JPH02177897A - モノクローナル抗体及び該抗体を使用する生物質の免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、シアリルラフｌ−Ｎ−フコペンタオースＩＩ
と特異的に結合するモノクロ−ナル抗体及び該抗体を使
用するシアリルラフｌ−Ｎ−フコペンタオース■の免疫
測定法に関する。

（発明の背景） シアリルラフｌ−Ｎ−フコペンタオース■は、Ｌｅ　　
型面ｌｌｌ型の健常人に存在するラフｌ−Ｎ−フコペン
タオース■が癌化した細胞において活性化されたシアリ
ルトランスフェラーセの働きによってシアル化したもの
である。従って、血清あるいはその他のヒ！・の体液中
のシアリルラフｈ　Ｎ−フコペンタオース■の増減を知
ることは、種々の癌の診断、特に膵癌の診断に有用であ
る。

従来、シアリルラフＩ−Ｎ−フコペンタオース■の測定
はエンサイム・イムノアッセイあるいはラジオ・イムノ
アッセイによって行われているがその際用いられている
モノクロ−ナル抗体は、免疫グロブリンＧ（以下本明細
書中ではＩｇＧと略して記載する）クラス１に属する抗
体である。

本発明者らは、ＩｇＧサブクラス１に属するモノクロ−
ナル抗体のモノクロ−ナル抗体であってもシアリルラク
トＮ−フコペンタオース■の測定に使用できると考え鋭
意検討した結果、本発明を完成するに至った。即ち本発
明は、第１に、少なくとも血液中のシアリルラフトＮ−
フコペンタオースＩＩと特異的に結合し、かつ、ＩｇＧ
クラス３に属するという性質を有するモノクロ−ナル抗
体であり、第２に、該モノクロ−ナル抗体を使用する試
料中のシアリルラクトＮ−フコペンタオスＨの免疫ｆｌ
ｌｌｌ定法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

（発明の構成） 本発明のモノクロ−ナル抗体は、細胞融合法により製造
できる。さらに詳細には、本発明のモノクロ−ナル抗体
はつぎの（１）’−（４）の工程、即ち、 （］）抗体産生細胞調製］−程 （２）融合、スクリーニング、クローニング工程（３）
ハイブリドーマ培養工程 （４）必要に応じて行われる精製工程 を実施することにより得られる。以下、各工程について
詳細に説明するが、本発明はこれらの一例に限定される
ものではない。

（コ−）抗体産生細胞調製工程 抗体産生細胞は抗原であるシアリルラフｌ−Ｎフコペン
タオース■で十分免疫したマウス、ラット等の哺乳動物
の肺臓より採取できる。好ましくは、シアリルラフｌ−
Ｎ−フコペンタオース■の純度は高いほうがよいが、そ
れほど高いものでなくても目的は達成される。例えば、
ヒトの癌細胞あるいはそれに準する細胞より単離精製さ
れたもの、人工的に合成されたもの等を用いて前記の動
物等を免疫すれば良い。免疫条件、例えば、シアリルラ
クトＮ−フコペンタオースＨの使用量、投与部位等の条
件は従来の抗血清を得る場合の条件か適用できる。最終
免疫から２−５０後に、免疫した哺乳動物の肺臓から抗
体産生細胞を採取することが出来る。

（２）融合、スクリーニング、クローニング工程融合は
通常の融合促進剤の存在下、上記抗体産生細胞ならびに
公知の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）を公知の方法にて
混合することにより行うことができる。

一般にミエローマ細胞は、工程（１）で用いた免疫動物
に由来するものであってもまたは異なる動物に由来する
ものであってもよいが、ハイブリドーマ選択培地で成育
できず、かつ、それ自身が抗体を産生じないものが好ま
しい。このようなミエローマ細胞としては、例えば市販
されているマウス・ミエローマ細胞Ｐ　３・Ｘ６３・Ａ
ｇ８・Ｕｌあるいはこれと同程度のものが挙げられる。

両細胞の比は、通常、ミエローマ細胞１に対して抗体産
生細胞１−２０である。細胞融合促進剤としては、例え
ばポリエチレングリコールが用いられ、分子量は１００
０−７５００のものが好ましい。

融合細胞、すなわちハイブリドーマの培養は、融合促進
剤を洗浄除去しハイブリトーマ選択用培地に懸濁したハ
イブリドーマのｉ−００−２００μｌずつを播き、約３
７℃において５％炭酸ガス空気中で行う。

目的とするハイブリドーマのスクリーニングは培養液中
の抗体価を測定することにより行う。

すなわち、シアリルラフｌ−Ｎ−フコペンタオース■を
結合させさらにウシ血清アルブミンにてブロッキングし
たアッセイ・プレートの各ウェルにハイブリドーマの十
分成育した培地の上清を加え十分インキュベートシ抗原
抗体反応させた後、」１清を除去洗浄する。さらに、こ
れにパーオキシダーゼで標識した抗マウスＩ　ｇＧ３抗
体を作用させ洗浄後、基質となる過酸化水素を含むＡＢ
ＴＳ水溶液を加え呈色させる。

