JPH0218077B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0218077B2 JPH0218077B2 JP14050282A JP14050282A JPH0218077B2 JP H0218077 B2 JPH0218077 B2 JP H0218077B2 JP 14050282 A JP14050282 A JP 14050282A JP 14050282 A JP14050282 A JP 14050282A JP H0218077 B2 JPH0218077 B2 JP H0218077B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- creatinine
- ammonia
- sample
- adenine dinucleotide
- nicotinamide adenine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はクレアチニンの定量法に関するもので
ある。
ある。
更に詳細には本発明はアンモニアを含有する検
体中に存在するクレアチニンをそのまま直接定量
する方法に関するものである。
体中に存在するクレアチニンをそのまま直接定量
する方法に関するものである。
従来、生体に由来する血液、尿等の検体に存在
するクレアチニンを定量するこは検体中にすでに
存在しているアルカリピクリン酸反応（Jaffe法）
を妨害する物質を透析処理や樹脂による吸着処理
等をして除去した後Jaffe法にて定量するか、又
は検体中のクレアチニンをクレアチンに変換せし
める酵素を用いてクレアチンに変換せしめ、生成
したクレアチンを種々の方法により定量すること
によりクレアチニンを定量していた。
するクレアチニンを定量するこは検体中にすでに
存在しているアルカリピクリン酸反応（Jaffe法）
を妨害する物質を透析処理や樹脂による吸着処理
等をして除去した後Jaffe法にて定量するか、又
は検体中のクレアチニンをクレアチンに変換せし
める酵素を用いてクレアチンに変換せしめ、生成
したクレアチンを種々の方法により定量すること
によりクレアチニンを定量していた。
しかしながら検体の透析処理は煩雑な上に検体
が希釈される欠点があり、樹脂による吸着処理の
操作が煩雑であるという欠点もあつて、いずれも
好ましくない。またクレアチニンをクレアチンに
変換せしめ、生成したクレアチニンを定量する方
法はクレアチンの定量にすでに３段階以上もの反
応をカツプリングさせた多段階の反応系であり、
また検体中のクレアチンをあらかじめ消去せしめ
るか、あらかじめ検体の盲検を行なわなければな
らず二度手間がかかる上に検体量が少ない場合は
測定できないことになつて好ましいものではなか
つた。
が希釈される欠点があり、樹脂による吸着処理の
操作が煩雑であるという欠点もあつて、いずれも
好ましくない。またクレアチニンをクレアチンに
変換せしめ、生成したクレアチニンを定量する方
法はクレアチンの定量にすでに３段階以上もの反
応をカツプリングさせた多段階の反応系であり、
また検体中のクレアチンをあらかじめ消去せしめ
るか、あらかじめ検体の盲検を行なわなければな
らず二度手間がかかる上に検体量が少ない場合は
測定できないことになつて好ましいものではなか
つた。
本発明はこのようなクレアチニンの定量におけ
る従来の欠点を改善するためになされたものであ
る。
る従来の欠点を改善するためになされたものであ
る。
本発明はアンモニアを含有する検体にグルタミ
ン酸脱水素酵素（以下GlDHという）、α−オキ
ソグルタール酸（以下α−OGという）、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
NADHという）、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（以下NAD+という）を還元する酵素及
びNAD+を還元する酵素の基質を添加し、検体中
にすでに存在するアンモニアを水とグルタミン酸
に変化せしめ、その際生成されたニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドをニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを還元せしめる酵素を用いて再
度還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
に変換せしめ、しかる後検体に過剰量のクレアチ
ニンデイミナーゼと還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエート（以下NADPH
という）を添加して反応せしめ、NADPHの減
少量を340nmの吸光度の減少によつてクレアチニ
ンを定量する方法である。
ン酸脱水素酵素（以下GlDHという）、α−オキ
ソグルタール酸（以下α−OGという）、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
NADHという）、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（以下NAD+という）を還元する酵素及
びNAD+を還元する酵素の基質を添加し、検体中
にすでに存在するアンモニアを水とグルタミン酸
に変化せしめ、その際生成されたニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドをニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドを還元せしめる酵素を用いて再
度還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
に変換せしめ、しかる後検体に過剰量のクレアチ
