 対
立遺伝子の両者は、位置１１３で存在する塩基対によっ
てのみ区別される。Ｏ3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型か
らのサンプルは、位置１１３でＧ：Ｃ塩基対を有する核
酸及び位置１１３でＡ：Ｔ塩基対を有する核酸の両者を
含む。たとえば、対立遺伝子が、多型部位が独立して分
析される場合、決定されないＡ：Ｔ塩基対を付与するそ
れらの遺伝子型を区別することは必要である。
立遺伝子の両者は、位置１１３で存在する塩基対によっ
てのみ区別される。Ｏ3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型か
らのサンプルは、位置１１３でＧ：Ｃ塩基対を有する核
酸及び位置１１３でＡ：Ｔ塩基対を有する核酸の両者を
含む。たとえば、対立遺伝子が、多型部位が独立して分
析される場合、決定されないＡ：Ｔ塩基対を付与するそ
れらの遺伝子型を区別することは必要である。
【０１０９】遺伝子型決定のあいまいさは、不明瞭なサ
ンプルに存在する対立遺伝子のサブセットのみを増幅す
るための配列特異的増幅を用いて解決され得る。たとえ
ば、Ｏ対立遺伝子とＡ及びＢ対立遺伝子を区別する追加
のＧ：Ｃ塩基対に対して特異的なプライマーを用いての
Ａ又はＢ対立遺伝子のみからの核酸の配列特異的増幅、
続く位置１１３での塩基対の検出は、Ａ及びＢ対立遺伝
子の区別を可能にする。Ｏ3 ，Ａ又はＯ2 ，Ｂ1 遺伝子
型のいづれかであることが知られているサンプルからＡ
又はＢ対立遺伝子のみの増幅及び増幅された対立遺伝子
の同定は、Ｏ3，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型の区別を可
能にする。遺伝子型決定のあいまいさを排除するためへ
の配列特異的増幅の使用は、ＷＯ９２／１０５８９に記
載されるＨＬＡ ＤＲＢ遺伝子型決定法に使用されて来
た。
ンプルに存在する対立遺伝子のサブセットのみを増幅す
るための配列特異的増幅を用いて解決され得る。たとえ
ば、Ｏ対立遺伝子とＡ及びＢ対立遺伝子を区別する追加
のＧ：Ｃ塩基対に対して特異的なプライマーを用いての
Ａ又はＢ対立遺伝子のみからの核酸の配列特異的増幅、
続く位置１１３での塩基対の検出は、Ａ及びＢ対立遺伝
子の区別を可能にする。Ｏ3 ，Ａ又はＯ2 ，Ｂ1 遺伝子
型のいづれかであることが知られているサンプルからＡ
又はＢ対立遺伝子のみの増幅及び増幅された対立遺伝子
の同定は、Ｏ3，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型の区別を可
能にする。遺伝子型決定のあいまいさを排除するためへ
の配列特異的増幅の使用は、ＷＯ９２／１０５８９に記
載されるＨＬＡ ＤＲＢ遺伝子型決定法に使用されて来
た。
【０１１０】遺伝子型決定のあいまいさは、配列番号１
の領域外のもう１つの多型部位をさらに検出することに
よって解決され得る。たとえば、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈ
ａｎｇ，１９９２、前記は、Ａ対立遺伝子に存在しない
Ｂ対立遺伝子におけるＡｌｕＩ部位をもたらすコード配
列の位置７００での多型部位を記載する。Ａ及びＢ対立
遺伝子を区別する能力は、Ｏ3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝
子型の区別を可能にする。
の領域外のもう１つの多型部位をさらに検出することに
よって解決され得る。たとえば、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈ
ａｎｇ，１９９２、前記は、Ａ対立遺伝子に存在しない
Ｂ対立遺伝子におけるＡｌｕＩ部位をもたらすコード配
列の位置７００での多型部位を記載する。Ａ及びＢ対立
遺伝子を区別する能力は、Ｏ3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝
子型の区別を可能にする。
【０１１１】ドット−ブロットアッセイ 例１に記載されるようにして実質的に行なわれた増幅反
応からのＰＣＲ生成物を、アルカリによる処理により変
性した。特に、１０μｌのＰＣＲ生成物を、０．５Ｍの
ＥＤＴＡ（pH８．０）４．５μｌ，５ＮのＮａＯＨ
７．２μｌ及び７８．３μｌの水から成る変性溶液９０
μｌに添加した。その混合物を室温で１０分間インキュ
ベートし、変性を完結した。
応からのＰＣＲ生成物を、アルカリによる処理により変
性した。特に、１０μｌのＰＣＲ生成物を、０．５Ｍの
ＥＤＴＡ（pH８．０）４．５μｌ，５ＮのＮａＯＨ
７．２μｌ及び７８．３μｌの水から成る変性溶液９０
μｌに添加した。その混合物を室温で１０分間インキュ
ベートし、変性を完結した。
【０１１２】ＢｉｏＤｙｎｅ Ｂナイロンフィルター
（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，ＧｌｅｎＣｏｖｅ，ＮＹ）
を、水に５〜１０分間ソークし、そしてドット−ブロッ