スクリーニングしたハイブリドーマについて限界希釈法
にてクローニングし目的のハイブリドーマを調製できる
。

（３）ハイブリト−マ培養工程 前工程で得たクローン化ハイブリドーマをｉｎ　　ｖｉ
ｔｒｏまたはｉｎ　　ｖｉｖｏで培養すれば１」的のモ
ノクロ−ナル抗体が生産できる。

プレート中で数個のハイブリドーマの培養から始め、徐
々にスケール・アップすることにより行うことかできる
。また、ｉｎ　　ｖｉｖｏでの培養は、融合細胞の増殖
を容易にさせるためのプリスタン処理をしたマウス腹腔
内にハイブリドーマを接種することにより実施でき、７
−１５日後にはモノクロ−ナル抗体を含む腹水か蓄積さ
れる。

（４）精製］−程 必要に応じて行われる精製工程は、前工程で得られたモ
ノクロ−ナル抗体を通常の物理化学的手法、例えば塩析
、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー等の
手段を組み合わせることにより行われる。

次に本発明の第２の点である、前記の様にして？１ｉら
れる、シアリルラフトＮ−フコペンタオースＩＩと特異
的に結合し、かつ、ＩｇＧクラス３に属するという性質
を−Ｈするモノクロ−ナル抗体を使用するシアリルラフ
ｌ−Ｎ−フコペンタオース■免疫４１す定法について説
明する。

免疫ａｌｌｌ定法としては、例えば酵素免疫測定法や放
ｎ・１性向位元素免疫測定法訪等を例示できるがこれに
限定されない。具体的には、前記した様にして？１１ら
れるモノクロ−ナル抗体を免疫ａｌｌｌ定における固定
化抗体として又は標識抗体として使用することからなる
。

例えば酵素免疫定量法（ＥＩＡ）としては１、酵素標識
抗原と非標識抗原の双方を競合的に反応させる競争法、
あるいは抗体を酵素標識させ同相化抗体と酵素標識抗体
の間に抗原を挟み込んで検出するサントウィッチ・アッ
セイ法が例示される。

サンドウィッチ法では、１分子のシアリルラクトＮ−フ
コペンタオース■を２抗体でサンドウィッチすることは
難しいか、通常血中でシアリルラフ１−　Ｎ−フコペン
タオース■はキャリアータンパク質に多分子か結合した
形で存在することが知られており、その糖タンパク質を
サントウィッチして検出することが可能である。

本発明のモノクロ−ナル抗体を固定化抗体として用いる
場合には、不溶性担体に該抗体を結合させれば良いし、
標識抗体として使用する場合には、使用する例えば酵素
、蛍光物質、放射性同位元素等の標識を該抗体に結合さ
せれば良い。抗体の担体への結合又は抗体と標識の結合
は公知の方法に従えば良く、特別の制限は無い。また、
例えば競争法、サンドウィッチ法等における８＋１１定
のための操作も公知の方法に従えば良く、特別の制限は
無い。

（発明の効果） 本発明によれば、シアリルラフＩ−Ｎ−フコペンタオー
スＩＩと特異的に結合し、かつ、ＩｇＧクラス３に属す
るという性質を有するモノクロ−ナル抗体が提供される
。該抗体は前記した様に、シアリルラクトＮ−フコペン
タオース■の免疫測定に使用することが出来る。

本発明のモノクロ−ナル抗体は、従来使用されていたＩ
ｇＧクラス１−に属するモノクロ−ナル抗体とは異なる
、具体的にはＩｇＧクラス３に属するモノクロ−ナル抗
体である。従来の抗体と比較して抗原との特異性かより
高い抗体あるいは従来の抗体と異なる結合部位を有する
抗体又は従来の抗体と何等かの異なる作用を有する抗体
が求められる今日の免疫研究の分野において、本発明に
より提供される従来の抗体とは異なるクラスに属する抗
体は大きな意義を有するものである。

［実施例］ 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するか、
本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１（抗体産生細胞の調製） ２０μｇのシアリルラクトＮ−フコペンタオース■をザ
ルモネラ・ミネソタ菌体にうめ込んだものをリン酸緩衝
化生理食塩水に懸濁し、ＢＡＬＢ　／　ｃマウスの腹腔
内に投勾した。さらに初回免疫から数えて４日後、７日
後、１２日後、１８日後、２６１］後に追加免疫した。

最終免疫から３日後、このマウスのＩＪＩＩ！臓から抗
体産生細胞を採取した。

実施例２（融合、スクリーニング、クローニング）この
肝臓細胞（１，，０ＸＩＣ）８細胞）とマウス・ミエロ
ーマ（２，０，Ｘ］、０７細胞）をケーラとミルシュタ
インの方法にて融合した。重合後、２．０ＸＩＯ６牌臓
細胞／　ｍ　１になるようにヒボキサンチン、アミノプ
テリン、チミジンを含むＤＭＥＭ（ダルベツコ・モディ
ファイド・イーグルズ・メディウム）に懸濁し、９６ウ
エル・プレートに２．０×１０５細胞／ウエルとなるよ
うに播いた。ハイブリドーマか成育してきたところで、
スクリーニングを行った。スクリーニングにはシアリル
ラクトＮ−フコペンタオース■を２０ｎｇ／ウェルとな
るように結合した９６ウエル・マイクロタイター・プレ
ートを用い、２次抗体に抗マウスＩ　ｇＧ３を用いて抗
シアリルラクｌ−Ｎ−フコペンタオース■抗体を拾った
。このとき、９６ウエル・プレート５枚から抗ンアリル
ラクＩ−Ｎ−フコペンタオース■抗体陽性ハイブイト−
マ］株か得られた。このハイブリト−マを３回の限界希
釈法にてクローニングしセル・ラインとした。

