JPH0218079B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な基質、すなわちオリゴサツカラ
イド誘導体を基質として使用することを特徴とす
るα−アミラーゼ活性の測定方法に関するもので
ある。 試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、血液、尿
中のα−アミラーゼ活性は医学上の診断において
重要である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎に
おいては、血液、尿中のα−アミラーゼ活性は通
常の値に比べて著しい上昇を示す。 α−アミラーゼ活性の測定方法については、こ
れまでに種々の方法が発表されているが、主に、
アミロクラスチツク法、クロモゲニツク法、サツ
カロゲニツク法の３群に分類することができる。 アミロクラスチツク法のうちではキヤラウエイ
法が最も広く使用されてきたが、共存タンパクが
デンプンとヨードの呈色を阻害するため、又反応
時間が短いため再現性が悪い等の問題点がある。 クロモゲニツク法は一般にブルースターチ法と
呼ばれ、デンプン又はアミロースに色素を結合し
た不溶性基質を用い酵素反応で生成する可溶性色
素を測定する方法である。この方法は、最近広く
使用されているが、基質としての活性が弱いこ
と、不溶性であるため反応系が不均一であるこ
と、繁雑な操作が必要であり自動分析装置への適
用が困難であること等の問題点がある。 サツカロゲニツク法ではソモジー法が代表的で
あるが、試料中のグルコースにより高値を示す、
操作が繁雑である等の問題がある。 このように従来のα−アミラーゼ活性の測定方
法には各々に個有の欠点があるが、さらに共通し
て、基質に使用しているデンプンの品質により測
定値にバラツキが生じる、又α−アミラーゼ反応
を真に化学量論的反応として測定できないという
欠点がある。 デンプンは広く知られるようにアミロースと呼
ばれるα−１，４結合による直鎖状のグルカンと
アミロペクチンと呼ばれるα−１，６結合による
分岐を有するグルカンの混合物である。アミロー
スとアミロペクチンの混合比率、分子量、分岐
度、分岐構造は原料植物の種類、収獲時期、産地
等により異なり、不均一な混合物である。 不均一なデンプンを基質に使用する場合は、化
学量論的反応とはならず、α−アミラーゼの動力
学を検知することはできない。 α−アミラーゼの動力学的検知はグルコース鎖
が４個から７個までのオリゴサツカライドの使用
によつてなされる。 最近、デンプンの代わりに、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、
マルトヘプタオース等のオリゴサツカライドを基
質に用いる方法（特開昭50−56998号公報、特開
昭53−37096号公報）、又はＰ−ニトロフエノール
等の色原体を還元末端に結合したオリゴサツカラ
イドを用いる方法（特開昭54−51892号公報）等、
均一で構造の明確な基質を用いる方法が発表され
ている。 これらの方法では通常、測定用共役酵素として
α−グルコシダーゼ（E.C.3.2.1.20，α−Ｄ−グ
ルコシドグルコヒドロラーゼ）又はグルコアミラ
ーゼ（E.C.3.2.1.3，１，４−α−Ｄ−グルカング
ルコヒドロラーゼ）を必要とする。 これらの共役酵素は、α−１，４−グリコシド
結合を有する糖鎖の非還元性末端からα−１，４
−グリコシド結合を加水分解するエキソタイプの
酵素であり、α−アミラーゼ反応に関係なく基質
を分解してしまう欠点を有する。この結果、測定
用試液が不安定であり、試薬盲検値が極めて高く
測定精度を著しく悪くしていた。さらに測定に充
分なグルコアミラーゼ、あるいはα−グルコシダ
ーゼを使用できず、正確な測定法の組立が困難で
あつた。 本発明者らはかかる欠点を有するグルコース鎖
が４〜７個のオリゴサツカライドに対し、これら
のオリゴ糖の非還元末端グルコースの６位の一級
アルコール−CH₂OHを−CH₂NHRに置換した
基質を合成した。この基を導入することにより、
本基質並びに、α−アミラーゼ作用の結果生成す
る、−CH₂NHR基を有する生成物を分光光度的に
検出することが可能であり、また本基質（以下、
修飾オリゴ糖という。）がα−アミラーゼの親和
性に優れており良好な基質となること、グルコア
ミラーゼ又はα−グルコシダーゼの基質とならな
