JPS6234061A - クレアチニンの定量方法 - Google Patents
クレアチニンの定量方法Info
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- JPS6234061A JPS6234061A JP17312585A JP17312585A JPS6234061A JP S6234061 A JPS6234061 A JP S6234061A JP 17312585 A JP17312585 A JP 17312585A JP 17312585 A JP17312585 A JP 17312585A JP S6234061 A JPS6234061 A JP S6234061A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はクレアチニンの定量方法に関するものである。
更に詳細には、本発明は、検体中にすでに存在するアン
モニアをあらかじめ消費させ、クレアチニンを正確に測
定する方法に関するものである。
モニアをあらかじめ消費させ、クレアチニンを正確に測
定する方法に関するものである。
従来、生体に由来する血液、尿等の検体に存在するクレ
アチニンを定量するには、検体中にすでに存在している
アルカリピクリン酸反応(Jaffe法)を妨害する物
質を、透析処理や樹脂による吸着処理等をして除去した
後、Jaffe法にて定量するか、又は検体中のクレア
チニンをクレアチンに変換せしめる酵素を用いてクレア
チンに変換せしめ、生成したクレアチンを種々の方法に
より定量することによりクレアチニンを定量していた。
アチニンを定量するには、検体中にすでに存在している
アルカリピクリン酸反応(Jaffe法)を妨害する物
質を、透析処理や樹脂による吸着処理等をして除去した
後、Jaffe法にて定量するか、又は検体中のクレア
チニンをクレアチンに変換せしめる酵素を用いてクレア
チンに変換せしめ、生成したクレアチンを種々の方法に
より定量することによりクレアチニンを定量していた。
しかしながら、検体の透析処理は煩雑な上に検体が希釈
される欠点があり、樹脂による吸着処理も操作が煩雑で
あるという欠点もあって、いずれも好ましくない。また
クレアチニンをクレアチンに変換せしめ、生成したクレ
アチンを定量する方法は、クレアチンの定量にすでに3
段階以上もの反応をカップリングさせた多段階の反応系
であり、また検体中のクレアチンをあらかじめ消去せし
めるか、あらかじめ検体の盲検を行なわなければならず
二度手間がかかる上に、検体量が少ない場合は測定でき
ないことになって好ましいものではなかった。
される欠点があり、樹脂による吸着処理も操作が煩雑で
あるという欠点もあって、いずれも好ましくない。また
クレアチニンをクレアチンに変換せしめ、生成したクレ
アチンを定量する方法は、クレアチンの定量にすでに3
段階以上もの反応をカップリングさせた多段階の反応系
であり、また検体中のクレアチンをあらかじめ消去せし
めるか、あらかじめ検体の盲検を行なわなければならず
二度手間がかかる上に、検体量が少ない場合は測定でき
ないことになって好ましいものではなかった。
また、クレアチニンの検出おいては、アンモニアを生成
させ、生成したアンモニアをGl!DH(グルタミン酸
脱水素酵素)によってグルタミン酸に変換し、この際N
ADII (ifi元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド)→NADH+にコチンアミドアデニンジヌク
レオチド)の共役反応によって減少するNADllの量
を340nmで測定して定量していた。
させ、生成したアンモニアをGl!DH(グルタミン酸
脱水素酵素)によってグルタミン酸に変換し、この際N
ADII (ifi元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド)→NADH+にコチンアミドアデニンジヌク
レオチド)の共役反応によって減少するNADllの量
を340nmで測定して定量していた。
しかし、この反応系では必ずアンモニアを生成するため
に、そもそも検体中に存在するアンモニアが測定値に含
まれてしまって、正確な定量を困難にしていた。
に、そもそも検体中に存在するアンモニアが測定値に含
まれてしまって、正確な定量を困難にしていた。
そこで、あらかじめ検体中に存在するアンモニアを前処
理でGΩDHによってα−KG (α−ケトグルタル酸
)と反応させてグルタミン酸に変換させてしまえば問題
はなくなるのである。そして、このアンモニア−グルタ
ミン酸の系にはNAD (P)H4NAD (P)“の
変化を伴なうために、NAD(P)+→NAD (P)
Hの逆反応でNAD(P)Hに戻す必要があり、この際
イソクエン酸を基質として1cDH(イソクエン酸脱水
