JPH0218073B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0218073B2 JPH0218073B2 JP12888282A JP12888282A JPH0218073B2 JP H0218073 B2 JPH0218073 B2 JP H0218073B2 JP 12888282 A JP12888282 A JP 12888282A JP 12888282 A JP12888282 A JP 12888282A JP H0218073 B2 JPH0218073 B2 JP H0218073B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ammonia
- sample
- creatinine
- added
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は検体の前処理方法に関するものであ
る。更に詳細には、本発明は尿、血液等の検体中
に存在する目的物質をアンモニア生成系で定量す
るにあたり、予め検体中に存在するアンモニアを
消去せしめる方法に関するものである。
る。更に詳細には、本発明は尿、血液等の検体中
に存在する目的物質をアンモニア生成系で定量す
るにあたり、予め検体中に存在するアンモニアを
消去せしめる方法に関するものである。
従来、生体に由来する尿、血液等の検体に存在
する反応生成物としてアンモニアを生ずる物質、
例えばクレアチニン、尿素等の定量はクレアチニ
ンあるいは尿素と特異的に反応する試薬、例えば
アルカリピロリン酸（クレアチニンの場合：
Taffe法）やジアセチルモノオキシム（尿素の場
合：Fearon反応）を添加し、化学反応により生
じた物質の吸収極大をもつて測定する方法があつ
た。しかしながら、この化学的呈色法は検体中に
目的物質と同様の呈色を示す物質が多数存在する
という欠点があつて好ましくない。
する反応生成物としてアンモニアを生ずる物質、
例えばクレアチニン、尿素等の定量はクレアチニ
ンあるいは尿素と特異的に反応する試薬、例えば
アルカリピロリン酸（クレアチニンの場合：
Taffe法）やジアセチルモノオキシム（尿素の場
合：Fearon反応）を添加し、化学反応により生
じた物質の吸収極大をもつて測定する方法があつ
た。しかしながら、この化学的呈色法は検体中に
目的物質と同様の呈色を示す物質が多数存在する
という欠点があつて好ましくない。
他の方法として、検体中のクレアチニンあるい
は尿素をアンモニアに変換せしめる酵素を用い
て、クレアチニンあるいは尿素をアンモニアに変
換せしめ、生成したアンモニアを定量することに
よりクレアチニンあるいは尿素の量を知る方法が
あつた。しかしこの方法は簡単な方法ながら検体
中にすでに多量のアンモニアが混在するため、正
確に定量できないという欠点があつた。
は尿素をアンモニアに変換せしめる酵素を用い
て、クレアチニンあるいは尿素をアンモニアに変
換せしめ、生成したアンモニアを定量することに
よりクレアチニンあるいは尿素の量を知る方法が
あつた。しかしこの方法は簡単な方法ながら検体
中にすでに多量のアンモニアが混在するため、正
確に定量できないという欠点があつた。
本発明者等は、上記アンモニアの混在する検体
でしかもアンモニアを反応生成物として生じる物
質の定量を研究の結果、本発明に達した。
でしかもアンモニアを反応生成物として生じる物
質の定量を研究の結果、本発明に達した。
即ち、本発明は検体中の目的物質を定量するに
あたり、検体にグルタミン酸脱水素酵素（以下
GlDHという）、２−オキソグルタール酸（以下
α−KGという）、還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエート（以下NADPH
という）そしてニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート（以下NADP+という）を還
元する酵素及び基質を添加混合し、検体中にすで
に存在するアンモニアを消去せしめ、その際生成
されたNADP+を、NADP+を還元せしめる酵素
を用いて再度NADPHに変換せしめることを特
徴とすること。更にはウレアーゼを添加混合する
ことを特徴とする検体の前処理方法を提供する。
あたり、検体にグルタミン酸脱水素酵素（以下
GlDHという）、２−オキソグルタール酸（以下
α−KGという）、還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエート（以下NADPH
という）そしてニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート（以下NADP+という）を還
元する酵素及び基質を添加混合し、検体中にすで
に存在するアンモニアを消去せしめ、その際生成
されたNADP+を、NADP+を還元せしめる酵素
を用いて再度NADPHに変換せしめることを特
徴とすること。更にはウレアーゼを添加混合する
ことを特徴とする検体の前処理方法を提供する。
本発明の特色とするところは、検体中にすでに
存在するアンモニアを、GlDH、α−KG、
NADPHによつてグルタミン酸と水に変化せし
