JPH02724A - 化学発光による測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、１，２−ジオキセタン分子中の酵素によって
切断しうる基の酵素性分解によってもたらされる光学的
に検出可能な反応を用いて特異的結合対の一員を検出し
且つ定量化しうる検定法及びそれに用いる有用な１，２
−ジオキセタン類並びにその中間体及びその製法に関す
る。

（従来の技術） １．２−ジオキセタンとして知られる４員環の有機ペル
オキシドは既知化合物であるが、これまでめったに利用
されたことのない化合物群である。

それらの化合物固有の化学的不安定性ゆえに、いくつか
の１，２−ジオキセタンはある種の条件下で（例えば酵
素の作用により）化学発光分解を示し、このことは゛ジ
オキセタンの酵素性分解？用いる物質の検出法パと題す
る係属中の米国特許出題第８８９８２３号に開示されて
いる（これらの技術内容は参照によシここに引用される
）。このような化学発光の間に放出される光線の量は発
光物質の濃度の尺度であシ、ひいてはその前駆物質（す
なわち１，２−ジオキセタン５の３度の尺度である。従
って、発光の強度および持続時間を測定−することによ
って、１，２−ジオキセタンの濃度（それゆえに検定す
べき物質、すなわち特異的結合対の１．２−ジオキセタ
ン電子に結合した物質、の濃度）を求めることができる
。１，２−ジオキセタン環の置換基を適当に選択すると
、その分子の化学的安定性を調節することができ、ひい
ては化学発光の開始をコントロールすることができ、そ
れによシ実施目的のための、例えば上記出願明細書中に
ある化学発光イムノアッセイにおけろ、この種の化合物
の化学発光作用の有用性ン高めることができる。

オレフィン性二重結合の光酸化によろ１，２−ジオキセ
タンの製造は知られている。しかしながら、容易に入手
しつる出発物質から扱いやすい中間体を経て誘導される
オレフィン性不飽和前駆物質からの置換１．２−ジオキ
セタン類の便利な一般的合成法の必要性が存在する。こ
れに関連して、次式− （式中Ｔ、Ｒ，ＹおよびＺは以下で定義する通りである
）の置換１．２−ジオキセタン暑エノールエーテル呈前
駆物質： から製造するための商業的に有用な方法の必要性が轡に
存在する。

二ノールエーテル化合物はい（つかの古典的方法、例え
ばアセタールからのアルコールの酸触媒除去（Ｒ，Ａ、
ｊＶｈｏｌ　、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　、　ｐ、　３８
　（１９７４）　）、塩基性媒体中でのアルコキシメチ
レンシランまたはホスホランとアルデヒドまたはケトン
とのピーターソン（ｐ６ｔｇｒｓｏｎ）またはウイツチ
ヒ（Ｆｉｔ−１ｉｇ）反応（ＭａｇｎｌＬｓ　＋　Ｐ、
ら、ＯｒｇｃＬｎｏｍｅ　ｔａｌ　Ｌ　ｉ　−ｃｓ、１
．５５３（１９８２））、およびアルコキシ酢酸シアニ
オ／とケト／との反応それに続くプロピオラクトンの形
成およびＣＯ２の除去（Ｃａ２”　６　ｎ　＋Ｇ、ら１
．ぐａｎ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、、５１．９８１（１９７３）
）によシ製造することができろ。ケトンエノラートアニ
オンのＯ−アルキル化は可変量の付随して形成されるα
−アルキル化ケトンゆえに（その程度は溶媒、塩基、ア
ルキル化剤およびケトンの構造に左右される）、−船釣
製造法としてあまり用いられない（Ｅ、Ｏ，Ｂｏｕｓａ
　＋　”　ｋｌｏｄｅｒｎ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃＲｅａ
ｃ、ｔｉｏｎｓ　　ｐ、　１６３−２１５　（Ｂｔｎｊ
ａｍｉｎ１９６５）；およびＪ　、Ｄ、　Ｒｏｂｅｒｔ
ｓおよび〜、Ｃ０Ｃａ５ｅτｉｏ、　”　Ｂａ５ｉｃ　
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ＯｒｇｃＬｎｉｃＣｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　”　（Ｂｅ？Ｌｊａｍｉｎ、　１９６４
　）　　’（！’参照されたい）。発癌性溶媒として知
られるヘキサメチルホスホルアミド（ＥＭＰＡ）’！ａ
？使用する場合は、よく見積もっても、０−アルキル化
生成物の収率は７０％以下である。その上、Ｃ−アルキ
ル化ケトンからのエノールエーテルの分離は非常に退屈
な作業である。

アダマント−２−イルアリールケトンは１９６０年代の
末期から知られているが（（１’Ａｇｍ、　Ａｂｓｔ。

７１　：　Ｐ８０８１２１’）、それらをＯ−アルキル
化する試みは文献に全く報告されていない。今や、極性
非プロトン性溶媒のジメチルスルホキシド（ＤｉＳＩ　
Ｓ　Ｏ）中でのエノラートとしてのこれらのケトンと”
ハード（ｈａｒｄ）”な離脱基を含む反応性アルキル化
剤（Ｆｌｅｍｉｎｇ、　１．、　”　Ｆｒｏ？Ｌｔｉｅ
ｒ　Ｏｒ　−ｂｉｔｃＬｔｓ　ｃＬｎｄ　Ｏｒｇａｎｉ
ｃ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　。

ｐ、　４０　（Ｆｉｌｇｙ、　１９７６　）　’ｌ参照
されたい）との反応はもっばらＯ−アルキル化をもたら
すことが見出された。このようにして得られたエノール
エーテルは１．２−ジオキセタン合成における有利な中
間体として使用される。この種の中間体はシングレット
酸素（化学的または光化学的に発生されろ）と反応して
化学発光ジオキセタン分解に基づく検定法において有用
な十分に安定性のある１、２−ジオキセタン？もたらす
物質？製造するために使用される。このＯ−アルキル化
法は一般的であり、それ故に他のシクロアルキルアリー
ルケトン物質にも応用できる。このシクロアルキルアリ
ールケトンは適当な第ニジクロアルキルアルデヒドとア
リールグリニヤール試薬との反応、および得られた第二
アルコールのジョーンズ試薬による酸化によって合成す
ることができる。好ましくは、グリニヤール試薬は第ニ
ジクロアルキルニトリルと反応させ、続いて酸加水分解
してイミン塩を形成させる。すべての場合において、出
発物質および生成物はシクロアルキル系の第二炭素原子
、縮合ポリシクロアルキル（例えばアダマンチル）系の
場合には、両側にブリッジヘッド（ｂｒｉｄｇｅｈｅａ
ｄ　）炭素原子が存在する第二炭素原子、に結合された
官能基を含有する。

発光を用いた従来の検定方法として代表的なものは、■
標識酵素としてＰＯＤＩ：用い、基質としてＩＩ　２０
２　及びルミノール？用いろＥＩＡ法、■アクリジンエ
ステル暑標識体Ｅして用い、Ｈ２Ｏ２で発光させるＣＬ
ＩＡ法が知られている。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来の方法の■の場合、低濃度のリガン
ド測定に対して定量性がな（、■の場合はラベル体自体
の増幅ができない等の欠点ン有していた。そのため、高
“度の測定を目指すにはより多くの光量乞もった測定法
の開発が望まれていた。

本発明は上述の如き従来方法の欠点を克服し得た。

すなわち、本発明の目的は、１，２−ジオキセタンの化
学発光分解に基づく検定法および該検定法において有用
な１．２−ジオキセタン類の新規合成法暑提供すること
である。

