JPS6030697A - α―アミラーゼ活性の新規測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ａ−アミラーゼ活性の測定方法及び試薬に関
する。

生体試料など被検試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、
血液、尿中のα−アミラーゼ活性は医学上の診断に於い
て重要である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎におい
ては、血液、尿中のα−アミラーーゼ活性は通常の値に
比べて著しい上昇を示す。

α−アミラーゼ活性の測定法については、これまでに種
々のものが発表されているが、主に、アミロクラスチッ
ク法、クロモダニツク法、サツカロダニツク法の３群に
分類することができる。

アミロクラスチック法のうちではキャラウェイ法が最も
広く使用されてきたが、共存タンパクがデンプンとヨー
ドとの呈色を阻害するため、又、反応時間が短いため再
現性が悪い等の問題点がある０ クロモダニツク法は一般にブルースターチ法と呼ばれ、
デンプン又はアミロースに色素を結合した不溶性基質を
用い酵素反応で生成する可溶性色素を測定する方法であ
る。この方法は、最近広く使用されているが、基質とし
ての活性が弱いこと、不溶性であるため反応系が不均一
であること、繁雑な操作が必要であり自動分析装置への
適用が困難であること等の問題点がある。

サノ力ロゲニツク法ではメモジー法が代表的であるが、
試料中のグルコースにより高値を示す、操作が繁雑であ
る等の問題がある。

このように従来のα−アミラーゼ活性の測定法には各々
に個有の欠点がある。

又、α−アミラーゼは、α−１，４−グリコシド結合鎖
を加水分解する酵素であるので、デンプン、アミロース
、グリコーゲン等のα−１，４−グリコシド結合を有す
る多糖類、あるいはこれらの基質に修飾基が導入された
修飾基質に対して作用するが、α−アミラーゼにこれら
の基質のうち修飾基質を作用させ、グルコアミラーゼを
共役酵素として用い、生成するグルコースを測定してα
−アミラーゼ活性をめる方法がある。従来、この方法は
一定条件に於ける反応速度を分光学的にとらえ測定する
、いわゆるレイト・アッセイ（ＲａｔｅＡｓｓａｙ　）
法が主として行われていた。

本発明者らは、このようなレイト・アッセイ法を与える
修飾基質を用いる反応を効果的に停止させることができ
る停止剤が見出されれば、ワンポイントアッセイ法によ
るα−アミラーゼ活性の測定方法及び試薬が容易に得ら
れる点に着目し、そのような反応停止剤にイ」鋭意研究
の結果、一般式Ｏ〕で示される化合物又はその塩が、そ
のような反応停止剤として極めて効果的であることを見
出し、Ｈ□−ＣＨ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’　−一般式　〔１〕２ （ただし、Ｒ１−Ｒ４は水素又は−ＯＨ基を有していて
もよい炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）即ち、
本発明は、グリコアミラーゼを共役酵素として用いてα
−アミラーゼの酵素活性を測定するにあたり、反応進行
時に反応停止剤として一般式印で示される化合物又はそ
の塩を用いて酵素反応を停止させるワンポイントアッセ
イ法によってα−アミラーゼの酵素活性を定量的に測定
することを特徴とする、α−アミラーゼ活性の測定方法
及び試薬である。

本発明によると、グルコアミラーゼ活性を効果的に停止
させることができるので、正確で再現性のよい値で、α
−アミラーゼ活性を、定限的に測定することができる。

本発明において反応停止剤として用いることができる一
般式〔１〕で示される化合物を例示すると（１）乃至（
８）である。

（１）２〜アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プ
ロパンジオール（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン） ＣＨＯＨ １′ ＨＯＣＨ２〜Ｃ−ＮＨ２ ＣＨＯＨ （２）　２〜アミノ−１，３−プロパンジオ−ルＨＯＣ
Ｈ２−Ｃ−ＮＨ２ ＣＩ−Ｉ　０Ｈ （３）２〜アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオ
ール ＣＨ３ ＨＯＣＨ２−Ｃ−ＮＨ２ ＣＨ，，０Ｈ （４）２−アミノ−２−エチル−１，３−ブロノくンジ
オール ２Ｈ５ ＨＯＣＨ２−Ｃ−ＮＨ２ ＣＨ２０Ｈ （５）２−アミノ−１，４−ブタンジオール■ ＨＯＣＨ２−Ｃ−Ｃ２Ｈ４ＯＨ Ｈ２ （６）モノエタノールアミン ■ ＨＯＣＨ２−Ｃ−ＮＨ２ （７）ジェタノールアミン ＮＨ（Ｃ２Ｈ４０Ｈ）２ （８）トリエタールアミン Ｎ（Ｃ２Ｈ４０Ｈ）３ （１）乃至（８）で示される化合物は、塩好ましくは塩
酸又は硫酸等の鉱酸、あるいは、マレイン酸又は蓚酸等
の有機酸の塩として使用することもできる。