め、その際生成されたNADP+を、NADP+を還
元せしめる酵素を用いて、再度NADPHに変換
せしめる点にあり、更にはウレアーゼによつて尿
素をアンモニアに変質しグルタミン酸と水に変化
せしめその際生成されたNADP+を再度NADPH
に変換せしめる点にある。
存在するアンモニアを、GlDH、α−KG、
NADPHによつてグルタミン酸と水に変化せし
め、その際生成されたNADP+を、NADP+を還
元せしめる酵素を用いて、再度NADPHに変換
せしめる点にあり、更にはウレアーゼによつて尿
素をアンモニアに変質しグルタミン酸と水に変化
せしめその際生成されたNADP+を再度NADPH
に変換せしめる点にある。
ここに本発明のアンモニア消去の反応系の一例
を式(1)で表わす。
を式(1)で表わす。
本発明において検体中に存在するアンモニアを
あらかじめ消去させるには、第一に既存のアンモ
ニアとα−KGより水とグルタミン酸を生成する
系でGlDHが必須となる。この反応系には助酵素
としてNADPHの存在が必須である。しかしこ
のNADPHは後に定量する際の反応生成物であ
るアンモニアにも影響するため、すでに検体中に
存在するアンモニアを予め消去するために必要な
充分量を添加することはできない。
あらかじめ消去させるには、第一に既存のアンモ
ニアとα−KGより水とグルタミン酸を生成する
系でGlDHが必須となる。この反応系には助酵素
としてNADPHの存在が必須である。しかしこ
のNADPHは後に定量する際の反応生成物であ
るアンモニアにも影響するため、すでに検体中に
存在するアンモニアを予め消去するために必要な
充分量を添加することはできない。
そこで本発明は目的物質の定量に影響を及ぼさ
ない程度のNADPH添加量とするため、NADP+
を還元する酵素と基質を反応系に共存させること
によつてNADP+をNADPHに変化せしめ、
NADPHの添加量を極力おさえることによつて
上記問題を解決した。すなわちNADPHの添加
量を少なくするために反応で生成するNADP+を
還元するグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下Ｇ−６−PDHという）等のNADP+を還元する
酵素を過剰のグルコース−６−リン酸（以下Ｇ−
６−Ｐという）等のNADP+を還元する酵素反応
基質と一緒に添加しておいて６−ホスホグルコン
酸（以下６−PGという）を生成させると同時に
アンモニアをα−KGによつて完全に水とグルタ
ミン酸に変化させてしまうのである。
ない程度のNADPH添加量とするため、NADP+
を還元する酵素と基質を反応系に共存させること
によつてNADP+をNADPHに変化せしめ、
NADPHの添加量を極力おさえることによつて
上記問題を解決した。すなわちNADPHの添加
量を少なくするために反応で生成するNADP+を
還元するグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下Ｇ−６−PDHという）等のNADP+を還元する
酵素を過剰のグルコース−６−リン酸（以下Ｇ−
６−Ｐという）等のNADP+を還元する酵素反応
基質と一緒に添加しておいて６−ホスホグルコン
酸（以下６−PGという）を生成させると同時に
アンモニアをα−KGによつて完全に水とグルタ
ミン酸に変化させてしまうのである。
式(1)の反応においてα−KGからグルタミン酸
の変化によつてNADPHがNADP+になると
340nmによる吸光度が一旦は減少するが、Ｇ−６
−PDHによつて再びNADPHに変化するために
340nmによる吸光度は上昇し、吸光度の変化がが
なくなつたらアンモニアが全部消費されたことに
なる。
の変化によつてNADPHがNADP+になると
340nmによる吸光度が一旦は減少するが、Ｇ−６
−PDHによつて再びNADPHに変化するために
340nmによる吸光度は上昇し、吸光度の変化がが
なくなつたらアンモニアが全部消費されたことに
なる。
本発明のアンモニア消費群のうち、GlDHは必
須であるが助酵素のNADP+を還元する酵素はＧ
−６−PDHに限らずNADP+を助酵素として還元
する酵素であれば任意に選択することができる。
須であるが助酵素のNADP+を還元する酵素はＧ
−６−PDHに限らずNADP+を助酵素として還元
する酵素であれば任意に選択することができる。
例えばNADP+の場合はＧ−６−PDH
〔EC1.1.1.49〕、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素
（以下６−PGDHという）〔EC1.1.1.44〕、イソク
エン酸脱水素酵素（以下iCDHという）
〔EC1.1.1.42〕等があり、これらを用いる場合は
それぞれ過剰の基質としてＧ−６−Ｐ、6PG、イ
ソクエン酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。
更には検体中に多量存在するアンモニアを反応生
成物として生ずる尿素をも、検体の前処理として
ウレアーゼを添加することにより尿素を消去せし
めることが出来る。このことは目的物質を定量す
るに用いる酵素がウレアーゼを混在する粗酵素の
時に効果的である。