トマニホルド（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃ
ＡからのＢｉｏ−Ｄｏｔ）が設定された後、水２００μ
ｌによりさらにすすぐことによって調製した。１００μ
ｌの変性されたサンプル混合物を、ドットブロット装置
を用いて、ナイロン膜に真空下で適用した。次に、個々
のウェルを０．４ＮのＮａＯＨ ２００μｌによりすす
ぎ、次に、２× ＳＳＣによりすばやくすすぎ、そして
液体のプールがなくなるまで、空気乾燥せしめた。固定
されたＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｏｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ＵＶ光ボック
ス（“自己交差”設定で）による５００mI／cm2 の束で
の紫外線照射によりナイロンフィルターに交差せしめ
た。
（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，ＧｌｅｎＣｏｖｅ，ＮＹ）
を、水に５〜１０分間ソークし、そしてドット−ブロッ
トマニホルド（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃ
ＡからのＢｉｏ−Ｄｏｔ）が設定された後、水２００μ
ｌによりさらにすすぐことによって調製した。１００μ
ｌの変性されたサンプル混合物を、ドットブロット装置
を用いて、ナイロン膜に真空下で適用した。次に、個々
のウェルを０．４ＮのＮａＯＨ ２００μｌによりすす
ぎ、次に、２× ＳＳＣによりすばやくすすぎ、そして
液体のプールがなくなるまで、空気乾燥せしめた。固定
されたＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａ
ｔａｇｏｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ＵＶ光ボック
ス（“自己交差”設定で）による５００mI／cm2 の束で
の紫外線照射によりナイロンフィルターに交差せしめ
た。
【０１１３】ハイブリダイゼーションを、２μＭのビオ
チニル化されたプローブを含むハイブリダイゼーション
緩衝液（５× ＳＳＰＥ，０．５％ ＳＤＳ）において
実施した。フィルターを５５℃で２５〜３０分間、ハイ
ブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションの後、フ
ィルターを室温で、洗浄用緩衝液（２．５× ＳＳＰ
Ｅ，０．１％ ＳＤＳ）によりすすぎ、過剰のプローブ
のほとんどを除去した。
チニル化されたプローブを含むハイブリダイゼーション
緩衝液（５× ＳＳＰＥ，０．５％ ＳＤＳ）において
実施した。フィルターを５５℃で２５〜３０分間、ハイ
ブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションの後、フ
ィルターを室温で、洗浄用緩衝液（２．５× ＳＳＰ
Ｅ，０．１％ ＳＤＳ）によりすすぎ、過剰のプローブ
のほとんどを除去した。
【０１１４】ビオチンプローブラベルを、ハイブリダイ
ゼーション緩衝液及びＨＲＰ−ＳＡを含む酵素接合体溶
液においてフィルターをインキュベートすることによっ
てホースラディシュペルオキシダーゼ−ストレプトアビ
ジン（ＨＲＰ−ＳＡ）に接合した。酵素接合体溶液は、
個々のmlのハイブリダイゼーション溶液にＰｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）からの酵素接合
体：ＨＲＰ−ＳＡ ８μｌを添加することによって調製
された。個々のフィルターを、５５℃で５分間、酵素接
合体溶液においてインキュベートした。接合に続いて、
フィルターを室温で洗浄用緩衝液によりすすいだ。緊縮
洗浄を、振盪水浴において５５℃で１２分間、洗浄用緩
衝液により行なった。緊縮洗浄の配列特異的ハイブリダ
イゼーション条件は、標的配列に対して正確に相補的な
プローブのみが結合したまま存続することを確保した。
ゼーション緩衝液及びＨＲＰ−ＳＡを含む酵素接合体溶
液においてフィルターをインキュベートすることによっ
てホースラディシュペルオキシダーゼ−ストレプトアビ
ジン（ＨＲＰ−ＳＡ）に接合した。酵素接合体溶液は、
個々のmlのハイブリダイゼーション溶液にＰｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）からの酵素接合
体：ＨＲＰ−ＳＡ ８μｌを添加することによって調製
された。個々のフィルターを、５５℃で５分間、酵素接
合体溶液においてインキュベートした。接合に続いて、
フィルターを室温で洗浄用緩衝液によりすすいだ。緊縮
洗浄を、振盪水浴において５５℃で１２分間、洗浄用緩
衝液により行なった。緊縮洗浄の配列特異的ハイブリダ
イゼーション条件は、標的配列に対して正確に相補的な
プローブのみが結合したまま存続することを確保した。
【０１１５】固定された増幅生成物に結合したまま存続