ニンデイミナーゼと還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエート（以下NADPH
という）を添加して反応せしめ、NADPHの減
少量を340nmの吸光度の減少によつてクレアチニ
ンを定量する方法である。
本発明の特色とするところは検体中にすでに存
在するアンモニアをGlDH、α−OGとNADHに
よつてグルタミン酸に変化させ、後にクレアチン
デイミナーゼの反応によりクレアチニンから生ず
るアンモニアを同じGlDHとNADPHによつて反
応させてグルタミン酸と水に変化せしめる点にあ
る。
在するアンモニアをGlDH、α−OGとNADHに
よつてグルタミン酸に変化させ、後にクレアチン
デイミナーゼの反応によりクレアチニンから生ず
るアンモニアを同じGlDHとNADPHによつて反
応させてグルタミン酸と水に変化せしめる点にあ
る。
本発明のクレアチニンの定量法によれば検体中
にすでに存在するアンモニアを前もつて消費させ
てしまつているので、同一検体でそのまま添加し
たクレアチニンデイミナーゼにより検体中のクレ
アチニンからアンモニアを生成させ、直接生成す
るアンモニア全量をクレアチンデイミナーゼによ
つて分解されたアンモニアとして測定することが
できるのでクレアチニン含量は正確に測定するこ
とができる。
にすでに存在するアンモニアを前もつて消費させ
てしまつているので、同一検体でそのまま添加し
たクレアチニンデイミナーゼにより検体中のクレ
アチニンからアンモニアを生成させ、直接生成す
るアンモニア全量をクレアチンデイミナーゼによ
つて分解されたアンモニアとして測定することが
できるのでクレアチニン含量は正確に測定するこ
とができる。
ここに示した本発明のアンモニア消費系の反応
の一例を式(1)で表わせば次の通りである。
の一例を式(1)で表わせば次の通りである。
本発明のクレアチニンの定量法はアンモニアを
含有する検体中、例えば血清・尿中のクレアチニ
ンの定量に用いられる。これらの検体にはすでに
多量のアンモニアが絶えず存在しているために直
接グルタミン酸生成反応によつて測定するとクレ
アチニン量に、相当量のアンモニア量を付加して
測定されてしまうので正確な定量値が得られなか
つたものである。本発明ではあらかじめ検体中の
アンモニアをNADHにより消費させてしまつた
後にクレアチニンデイミナーゼを検体中のクレア
チニンに作用させるので、そこに生成する
NADP+の量は正確にクレアチニンの量として測
定されるものである。
含有する検体中、例えば血清・尿中のクレアチニ
ンの定量に用いられる。これらの検体にはすでに
多量のアンモニアが絶えず存在しているために直
接グルタミン酸生成反応によつて測定するとクレ
アチニン量に、相当量のアンモニア量を付加して
測定されてしまうので正確な定量値が得られなか
つたものである。本発明ではあらかじめ検体中の
アンモニアをNADHにより消費させてしまつた
後にクレアチニンデイミナーゼを検体中のクレア
チニンに作用させるので、そこに生成する
NADP+の量は正確にクレアチニンの量として測
定されるものである。
本発明のクレアチンの定量法は、単にエンドポ
イント法によつてもアンモニアを含有する検体中
のクレアチニンを定量できるし、また適量なクレ
アチンデイミナーゼの量を選択することによつて
Rate Assayにてクレアチニンを定量できる。
イント法によつてもアンモニアを含有する検体中
のクレアチニンを定量できるし、また適量なクレ
アチンデイミナーゼの量を選択することによつて
Rate Assayにてクレアチニンを定量できる。
本発明においてあらかじめ存在するアンモニア
を消費させるには第一にアンモニアとα−ケトグ
ルタール酸より水とグルタミン酸を生成するグル
タミン酸脱水素酵素（GlDH）（EC1.4.1.3）が必
要となる。
を消費させるには第一にアンモニアとα−ケトグ
ルタール酸より水とグルタミン酸を生成するグル
タミン酸脱水素酵素（GlDH）（EC1.4.1.3）が必
要となる。
この反応には助酵素としてNADHの存在が必
要であるが、NADHの添加量を少なくするため
に反応で生成するNAD+を還元するグルコース−
６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−PDH）
（EC1.1.1.49）などのNAD+を還元する酵素を過
剰のグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）など
のNAD+を還元する酵素反応基質と一緒に添加し
ておいて６−ホスホグルコン酸（６−PG）を生
成させると同時にアンモニアをα−ケトグルター
ル酸によつて完全に水とグルタミン酸に変化させ
てしまうのである。
要であるが、NADHの添加量を少なくするため
に反応で生成するNAD+を還元するグルコース−
６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−PDH）
（EC1.1.1.49）などのNAD+を還元する酵素を過
剰のグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）など
のNAD+を還元する酵素反応基質と一緒に添加し
ておいて６−ホスホグルコン酸（６−PG）を生
成させると同時にアンモニアをα−ケトグルター
ル酸によつて完全に水とグルタミン酸に変化させ
てしまうのである。
式(1)の反応においてα−OG→グルタミン酸の
変化によつてNADHがNAD+になると340nmに
よる吸光度が一旦は減少するがＧ−６−PDHに
よつて再びNADHに変化するために340nmによ
る吸光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつたら
アンモニアが全部消費されたことになる。
変化によつてNADHがNAD+になると340nmに
よる吸光度が一旦は減少するがＧ−６−PDHに