他の目的は、いくつかの１．２−ジオキセタンの合成に
おいて有用な中間体の製法乞提供することである。

さらに他の目的は、光学的に検出し５る反応において酵
素により分解されるある種の１．２−ジオキセタンの合
成前駆物質として有用な新規化合物を提供することであ
る。

本発明のこれらの目的および他の目的並びにそれらの利
点は、以後の説明および特許請求の範囲乞参照すること
により十分に理解されろであろう。

（課題乞解決するための手段） 前記の目的は、次式で表される１、２−ジオキセタン類
の製法によって本発明に従って達成される。

式中、Ｔ＝は１，２−ジオキセタン環の炭素原子にスピ
ロ結合されたシクロアルキリデンｚ４たはポリシクロア
ルキリデン基（例えばアダマント−２−イリデンのよう
な縮合環ポリシクロアルキリデン）であり：Ｒは非分岐
状または分枝状、非置換または置換Ｃｌ−６２０アルキ
ル基、アルアルキル基（エチレン性不飽和アルアルキル
基を含む）または多核（例えば、縮合環）アルアルキル
基、もしくはシクロアルキル基（例えばメチル基、イン
フチル基、ベンジル基、ビニルベンジル基、ナフチルメ
チル基、シクロヘキシル基、およびポリアルキレンオキ
シ基やカルボ−Ｎ−スクシンイミドオキシベンジル基の
ようなＮ、ＯおよびＳヘテロ原子７含む基）であり；Ｙ
は螢光発色団（すなわち、エネルギーン吸収して励起状
態（高エネルギー状態）となり、その状態から低エネル
ギー状態へ自然駄移す、る際に光線７発することのでき
る厚子団）であり；いかなる発色団でもよい。−船釣に
は、感度を増加させるために量子収量７最大とする発色
団ン使用することが好ましい。

適当な発色団の例には下記のものが含まれる：１）フェ
ニレン及びフェニレン誘導体、例フェノキシ ２）ナフタレンおよびナフタレン誘導体、例、５−ジメ
チルアミノナフタレン−１−スルホン酸およびヒドロキ
シナフタレン； ３）アントラセンおよびアントラセン誘導体、例、９．
１０−ジフェニルアントラセン、９−メチルアントラセ
ン、９−アントラセンカルボキシアルデヒド、アントリ
ルアルコール類および９−フェニルアントラセン； ４）ローダミンおよびローダミン誘導体、例、ロドール
類、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミン
、シンエニルジメチルローダミン、ジフェニルジエチル
ローダミン、およびジナフチルローダミン； ５）フル、オレセインおよびフルオレセイン誘導体、例
、５−ヨードアセトアミドフルオレセイン、６−ヨード
アセトアミドフルオレセイン、およびフルオレセイン−
５−マレイミド； ６）エオシンおよびエオシン誘導体、例、ヒドロキシエ
オシン類、エオシン−５−ヨードア七ドアミド、および
エオシン−５−マレイミド；７）クマリンおよびクマリ
ン誘導体、例、７−ジアルキルアミノ−４−メチルクマ
リン、４−ブロモメチル−７−メチルクマリン、および
４−フロモメチル−７−ヒドロキシクマリン；８）エリ
スロシンおよびエリスロシン誘導体、例、ヒドロキシエ
リスロシン類、エリスロシン−５ヨードアセトアミドお
よびエリスロシン−５−マレイミド； ９）アクリジンおよびアクリジン誘導体、例、ヒドロキ
シアクリジン類および９−メチルアクリジン； １０）ピレンおよびピレン誘導体、例、Ｎ−（１−ピレ
ン）ヨードアセトアミド、ヒドロキシピレン類、および
１−ピレンメチルヨードアセテート；１１）スチルベン
およびスチルベン誘導体、例、６．６′−シフロモスチ
ルベンおよびヒドロキシスチルベン類； １２）ニトロベンゾキサジアゾール類およびニトロベン
ゾキサジアゾール誘導体、例、ヒドロキシニトロベンゾ
キサジアゾール類、４−クロロ−７−ニトロベンツー２
−オキサ−１、３−シフ　ソール、２−（７−ニドロベ
ンツー２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）メ
チルアミノアセトアルデヒド、および６−（７−ニドロ
ベンツー２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）
−アミノヘキサノイックアシド； １３）キノリンおよびキノリン誘導体、例、６−ヒドロ
キシキノリンおよび６−アミノキノリン；１４）アクリ
ジンおよびアクリジン誘導体、例、Ｎ−メチルアクリジ
ンおよびＮ−フェニルアクリジン； １５）アシドアクリジンおよびアシドアクリジン誘導体
、例、９−メチルアシドアクリジンおよびヒドロキシ−
９−メチルアシドアクリジン；１６）カルバゾールおよ
びカルバゾール誘導体、例、Ｎ−メチルカルバゾールお
よびヒドロキシ−Ｎ−メチルカルバゾール； １７）螢光性シアニン類、例、ＤＣＭ（レーザー色素）
、ヒドロキシシアニン類、ｔ、６−ジフェニル−１，３
，５−ヘキサトリエン、１−（４−ジメチルアミノフェ
ニル）−６−フェニルヘキサトリエン、および対応する
１、３−ブタジェン類；１８）カルボシアニンおよびカ
ルボシアニン誘導体、例、フェニルカルボシアニンおよ
びヒドロキシカルボシアニン類； １９）ピリジニウム塩、例、４（４−ジアルキルジアミ
ノスチリル）Ｎ−メチルピリジニウムイオデートおよび
ヒドロキシ−置換ピリジニウム塩；２０）オキソノール
類；および ２１）レゾロフィン類およびヒドロキシレゾロフィン類
。

Ｚ基は酵素で切断可能な結合を介して発色団Ｙに結合す
ることが好ましい。適当な酵素との接触によシ酵素で切
断可能な結合が切断され、発色団Ｙに結合した電子密度
の高い部位が得られる：この部位が、２つの個々のケト
ン類への、またはＸ基が水素の場合にはケトンとアルデ
ヒドへのジオキセタンの分解を開始する。電子密度の高
い部位の例には、酸素、イオウ、およびアミンなどが含
まれる。最も好適な部位は酸素陰イオンである。

酵素で切断可能な基の適当な例およびこれらの基に特異
的な酵素類は下記の表１に示されている；矢印は酵素で
切断可能な粘合７示す。最も好適な基は、アルカリ性ま
たし１度件ホスファターゼ酵素で切断されろリン酸エス
テルあるいはエステラーゼで切断されるカルボン酸エス
テルである。

リン酸エステル 酢酸エステル カルボキシル 表１ β−Ｄ−キシロイ ド β−Ｄ−フコシド １−チオー〇−グルコシド β−Ｄ−ガラクトシド 功 Ｅ α−Ｄ−ガラクトシド 功 Ｅ　　　　　ＯＨ α−Ｄ−グルコシド β−Ｄ−グルコシド アデノシン三すン酸同脹体 アデノシンニリン酸同族体 迫 ｆｆ Ａ　Ａｆ　Ｐ同族体 ＯＨ α−Ｄ−マンノシド β−Ｄ−マンノシド β−Ｄ−フルクトフラノシド Ｅ　　　　　ＯＢ β−Ｄ−グルコシドウロネート Ｂ２ Ｃ８４ −Ｅ 暫 Ｃ＝ＮＨ Ｂ２ −Ｈ Ｃ＝ＮＨ Ｅ２ 最も好適な発色団は タンの製法は以下の反応式で表されるニ−ＣＭ Ｔ人Ｙ−ＯＲ’ フェニレン ナフチレン ヒドロキシ誘導体である。