これらの化合物のうち、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンについては、グルコアミラーゼに対し活性阻
害作用を有することが確められている。

たとえば、文献アグリカルチャー　バイオロジカル　ケ
ミストリー土１，２１４９〜２１６１（１９７７）（Ａ
ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　４±、２１４９
〜２１６１（１９７７））によると、特に１リス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンがグルコアミラーゼに対し
活性阻害作用を有し、その活性阻害作用をアスペルギル
ス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒ
ｉ　）由来のグルコアミラーゼ０３９単位をトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン５０ｍＭとｐＨ５，３，
３７℃で５分間加温したのち、可溶性でんぷん（０２％
）を加え生成するブドウ糖の量から残存活性を測定する
ことによ請求めている。そのときの残存活性は４９．９
％である。

また、他の文献アグリカルチャー　バイオロジカル　ケ
ミストリ一旦、２１３９〜２１４８（１９７７）（Ａｇ
ｒｉｃ　、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、’旦、　２１３９
〜２１４８（１９７７））によるとムコ−Ａｚ　ルシア
：ｙ　（Ｍｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉａｎｎｓ　）由来のゲ
ルコアミラー−１ｇ＋ｄトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン５　ｍＭ　、　’ｐＨ５，３に於いて阻害を
受けるが、残存活性は２６．７％あるいは２８８％であ
る。

このようにこれら文献ではトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンにはグルコアミラーゼに対する阻害作用が
あることが紹介されているが、その阻害作用は完全では
なくかなりの残存活性が認められる。一方、反応進行中
の酵素反応を停止させるワンポイントアッセイ法に於て
、正確で再現性のよい酵素活性の測定結果をうる為に要
求される反応停止剤の性能としては、短時間に、しかも
ほぼ完全に酵素活性を阻止することが必要である。

それ故グルコアミラーゼに対する阻害作用が完全ではな
いトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ／が反応進行
中のグルコアミラーゼの反応停止剤としては用いること
ができないと当然のことながら判断された。

しかしながら、本発明者らは、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンのグルコアミラーゼに対する阻害作用
は、基質との競合阻害ではないかとの着想を得、修飾基
質を用い、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを
反応進行中のグルコアミラーゼの反応停止剤として用い
たところ、グルコアミラーゼ活性を特に効果的に停止さ
せることができ、正確で再現性のよい値で、α−アミラ
ーゼ活性を測定することができる、との知見を得、更に
他の類似の化合物についても鋭意研究を重ね、本発明を
完成するに至ったものである。

即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのグル
コアミラーゼに対する阻害作用の機構は未だ明確にはさ
れていないが、本発明の如く修飾基質を用いるα−アミ
ラーゼ活性測定においてはα−アミラーゼの酵素作用に
よってグルコアミラーゼの基質が少量ずつ生成してくる
為、阻害剤の基質に対する濃度比率が高くなりそれにつ
れて阻害効率が向上するのではないかとの着想を得た。

以下、本発明についてその典型的な実施態様の−をあげ
て詳細に説明する。

本発明は、修飾基質にα−アミラーゼと同時に又は、こ
れに次いで共役酵素のグルコアミラーゼを作用させ生成
するグルコースを測定しα−アミラーゼ活性をめるので
あるが、この反応式の一例を次に示す。

Ｇｎ−Ｇ−Ｇ〜 （上式中Ｇはグルコース単位、Ｘはカーレボキシメチル
基等の修飾基を表わし、ｎ、ｍは２以上の整数を表わす
。） グルコースの定量方法は多数知られており、これらの方
法のいずれも使用できることは言うまでもない。

主なグルコースの定量方法を示す。

まずグルコースにグルコースオキシダーゼを作用させる
と酸化され、同時に過酸化水素が生じる。

生成した過酸化水素は共存するペルオキシダーゼを介し
て色原体を電歇的に酸化し、生成した酸化型色原体の呈
色を比色することにより反応液中のグルコース量を測定
することができる。以下に反応式を示す。