よつて再びNADHに変化するために340nmによ
る吸光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつたら
アンモニアが全部消費されたことになる。
本発明のアンモニア消費群のうちGlDHは必須
であるが助酵素のNAD+を還元する酵素はＧ−６
−PDHに限らずNAD+を助酵素として還元する
酵素であれば任意に選択することができる。例え
ばＧ−６−PDH（EC1.1.1.49）（グルコース−６−
リン酸脱水素酵素） ６−Ｐ−GDH（EC1.1.1.44）（６ホスホグルコ
ン酸脱水素酵素） iC−DH（EC1.1.1.42）（イソクエン酸脱水素酵
素） などがあり、これらを用いる場合はそれぞれ過剰
の基質としてＧ−６−Ｐ、６−PG、イソクエン
酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。
であるが助酵素のNAD+を還元する酵素はＧ−６
−PDHに限らずNAD+を助酵素として還元する
酵素であれば任意に選択することができる。例え
ばＧ−６−PDH（EC1.1.1.49）（グルコース−６−
リン酸脱水素酵素） ６−Ｐ−GDH（EC1.1.1.44）（６ホスホグルコ
ン酸脱水素酵素） iC−DH（EC1.1.1.42）（イソクエン酸脱水素酵
素） などがあり、これらを用いる場合はそれぞれ過剰
の基質としてＧ−６−Ｐ、６−PG、イソクエン
酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。
このように検体中のすでに存在していたアンモ
ニアは消費されクレアチンデイミナーゼの作用に
よつて生成するアンモニアは直接測定できる状態
となつたわけである。
ニアは消費されクレアチンデイミナーゼの作用に
よつて生成するアンモニアは直接測定できる状態
となつたわけである。
次に本発明におけるクレアチニンを定量する場
合の反応系を式(2)で表わせば次の通りである。
合の反応系を式(2)で表わせば次の通りである。
なお太線はアンモニア消費系の反応に関する係
で、細線はクレアチニンデイミナーゼの反応に関
する系である。
で、細線はクレアチニンデイミナーゼの反応に関
する系である。
即ち検体に定量するクレアチニン量に応じた基
質・酵素及び過浄のNADPHを添加して反応せ
しめることによつてクレアチニン量をNADPH
の減少量として340nmによる測定で定量すること
ができる。ここで添加に必須のものとしてはα−
OG並びに牛肝臓GlDHであるが最初のアンモニ
ア消費反応系に添加されていたものを使用するこ
ともできる。最初の添加量が少ないときは、ここ
で追加して添加することもできる。またクレアチ
ニンデイミナーゼの添加も必須である。また
NADPHの添加は必須であつてNADPHの
NADP+への変化によつて生じる340nmの減少に
よつてクレアチニン含量が測定できることにな
る。
質・酵素及び過浄のNADPHを添加して反応せ
しめることによつてクレアチニン量をNADPH
の減少量として340nmによる測定で定量すること
ができる。ここで添加に必須のものとしてはα−
OG並びに牛肝臓GlDHであるが最初のアンモニ
ア消費反応系に添加されていたものを使用するこ
ともできる。最初の添加量が少ないときは、ここ
で追加して添加することもできる。またクレアチ
ニンデイミナーゼの添加も必須である。また
NADPHの添加は必須であつてNADPHの
NADP+への変化によつて生じる340nmの減少に
よつてクレアチニン含量が測定できることにな
る。
反応はPH7.5の緩衝液中で25℃で行なわれる。
式(2)の反応においてクレアチニンがクレアチニン
デイミナーゼによつて分解されアンモニアからα
−OGとともにGlDHによつてグルタミン酸にな
るときにNADPHがNADP+になつて蓄積する。
この時検体中のアンモニアを消費するために添加
されていた、NADHがNADPHと同様に酸化さ
れて、さらにiCDHによつてNADPHにもどると
危惧される。しかしNADHはNADPHに比較し
てごく微量、例えば10分の１以下しか存在しない
ため、iCDHサイクルが回る事は無視できるもの
である。
式(2)の反応においてクレアチニンがクレアチニン
デイミナーゼによつて分解されアンモニアからα
−OGとともにGlDHによつてグルタミン酸にな
るときにNADPHがNADP+になつて蓄積する。
この時検体中のアンモニアを消費するために添加
されていた、NADHがNADPHと同様に酸化さ
れて、さらにiCDHによつてNADPHにもどると
危惧される。しかしNADHはNADPHに比較し
てごく微量、例えば10分の１以下しか存在しない
ため、iCDHサイクルが回る事は無視できるもの
である。
また検体中のアンモニアを消費するために含有
されているiCDHがNADP+を還元すると危惧さ
れるが、ここで含有される酵素は助酵素に高い特
異性を持つものが選ばれているため、その心配は
必要としない。
されているiCDHがNADP+を還元すると危惧さ
れるが、ここで含有される酵素は助酵素に高い特
異性を持つものが選ばれているため、その心配は
必要としない。
生成したNADP+はそのまま340nmの吸光度の
減少によつてクレアチニン含量を測定することが
できる。
減少によつてクレアチニン含量を測定することが
できる。
また尿素の定量もクレアチニンの定量と同様に
行なうことができる。そして他のアンモニア生成
反応系ではクレアチニンの定量と全く同様にアン
モニアを生成する物質を定量することができるも
のである。
行なうことができる。そして他のアンモニア生成
反応系ではクレアチニンの定量と全く同様にアン
モニアを生成する物質を定量することができるも
のである。
このように本発明はクレアチニンの定量におい
て前もつて検体中のアンモニアを消費せしめたた
めに引続き同一検体で直接クレアチニンの定量を
可能としたもので、クレアチニンの自動分析に極