本発明により得られる化合物を水溶系における発光方法
に利用するには、Ｔ、ＸまたはＹ基の１つもしくはそれ
以上は可溶化置換基（例、カルボン酸、スルホン酸もし
くは４級アミン塩）であることが、好ましい。

更に、１．２−ジオキセタン類のＴ、ＸおよびＹ基を適
宜修飾することによって、１，２−ジオキセタン類の溶
解性および１，２−ジオキセタン類の分解反応の速度を
変えることができる。１゜２−ジオキセタン類は多種類
の分子（例、タンパク質もしくはハプテン）または固定
支持体（例、高分子膜）に付着させることも、あるいは
単独重合体もしくは共重合体中の側鎖基として含ませる
こともできる。

より詳細には、本発明による１、２−ジオキセ式中、Ｒ
１は独立してＲＫついて先に定義した置換基のいずれか
であり得；Ｗ　はハロゲンイオン（例えば塩素イオン）
のような酸アニオンでアリ；そしてＸおよび”Ｒ化剤°
゛は以下で定義する通りである。

前記の反応式はそれぞれの反応生成物を単離しながら段
階的に実施される。しかしながら、段階１　（ＣＮ−ま
たは有機スルフィネートイオンのような求核酸性化アニ
オンによるアルキル基切断）および段階ｖＩｌ（β−説
離反応を経る脱保護）は中間体のリン酸エステル塩を単
離することなく有利に行われ、この種の中間体はその存
在を確認するときのみ単離する必要がある。

前記の反応式の段階■および■において、段階■で用い
られる塩のカテオ／Ｍ＋および段階■で用いられる塩基
のカチオンＭ＋はアルカＩＪ金属＋ （例えばＨａ　）、　アンモニウム、また（工Ｃ，−Ｃ
，アルキル、アルアルキルまたは芳香族第四アンモニウ
ムカチオン（＃／？４）＋（ここでＲ３はアルキル基、
ル基、のいずれかまたは全部であり得、あるいはり素環
系の一部、例えばピリジニウム、を形成することができ
る）であり得、こうして段階■およびｖｍの生成＠は次
の通りである。

さらに、第四アンモニウムカチオン（１以下のようにそ
の四級化基の１つを介してポリマー主鎖へ結合すること
ができ： 例えばエチル基、アルアルキル基、例えばベンジ媒体（
例えばジメチルスルホキシド中のアルカリ金属アルコキ
シド）中で反応させることによる次式： あるいはそれ自体がポリ第四アンモニウム塩の一部であ
り得る。

前記の合成経路内に、本発明は次式： （式中Ｔ＝Ｒ，Ｒ１およびＹは先に定義した通りである
〕で表される化合物の製法を包含する。

本発明はさらに次式： （式中Ｔはカルボニル基に対してα位の炭素原子にスピ
ロ結合されている）で表される化合物と、Ｒ−サルフェ
ート、トルエンスルホネ−）（）シレート）、メタンス
ルホネート（メシレート）、トリフルオロメタンスルホ
ネート（トリフレート）、およびクロロメチルエーテル
並びにトリアルキルオキソニウム塩より成る群から選ば
れるアルキル化剤（Ｒの定義と合致するより一般的な用
語では”Ｒ化剤”）とを、塩基性、極性、非プロトン性
で表される化合物と次式： （式中Ｘはハロゲン（例えばクロロ）のような電気陰性
離脱基である）で表される化合物とを、液状芳香族化合
ｍ＜例えばベンゼン、トルエン）、エーテル（例えばグ
リム、ジグリム）または環状エーテル（例えばテトラヒ
ドロフラン（ＴＢＦ）のような非プロトン性有機溶媒中
に溶解した第三アミン（例えばトリエチルアミン）のよ
うなルイス塩基の存在下で反応させることから成る次式
：（式中Ｔ、Ｒおよび）′は先に定義した通りである）
で表される化合物の製法を提供する。ハロホスフェート
の使用に代わるべきものとして、類似のハロホスフィツ
トすな←ちｘｐｏ２ＣＣＥｔ）２を使用しその後酸化お
よび照射をすることにより、直接ジオキセタンを形成す
ることもできる。

他の面において、本発明は次式： （式中Ｘは先に定義した通りである）で表わされる化合
物とを、液状芳香族化合物（例えばベンゼン、トルエン
）、エーテル（例エハク＋）ム、ジグリム）または環状
エーテル（例えばＴＨＦ）のような非プロトン性有機溶
媒中で第三アミン（例えばトリアルキルアミン）のよう
なルイス塩基の存在下に反応させることから成る次式： で我される化合物と次式： （式中、Ｔ、ＲおよびＹは先に定義した通りであり、Ｒ
５は独立してＲについて先に定義した置換基のいずれか
であり得、モしてＲ２およびＲ３はそれぞれ独立してシ
アン、０−またはｐ−ニトロフェニル、０＋７’４たは
０．０−ジニトロフェニル、トルエ／ズルホニル、サン
ゼンスルホニルマタはメタンスルホニルである）で表さ
れる化合物の製法を提供する。ハロホスフェートの使用
に代わるべきものとして、類似のツルーオキシ化合物（
すなわちハロホスフィット）を使用しその後酸化および
照射を行うことにより、直接ジオキセ、タンを形成する
ことができる。

上述の酸化は元存在下にオレフィンを一重項酸素（’０
２）で処理することによって光化学的に実施することが
好ましい。１０２は二重結合して下記のようにジオキセ
タンを形成することができる゛：反応は一７８℃、ハロ
ゲン化溶媒（例、塩化メチン／）中で実施することが好
ましい。ｌ□、は光増感剤を用いて発生させることがで
きる。光増感剤とし′Ｃは高分子結合ローズベンガル〔
センシトックスｒ　（５ｅｒｔｓｉｔｏｚ　　Ｔ　）と
して市販されておりハイドｏ７研究所（Ｈｙｄｒｏｎ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　＊　ＮｅｗＢｒｕ？Ｌｓｗ
ｉｃｋｒＮ−１−）から入手可能〕およびメチレンブル
ー（有名な色素かつｐＨ指示薬）などを使用することが
できる。好適な増感剤はローズベンガルである。

更に本発明は光の発生方法を提供するものである。この
方法は試料中の特定の物質の存在または濃度を求めるた
めに視覚的検定方法として利用することができる。上記
の１．２−ジオキセタン類はこれらの検定法のいずれに
も使用しうる。こうした検定法の例には、抗体または抗
原（例、αまたはβ−ｈＣＧ、ＴＳＨ，ＬＨ等のホルモ
／、ＡＦＰ。

ＣＥＡの様な癌関連抗原）を検出する免疫検定法（酵素
免疫測定法）；酵素検定法（例、アルカリホスファター
ゼ）；カリウムまたはナトリウムイオンなどを検出する
化学検定法；およびウィルス（例、ＩｆｓＶｒ、ＩＩＴ
Ｌ〆ＩＩＩ　モジ（［？イ１−メｆＪ。