グルコースオキシダーゼ ブドウ糖＋０□＋Ｈ２Ｏ Ｈ２Ｏ□＋グルコン酸 ペルオキシダーゼ Ｈ２Ｏ２＋色原体 酸化型色原体子Ｈ２０ また、グルコースはＡＴＰ存在下へキソキナーゼによっ
てグルコース−６−リン酸となる。生成したグルコース
−６−リン酸はＮＡＤ存在下、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素によって６−ホスホグルコノラクトンとなり
、一方ＮＡＤは還元されＮＡＤＨとなるのでとのＮＡＤ
Ｈの３４０ｎｍ付近に於ける吸光度の増加を測定するこ
とにより、反応液中のグルコース量を測定すること力；
、ｉＪ’来る。

以下に反応式を示す。

グルコース− グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ□ ６−リン酸脱水素酵素 一−−−−−−−−−→６−ホスホグ！レコノラクトン
十ＮＡＤＨ ＡＴＰ　；アデノシン−５′−トリリン酸塩ＡＤＰ　；
アデノシン−５７−ジリン酸塩ＮＡＤ；ニコチンアミド
アデニンジヌクレメーチドＮＡＤＨ；還元Ｗ−ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド α−アミラーゼと同時に又はこれに次いで共役酵素のグ
ルコアミラーゼを作用させ生成するグルコースを測定す
る場合は、検体特に血清、尿などの生体試料に共存する
グルコースの影響を受ける可能性があり、イｔ−＝アミ
ラーゼの反応に先行して、既存グルコースを消失するこ
とは本測定法を実施　・する上で有効な手段となる。

消去の方法としてはグルコースオキシダーゼ−カタラー
ゼによる方法、ヘキソキナーゼによる方法（特開昭５７
−４７４９５号公報）、グルコースオキシダーゼ−ペル
オキシダーゼによる方法等、種々の方法があり、いずれ
の方法も自由に組合せることが可能である。

本発明の測定対象となる試料は、α−アミラーゼを含有
する検体なら何れを用いてもよく、例えば、生体成分と
して血液、血清、尿等がある。

グルコアミラーゼとしては、特に限定されないが例えば
動物、微生物由来のものが利用できる。

本発明で用いられる基質として好ましいのは、α−アミ
ラーゼの基質となる程度に適度に非還元末端に修飾基の
入った多糖体、例えばソジウムスターチ　グリコレート
（カルボキシメチル化デンプン）文献「クリニカ　ヒミ
力　アクタ　ｎ（１９７７）２７７−２８３（Ｃ１ｉｎ
ｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ。

ＬｆＬ（１９７７）２７７−２８３．、！Ｊあるいはカ
ルボキシメチル化アミロース（特願昭５７−１４８７５
６号）等修飾基七してカルボキシビニル基の入っタモノ
が溶解性の点から特に好ましいが、カルボキシメチル基
以外にも、２−ピリジルアミノ基、３−ピリジルアミノ
基、アニリノ基、２−ヒドロキシアニリノ基、メチルア
ニリノ基、カルボキシフェニルアミノ基等が入ったもの
も問題なく用いられ、又、これ以外のものについても特
に修飾基に制約を受けるものではない。デンプンあるい
はアミロース等のα−１，４−グリコシド結合を有する
多糖類を基質として用いた場合は、α−アミラーゼにグ
ルコアミラーゼを共役させて生成するグルコースを測定
する方法に於いて、グルコアミラーゼはα−アミラーゼ
に関わりなくアミロースの非還元末端からα−１，４−
グリコシド結合を加水分解するエキンタイプの酵素であ
る為、α−アミラーゼ反応に関係なく基質を分解してし
まう欠点を有するので、（１）測定用試液中に基質とグ
ルコアミラーゼの両方を含有できない、（２）測定に充
分なグルコアミラーゼを使用できない、（３）試薬１検
の上昇を生じる、等の問題が生じるので好ましくない。

又、本発明を実施する測定条件として、一般式〇〕で示
される化合物の特に効果的な反応停止時の濃度としては
５０乃至１００ｍＭ以上、である。

アミラーゼ反応及び共役酵素の反応温度は、特に限定さ
れないが好ましくは約２５〜４０℃であり、反応時間は
目的によシ自由に選択できる。

アミラーゼ及び共役酵素の反応の至適ｐＨとしては特に
限定されないが、ｐＨ約６〜８が好ましい例である。至
適ｐＨを維持する緩衝剤は自由に使用できるが、例えば
、リン酸塩、グツドの緩衝剤などがある。又、−最終的
な液性は、グルコース測定系により若干変動するが、ｐ
Ｈ６，５〜８５が好ましい。