めて適した方法である。
て前もつて検体中のアンモニアを消費せしめたた
めに引続き同一検体で直接クレアチニンの定量を
可能としたもので、クレアチニンの自動分析に極
めて適した方法である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 クレアチニンの定量の場合
α−OG 4.2mM
NADH 0.013mM
イソクエン酸 3.2mM
iCDH 3.2u／ml
GlDH（牛肝臓由来） 38u／ml
以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12mg／
ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝0.96
mg／ml）20μを添加した。それぞれ25℃で５分
間保温した後340nmの吸光度を測定し、吸光度の
変化が停したところで5mM NADPH72μを添
加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡した
後クレアチンデイミナーゼ50μを添加し、
340nmの吸光度の減少を測定した。
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12mg／
ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝0.96
mg／ml）20μを添加した。それぞれ25℃で５分
間保温した後340nmの吸光度を測定し、吸光度の
変化が停したところで5mM NADPH72μを添
加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡した
後クレアチンデイミナーゼ50μを添加し、
340nmの吸光度の減少を測定した。
ΔE；Ａ＝0.042 Ｂ＝0.084 Ｃ＝0.168
Ｄ＝0.335であつた。
これを次式により計算した結果、検体中にすで
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく、検体中のクレアチニン含量が定量され
た。
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく、検体中のクレアチニン含量が定量され
た。
クレアチニン量
mg／ml＝ΔE／6.2×3.142／0.02×113／1000
ΔE＝NADPHの減少による吸光度の減少
6.2＝NADPHの1mMの吸光度
3.11＝全反応液量
0.02＝検体量
113＝クレアチニンの分子量
Claims (1)
- １ 検体にグルタミン酸脱水素酵素、α−オキソ
グルタール酸、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド、及びニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドを還元する酵素と基質を添加混合し、
混合液中にすでに存在するアンモニアを消費せし
め、その際生成されたニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドを、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを還元せしめる酵素を用いて再度還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換せ
しめ、しかる後還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフエート及びクレアチニンデイ
ミナーゼを添加して反応せしめることを特徴とす
るクレアチニンの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050282A JPS5931698A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050282A JPS5931698A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5931698A JPS5931698A (ja) | 1984-02-20 |
| JPH0218077B2 true JPH0218077B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15270126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14050282A Granted JPS5931698A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5931698A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
| US5196087A (en) * | 1991-06-18 | 1993-03-23 | Multimedia Design, Inc. | Method for making multi-layer printed circuit board |
| US5618684A (en) * | 1992-02-07 | 1997-04-08 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of determination of calcium |
-
1982
- 1982-08-14 JP JP14050282A patent/JPS5931698A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5931698A (ja) | 1984-02-20 |
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