実施例３（モノクロ−ナル抗体の製造）前項で得たハイ
ブリドーマ１．　　ＯＸ　１０７個を、予めプリスタン
処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投Ｊｊシた。１
０日目に１」的とするモノクロ−ナル抗体を含む腹水５
ｍ１／マウスを得た。

実施例４（酵素免疫８＋１１定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）への応
用）以上のように得たモノクロ−ナル抗体を酵素標識し
た。標識物質と［２ては西洋ワサビ・パーオキシダーセ
（ＴＯＹＯＢＯ社生製、以下ＨＲＰと略す）を用いた。

５　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉの割合でＨＲＰを含む０．３Ｍ
重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に１％１フロロ
−２，４−ジニトロベンゼンのエタノル溶液をＯ，］、
ｍｌ添加し、室温にて１時間反応させた後、０．０６Ｍ
過ヨウ素酸すトリウム溶液を１．　ｍ　ｌ添加しさらに
３０分反応させた。０．１６Ｍのエチレングリコール１
ｍｌを添加して未反応の過ヨウ素酸すトリウムを除去し
た後、０．０１Ｍの炭酸すトリウム緩衝液（ｐＨ９，５
）に対］　２ して透析し、続いて、モノクロ−ナル抗体５ｍｇを添加
して５時間反応させた。ついで、水素化ホウ素すトリウ
ム５ｍｇを添加して４℃で一晩放置した。未反応の水素
化ホウ素すトリウムを除去するため０．８５％塩化ナト
リウムを含む１０ｍＭリン酸すトリウム緩衝液（ｐＨ７
，１）に対して４°Ｃで一晩攪拌しながら透析した後、
高速液体クロマトグラフィー（東ソー株式会社製、Ｔ　
Ｓ　ＫゲルＧ−３０００ＳＷ）を用いて精製し酵素標識
モノクロ−ナル抗体を？１また。

未処理９６ウエル・マイクロタイター・プレト（ヌンク
・イムノプレート、インターメツド社製）の各ウェルに
Ｏ，１Ｍ炭酸すトリウム緩衝液に（ｐＨ９，６）に溶解
した５　μｇ　／　ｍ　１の未標識モノクロ−ナル抗体
２５０μｌを加え３７℃でインキュベートシてプレート
に結合させた。反応上清を除去洗浄後、１％のウシ血清
アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水を加えて４℃
で一晩反応させ、ブロッキングした。以上のようにシシ
ｊ製したプレートを用いてザンドウイツチ・アッセイし
た。

予め結腸癌細胞の培養上清を市販シアリルラフｌ−Ｎ−
フコペンタオース■測定用キットにて濃度をｉｆ＋１１
定し、それを標準物質となるように希釈して各ウェルに
１０μｌすつ加えた。次いて各ウェルに酵素標識モノク
ロ−ナル抗体５　ｍ　ｇ　／　ｍ　１を１％ウシ血清ア
ルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水で１０００倍に
希釈した溶液を１００μｌすつ添加し３７°Ｃ２時間イ
ンキュベートシた後、溶液を除去してから１％ウシ血清
アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し
た。

さらに過酸化水素と０．６ｍｇ／ｍ１ＡＢＴｓを含むク
エン酸緩衝液を基質および発色液として１００μｌずつ
加えた。反応停止後、各ウェルについて波長４１．５ｎ
ｍ、対照波長６００ｎｍの吸収強度を１］動マイクロタ
イター・プレート・リーダ（ＭＰＲ−Ａ４　；東ソー株
式会社製）でｔｌり定し、標準物質の濃度および吸収強
度をプロットして本発明の抗体を使用したシアリルラフ
Ｉ−Ｎ−フコペンタオース■の免疫測定を行った。その
結果、シアリルラフｌ−Ｎ−フコペンタオースＨＨＨ度
の増加に相関し、ｉすられる信号（４１５ｎｍの吸光度
）も増加していることが確認された。結果を表］に示す
。

第　１　表 ］　５

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも次の性質を有するモノクロ−ナル抗体
   。 （ａ）少なくとも血液中のシアリルラクトＮ−フコペン
   タオースIIと特異的に結合し、 （ｂ）免疫グロブリンＧクラス３に属する。
2. （２）請求項第（１）項記載のモノクロ−ナル抗体を使
   用する試料中のシアリルラクトＮ−フコペンタオースI
   I免疫測定法。