〔EC1.1.1.49〕、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素
（以下６−PGDHという）〔EC1.1.1.44〕、イソク
エン酸脱水素酵素（以下iCDHという）
〔EC1.1.1.42〕等があり、これらを用いる場合は
それぞれ過剰の基質としてＧ−６−Ｐ、6PG、イ
ソクエン酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。
更には検体中に多量存在するアンモニアを反応生
成物として生ずる尿素をも、検体の前処理として
ウレアーゼを添加することにより尿素を消去せし
めることが出来る。このことは目的物質を定量す
るに用いる酵素がウレアーゼを混在する粗酵素の
時に効果的である。
このようにして、検体中にすでに存在していた
アンモニアは消去され、目的物質よりアンモニア
を生成せしめる酵素の作用によつて生成するアン
モニアは直接測定できる状態となつたわけであ
る。
アンモニアは消去され、目的物質よりアンモニア
を生成せしめる酵素の作用によつて生成するアン
モニアは直接測定できる状態となつたわけであ
る。
このように本発明はアンモニア混在検体中のア
ンモニアを生成せしめる物質の定量において予じ
め検体中に存在するアンモニアを消去せしめたた
めに引続き同一反応系で直接アンモニアを生成せ
しめる物質の定量を可能としたものでアンモニア
を生成せしめる物質の自動分析にきわめて適した
方法である。
ンモニアを生成せしめる物質の定量において予じ
め検体中に存在するアンモニアを消去せしめたた
めに引続き同一反応系で直接アンモニアを生成せ
しめる物質の定量を可能としたものでアンモニア
を生成せしめる物質の自動分析にきわめて適した
方法である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 １
（クレアチニンの定量の場合）
α−KG 4.2mM
NADPH 0.013mM
Ｇ−６−Ｐ 3.2mM
Ｇ−６−PDH（酵母由来） 3.2u／ml
GlDH（牛肝臓由来） 38u／ml
以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12mg／
ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝0.96
mg／ml）20μを添加した。それぞれ25℃で５分
間保温した後340nmの吸光度を測定し、吸光度の
変化が停止したところで、 5mM NADH 72μ を添加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡
した後、 クレアチニンデイミナーゼ 50μ を添加し、340nmの吸光度の減少を測定した。
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12mg／
ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝0.96
mg／ml）20μを添加した。それぞれ25℃で５分
間保温した後340nmの吸光度を測定し、吸光度の
変化が停止したところで、 5mM NADH 72μ を添加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡
した後、 クレアチニンデイミナーゼ 50μ を添加し、340nmの吸光度の減少を測定した。
ΔE；Ａ＝0.042 Ｂ＝0.084 Ｃ＝0.168 Ｄ＝0.335
であつた。
これを次式により計算した結果、検体中にすで
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく検体中のクレアチニン含量が定量された。
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく検体中のクレアチニン含量が定量された。
クレアチニン量
mg／ml＝ΔE／6.2×3.142／0.02×113／1000
ΔE＝NADHの減少による吸光度の減少
6.2＝NADHの1mMの吸光度
3.11＝全反応液量
0.02＝検体量
113＝クレアチニンの分子量
実施例 ２
（クレアチニンデイミナーゼの粗酵素液を用い
てのクレアチニンの定量の場合） α−KG 4.2mM NADPH 0.013mM Ｇ−６−Ｐ 3.2mM Ｇ−６−PDH（酵母由来） 3.2u／ml GlDH（牛肝臓由来） 38u／ml 以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）３mlに2mMアンモニア並びに2mM尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体（0.48
mg／ml）20μを添加した。これを25℃で５分間
保温した後340nmの吸光度を測定し吸光度の変化
が停止したところで、 5mM NADH 72μ を添加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡
した後、 20u／mlクレアチニンデイミナーゼの粗酵素液
50μ を添加し、340nmの吸光度の減少を測定した。こ