ウィルス）または細菌（例、大腸園）などを検出するヌ
クレオチドプローブ法が含まれる。

検出される物質が抗体、抗原または核酸である場合には
、ジオキセタンのＺ基を切断可能な酵素が、検出される
物質に特異的な親和性を有する物質（すなわち検出され
る物質に特異的に結合する物質）（例、それぞれ抗原、
抗体、または核酸プローブ）に結合することが好ましい
。酵素を特異的親和性物質に結合させるために常法（例
、カルボジイミドカップリング）が使用される；結合は
アミド結合を介することが好ましい。

−数的に検定法は下記のように実施することができる。

検出される物質を含む試料と、検出される物質（例えば
抗原）に特異的親和性を有する物質（例えば抗体）Ｋ結
合した酵素を含む緩衝液に接触させ更に’Ｗ異的親和性
を有するもう一つの物質（例えば抗体）を結合した同相
（例えば抗体結合のビーズ）に接触させる。一定時間イ
／キュペーショ／した後過剰の特異的親和性を有する物
質に結合した噂累を洗い流し、その酵素部分によって切
断されうるＺ基を有する１、２−ジオキセタン類（基質
）を添加する。酵素はＺ基を切断してジオキセタンを２
つのケトン（またはＸ基が水素の場合をエアルデヒドと
ケトン）に分解する；ケトンの１つに結合している発色
団】′はこうして励起されで発光する。この発光はキュ
ベツトまたはカメラルミノメータ−などを用いて、試料
中に検出される物質が存在することの指標として検出さ
れる。物質の濃度を求めるために発光強度を測定するこ
とができる。

検出される物質が酵素である場合には、特異的親和性物
質（例えば抗体）は不必要である。その代わりに検出さ
れる酵素によって切断されうるＺ基を有する１、２−ジ
オキセタン類（その酵素の基質）を使用する。そこで、
酵素の検出法は、酵素−含有試料への１，２−ジオキセ
タン類の添加、および酵素の存在と濃度の指標として得
られる発光の検出を含むものである。

（実施例） 以下に不発明の詳細な説明するために実施例が記載され
るが、本発明は何らそれらに限定されず、その要旨を逸
脱しない範囲での修飾および変法を含むものと思われる
。

３−メトキシフェニルアダマント−２−イルケトマグネ
シウム削り屑（１，６４？、０．０６７モル）をアルゴ
ン雰囲気下で火炎乾燥フラスコに入れた。

ヨウ素の小さい結晶および乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）（水素化アルミニウムリチウム上で新たに蒸留し
たもの）７ｍｌを加えた。一定量（７ｒｎｌ、００５５
モル）の３−プロモアニンールを注射器から穏やかに撹
拌した金属懸濁液に加えた。５０℃で短時間加熱後発熱
反応が始まった。フラスコを室温の水浴に入れ、その間
ｒｇｒ’（３３ｍｇ）を滴下ロートから細流として添加
した。発熱反応がおさまった後、この混合物を４５分間
還流した。

その還流しつつあるグリニヤール試薬へ乾燥ＴＨＦ５０
＋＋＋ｌ中の２−シアノアダマンタン（８，７５’、０
．０５４モル；ＯｒｇａｆＬｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
”　、　５７　。

８　（Ｆｉｌｅｙ、　１９７７）またはｖａｎ　Ｌｅｌ
Ｌｓｇｎ　、　Ａ、Ｍ。

ら、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｒｎ、、４２．３１１４　（１
９７７）を参照されたい）の溶液を１５時間にわたって
滴下した。この反応混合物を還流温度で一晩加熱した後
、黄色の懸濁液を得た。フラスコとその内容物を水浴中
で冷却している間に、エーテル（５０ｍ／）を７１０工
た。濃塩酸Ｃ８ｍｌ、　０．０９６　モルＨｃｔ）を激
しく撹拌しながら２０分間にわたり滴下した。沈殿物を
濾過により分離し、エーテルで洗い、乾燥してケテンイ
ミン塩２９７を若干の残留マグネシウムを含む淡黄色の
非吸湿性粉末として得た。この塩をエタノール９０ｒｎ
ｌと濃塩酸９０ｍ１との混合物中に懸濁し、３時間還流
した。その間に混合物はかなり薄くなった。水浴で冷却
後、得られた固形物を砕き、濾過により分離し、中性に
なるまで洗浄し、乾燥して薄い灰色のケト７１３．６５
Ｆ（２−シアノアダマンクンに基づいて収率９３％〕を
得た（融点１１１〜１１４°Ｃ）。薄層クロマトグラフ
ィー（ＴＬＣ）はこの生成物がその後の操作によって十
分な純度であることを示したＣＲｆＯ，４５；　Ｋ５Ｆ
−ＣＨ２Ｃ１２：ヘキサン５０　：　５０）。

ヘキサ／から再結晶してプリズム晶として表題化合物を
得た（融点１１３〜１１５°Ｃ）。ＪＲ（ＣＨ２Ｃ１２
）２９００ｃｍ−’、１６７０ｃｍ−’　（Ｃ＝Ｏ）、
１５９０ｃｍ−’　、　１５７５ｃｍ−’により生成物
の構造が次式の通りであることを確認した。

マンタン 実施例１に従つ″′Ｃ製造した一定量（１１，３Ｆ、０
．０４２モル）の３−メトキシフェニルアダマント−２
−イルケトンをモレキュラーシーブ乾燥（３Ａ）ジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）９０ｒｎｌに懸濁した。懸
濁固体を溶解するために加熱した。

撹拌しながら室温へ冷２！（ｌすると、微細な懸濁液が
得られた。カリウムｔ−ブトキシド（８，５？、００７
０モル）をアルゴン雰囲気下に加えた。５分後、はとん
ど均質な橙色の溶液が得られ、これを５０℃の水浴に入
れた。硫酸ジメチル（４ｍｌ、０．０４２モル）を注射
器から１０分間にわたって滴下した。さらに１５分撹拌
した後、追加の硫酸ジメチルｃ３．３ｍｌ、０．０３４
モル）を同シャリ方で加えた後、無色の溶液を室温で一
晩撹拌した。

水浴で冷却後、Ｋ２Ｃｏ、　　０．５９および氷水１２
５ｒａｔを加え、この混合物を５０ｍ１ずつの酢酸エチ
ルで３回抽出した。合わせた有機画分を水で３回、飽和
＃　ａ　Ｃを水溶液５０　ｍｌ：で１回洗い、Ｋ２ＣＯ
３上で乾燥した。溶媒を真空除去して油状物を得た。

その油状物をヘキサ／に溶かし、得られた溶液をセライ
トを通して濾過し、真空濃縮して粘稠性のある淡黄色の
油状物１１．５５’（収率９６％）を得た。ＴＬＣは微
量のケトン出発物質を含むエノールエーテル（Ｒｆ　Ｏ
，６８：　Ｅ、Ｍｅｒｃｋ　Ａｌ２Ｏ２−ｃｇ２ｃｌ、
：ヘキサン５０：５０）へのきれいな転化を示していた
。１．Ｒ，（ＣＨ２Ｃ１２）：２９００ｃｍ−皿１６０
０　ｃｍ−’、１５９０　ｃｍ−’、１５８０ｃｍ−’
１５７０ｃｒｎ−’、１０９５ｃＩｎ−’、１０８０ｃ
Ｉｎ−’　：ＨＮＭＲ（（：’　ＤＣＺ３　）　：δ１
．５−２　（ｍ　、　１２Ｈ）、δ２．５５（ｓ、ＩＨ
）、δ３．２　（ｓ　、　、ＩＨ）、δ３．２５（ｓ、
３Ｈ）、δ３．７５（ｓ、３Ｈ）、およびδ６．７　７
．３（ｍ、４Ｈ）、これらのデータにより、この生成物
の構造が次式の通りであることを確認した。