いことを発見し本発明を完成するに至つた。 すなわち本発明は、α−アミラーゼ活性を測定
するに際し、グルコースが４〜７個からなる直鎖
状オリゴサツカライドの非還元末端グルコースの
６位の一級アルコール（−CH₂OH）が一般式−
CH₂NHRで表わされる基で置換された、下記構
造式（）を有するオリゴサツカライド誘導体を
基質として使用することを特徴とするα−アミラ
ーゼ活性の測定方法である。 （式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｎ
は２〜５の整数であり、Ｒは、グルコースが４〜
７個からなる直鎖状オリゴサツカライドの非還元
末端グルコースの６位に一級アルコール（−
CH₂OH）を有していてこれが一般式−
CH₂NHRで表わされる基で置換されると構造式
(1)を有するオリゴサツカライド誘導体となるアル
コール（−CH₂OH）が酸化されて相当するアル
デヒド（−CHO）となつた酸化多糖体のアルデ
ヒド（−CHO）と反応してシツフ塩基を形成す
るアミノ基を有する有機残基を表わす。） 以下、本発明について例を挙げて詳細に説明す
る。 先ず、本発明に使用する修飾オリゴ糖について
述べると、デキストリンを原料とし、ジメチルス
ルホキシドとＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドでデキストリンのグルコース単位の第１
級アルコールを部分的に酸化する。例えば、グル
コース基約30個に１個の割合で酸化する。本反応
はJones，Ｇ・Ｈらの方法〔Method in
Carbohydrate Chemistry Vol.Vl 315〜322頁
（1972）Academic Press，New York〕による。 酸化反応はシユウ酸を加えて停止させ、次いで
２−アミノピリジンなどの本発明に係る有機アミ
ン、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え95℃に
加熱し約20分反応させる、反応混合物に水を加
え、生じる沈澱を別して除き、この液に塩酸
を加えPHをいつたん約1.0としシアノ水素化ホウ
素ナトリウムを分解した後、PHを中性にし、この
液をBiogel ｐ−２を充填したカラムを使用しゲ
ル過し高分子（修飾デキストリン）画分を集め
る。 この修飾デキストリンにBacillus subtilis由来
の液化タイプのα−アミラーゼを約PH5.5の緩衝
液中、37℃で約30分反応後、反応液を70℃以上の
温度で、20〜60分加熱し、α−アミラーゼを失活
させる。加熱処理後、反応液を約20℃程度まで冷
却させ、液のPHを６〜８の中性に調整後、α−グ
ルコシダーゼ又はグルコアミラーゼを加え37℃で
20〜50時間作用させ、α−アミラーゼの作用によ
り生成した修飾オリゴ糖をうる。 この反応を一般化し一般式を次に示す。 （式中、Ｇはグルコース単位を示し、Ｘは

【式】などの−CH₂NHRで示 される基を表わす。また、ｌ，ｍ，ｎは０あるい
は正の整数を表わす。） 次に、この混合物を濃縮し、Biogel Ｐ−４を
充填したカラムを用い、カラムクロマトグラフイ
ーで修飾オリゴ糖、即ちピリジールアミノ基など
の−NHR基が非還元末端に入つたマルトテトラ
オース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオースの各分画を得ることがで
きる。 即ち、本製法を要約すれば、デキストリンの第
１級アルコール（−CH₂OH基）を酸化してアル
デヒド（−CHO）とした後、２−アミノピリジ
ンなどの本発明に係る有機アミンを作用させシツ
フの塩基とし、還元して修飾デキストリンを得
る。次いで酵素的加水分解により、目的とする修
飾オリゴ糖を得る。 本製法に於いて、原料の多糖体としてはα−
１，４−グリコシド結合を有する長鎖の糖ならば
いずれも使用でき、デキストリンの他、デンプ
ン、アミロース等も同様に原料としうる。 また、酸化多糖体から修飾多糖体を得る工程に
於いては、２−アミノピリジンの他にも酸化多糖
体中のアルデヒドとシツフ塩基を形成するアミノ
基を有する化合物（本発明に係る有機アミン）な
らいずれも有効に使用できるが、２−アミノピリ
ジンのほかに例えば３−アミノピリジン、アニリ
ン、２−ヒドロキシアニリン、アミノ安息香酸、
メチルアニリン等が挙げられる。この場合最終的