のときの吸光度の変化は0.326であつた。この吸
光度変化は、クレアチニン含量の２倍近い値を示
した。
てのクレアチニンの定量の場合） α−KG 4.2mM NADPH 0.013mM Ｇ−６−Ｐ 3.2mM Ｇ−６−PDH（酵母由来） 3.2u／ml GlDH（牛肝臓由来） 38u／ml 以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）３mlに2mMアンモニア並びに2mM尿素を
含むように調整したクレアチニン含有検体（0.48
mg／ml）20μを添加した。これを25℃で５分間
保温した後340nmの吸光度を測定し吸光度の変化
が停止したところで、 5mM NADH 72μ を添加し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡
した後、 20u／mlクレアチニンデイミナーゼの粗酵素液
50μ を添加し、340nmの吸光度の減少を測定した。こ
のときの吸光度の変化は0.326であつた。この吸
光度変化は、クレアチニン含量の２倍近い値を示
した。
一方、クレアチニン含有検体を添加した際にウ
レアーゼを検体当り10u添加した場合についても
同様の操作を行ない340nmの吸光度の減少を測定
したところ0.168であつた。この吸光度変化はク
レアチニン含量に一致した。
レアーゼを検体当り10u添加した場合についても
同様の操作を行ない340nmの吸光度の減少を測定
したところ0.168であつた。この吸光度変化はク
レアチニン含量に一致した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 検体中の目的物質を定量するにあたり、検体
にグルタミン酸脱水素酵素、２−オキソグルター
ル酸、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフエート、そしてニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフエートを還元する酵素及
び基質を添加混合し、検体中にすでに存在するア
ンモニアを消去せしめ、その際生成されたニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエートを
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ートを還元せしめる酵素を用いて再度還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート
に変換せしめることを特徴とする検体の前処理方
法。 ２ 更にウレアーゼを添加混合する特許請求の範
囲第１項記載の検体の前処理方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12888282A JPS5921398A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 検体の前処理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12888282A JPS5921398A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 検体の前処理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5921398A JPS5921398A (ja) | 1984-02-03 |
| JPH0218073B2 true JPH0218073B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=14995682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12888282A Granted JPS5921398A (ja) | 1982-07-26 | 1982-07-26 | 検体の前処理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5921398A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0673476B2 (ja) * | 1985-07-02 | 1994-09-21 | オリエンタル酵母工業株式会社 | イソクエン酸脱水素酵素反応の停止方法 |
| JPS6234060A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | 尿素の定量方法 |
| JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
-
1982
- 1982-07-26 JP JP12888282A patent/JPS5921398A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5921398A (ja) | 1984-02-03 |
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