素酵素)とマグネシウムイオン又はマンガンイオンなど
の金属イオンによって共役反応を生起させることができ
る。この反応系は、次の式(【)に示される。
理でGΩDHによってα−KG (α−ケトグルタル酸
)と反応させてグルタミン酸に変換させてしまえば問題
はなくなるのである。そして、このアンモニア−グルタ
ミン酸の系にはNAD (P)H4NAD (P)“の
変化を伴なうために、NAD(P)+→NAD (P)
Hの逆反応でNAD(P)Hに戻す必要があり、この際
イソクエン酸を基質として1cDH(イソクエン酸脱水
素酵素)とマグネシウムイオン又はマンガンイオンなど
の金属イオンによって共役反応を生起させることができ
る。この反応系は、次の式(【)に示される。
クレアチニン
↓クレアチニナーゼ
式(■)に示されるように、検体中のアンモニアの消費
分解して得たアンモニアの測定は同じ共役反応によって
行うことができるのであるが、検体中のアンモニアの消
費が完了したらNAD(P)+→NAD(P)Hの反応
が完全に停止されてはじめてクレアチニンを分解して得
たアンモニアの正確な定量が行なえるのである。
分解して得たアンモニアの測定は同じ共役反応によって
行うことができるのであるが、検体中のアンモニアの消
費が完了したらNAD(P)+→NAD(P)Hの反応
が完全に停止されてはじめてクレアチニンを分解して得
たアンモニアの正確な定量が行なえるのである。
そこで、問題となるのは、式(I)におけるNAD(P
)H=NAD(P)+においてNAD (P)+→NA
D(P)Hの反応をいかにして完全に停止させるかであ
った。従来、NAD (P)+→NAD(P)Hの反応
を完全に停止させることは知られていなかった。
)H=NAD(P)+においてNAD (P)+→NA
D(P)Hの反応をいかにして完全に停止させるかであ
った。従来、NAD (P)+→NAD(P)Hの反応
を完全に停止させることは知られていなかった。
本発明者らは、上述の式(I)及び式(n)におけるイ
ンクエン酸→αKGの反応を完全に停止させi CD
t( アンモニアを反応生成物とする生体物質を正確に測定す
る方法を求めて鋭意研究したところ、ATP又は/及び
キレート剤の添加によって。
ンクエン酸→αKGの反応を完全に停止させi CD
t( アンモニアを反応生成物とする生体物質を正確に測定す
る方法を求めて鋭意研究したところ、ATP又は/及び
キレート剤の添加によって。
NAD(P)“ NAD(P)HcDIl
の反応を完全に停止させることに成功したのである。
本発明は検体にG Q D l(、α−KG、 NAD
(P)H、イソクエン酸、マグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンなどの金属イオン、およびiC叶を添加温
合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消費せしめ
、次いでATP又は/及びキレート剤を添加し、1cD
II反応を停止し、これと同時もしくはしかる後クレア
チニナーゼを添加して、生成するアンモニアを測定する
ことを特徴とするクレアチニンの定量方法である。
(P)H、イソクエン酸、マグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンなどの金属イオン、およびiC叶を添加温
合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消費せしめ
、次いでATP又は/及びキレート剤を添加し、1cD
II反応を停止し、これと同時もしくはしかる後クレア
チニナーゼを添加して、生成するアンモニアを測定する
ことを特徴とするクレアチニンの定量方法である。
ここで、金属イオンとはマグネシラ11イオン、マンガ
ンイオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオ
ン、カルシウムイオンなどを云うが、これらのイオン種
に制限されることはない。
ンイオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオ
ン、カルシウムイオンなどを云うが、これらのイオン種
に制限されることはない。
また、キレート剤とはEDTAおよびその塩、1,2−
ビス(0−アミノフェノキシ)エタン−N、 N、 N
’、 N’−四酢酸およびその塩、トランス−1,2−
シクロヘキサンジアミン−N、 N、 N’、 N’−
四酢酸およびその塩、ジヒドロキシエチルグリシンおよ
びその塩、1,3−ジアミノプロパノ−ルーN、 N、
N’、 N−四酢酸およびその塩、ジエチレントリア
ミン五酢酸およびその塩、エチレンジアミンジオルトヒ
ドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレンジアミン
ニ酢酸およびその塩、エチレンジアミンニプロピオン酸
およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス(メチI
ノンホスホン酸)およびその塩、グリコールエーテルジ
アミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイミノニ
酢酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、ジアミ
ノプロパン四酢酸およびその塩、ニトリロ三酢酸および
その塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニトリ
ロトリス(メチレンホスホン酸)およびその塩、トリエ
チレンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが、こ
れらのキレート剤に制限されることはない。
ビス(0−アミノフェノキシ)エタン−N、 N、 N
’、 N’−四酢酸およびその塩、トランス−1,2−
シクロヘキサンジアミン−N、 N、 N’、 N’−
四酢酸およびその塩、ジヒドロキシエチルグリシンおよ
びその塩、1,3−ジアミノプロパノ−ルーN、 N、
N’、 N−四酢酸およびその塩、ジエチレントリア
ミン五酢酸およびその塩、エチレンジアミンジオルトヒ
ドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレンジアミン
ニ酢酸およびその塩、エチレンジアミンニプロピオン酸
およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス(メチI
ノンホスホン酸)およびその塩、グリコールエーテルジ
アミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイミノニ
酢酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、ジアミ
ノプロパン四酢酸およびその塩、ニトリロ三酢酸および
その塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニトリ
ロトリス(メチレンホスホン酸)およびその塩、トリエ
チレンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが、こ
れらのキレート剤に制限されることはない。
本発明はATP又は/及びキレート剤の添加によって上
記式(n)9式(III)への変化を行わせるものであ
る。即ち、検体中のアンモニアの完全消費を式(n)で
行わせ、完全消費ののち反応系にATP又は/及びキレ
ート剤を添加し、NAD(P)+→NAD (P)Hi
cDl( の反応を停止させるものである。
記式(n)9式(III)への変化を行わせるものであ
る。即ち、検体中のアンモニアの完全消費を式(n)で
行わせ、完全消費ののち反応系にATP又は/及びキレ
ート剤を添加し、NAD(P)+→NAD (P)Hi
cDl( の反応を停止させるものである。
iC叶の反応を停止させた後は、ATP又は/及びキレ
ート剤の添加と同時もしくはその後で検体中にクレアチ
ニナーゼを添加し、 アンモニアからグルタミ
ン酸への共役反応としてNAD(P)II→NAD(P
)+の反応にともなう340nm吸光度の減少によって
それぞれの物質を定量するものである。
ート剤の添加と同時もしくはその後で検体中にクレアチ
ニナーゼを添加し、 アンモニアからグルタミ
ン酸への共役反応としてNAD(P)II→NAD(P
)+の反応にともなう340nm吸光度の減少によって
それぞれの物質を定量するものである。
反応としては次の式(■)が示される。
本発明においては、検体中のクレアチニンを分解し、N
AD(P)H→NAD(P)+の反応によってNAD
(P)Hを消費して正確な被検物の定量を行うものであ
る。
AD(P)H→NAD(P)+の反応によってNAD
(P)Hを消費して正確な被検物の定量を行うものであ
る。
本発明において用いる、ATP又は/及びキレート剤に
よるiCDH反応の停止は、反応を停止したそのままの
媒質でNAD(P)H→NAD(P)”の反応を用い各
種反応が行える点できわめて有用である。
よるiCDH反応の停止は、反応を停止したそのままの
媒質でNAD(P)H→NAD(P)”の反応を用い各
種反応が行える点できわめて有用である。
反応系に対するATPの添加量は151以上であればよ
い。
い。
また、反応系に対するキレート剤2例えばEDTAの添
加量は1mM以上であればよい。
加量は1mM以上であればよい。
次に、本発明の実施例を示す。
実施例1
α−KG 10 mM
NADH0,16mM