に得られる修飾オリゴ糖はそれぞれに対応する基
で修飾されたオリゴ糖となる。即ち、本発明に係
る修飾オリゴ糖の例を挙げると、２−ピリジルア
ミノ基又は３−ピリジルアミノ基などのピリジル
アミノ基修飾オリゴ糖、アニリノ基修飾オリゴ
糖、２−ヒドロキシアニリノ基などのヒドロキシ
アニリノ基修飾オリゴ糖、カルボキシフエニルア
ミノ基修飾オリゴ糖、メチルアニリノ基などのア
ルキルアニリノ基修飾オリゴ糖が挙げられる。 修飾デキストリンをオリゴ糖に加水分解する目
的でα−アミラーゼを使用するが、種類は特に限
定されず、例えば動物の膵臓、微生物由来のアミ
ラーゼを使用することができる。前述のBacillus
subtilis由来の液化タイプのアミラーゼはグルコ
ース鎖10個程度のオリゴ糖の状態で反応が停止す
るかあるいは遅くなるため、生成物をコントロー
ルするのが容易であり有効に使用することができ
る。 本修飾オリゴ糖を使用したα−アミラーゼの測
定例として、高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）法、分光光度法を挙げ、その測定原理
と特徴を示すが、本修飾基質の使用範囲を限定す
るものではない。 〔〕 高速液体クロマトグラフイー（HPLC）
法 ピリジールアミノ基が螢光を有する（励起波長
320nm、螢光波長400nm）ことに着目、これを利
用し、本修飾基質を用いα−アミラーゼ反応させ
た後、生成した非還元末端グルコースにピリジー
ルアミノ基が入つた短鎖（グルコース基が２また
は３個）の修飾オリゴ糖を含む液をHPLCにか
け、その流出ピークを同様に操作した活性値既知
の標準検体の流出ピークと比較することによりα
−アミラーゼ活性を求めることができる。 HPLCに於いて、カラム、溶出液は特に限定さ
れないが、カラムはTSK−Gel LS 410，5μm，
C18（Toyosoda Co）、溶出液は0.1％ ｎ−ブタ
ノールを含む0.1M酢酸が効果的に使用すること
ができる。 本発明の修飾オリゴ糖をHPLC法によるα−ア
ミラーゼ活性測定用基質として用いることにより
以下の(イ)〜(ホ)の利点を有する測定法の組立てが可
能になる。 (イ) 修飾オリゴ糖は水に易溶で、α−アミラーゼ
との反応性が高い。 (ロ) 本発明の方法では、単一の化合物を基質とす
ることから、反応の化学量論が成立し、α−ア
ミラーゼの動力学を検知することができる。 (ハ) 本法ではα−アミラーゼ反応に続く共役酵素
系を使用しない為、α−アミラーゼの動力学を
検知することが容易である。 (ニ) 本法ではα−アミラーゼ反応で生成するピリ
ジールアミノ基又はその他の修飾基を有するグ
ルコース単位２または３個のオリゴ糖を分離し
た上測定するため、血中に既存のグルコース等
の影響を受けない。 (ホ) ケイ光光度法で検知を行うため高感度測定が
可能であり、微量検体で測定できる。 〔２〕 分光光度法 グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼはエ
キソタイプの酵素であるため本修飾基質を基質と
できない。これに対しα−アミラーゼはオリゴサ
ツカライドの任意のα−１，４グリコシド結合を
加水分解するエンド型酵素であり、本修飾基質を
基質とできるため、α−アミラーゼの酵素作用に
よつて修飾基質が加水分解されて非環元末端が新
たに生成する。この新たに生成した非還元末端に
対してα−グリコシダーゼ又はグルコアミラーゼ
が作用してグルコースが生成し、生成したグルコ
ース量を測定することによりα−アミラーゼ活性
を知ることが出来る。 グルコースの定量方法は多数知られており、こ
れらの方法のいずれも使用できることは言うまで
もない。 主なグルコースの定量方法を示す。 まずグルコースにグルコースオキシダーゼを作
用させると酸化され、同時に過酸化水素が生じ
る。生成した過酸化水素は共存するペルオキシダ
ーゼを介して色原体を定量的に酸化し、生成した
酸化型色原体の呈色を比色することにより反応液
中のグルコース量を測定することができる。以下
に反応式を示す。 ブドウ糖＋O₂＋H₂O グルコースオキシダーゼ ――――――――――――→ H₂O₂＋グルコン酸 H₂O₂＋色原体 ペルオキシダーゼ ― ― ― ― ― ― ― ― ― → 酸化型色原体＋H₂O また、グルコースはATP存在下ヘキソキナー
ゼによつてグルコース−６−リン酸となる。生成