ダマンタン モレキュラーシーブ乾！（３，（）ジメチルホルム７　
ミド（ＤＭＦ　）　７０　ｍｌ中の実施ｆｌ１２に従っ
て製造したメトキシ（３−メトキンフェニル）メチレン
アダマンクン（１４２，０，０４９モル）の解散を、ア
ルゴン雰囲気下で同じ溶媒中のナトリウムチオエトキシ
ド（７，４Ｆ、０．８８モル）の溶液ニ加えた。この混
合物を３時間還流した。撹拌しながら水浴で冷却後、こ
の反応を水２００ｍ１中のＮＨ，Ｃ１６２Ｆで停止させ
た。酢酸エチル（１２０ｍｌ）および少量の氷水を加え
た。水層を分離し、酢酸エチル７５ｍ１で抽出した。有
機抽出物を１００ｍ１ずつの水で４回、次に飽和ＮａＣ
１（１００ｍｌ　）で洗い、すばやくＮｃＬ２ＳＯ４上
で乾燥させた。この溶液を濾過し、濃縮して油状物を得
、それをヘキサン５０ｒｎｌで摩砕した。回転蒸発器で
溶媒を除去すると固体が残り、それを冷ヘキサンで細か
くすりつぶし、濾過し、ヘキサンで洗った。粗製の灰白
色フェノール系生成物（１３５’）は５％Ｍ　ａ　０Ｈ
−Ｃ１ｌ、ＣＭから再結晶して無色プリズム状結晶１０
２を得た（融点１３１〜１３３℃）　ｏ　ＩＲ（ａｉ２
Ｃ４２）　’３５８０ｃｍ−’、３３２０　ｃｍ−’、
２９１０ａｎ−’１５９０ｃｆｎ−’、Ｉ　５８０ＣＩ
ｎ−’、１４４０ｃｍ−’により生成物の構造が次式の
通りであることを確認した。

実施例３に従って製造したメトキシ（３−ヒドロキシフ
ェニル）メチレンアダマンクン（１，１ｆ、０００４モ
ル）をアルゴン雰囲気下でモレキュラーシーブ乾燥（３
Ａ）ぺ７９７１５ｍ１Ｋ溶解した。

）　ＩＪ　ｚチル７　ミ７　（０，５７ｍｌ、０．００
４モル）を注射器から加えた。この撹拌溶液を水浴で０
℃に冷却し、２−クロロ−２−オキソ−１，３−ジオキ
サホスホラン（０，３７ｍ／ｊ、０．００４モｙ）を滴
下した。水浴中で１０分後、粘稠な混合物を室温へ徐々
に温め、３．５時間撹拌した。ベンゼンを真空除去し、
アルゴン下でエーテル６０ｍ１を加えた。

この懸濁液を不活江雰囲気下で濾過し、得らｎた固形物
を２０＋ｎｌずつのエーテルで３回洗った。Ｆ液を真空
除去してリン酸トリエステル１．６２を粘稠な無色の油
状物として得た。ＪＲ（ＣＦ２Ｃｌ２）：２９００ｃＩ
ｎ−’、１６００ｃｒＩＴ−’、１５７５ｃＩｎ−’１
３００ｃｍ−’（Ｐ＝０）。７ｘノール性ＯＨ（７）伸
縮またはＣ−０（１６７０ｃｍ−’　）の吸収はＩＲス
ペクトルに存在しなかった。ＴＬＣで出発物質のないこ
とを確認した。これらのデータは３−（アダマンチリデ
ンメトキシメチル）フェニルエチレンホスフェートの下
記構造と一致した。

上記の油状物＆１ＤＭ１７ｍｌ”ＩｃＨ解し、ＤＭＦ中
のシアン化ナトリウム（０，２１ｒ、０．００４モル）
を加え、この混合物を室温で２４時間撹拌した。

得られた黄色の溶液を５０’Ｃで真空除去し、２ｍｌず
つのキシン／で数回追い出し、残留物を二一テルで摩砕
してガムを得、そのガムをＣＨ２Ｃｌ２に取り、真空除
去して淡黄色の非晶質発泡体１．５７を得た。ＪＲ（Ｃ
Ｈ２Ｃ２２）　’　２２４０　ｃＩｎ−’（弱い、ＣＮ
）、１５９５ｃｒ＋＋−’１１５７０ＣＩｎ−’、１４
７５ｃｎ−’１２７５ｃｍ”ＣＰ−０）、１２３５ｃｍ
−’　、１１００ｃｒｎ−１゜これらのデータはナトリ
ウム３−（アダマンチリデンメトキシメチル）フェニル
−２′−シアノエチルホスフェートの予測された下記構
造と一致した。

乾燥後に吸湿性の白色固体（１１５℃で焼結し、１３０
〜１３３°Ｃで融解する）０．９５Ｆを得た。

ＨＰＬＣ（逆相（：’１８−０．１％酢酸アンモニウム
／ＣＤ、ＣＮ　勾配）は１つの主要なピークを示した。

ＪＲ（ヌジョール）　：　１５９５ｃｒｎ−’　、１５
７５ｃｍ−’１２４５ｃｍ’″’、１２００　ｃＩｎ−
’　　、　１０９５ｃｍ　−菖１０８０ｃｍ−’　、８
９０ｃｍ−’。ＵＶ（２０％Ｍ、　ＯＨ−ジオキサン）
λｍａｙｅ　２６０　／　ｎｍ　：ε−１０，０００゜
これらのデータにより生成物の構造が次式の通りである
ことを確認した。

この塩（１，５Ｆ、０．００３５モル）は水５ｍ／に溶
解した。次いで、濃水酸化アンモニウム（５ｍｌ）を滴
下した。この溶液を室温で一晩撹拌した。得られた白色
スラリーを水浴中で冷却し、アセトニトリル３Ｑｍｌで
処理した。濾過し、１５ｍ１ずつの冷アセトニトリルで
２回洗浄して、短時間の減圧大きい培養試験管中で、実
施例４に従って製造シタエノールエーテルホスフェ−）
！０．０６４Ｍ（０，０００１７モ＃）をＣＨＣｔ、２
５　ａｔに溶解した。

シリカゲル上のメチレンブルー（シリカゲル１２当たり
染料０．００２６ｆ）０．２１０５’を増感剤として加
えた。試験管は水冷した浸漬ウェルの内部に２５０ワツ
トの高圧ナトリウムランプを含む銀めっきしたデユワ−
フラスコに入れた。−枚の５ミルカプト７　（Ｋａｐｔ
ｏｎ：Ｄｘｐｏｎｔ社）をＵＶフィルターとしてウェル
の内部に置いた。この装置に氷水をポンプで送り、試料
の温度を１５０℃以下に保った。乾燥酸素の連続流を毛
細管を通して反応容器に送った。気体流（工固相増感剤
の均一懸濁液を維持するように調節した。２５分の照射
時間後、出発物質のＵＶ（２６０ｎｒｎ）吸収が消失し
た。