さらにα−アミラーゼの賦活剤として、例えば塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用される
。

従来の反応停止剤を用いないレイト　アッセイ法を用手
的に行なう場合は、測定条件の制約を厳守しないと、正
確で再現性の良い測定値を得ることが出来ず、また多数
検体を測定することも困維であり、その結果これらの問
題を避ける手段として特殊な自動分析機器が必要とされ
ていたが、本発明によれば反応停市剤を用い反応を停ｄ
−させて測定する為、特殊な自動分析機器を必要とせず
、用手法による測定ができ測定法の実用範囲が拡大し、
しかも用手法に於いて多数検体を同時に測定することが
できるようになった。又、反応が極めて迅速に停止する
為、測定誤差が少なく、再現性のよい正確な値が得られ
る。更に又、強酸、強アルカリを必要とせず、中性付近
の緩和な液性を選択できる為、呈色の安定な条件を維持
することも容易である。これらの軸点に於いても斯業に
貢献するところ大なるものがある。

以下に実施例を示しさらに詳細に説明するが、本発明は
、これらに限定されるものではない。

以ｆ：辛や 実施例１ 試薬 （１）　試液１ グツド緩衝液（Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ　）　］、　Ｏｒｎｍｏ
ｌ、グルコアミラーゼ２万単位、グルコースオキシダー
ゼｌ。

万単位、ムタロターセ２００単位、カタラーゼ５０万単
位、Ｎ、Ｎ−ジエチルキシリジン１ｍｍｏｌ、塩化すト
グラム１５ｍｍｏｌ、塩化カルシウム５　ｒｎｒｎｏ７
をとり精製水に溶かして水酸化す］・グラムでｐＨ６，
９とし全量を１１とする。

（２）　試液２ クーノド緩衝液（ＰＩ　ＰＥＳ　）　２０ｍｍｏｌ、へ
／ｌ／オキシダーゼ５，０００単位、塩化ナトリウム１
５用ム１　５ｒｎｍｏｌ，　４−アミノアンチピリ７　
０．５ｍｍｏｌをとり精製水に溶かして水酸化ナトリウ
ムでｐＨ６、９とし全量を］ｌとする。

（３）反応停止層 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン０６ｍａｉｌ
をとり精製水に溶かし、塩酸を加えｐＨ７．５とし全量
を１４とする。

測定方法 試液１の１　ｍｌに検体血清１０μｌを加え、３７°Ｃ
で５分間加温する。これに試液２のｌ　ｍｌを加え、３
７℃で１０分間反応を行なう。この液に反応停止液２　
ｍｌを加え反応を停止さぜ、６　２　０　ｎｍの吸光度
を測定する。

別に、！ーアミラーゼ活性既知の標準検体を用い上記と
同様に操作して検量線を作製し、この検量線から検体の
αーアεラーゼ活性をめる。

第１図より明らかなように、反応停止液を添加した後の
吸光度は一定している。

実施例２ 試薬 （１）試液１ リン酸−カリウム２０ｍＩＴｌｃ＋ｌグルコアミラーゼ
３ノ 万単位，ヘキソキナーゼ１万単位，グルコース−６−リ
ン酸脱水素酵素１万単位，塩化マグネシウム５　ｍｍｃ
＋１ｒＮＡＤ　（酸化型＝コチンアミドアデニンジヌク
レオナド）　２ｍｍｏｌ，　ＡＴＰ　（アデノシンニリ
ン酸）　２　ｍｉｎ’ｃ＋ｌ　＋カルボキシメチルスタ
ーチ３ｇをとシ精製水に溶かし水酸化カリウムでＩ）　
Ｈ　７．　Ｏとし全量１１とする。

（２）反応停止液 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン０．４ｍｃ＋
ｌをとり精製水に溶かし、塩酸を加えｐ　Ｈ　７．　０
とし全量を１１とする。

測定方法 試液１の２　ｍｌに検体血清２０μｌを加え、３７℃で
１０分間加温する。この液に反応停止液１　ｍｉを加え
反応を停止させ、３　４　０　ｎｌＴ］の吸光度を測定
する。