したグルコース−６−リン酸はNAD共存下、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素によつて６−ホ
スホグルコノラクトンとなり、一方NADは還元
されNADHとなるのでこのNADHの340nm付近
に於ける吸光度の増加を測定することにより、反
応液中のグルコース量を測定することが出来る。
以下に反応式を示す。 グルコース＋ATPヘキソナーゼ ― ― ― ― ― ― ― → Mg²⁺グルコース−６−リン酸＋ADP グルコース−６−リン酸＋NADグルコース−６−リン
酸脱水酵素 ――――――――――――――――→ ６−ホスホグルコノラクトン＋
NADH ATP；アデノシン−5′−トリリン酸塩 ADP；アデノシン−5′−ジリン酸塩 NAD；β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド NADH；還元型−β−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド 本修飾オリゴ糖を用いた分光光度法によるα−
アミラーゼ活性測定法に於いて、α−アミラーゼ
と同時に又はこれに次いで共役酵素のグルコアミ
ラーゼ、又はα−グルコシダーゼを作用させ生成
するグルコースを測定するが、この方法では検体
特に血清、尿などの生体試料に共存するグルコー
スの影響を受け正確な測定値が得られない可能性
があり、α−アミラーゼの反応に先行して、既存
グルコースを消去することは本測定法を実施する
上で有効な手段となる。 消去の方法としてはグルコースオキシダーゼー
カタラーゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方
法（特開昭57−47495号公報）、グルコースペルオ
キシダーゼによる方法等、種々の方法があり、い
ずれの方法も自由に組合せることが可能である。 また本修飾オリゴ糖を基質とし、α−アミラー
ゼを作用させ生成するマルトースを測定すること
によりα−アミラーゼ活性を測定することができ
る。マルトースの測定は、例えば特開昭52−
119296に記載の測定系による。 本発明の修飾オリゴ糖を分光光度法によるα−
アミラーゼ活性測定用基質として用いることによ
り以下の利点を有する測定法の組立てができる。 (イ) 本修飾オリゴ糖は水に易溶で、α−アミラー
ゼとの反応性が高い。 (ロ) 本発明の方法では、単一の化合物を基質とす
ることから、反応の化学量論が成立し、α−ア
ミラーゼの動力学を検知することができる。 (ハ) 本発明に使用する修飾オリゴ糖はグルコアミ
ラーゼ（またはα−グルコシダーゼ）の基質と
はならずα−アミラーゼの特異基質である為、
副反応が起らず、試薬盲検値は極めて小さい。 (ニ) グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼの充
分量が使用可能なため、α−アミラーゼ反応以
降の反応が速く、正確なレイトアツセイができ
る。 (ホ) 測定用試液が安定である。 (ヘ) 自動分析装置への適応性が良い。 次に実施例を示し、さらに詳しく説明する。 実施例 １ 修飾オリゴ糖の調製 ジメチルスルホキシド250mlにデキストリン10
ｇとＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド
15ｇを溶解し、これにジクロル酢酸１mlとジメチ
ルスルホキシド12.5mlの混合液を加え、よく混合
し20〜25℃で40分間反応させる。メタノール25ml
にシユウ酸（２水塩）6.3ｇを溶解した液を加え、
反応を停止する。この反応混合液に２−アミノピ
リジン溶液（２−アミノピリジン60ｇ、水90ml、
酢酸24mlそしてシアノ水素化ホウ素ナトリウム24
ｇを混合した液）を加え95℃で20分間加熱する。
加熱反応後水１を加え、沈澱を生じさせ、別
する。この液を６規定塩酸でPH1.0とし、過剰
のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを分解後、６規
定アンモニア水でPH7.0に調整し、真空で濃縮す
る。この濃縮物の一部350mgをとり、水に溶解し、
ゲル過する。カラムは10mM重炭酸アンモニウ
ムで平衡化したBiogel Ｐ−２（Bio Rad社製）
を充填した直径2.6cm、高さ113cmのものを使用