淡黄色溶液を濾過し、蒸発させ、水１０ｒｎｌで再調製
した。この水性試料は０．４５ミクロンのナイロンフィ
ルターを通して濾過し、逆相Ｃ１８分離用ＨＰＬＣカラ
ムでクロマトグラフにかけ、水／アセトニトリル勾配で
溶出した。２７７　ｎｔｎで弱いＵＶ吸収を示す画分を
合わせ、凍結監燥し℃ジオキセタン乞白色の綿状吸湿性
固体として得た。この固体は融点を示さずに１４５°〜
１５０℃で分解してアダマンタノを生成して昇華し、部
分的に分解して残留した固体は２７０℃以下では融解し
ない。’ＨＮ−Ｍ−Ｒ−（Ｄｚｏ　、７Ｊｐｔｎ）　：
　、８９　１．８５　（ｍ　。

１２＃）：２．１０（ｇ　、ＬＨ）；３．１５（ｓ　、
３Ｂ）；４．６５（ｓ　、ＨＯＤ−ＨＥ”；）　；７．
１０　７．３６（ｍ。

４Ｂ　）ｏ　１．Ｒ，（ヌジョール−ｒｈ　、　ｃｍ−
’　）　：　３１２０゜１９７０−１７９０（弱い、巾
広−ＮＢｉ）、１６４０（巾広）、１６００（弱い）、
１５８０１．１２８４．１２７３．１１２２．９８０．
８９５゜この生成物の構造は上記ＪＲおよびＮＭＲスペ
クトルにより次式の通りであると確認した。

シー４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１゜メ
トキシ（３−ホスホリルオキシフェニル）メチン／アダ
マンタンナトリウムアンモニウム塩（３，３１）を１滴
のピリジンを含有する１５ｍ１の水に溶解させた。この
溶液（該化合物をピリジニウム塩の形で含む）をアンバ
ーライトｌＲ１２０（プラス）イオン又換樹脂（アルド
リッチケミカル社製）の３ｃＩｎ×２５ｃＩｎのカラム
にゆっくり通した。蒸留水でこのカラムを溶出すると、
２６０ｆＬｍに吸収を示すフラクションが得られ、これ
らをいっしょにして速結乾燥した。得られたモノピリジ
ニウム塩（１２，２，３ミリモル）の１部を１００ｄの
ＣＨｃｔ３　（Ａｔ２０．で乾燥）に溶解した。得ろｎ
だ溶液を大きなシリンダー状の試験管に入れ、５．１０
，１５．２０−テトラフェニル−２１Ｈ１２３Ｈ−ボＡ
／フイ７Ｃ２ｍ９．１ｍｌ　　ＣＨＣ４，中）で処理し
た。得られた均一な緑色の溶液を０°Ｃに冷却し、スパ
ージャ−管を通して酸素ガスで前以って飽和した。この
混合物を銀ジュワーフラスコ中で一定の０２流下に照射
した。このフラスコはデュポンのカプトン（Ｋａｐｔｏ
ｎ）　　ポリイミドフィルムの単一シート（５ミル）で
炉光された２５０ワツトナトリウム蒸気ランプの周りを
囲む冷却された浸漬壁をも含んでいる。デユワ−フラス
コ中の温度は、１２分間の照射の間００−５℃に維持さ
れた。溶媒を真空で除去し、続いて５００ｍ９のＮａ　
−ＢＣＯ，を含有する１００−の蒸留水を添加した。得
られた淡いピンク色の溶液を冷却し、０．４部Ｍクロン
のテフロン膜を通して濾過した。得られたジオキセタン
の水ｉ＠液を、ポリステレフカラム中ＣＨ，−ＣＮ　−
０，５％＃ａｌｌＣＯｓ勾配を使用した調製用逆相ＥＰ
ＬＣに付した。続いて２回目は、ＣＨ，ＣＭ−Ｈ，Ｏ勾
配を使用してカラムに通した。得られた溶液（無機塩を
含まない）を凍結乾燥して８００ｍ９の粒状のかすかに
黄色がかった白色固体を得た。

この固体は融点を示さずに１４５°−１５０℃で分解し
てアダマンクンを生成して昇華し、部分的に分解して残
留した固体は２７０℃以下では融解しない。ｌＢＮ、Ｍ
、Ｒ，（Ｄ２０　）　：δ　、８５−δ１．７５（ｍ。

１２Ｈ）；　δ２．１５（Ｓ、ＩＨ）：　δ２．７５（
ｓ。

ＩＨ）；δ３．１０（Ｓ、３Ｈ）；　δ７．１０−δ７
．３５（ｍ、４Ｈ）。１．Ｒ，（ヌジョールマ／ｌ／　
）　：１６００ｃｍ−’　（弱い）、１５８０ｃ！ｎ−
’、１２８５ｚ−’、１２７５ｃＩｎ−’、１１２０ｃ
Ｉｎ−’　（巾広）、９８０ｃｍ−’　　　８９５ＣＩ
ｎ−’ダマ／タン 実施例３に従って製造した（３−ヒドロキシフェニル）
メトキシメチレンアダマンタフ（ｌ？、０．００３７モ
ル）をアルゴン下でＣｆｆ２ＣＬ２４５罰に懸濁した。

この混合物はトリエチルアミン（０，６ｍｌ、０．００
４３モル）を加えながら撹拌し、それにより無色の溶液
を得た。その後無水酢酸（０，４解、０．００４３モル
）を滴下した。この浴液を室温で４８時間撹拌し、次い
で４時間還流した。溶媒を除去した後、エーテル４ｏｍ
ｉと少量の活性炭を加えた。セライトを通して濾過し、
そのＰ液を濃縮し又油状＠１．２！ＩＭ’を得、これを
シリカゲル（３５ｆ）のプラグを通してクロマトグラフ
にかげ、ＣＭ、Ｃｆ２：　ヘキサン（５０：５０）で浴
出した０生成物（０，８０Ｏｒ）は無色の油として得ら
れ、ＴＬＣで均一であった（　Ｒｆ　　Ｏ，３２：に５
Ｆ−ＣＨ２Ｃｆ２：ヘキサン５０　；　５０）ＪＲ（薄
膜）。

２９００ｃｒｎ−’、１２００ｃＩｎ−’、１０４０ｃ
ｒｎ−’１０３５ｃｒｎ−’　。’ＮＭＲ（アセト／−
δ６）：δ１．９２．２（ｙｙｂ、１２Ｈ）、δ２．４
５（ｓ、３Ｈ）、δ２．８５（ｓ、ＩＨ）、δ３．４５
（重複する一重線３Ｈ＆ＩＨ）、δ７．２　７．７（ｍ
、４Ｈ）。

これらのデータにより生成物の構造が下記の通りである
ことを確認した。

キセノ／の合成 実施例７に従って製造した（３−アセトキシフェニル）
−メトキシメチレンアダマンタン（０，０３１ｒ、０．
０００１モル）ヲモレキュラーシーブ乾燥アセトニトリ
ル１９．４ｍｌに溶解した。この５０．７．ＡＩ溶液Ｉ
Ｑｍｌおよびポリスチレンビーズに固定化シたローズベ
ンガル（センシトツクス：５ｅｎｓｉ−ｔｏｚ　）　（
０，１６０？５Ｐｏｌｙｓｃｉｅ？Ｌｃｅｓ社製）を試
験管に入れた。この試験管は氷水を満たした透明なデユ
ワ−フラスコの内縁に配置した。試験管の底にまで延在
する毛細管を通して乾燥酸素の流入を開始した。その後
、試料はフラスコの外縁から７．６２ｃｙ＋＋（３イ／
テ）の距離で２５０ワツトの高圧す）　ＩＪウムランプ
を用いて照射した。ＵＶスペクトルで２６０１部ｍバン
ドの消失を３時間にわたって監視した。増悪剤の除去後
、淡黄色溶液を濃縮し、逆相Ｃ１８分離用ＨＰＬＣカラ
ムでクロマトグラフにかけ、６０％アセトニトリル／水
から１００％アセトニトリルまでの勾配を用いて溶出し
た。過当な画分を蒸発させてジオキセタンを油状ヮとし
て得た。Ｉ＃　ＮＭＲ（アセトン−δ６）：δ１．２　
２．１（ｍ、１２Ｈ）、δ２．３　（ｓ　、　ＩＨ）、
δ２．４　（ｓ　、　３Ｈ）、δ３．１５　（ｓ　、　
ＬＨ）、δ３．３５（ｓ、３Ｈ）、δ７．３　７．８　
（ｍ、　４Ｈ）。