イソクエン酸 5 mM
ADP 0.5 mM
MgCf12 0.5 mMC+QDH50
u/mQ icDfl 2 u/mQ以上を含有
する0、1Mトリエタノールアミン塩酸(pH7,5)
2.4mI2に150mMアンモニアを含む様々な濃
度に調整したクレアチニン含有検体(0〜100mg/
dQ)30μQ添加した。それぞれ37℃で5分間保温
したのちATP、クレアチニナーゼ濃度がそれぞれ20
mM、0.3u/mρになるようにATP、クレアチニ
ナーゼ混液を0.6mu加え分光光度計により37°C
での340nmの1分間における吸収の減少から検体中
のクレアチニンを測定した。その測定結果を下に示す。
u/mQ icDfl 2 u/mQ以上を含有
する0、1Mトリエタノールアミン塩酸(pH7,5)
2.4mI2に150mMアンモニアを含む様々な濃
度に調整したクレアチニン含有検体(0〜100mg/
dQ)30μQ添加した。それぞれ37℃で5分間保温
したのちATP、クレアチニナーゼ濃度がそれぞれ20
mM、0.3u/mρになるようにATP、クレアチニ
ナーゼ混液を0.6mu加え分光光度計により37°C
での340nmの1分間における吸収の減少から検体中
のクレアチニンを測定した。その測定結果を下に示す。
検体番号 1 2 3 4 5 6 7
9 10 11実施例2 α−KG10 mM NADII 0.2mMインクエン酸
5 mM ADP 0.5mM MgCQ2 0.5mM GQDII 50 u/muiCDH2
u/mu 以上を含有する0、1Mトリエタノールアミン塩酸(p
)17.5) 2.4mQに150mMアンモニアを含
む様々な濃度に調整したクレアチニン含有検体(0〜1
000mg/d+2)30μQ添加した。それぞれ37
℃で5分間保温したのちEDTA、クレアチニナーゼ濃
度がそれぞれ5IIIM、0.3u/mflになるよう
にEDTA、クレアチニナーゼ混液を0.6mQ加え分
光光度計により37℃での340nmの1分間における
吸収の減少から検体中のクレアチニンを測定した。その
測定結果を下に示す。
9 10 11実施例2 α−KG10 mM NADII 0.2mMインクエン酸
5 mM ADP 0.5mM MgCQ2 0.5mM GQDII 50 u/muiCDH2
u/mu 以上を含有する0、1Mトリエタノールアミン塩酸(p
)17.5) 2.4mQに150mMアンモニアを含
む様々な濃度に調整したクレアチニン含有検体(0〜1
000mg/d+2)30μQ添加した。それぞれ37
℃で5分間保温したのちEDTA、クレアチニナーゼ濃
度がそれぞれ5IIIM、0.3u/mflになるよう
にEDTA、クレアチニナーゼ混液を0.6mQ加え分
光光度計により37℃での340nmの1分間における
吸収の減少から検体中のクレアチニンを測定した。その
測定結果を下に示す。
検体番号 1 2 3 4 5 6 7
9 10 11実施例3 α−KG 10 mM NADPHO,2mM インクエン酸 10 mM MgCI22 0.5mM GflDll 20 u/mQiCDH
2u/mQ 以上を含有する0、1Mトリエタノールアミン塩酸(p
H7,5) 2.4mMに150mMアンモニアを含む
様々な濃度に調整したクレアチニン含有検体(0〜10
0mg/dQ)30μQ添加した。それぞれ37℃で5
分間保温した後、EDTA、クレアチニナーゼ濃度がそ
れぞれ5mM、0.3u/mQになるようにIEDTA
、クレアチニナーゼ混液を0.6社加え分光光度計によ
り37℃での340nmの1分間における吸収の減少か
ら検体中のクレアチニンを測定した。その測定結果を下
に示す。
9 10 11実施例3 α−KG 10 mM NADPHO,2mM インクエン酸 10 mM MgCI22 0.5mM GflDll 20 u/mQiCDH
2u/mQ 以上を含有する0、1Mトリエタノールアミン塩酸(p
H7,5) 2.4mMに150mMアンモニアを含む
様々な濃度に調整したクレアチニン含有検体(0〜10
0mg/dQ)30μQ添加した。それぞれ37℃で5
分間保温した後、EDTA、クレアチニナーゼ濃度がそ
れぞれ5mM、0.3u/mQになるようにIEDTA
、クレアチニナーゼ混液を0.6社加え分光光度計によ
り37℃での340nmの1分間における吸収の減少か
ら検体中のクレアチニンを測定した。その測定結果を下
に示す。
検体番号 1 2 3 4 5 6 7
9 10 11検体中に存在している高濃度のア
ンモニアの影響を全くうけず被検液中のクレアチニンの
定量が可能となった。
9 10 11検体中に存在している高濃度のア
ンモニアの影響を全くうけず被検液中のクレアチニンの
定量が可能となった。
Claims (1)
- (1)検体にGlDH、NADH(又はNADPH)、
イソクエン酸、マグネシウムイオンまたはマンガンイオ