し、このカラムを２度通した。このカラム操作を
３回行い（濃縮物のチヤージ量は各350mg）高分
子画分を集め凍結乾燥した。ここでの収量は約
700mgであり、0.1M酢酸中での310nmの吸光度か
ら修飾はグルコース単位で3.1％であつた。修飾
化度の測定はHase，S.らの方法〔J.Biochem.85．
217.（1979）〕によつた。 この修飾デキストリン470mgを水15mlに溶解し、
33mM酢酸−酢酸カルシウム緩衝液（PH5.5）90
mlと混合し、これにBacillus Subtilis由来の液化
タイプアミラーゼ50単位を加え37℃で25分間イン
キユベートする。その後、100℃で15分間加熱し
アミラーゼを不活化した後、グルコアミラーゼ
150単位を加え37℃で24時間インキユベートし、
さらにグルコアミラーゼ150単位を追加し、24時
間インキユベートを行う。 この加水分解物を濃縮し、20mM酢酸で平衡化
したBio gel Ｐ−４（Bio Rad社製）を充填した
カラムを用いクロマトを行う。カラムは直径1.9
cm高さ212cmのものを使用した。 修飾オリゴ糖のグルコース鎖４〜７個の各分画
を集め凍結乾燥した。 基質の精製はHPLCにTSK−Gel LS410 5μm
C18を充填したラージカラム（７×300mm）を使
用し、溶出液に0.045％ｎ−ブタノールを含む
0.1M酢酸アンモニウム緩衝液（PH3.9）を使用
し、3.0ml／minの流速で行つた。 構造の確認 修飾オリゴ糖は水素化ホウ素酸ナトリウムで還
元したのち1.5N塩酸含有メタノール溶液中で90
℃、４時間加熱分解した後、次いでピリジン中で
トリメチルシリル化する。そしてガスクロマトグ
ラフイーにより測定した。カラムはChromosorb
Ｗに２％OV−17をコーテイングした80〜100メ
ツシユ（0.5×300cm）を使用し、120℃から185℃
までの昇温（４℃／min）クロマトグラフイーで
測定した。同様に操作したマルトースを標準とし
て、グルコースとグリシトールの割合より各画分
のグルコースの個数１，２，３，４そして５を求
め、これよりオリゴ糖のグルコース鎖長３，４，
５，６そして７を決めた。（それぞれFG3、FG4、
FG5、FG6、FG7と略号をつけた。） また各修飾オリゴ糖はグルコアミラーゼで加水
分解されないところから非還元末端に修飾基（ピ
リジールアミノ基等。）が入つていることが考え
られる。そこで、 FG3〜７の各画分について、箱守法による完全
メチル化〔生化学実験講座４、糖質の化学（下
巻）P.506、東京化学同人〕を行つた後、酸で加
水分解し、ガスクロマトグラフイーによりメチル
ー２，３，４，６−テトラ−０−メチルグルコシ
ドが全く生成していないことを確認した。 さらにFG3とFG5の画分をとり、0.1M酢酸ナ
トリウム−10mM酢酸カルシウム緩衝液PH5.5に
溶解し、タカアミラーゼを加え37℃で３時間加熱
して加水分解した。そしてこの水解物をHPLC及
びTLCで調べた結果FG5からはFG3とマルトー
スを生成したが、FG3はタカアミラーゼで加水分
解を受けなかつた。またFG3を0.3N塩酸に加え
100℃で30分間加水分解したところ、生成物はマ
ルトース、グルコースと２種のケイ光を有する化
合物を得、マルトトリオースは生成しなかつた。 実施例 ２ 試 薬 (1) 試液１ 酢酸ナトリウム100mmol、酢酸カルシウム
10mmol、実施例１で調製した非還元末端にピリ
ジールアミノ基が入つたマルトペンタオース
0.36mmolをとり精製水に溶かして水酸化ナトリ
ウムでPH5.5とし全量を１とする。 測定操作 試液１ 500μlに検体血液5μlを加え、37℃で15
分間加温する。この反応液を高速液体クロマトグ
ラフイーにかけ、非還元末端グルコースにピリジ
ールアミノ基が入りグルコース３個の修飾オリゴ
糖の生成量をピーク面積から求める。別にα−ア
ミラーゼ活性既知の標準検体を用い上記と同様に
操作し、検量関係を求め、この検量線から検体の
α−アミラーゼ活性を求める。 このときの標準検体の各希釈段階に於けるα−
アミラーゼ活性（Somogyi単位／dl）と遊離した
FG3の量（μM）との関係を第１図に示す。標準
検体のα−アミラーゼ活性は200Somogyi単位で
ある。 液体クロマトグラフイーのカラムはTSK−Gel
LS410、5μm、C18（４×300mm、Toyosoda