これらのデータにより生成物の構造が次式の通りである
ことを確認した。

（３−アセトキシフェニル）メトキシメチレンアダマン
タ：’（１，１ｓｙ、３．６８ミリモル）を３、ＯＯｍ
Ａ！のＣＨ（：’　Ａｓ　（”２０３で乾燥）に溶解さ
せた。

この溶液を大きなシリンダー状の試験管に入れ、ＣＨＣ
！−５中猜製されたメチレンブルーの飽和溶液３ｍｌで
処理した。均一な青色の溶液を０°ＣＫ冷却し、スパー
ジャ−営を通して酸素ガスで前飽和さぞた。この混合物
を一定の０２流下に銀蒸着ジュワーフラスコ中で照射し
た。このフラスコにはデュ、′ｔ？ンカプト７　（Ｄｕ
ｐｏｎｔ　Ｋａｐｔｏｘ　）ポリイミドフィルムの単一
シート（５ミル）でＰＫされた２５０ワツトナトリウム
蒸気ランプの周りを囲む冷却された浸漬壁をも含んでい
た。該ジュワー円の温度は７分間の照射中０°〜５℃に
保持された。

薄層クロマトグラフィー（ワットマンに５Ｆ、ｃｇ、ｃ
ｔ、：ヘキサン５０　：　５０の混合物を使用）にかけ
ても何ら出発物ｌＫは検出せず、Ｒ−ｆ、　　０．３５
に生成物を検出した。溶媒を除去して青色油状物を得た
。ＣＨ２Ｃｌ−２：ヘキサン５０　：　５０の混合物２
０ｍ１に溶解させると暗色の固体が沈殿した。この懸濁
液を８２の微細なメツシュシリカゲルのプラグに流した
。加圧下に１００Ｉｎ／の上記と同じ溶好で溶出して真
臣下に濃縮して１．３２の淡黄色油状物を得た。ｌＨＨ
，、Ｉ４．Ｒ，（ＣＤＣ１３）　：δ、９９８−６１９
０（，１２Ｈ）：δ２．１５（ｓ、ＩＨ）：６２．３０
（８，３Ｈ）：　　δ３．０４　　（ｓ　　、　　ＩＨ
）　　；δ３．２０　（ｓ　　、　　３Ｈ）　　；　　
δ７１０−δ７．５０　（ｍ。

４Ｈ）。上記油状生成物の１部を冷蔵庫に保存しておく
と３週間かけてゆっくり固体になった。石油エーテル（
沸点３０−６０°Ｃ）で−２０℃で研和してわずかに黄
色がかった白色固体を得た。融点７８−８１°Ｃｏ１．
Ｒ８（ＣＨＣｔ３）　：　３１００ｃｍ−’２９２０ｃ
ｍ−’　、２８８０ｃ＋＋＋−’　、１７６０Ｃ７ｎ−
’　（Ｃ＝Ｑ）、１６０５ｃｒｎ−’　（弱い）、１５
８５ｃｍ−’　、１３７０ｃｍ−’１１９０ｃｉ−’、
１０１０ｃＩｎ−’、９１０ｃｒｎ−’、　９００ｃｍ
−’０イルケトン マグネシウム削り屑（１，１５’、０．０４５モル）を
ヨウ素の結晶および乾燥ＴＨＦ５ｍｌと共にアルゴン雰
囲気下で火災乾燥フラスコに入れた。この懸濁液を４５
℃に刀口熱し、その間に乾燥ＴＨＦ２５ｍｌ中の２−ブ
ロモ−６−メドキシナフタレン（７，１３？、０．０３
モル）の溶液を滴下した。発熱反応が始まったとき、こ
のフラスコを呈温の水浴に沈めた。滴下完了後、反応混
合物を３０分間還流した。２−シアノアダマ／タン（４
，８５５’、０．０３モル）の＠液を３０分間にわたっ
て滴下した。得られた黄褐色溶液を一晩還流し、水浴で
冷却し、エーテル３Ｑｍ／で希釈した。その後、製塩ｐ
　（５ｍｌ、０．０６　モルＨＣｔ　）を撹拌Ｌ　＆　
７５”　ラ滴下した。生じた沈殿物は濾過により分離し
、エーテルで洗い、乾燥し、メトキシエタノール３５＋
＋＋Ａ’と濃塩酸３０ｍ１の混合物に懸濁して５時間還
流した。その懸濁液がまだ温いうちに固体を戸数し、水
で洗った。粗製ケト７７．３２を灰白色粉末として得た
。ＴＬＣＣＲｆ　Ｏ，３９：に５Ｆ−Ｃ１１２ＣＬ２：
ヘキサン４０：６０）は１つの主要な生成物を示した。

酢酸エチル１５０ｍＪかも再結晶して黄褐色針状晶５７
を得た（融点１７３〜１７５°Ｃ）。ＪＲ（Ｃ＃２Ｃ６
２）：　２９００Ｃｒｎ−’、１６６５ｃｍ”’（Ｃ＝
Ｏ）、１６２０ＣＩｎ−’、１４７５ＣＩｎ−’、１１
９０ｃｍ−’、１１６５Ｃ７ｎ−１により生成物の構造
が次式の通りであることを確認した。

実施例６に従って製造した６−ノドキシナフト−２−イ
ルアダマント−２′−イルケトン（３，５１，０，０１
１モル）をアルゴン雰囲気下でシーブ乾燥（３Ａ　）Ｄ
ＭＳＯ３０１ｒＬｔに懸濁した。カリウムを一ブトキシ
ド′Ｃ２，２５１，０，０２０２％ル）を撹拌しながら
加えて、若干の固形分を含む深橙色溶液を得た。フラス
コを４８℃の水浴に入れ、硫酸ジメｆルｃ　１９ｍ１．
　０．０２０％ル）を注射器カラ２０分間にわたって滴
下した。脱色した溶液を呈温まで冷却し、得られた懸濁
液を一晩撹拌した。

この混合物を水浴で冷却し、水ＩＱｉ／で滴下処理した
。撹拌を水浴中で４５分間現けた。沈殿物を戸数し、減
圧乾燥し、その抜水で十分に洗浄した。

乾燥後、融点が７８〜８０’Ｃの白色固体（３，４５７
，９４％）を得た。ＴＬＣは微量の出発物質を含む均一
な生成物を示した（ＲｆＯ，６４：Ｅ−ｉｋｆｅｒｃｋ
　Ａ１２ｏ３−ヘキサン：　ｃＨ２Ｃｔ２６０　：　４
０　）。

／　Ｒ（ＣＨ，Ｃ１０）　：　２９００ｃ！ｎ−’　、
　１６２０ｃｍ−’１６００ｃｍ−’　、１４８０ｃ７
ｎ−’、１０３０Ｃ！ｎ−’により生成物の構造が次式
の通りであることを確認した。