するビオチニル化されたプローブを次の通りに可視化し
た。色彩進行溶液を、１００mlのクエン酸塩緩衝液
（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、pH５．０）、５mlの
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌ
ｋ，ＣＴ）及び３％過酸化水素水１００μｌを混合する
ことによって調製した。フィルターをまず、１００mMの
クエン酸ナトリウム（pH５．０）によりすすぎ、次に暗
室において室温で１０分間、軽く撹拌しながら、色彩進
行溶液においてインキュベートした。初め無色のＴＭＢ
は、過酸化水素の存在下で、プローブ結合されたＨＲＰ
により着色された沈殿物に転換された。進行されたフィ
ルターを水により数分間すすぎ、そしてすばやく写真を
取った。
するビオチニル化されたプローブを次の通りに可視化し
た。色彩進行溶液を、１００mlのクエン酸塩緩衝液
（０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、pH５．０）、５mlの
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌ
ｋ，ＣＴ）及び３％過酸化水素水１００μｌを混合する
ことによって調製した。フィルターをまず、１００mMの
クエン酸ナトリウム（pH５．０）によりすすぎ、次に暗
室において室温で１０分間、軽く撹拌しながら、色彩進
行溶液においてインキュベートした。初め無色のＴＭＢ
は、過酸化水素の存在下で、プローブ結合されたＨＲＰ
により着色された沈殿物に転換された。進行されたフィ
ルターを水により数分間すすぎ、そしてすばやく写真を
取った。
【０１１６】例３．ＡＢＯ対立遺伝子の頻度 ＡＢＯ対立遺伝子の頻度を評価するために、４種の異な
った集団からの６２２人の個人からのサンプルを、ＡＢ
Ｏ遺伝子座で型分けした。サンプル化された集団は、１
７８人のアフリカ系アメリカ人、１８１人のアメリカ系
白人、１７４人のアメリカ系スペイン人及び８９人の日
本人からそれぞれ成った。
った集団からの６２２人の個人からのサンプルを、ＡＢ
Ｏ遺伝子座で型分けした。サンプル化された集団は、１
７８人のアフリカ系アメリカ人、１８１人のアメリカ系
白人、１７４人のアメリカ系スペイン人及び８９人の日
本人からそれぞれ成った。
【０１１７】ＡＢＯ核酸の増幅を、例１に記載のように
して実質的に行なったが、但し、次の例外を包含する。
第１に、８人の他の遺伝子からの標的配列に対して特異
的な追加の増幅プライマーを、個々の遺伝子からの標的
配列が同時に増幅されるように、増幅混合物に含んだ。
第２に、最終試薬濃度は次の通りであった： ２ngの精製されたヒトゲノムＤＮＡ ２００nMの個々のプライマー ２００μＭの個々のｄＮＴＰ ５０mMのＫＣｌ ２０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８．３ ３mMのＭｇＣｌ2 １．５μｌの変性されたＤＮＡポリメラーゼ溶液（約
７．５単位）。
して実質的に行なったが、但し、次の例外を包含する。
第１に、８人の他の遺伝子からの標的配列に対して特異
的な追加の増幅プライマーを、個々の遺伝子からの標的
配列が同時に増幅されるように、増幅混合物に含んだ。
第２に、最終試薬濃度は次の通りであった： ２ngの精製されたヒトゲノムＤＮＡ ２００nMの個々のプライマー ２００μＭの個々のｄＮＴＰ ５０mMのＫＣｌ ２０mMのトリス−ＨＣｌ，pH８．３ ３mMのＭｇＣｌ2 １．５μｌの変性されたＤＮＡポリメラーゼ溶液（約
７．５単位）。
【０１１８】使用される変性されたＤＮＡポリメラーゼ
は、１９９６年８月１７日に出願されたヨーロッパ特許
出願第９６１１３２２２．２号に記載されるように、２
００倍モル過剰のシトラコン酸無水物との反応により可
逆的に不活性化されたＴａｑＤＮＡポリメラーゼであっ
た。手短に言及すれば、その方法は、トリス緩衝液（５
０mMのトリス−ＨＣｌ，１mMのＥＤＴＡ，６５mMのＫＣ
ｌ，pH７．５）における１．３mg／nlの初期濃度でのＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ登録商
標、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃ
Ｔ）の使用を包含する。
は、１９９６年８月１７日に出願されたヨーロッパ特許
出願第９６１１３２２２．２号に記載されるように、２
００倍モル過剰のシトラコン酸無水物との反応により可
逆的に不活性化されたＴａｑＤＮＡポリメラーゼであっ
た。手短に言及すれば、その方法は、トリス緩衝液（５
０mMのトリス−ＨＣｌ，１mMのＥＤＴＡ，６５mMのＫＣ
ｌ，pH７．５）における１．３mg／nlの初期濃度でのＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ登録商
標、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃ
Ｔ）の使用を包含する。
【０１１９】シトラコン酸無水物の溶液は、ＤＭＦ
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に１００倍で１１．
０６Ｍのシトラコン酸無水物（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌ
ｗａｕｋｅｅ，ＷＩから市販されている）を希釈するこ
とによって創造された。約２００／１のモル比でシトラ
コン酸無水物／Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液
を４℃で一晩インキュベートし、Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼを不活性化した。不活性化に続いて、増幅を変性
された酵素の希釈シリーズを用いて行ない、７．５単位
の変性されていないＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用い
て得られるのと実質的に同じ増幅の結果を生成するシト
ラコン酸化されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ溶液の量
を決定した。
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に１００倍で１１．
０６Ｍのシトラコン酸無水物（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌ
ｗａｕｋｅｅ，ＷＩから市販されている）を希釈するこ
とによって創造された。約２００／１のモル比でシトラ
コン酸無水物／Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液
を４℃で一晩インキュベートし、Ｔａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼを不活性化した。不活性化に続いて、増幅を変性
された酵素の希釈シリーズを用いて行ない、７．５単位
の変性されていないＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用い
て得られるのと実質的に同じ増幅の結果を生成するシト
ラコン酸化されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ溶液の量
を決定した。
【０１２０】同時増幅に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
活性化の量（７．５単位）を、１回の増幅で使用される
量（２．５単位）以上に高め、同時増幅に必要とされる
高められたＤＮＡ合成を促進した。実験的な決定に基づ
いて、１．５μｌの変性されたＤＮＡポリメラーゼ溶液
を個々の反応に添加した。変性されたＤＮＡポリメラー
ゼが、上記のようにして、“ホット−スタート”を達成
するために同時増幅に使用された。反応混合物の予備反
応インキュベーションを９４℃で５分３０秒間行ない、
変性されたＤＮＡポリメラーゼを再活性化した。
活性化の量（７．５単位）を、１回の増幅で使用される
量（２．５単位）以上に高め、同時増幅に必要とされる
高められたＤＮＡ合成を促進した。実験的な決定に基づ
いて、１．５μｌの変性されたＤＮＡポリメラーゼ溶液
を個々の反応に添加した。変性されたＤＮＡポリメラー
ゼが、上記のようにして、“ホット−スタート”を達成
するために同時増幅に使用された。反応混合物の予備反
応インキュベーションを９４℃で５分３０秒間行ない、
変性されたＤＮＡポリメラーゼを再活性化した。
【０１２１】本発明で使用される対立遺伝子の名称は、
上記６個の組のプローブを用いて検出された多型現象に
より、下記表３に定義される。多型部位の位置は配列番
号１に関して番号付けされている。個々の対立遺伝子の
ためには、位置２９及び１１３での多型部位で存在する
塩基対、及び配列番号１の位置７７と７８との間での追
加のＧ：Ｃ塩基対の存在又は不在が決定された。位置３
２及び３３で存在する塩基対を別々に決定した。
上記６個の組のプローブを用いて検出された多型現象に
より、下記表３に定義される。多型部位の位置は配列番
号１に関して番号付けされている。個々の対立遺伝子の
ためには、位置２９及び１１３での多型部位で存在する
塩基対、及び配列番号１の位置７７と７８との間での追
加のＧ：Ｃ塩基対の存在又は不在が決定された。位置３
２及び３３で存在する塩基対を別々に決定した。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】対立遺伝子の同定を、例２に記載されるよ
うにして行なった。集団の個々について観察される対立
遺伝子及び遺伝子型頻度が下記表に与えられる。予測さ
れる遺伝子型頻度を、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平
衡を仮定する、観察された対立遺伝子頻度から計算し