Co.）、流出液は0.1％ｎ−ブタノールを含有の
0.1M酢酸水溶液を使用、流出速度は1.7ml／min
で室温で行つた。 実施例 ３ 試 薬 (1) 試液２ グツド緩衝液（PIPES）40mmol、グルコアミ
ラーゼ５万単位、グルコースオキシダーゼ10万単
位、ムタロターゼ200単位、カタラーゼ50万単位、
４−アミノアンチピリン0.7mmol、塩化ナトリウ
ム15mmol、塩化カルシウム5mmolをとり精製水
に溶かして水酸化ナトリウムでPH6.9とし全量を
１とする。 (2) 試液３ グツド緩衝液（PIPES）40mmol、ペルオキシ
ダーゼ15000単位、塩化ナトリウム15mmol、塩
化カルシウム5mmol、実施例１で調製した非還
元末端にピリジールアミノ基が入つたマルトペン
タオース３ｇ、窒化ナトリウム15mmol、フエノ
ール10mmolをとり精製水に溶かして水酸化ナト
リウムでPH6.9とし全量を１とする。 測定方法 試液２の２mlに検体血清20μlを加え、37℃で５
分間加温する。これに試液３の１mlを加え、37℃
で反応させ505nmに於ける２分後から５分後まで
の３分間の吸光度変化（ΔE／分）を測定する。 別にα−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い
上記と同様に操作して検量線を作製し、この検量
線から検体のα−アミラーゼ活性を求める。 この時の検量線を第２図に示す。標準検体のα
−アミラーゼ活性は500Somogyi単位である。 試薬盲検の３分間当りの吸光度変化を、基質に
ピリジールアミノ基が入つたマルトヘキサオース
を使用した場合とマルトヘキサオースを使用した
場合とで比較し以下に比較例として示す。 比較例 １ (1) 試液４ 実施例３の試液２に同じ (2) 試液５ 実施例３の試液３における非還元末端にピリジ
ールアミノ基が入つたマルトペンタオースの代わ
りに非還元末端にピリジールアミノ基が入つたマ
ルトヘキサオースを用い、以下試液３に同じ。 (3) 試液６ 実施例３の試液３における非還元末端にピリジ
ールアミノ基が入つたマルトペンタオースの代わ
りにマルトヘキサオースを用い、以下試液３に同
じ。 測定方法 試液４の２mlに精製水20μlを加え、37℃で５分
間加温する。これに試液５の１mlを加え、37℃で
反応させ505nmに於ける２分後から５分後までの
３分間の吸光度変化（ΔE／分）を測定する。 又、試液５の代わりに試液６を用い上記と同様
に測定する。 結果を表１に表わす。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２におけるα−アミラーゼ活
性（Somogyi単位／dl）と遊離したFG3の量
（μM／min）との関係を表わす。第２図は、実施
例３におけるα−アミラーゼ活性（Somogyi単
位／dl）と505nmにおける吸光度変化（ΔE／
min）との関係を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ α−アミラーゼ活性を測定するに際し、グル
   コースが４〜７個からなる直鎖状オリゴサツカラ
   イドの非還元末端グルコースの６位の一級アルコ
   ール（−CH₂OH）が一般式−CH₂NHRで表わ
   される基で置換された下記構造式(1)を有するオリ
   ゴサツカライド誘導体を、基質として使用するこ
   とを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法。 （式中、右端のグルコース単位は還元性基、ｎ
   は２〜５の整数、であり、Ｒは、グルコースが４
   〜７個からなる直鎖状オリゴサツカライドの非還
   元末端グルコースの６位に一級アルコール（−
   CH₂OH）を有していてこれが一般式−
   CH₂NHRで表わされる基で置換されると構造式
   (1)を有するオリゴサツカライド誘導体となるアル
   コール（−CH₂OH）が酸化されて相当するアル
   デヒド（−CHO）となつた酸化多糖体のアルデ
   ヒド（−CHO）と反応してシツフ塩基を形成す
   るアミノ基を有する有機残基を表わす。） ２ 構造式(1)を有するオリゴサツカライド誘導体
   の、一般式−CH₂NHRで表わされる基のＲが
   【式】である特許請求の範囲第１項記載の 測定方法。