ンなどの金属イオン、およびiCDHを添加混合し、検
体中にすでに存在するアンモニアを消費せしめ、次いで
ATP又は/及びキレート剤を添加し、iCDH反応を
停止し、これと同時もしくはしかる後クレアチニナーゼ
を添加して、生成するアンモニアを測定することを特徴
とするクレアチニンの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17312585A JPS6234061A (ja) | 1985-08-08 | 1985-08-08 | クレアチニンの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17312585A JPS6234061A (ja) | 1985-08-08 | 1985-08-08 | クレアチニンの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6234061A true JPS6234061A (ja) | 1987-02-14 |
Family
ID=15954593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17312585A Pending JPS6234061A (ja) | 1985-08-08 | 1985-08-08 | クレアチニンの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6234061A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5988220A (en) * | 1996-04-12 | 1999-11-23 | Asahi Organic Chemicals Industry Co., Ltd. | Three-way ball valve |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5921398A (ja) * | 1982-07-26 | 1984-02-03 | Oriental Yeast Co Ltd | 検体の前処理方法 |
| JPS5931697A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | 検体の前処理法 |
| JPS5931698A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量法 |
| JPS5931696A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
| JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPH0675515A (ja) * | 1992-08-26 | 1994-03-18 | Dainippon Printing Co Ltd | 混成型ホログラムとその製造方法 |
-
1985
- 1985-08-08 JP JP17312585A patent/JPS6234061A/ja active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5921398A (ja) * | 1982-07-26 | 1984-02-03 | Oriental Yeast Co Ltd | 検体の前処理方法 |
| JPS5931697A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | 検体の前処理法 |
| JPS5931698A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量法 |
| JPS5931696A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
| JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPH0675515A (ja) * | 1992-08-26 | 1994-03-18 | Dainippon Printing Co Ltd | 混成型ホログラムとその製造方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5988220A (en) * | 1996-04-12 | 1999-11-23 | Asahi Organic Chemicals Industry Co., Ltd. | Three-way ball valve |
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