検体盲検として、試液１からカルボキシメチルスターチ
だけを除いた試液を上記の試液１の代りに用い同一操作
をして３　４　０’　ｎｍの吸光度を測定する。

別にα−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い上記と同
様に操作し、各々検体盲検を差し引いた値で検量線を作
成し、この検量線から検体のび一アミラーゼ活性をめる
。

実施例３ 試薬 （１）試液１ グツド緩衝ｅ、（ＰＩＰＥＳ）１０ｍｍｏｌ、グルコア
ミラーゼ２万単位、グルコースオキシダーゼ］、　０万
年位、ムタロターゼ１００単位、カタラーゼ５０万単位
、　Ｎ、Ｎ−ジエチルキシリジン１ｍｍ０ｌ、塩化ナト
リウム１５ｍｍｏｌ、塩化カルシウム５ｍｍ０ｌをとり
精製水に溶かして水酸化ナトリウムでｐＨ６，９とし全
量を１１とする。

（２）試液２ グツド緩衝液（Ｐ　Ｉ　ＰＥＳ　）　２Ｑｍｍｏ１１へ
ｔ、Ａ−キシダーゼ５，０００単位、塩化すトリウム１
５ｒｎｍｏｌ。

カルボキシメチル化アミロース６ｇ、窒化ナトリウム１
５ｍｍｏｌ、４−アミノアンチピリ７０．５ｍｍｏ７を
とり精製水に溶かして水酸化ナトリウムでｐＨ６，９と
し全量を１１とする。

（３）反応停止液 モノエタノールアミンｏ、６ｍｏｌ（３６ｇ）をとす精
製水に溶かし、塩酸を加えｐ　Ｈ７，５とし全量を１１
測定方法 試液１のｌ　ｍｌに検体血清１０μｌを加え、３７℃で
５分間加温する。これに試液２のｌ　ｍｌを加え、３７
°Ｃで１０分間反応を行なう。この液に反応停止液２ｍ
ｌを加え反応停止させ、６２０１ｍの吸光度を測定する
。