た。
うにして行なった。集団の個々について観察される対立
遺伝子及び遺伝子型頻度が下記表に与えられる。予測さ
れる遺伝子型頻度を、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平
衡を仮定する、観察された対立遺伝子頻度から計算し
た。
【０１２４】上記のようにして、本発明の遺伝子型決定
を、Ｂ2 ，Ｏ3 及びＯ4 対立遺伝子の発見の前に行なっ
た。予測できない結果が、１３人のアフリカ系アメリカ
人、４人のアメリカ系白人、５人のアメリカ系スペイン
人及び８人の日本人から観察された。最っと頻繁に観察
される予測できない結果は、他の５つのプローブのハイ
ブリダイゼーションに基づいてＯ1 ，Ｂとして分類され
るサンプルにハイブリダイズするためにＢ対立遺伝子に
ハイブリダイズすることが予測されるＧＺ２７（配列番
号２）の不良であった。
を、Ｂ2 ，Ｏ3 及びＯ4 対立遺伝子の発見の前に行なっ
た。予測できない結果が、１３人のアフリカ系アメリカ
人、４人のアメリカ系白人、５人のアメリカ系スペイン
人及び８人の日本人から観察された。最っと頻繁に観察
される予測できない結果は、他の５つのプローブのハイ
ブリダイゼーションに基づいてＯ1 ，Ｂとして分類され
るサンプルにハイブリダイズするためにＢ対立遺伝子に
ハイブリダイズすることが予測されるＧＺ２７（配列番
号２）の不良であった。
【０１２５】続く配列分析は、それらのサンプルが実
際、Ｏ1 ，Ｂ2 であったことを決定した。予測されない
ハイブリダイゼーション結果を生成した３０のサンプル
のうち、３つのアフリカ系アメリカ人及び１つのアメリ
カ系スペイン人サンプルが解釈できない結果を生成し、
そして下記に示される結果から排除された。対立遺伝子
及び遺伝子型頻度を、解釈できるハイブリダイゼーショ
ン結果を提供する６１８のサンプルを用いて計算した。
際、Ｏ1 ，Ｂ2 であったことを決定した。予測されない
ハイブリダイゼーション結果を生成した３０のサンプル
のうち、３つのアフリカ系アメリカ人及び１つのアメリ
カ系スペイン人サンプルが解釈できない結果を生成し、
そして下記に示される結果から排除された。対立遺伝子
及び遺伝子型頻度を、解釈できるハイブリダイゼーショ
ン結果を提供する６１８のサンプルを用いて計算した。
【０１２６】振り返って見ると、Ｏ3 対立遺伝子の続く
発見の観点から、Ａ及びＢ対立遺伝子の頻度の評価の偏
向が存在する。なぜならば、本発明のプローブ組を用い
て区別できないＯ3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型が
Ｏ2 ，Ｂ遺伝子型として分類されたからであった。従っ
て、Ｏ2 ，Ｂ遺伝子型の評価された頻度は過大評価であ
った。しかしながら、Ｏ3 対立遺伝子はまれであるの
で、Ｏ3 ，Ａ遺伝子型の発生は得られる頻度評価に対し
て有意に影響を及ぼさないであろう。
発見の観点から、Ａ及びＢ対立遺伝子の頻度の評価の偏
向が存在する。なぜならば、本発明のプローブ組を用い
て区別できないＯ3 ，Ａ及びＯ2 ，Ｂ1 遺伝子型が
Ｏ2 ，Ｂ遺伝子型として分類されたからであった。従っ
て、Ｏ2 ，Ｂ遺伝子型の評価された頻度は過大評価であ
った。しかしながら、Ｏ3 対立遺伝子はまれであるの
で、Ｏ3 ，Ａ遺伝子型の発生は得られる頻度評価に対し
て有意に影響を及ぼさないであろう。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
【表５】
【０１２９】
【表６】
【０１３０】
【表７】
【０１３１】
【表８】
【０１３２】
（２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：エキソン （Ｂ）位置：５９．．１６１ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：イントロン （Ｂ）位置：１．．５８ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：５９．．１６１ （Ｄ）他の情報：／部分的 （xi）配列：配列番号１： CATGTGGGTG GCACCCTGCC AGCTCCATRT GRYCGCACGC CTCTCTCCAT GTGCAGTAGG 60 AAGGATGTCC TCGTGGTACC CCTTGGCTGG CTCCCATTGT CTGGGAGGGC ACRTTCAACA 120 TCGACATCCT CAACGAGCAG TTCAGGCTCC AGAACACCAC C 161
【０１３３】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２： ATGTGGGTGG CACCCTGC 18
【０１３４】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３： GGTGGTGTTC TGGAGCCTGA A 21