別にα〜アミラーゼ活性既知の標準検体を用い上記と同
様に操作して検量線を作製し、この検量線から検体のα
−アミラーゼ活性をめる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於て、８０ソモジ単位／ｄｉの血
清を用いたときの試液２を加えてからの吸特許出願人　
和光純薬工業株式会社 手続補正書 昭和Ｉ；２年／ρ月１５日 １、事件の表示 招冴ロ　ダ？４−＃オ冷洲貢タシ　／３り３／／艮Ｌ２
　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連ａ先４？許課（東京）　ＴＥｔ、　０３−２７０−８
５７１４　補正命令の日付 自　沁 ５、　補正により減少する発明の数 ６、　補正の対象 明細書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄及び発明
の詳細な説明の欄。 ７、　補正の内容 （１）発明の名称の欄に記載の「α−アミラーゼ活性の
新規測定方法及び試薬」ヲ「α−アミラーゼ活性の新規
測定方法」と補正する。 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （３）明細書７頁９行目に記載の「グリコアミラーゼ」
ヲ「グルコアミラーゼ」と補正する。 （４）明細書１５頁４行目から同頁６行目にかけて記載
の「グルコース　６−リン酸」ヲ「グルコース−６−リ
ン酸」と補正する。 （５）明細書２０頁７行目に記載の「Ｎ、Ｎ−ジエチル
キンリジンｊ’ｋｒＮ、Ｎ−ジエチルキンリジン」と補
正する。 （６）明細書２３頁７行目に記載の「Ｎ、　Ｎ−ジエチ
ルキンリジンＪｉ「Ｎ、Ｎ−ジエチルキシリジ７」と補
正する・　以上 別紙 ２、特許請求の範囲 （１）　グルコアミラーゼを共役酵素として用いてα−
アミラーゼの酵素活性を測定するにあたり、反応進行時
に反応停止剤として一般式〔１〕で示される化合物又は
その塩を用いて酵素反応を停止させ、α−アミラーゼの
酵素活性を定量的に測定することを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性の測定方法。 Ｒ′ （ただし、Ｒ１−Ｒ４は水素、又は−ＯＨ基を有してい
てもよい炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。） （２）　α−アミラーゼの酵素活性を測定するにあたり
修飾基質を用いる特許請求の範囲第１項記載の、α−ア
ミラーゼ活性の測定方法。 （３）　修飾基質が、カルボキンメチル化デンプン。 又はカルボキシメチル化アミロースである特許請求の範
囲第２項記載の、α−アミラーゼ活性の測定方法。 （４）酵素反応全停止させる一般式〔１〕で示される化
合物又はその塩の反応停止時の濃度が５０乃至１００　
＋ｕＭ以上である、特許請求の範囲第１項、第２項、又
は第３項記載の、α−アミラーゼ活性の測定方法。 （５）一般式ＣＤで示される化合物が、２−アミノ−２
−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、２−アミノ−
１，３−プロパンジオール、２〜アミノ−２−メチル−
１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−
１，３−プロパンジオール、２−アミノ−１，４−プロ
パンジオール、モノエタノールアミン、ジェタノールア
ミン、又はトリエタノールアミンである特許請求の範囲
第１項、第２項。 第３項、又は第４項記載の、α−アミラーゼ活性の測定
方法・　以よ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　グルコアミラーゼを共役酵素として用いてσ−
   アミラーゼの酵素活性を測定するにあたり、反応進行時
   に反応停止剤として一般式（１）で示される化合物又は
   その塩を用いて酵素反応を停止させ、α−アミラーゼの
   酵素活性を定量的に測定することを特徴とするα−アミ
   ラーゼ活性の測定方法。 Ｉ　Ｒ３ ＨＯＣＨ２−Ｃ−Ｎ−Ｒ’　−、般式〔］〕２ （ただし、Ｒ１−Ｒ４は水素、又は−〇Ｈ基を有してい
   てもよい炭素数１〜４の低級アルキル基を示−ｊ′０）
   （２）　α−アミラーゼの酵素活性を測定するにあたシ
   修飾基質を用いる特許請求の範囲第１項記載の、α−ア
   ミラーゼ活性の測定方法。 （３）修飾基質が、カルボキシメチル化デンプン、又は
   カルボキシメチル化アミロースである特許請求の範囲第
   ２項記載の、α−アミラーゼ活性の測定方法。 （４）酵素反応を停止させる一般式口〕で示される化合
   物又はその塩の反応停止時の濃度が５０乃至１００ｍＭ
   以上である、特許請求の範囲第１項、第２項、又は第３
   項記載の、α−アミラーゼ活性の測定方法。 （５）一般式〇〕で示される化合物が、２−アミノ−２
   −ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリ
   ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、２−アミノ−
   １，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−
   １，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−
   １，３−プロパンジオール、２−アミノ−１，４−ブタ
   ンジオール、モノエタノールアミン、ジエタノールアば
   ン、又はトリエタノールアミンである特許請求の範囲第
   １項、第２項、第３項、又は第４項記載の、α−アミラ
   ーゼ活性の測定方法。 （６ン　グルコアミラーゼを共役酵素として用いてα−
   アミラーゼの酵素活性を測定するにあたり、反応進行時
   に反応停止剤として一般式印で示される化合物又はその
   塩を用いて酵素反応を停止させ、α−アミラーゼの酵素
   活性を定量的に測定することを特徴とする、α−アミラ
   ーゼ活性の測定用試薬。 ＲＩ　Ｒ３ ２ （ただし、ＲＩ−Ｒ４は水素、又は−〇Ｈ基を有してい
   てもよい炭素数１〜４の低級アルキル基を示す。）（７
   ）　α〜アミラーゼの酵素活性を測定するにあたり修飾
   基質を用いる特許請求の範囲第゛６項記載のα−アミラ
   ーゼ活性の測定用試薬。 （８）　（Ｉｌｉ基質が、カルボキシメチル化デンプン
   、又はカルボキシメチル化アミロースである特許請求の
   範囲第７項記載の、α−アミラーゼ活性の測定用試薬。 （９）酵素反応を停止させる一般式口〕で示される化合
   物又はその塩の反応停止時の濃度が５０乃至１００ｍＭ
   以上である、特許請求の範囲第６項、第７項、又は第８
   項記載の、α−アミラーゼ活性の測定用試薬。。 （１０）一般式〔ｌ〕で示される化合物が、２−アミノ
   −２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（
   トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）。 ２−アミノ−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−
   ２−メチル−１，３〜プロパンジオール、２−アミノ−
   ２−エチル−１，３−フロパンジオール、２−アミノ−
   １，４−ブタンジオール、モノエタノールアミン、ジェ
   タノールアミン、又はトリエタノールアミンである、特
   許請求の範囲第６項、第７項、第８項、又は第９項記載
   のα−アミラーゼ活性の測定用試薬。