【０１３５】（２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４： AGCTCCATAT GACCGCAC 18
【０１３６】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号５： CGTGCGGTCA CATGGA 16
【０１３７】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号６： GGTACCCCTT GGCTGG 16
【０１３８】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号７： GTGACCCCTT GGCTGG 16
【０１３９】（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号８： GGAGGGCACA TTCAACAT 18
【０１４０】（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号９： GATGTTGAAC GTGCCCTC 18
【０１４１】（２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号１０： AGCTCCATAT GATCGCAC 18
【０１４２】（２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号１１： AGCTCCATGT GGCCGCAC 18
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガブリエル アンネマリー ザンゲンベル ク アメリカ合衆国，カリフォルニア 94501, アラメダ，シックスス ストリート 1440，アパートメント ナンバー 14
Claims (10)
- 【請求項１】 配列番号１の位置２２〜５８から成る領
域に含まれる少なくとも約１０ヌクレオチドの長さの配
列を含んで成るオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 ヌクレオチド位置２９，３２及び３３の
多型部位から選択された多型部位を含む領域中で配列番
号１のいづれかの鎖に正確に又は実質的に相補的であ
り、そして前記多型部位で配列番号１に正確に相補的で
あるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 前記領域が約１５〜約３５ヌクレオチド
の長さである請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 ＧＺ２６（配列番号４），ＧＺ２７（配
列番号５），Ｐ１（配列番号１０），Ｐ２（配列番号１
１）及びそれらの正確な相補体から成る群から選択され
る請求項２記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいづれか１項記載のオリ
ゴヌクレオチドを含んで成るＤＮＡベクター。 - 【請求項６】 配列番号１のヌクレオチド２９〜３３を
含んで成るＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子
核酸を含むサンプルに存在する対立遺伝子を同定するた
めの方法であって、配列番号１の位置２９，３２及び３
３から選択された多型部位に存在するヌクレオチド塩基
対を決定することを含んで成る方法。 - 【請求項７】 ヒト核酸を含むサンプルにおけるＡＢＯ
グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異配列の存在
を決定するための方法であって、 （ａ）ヌクレオチド位置２９，３２及び３３の多型部位
から選択された多型部位で前記変異配列に正確に相補的
である請求項１〜４のいづれか１項記載のオリゴヌクレ
オチドと前記核酸とを、前記核酸が前記変異配列を含む
場合にのみ、前記オリゴヌクレオチドが前記核酸に結合
して安定したハイブリッド複合体を形成する条件下で混
合し；そして（ｂ）前記オリゴヌクレオチドと前記核酸
との間で形成される、前記変異配列の存在を示すいづれ
かのハイブリッドの存在を検出する、ことを含んで成る
方法。 - 【請求項８】 段階（ａ）の前に前記核酸を増幅する請
求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記段階（ｂ）における検出が、前記オ
リゴヌクレオチドが前記核酸と安定したハイブリッド複
合体を形成する場合にのみ増幅が生じる条件下で、増幅
プライマーとして前記オリゴヌクレオチドを用いて、増
幅反応を実施することを含んで成る請求項７記載の方
法。 - 【請求項１０】 請求項１〜４のいづれか１項記載のオ
リゴヌクレオチドを含んで成る、ＡＢＯグリコシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子座で個人の遺伝子型を決定するた
めのキット。
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