乾燥ＤＭＦ２Ｏｍｌ中の実施例９に従って製造した（６
−ノドキシナフト−２−イル）メトキシメチレンアダマ
ンタンＣ２，０？、０．０６６モル）の＠液を、不活性
雰囲気下で同じ溶媒２ｏｒｎｌ中のナトリウムエタンチ
オラート（１，０５’、０．０１２モル）の溶液に加え
た。この混合物を２．５時間還流下に加熱した。水浴で
冷却後、黄色の懸濁液に激しく撹拌しながら飽和ＮＨ４
ｃＬ　　１５０ｍｌを加えた。

次いで酢酸エチル５０Ｉｎｌおよび水２０ｍ１を加えた
。

１０分間撹拌後、酢酸エチル層を分離し、水層を追加の
同一溶媒５０ｍ１で抽出した。合わせた有機抽出物を２
５ｍ１ずつの水で４回、飽和Ａ’　ａ　ＣＬ水溶液５０
ｍＡ’で１回洗った。この溶液なＮα、ＳＯ，上ですば
やく乾燥し、濃縮して橙色のガムを得、これをヘキサン
で数回摩砕した。ガムは冷蔵庫内で貯蔵した際に固化し
、灰白色固体１．７７を得た（融点１３３〜１４０℃）
。　Ｔ　ＬＣ（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ　　ＡＬ２０ｚ−ＣＨ２
Ｃｌ２：ヘキサン５０：５０）は原点に生成物ナフトー
ルを示し、出発物質（Ｒｆ　０．８５）は存在しなかっ
た。従って、生成物の構造は次式の通りであることを確
認した。

ＯＡｆ　ｅ させて淡黄色油状物を得、これを徐々に固化させた。こ
の固体を０℃にてヘキサンで２回摩砕し、白色固体３０
０ｍ９を得た（融点１０１〜１０３°Ｃ）。

Ｉ　Ｒ（ＣＨ２Ｃｔ２）　：２９００ｃｍ−’　、１７
６９　ｃｍ　−’　（Ｃ＝０　）、１６００ｃｒＩＩ−
’、　１３６５ｃｍ−’、１２０５ｃｍ−’、１０１０
ｃＪｎ−１゜これらのデータにより生成物の構造が次式
の通りであることを確認した。

実施例１２に従って製造した粗製ナフトールエノールエ
ーテル（０，７？、０．００２１８モル）をアルゴン雰
囲気下で”２Ｃ１２２０ｍｌと共に撹拌した。トリエチ
ルアミ７　（０，３５ｍ／、　　０．００２５％ル）を
加えて淡黄色溶液を形成した。その後無水酢酸（０，２
４ｍ、　０．００２５モル）を滴下した。

この混合物を２４時間還流し、減圧ストリッピングを行
い、得られた油状物をエーテル３０ｄＫ溶解し、水（２
ｘ１５ｙ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｘ１５
ｍｌ）および飽和塩化ナトリウム水溶液（１×２０ｍ１
）で抽出した。有機層をＮα２Ｓ０４上ですばやく乾燥
し、回転蒸発器で蒸発メトキシ（６−アセドキシナフト
ー２−イル）メチレンアダマンタンを実施例８に記載し
たようにし”Ｃ：）’ｅｌｌｆｆ素添加した。得られた
３　−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−
４−（６“−アセトキシ）ナフト−２′−イル−１，２
−ジオキセタンをカラムクロマトグラフィーで精製した
ＪＲおよびＮＡｆＲスペクトルをしらべた。下記結果を
示した。

Δ’−Ｍ−Ｒ−ＣＣＤＣＬ３．ｐ７）ｍ）：　、９５　
２．０（ｍ＋　　１２Ｈ）−次の２つの位置に各々二重
線を示す：、９５、ＩＨｌおよび１．１８、ＩＨ）　：
　２．１９　（＋、ＩＨ）：２．３８（ｓ　、３Ｈ）：
　３．１０（ｓ　、ＩＨ）；３．２４（ｓ　、　３Ｈ）
　；　７．３０−７゜９６　（ｒｎ　、　６　Ｈ）。

１、Ｒ，（ＣＨＣｔ３．ｃｍ　’　）　：　２９１８．
２８５６．１７５５（Ｃ＝Ｏ）、１６０５．１４７４．
１４５３．１３７２．１１９４．１１７３．１０７０．
９２５゜９１３．８９７゜ この生成物をアセトニトリルに溶して５Ｘ１０″″３Ｍ
溶液とし、この１０　Ｑ　ｐＬをキュベツトに入れ、す
ばやく２ｍｌの７５　ｍｕ　ＮαＯＨ溶液を添加した。

わずかにくもっている溶液をスペックスフルオロログ・
フルオロメーター（５ｐｅｚ　ＦｔｗｏｒｏＬｏｇＦＬ
ｕｏｒｏｍｔｔｅｒ）に入れ、里温で４００〜７００？
Ｌ？７Ｌの波長の光線で５スキヤン運胱で照射を絖けた
。

次いで実施例１で合成した対応する２、７−置換ジオキ
セタンの５　Ｘ　１０−３アセトニトリル’Ｆ＋９を使
用してこの実験を繰返した。これら２つのジオキセタン
の化学発光スペクトルを波長と発光強度との関係につい
て同時にプロットした。主として水性媒体で行なった実
験で得られた２、７−異性体からの発光は５５５　ｎｍ
であった。−万、２゜６−異性体からの強度が弱い発光
は同じ媒体中で４５９　ｎｍであった。

同一の一組の実験を行い、３−　（２’−スピロアダマ
／タン−４−メトキシ−４−（７“−アセトキシ）ナフ
ト−２′−イル−１，２−ジオキセタンと３−　（２’
−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３“−
アセトキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンとを各々
ＣＨ３ＣＮ中５Ｘ１０−’＆浴液としたものからの発光
を比較した。

上記ナフタレンをペースとする系は５５５　ｎｍでも発
光したが、上記アセトキシフエニルジオキセタンは４７
３　ｎｍで同様の強度で発光した。

抗ｈＣＧ抗体被覆ビーズおよび抗ｈＣＧ抗体：アルカリ
注ホスファクーゼコンジュゲートはハイブリチク・タン
デム・アラ七イ・キット（Ｈｙｂデ（−１ｇｃｈ　Ｔａ
ｎｄｅｍ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔ　）力）ら得られた。

以下に実施例６で合成した１、２−ジオキセタン（ＡＭ
ＰＰＤ）ジナトリウム塩（以下の実施ｇＡ１でＶｔこの
塩をＡＭＰＰＤと略記した。）をアルカ１ノ２オス！ア
ターゼの基質として用℃・た場合の五〇Ｇの検定を示し
た。比収のため、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とし
て比色定量検定した。

１、　ビーズから過剰の緩衝液を吸（・取った後、各試
験管（１２ｘ７５ｍ）に１個のビーズを入れた。

２、各試験管に抗ｈｃＧ抗体倉スファターゼコン・シュ
ゲート１００μＬを力ａえた。

３、各試験管に試料１００μＬをカロえた。ｇｔｔの試
験管に以下のものを準備した二 ｃＬ）　　対照ゼロ試料（男性の血清またＩＬ１尿）ｂ
）　　２５　ｍｌＵ／ｍｌ　％ＣＧ標品（皿漬マたを１
尿）ｃ）　　２００　ｔｎｌＵ／ｍｌ　ｈＣＧ標品（血
清また（１尿−）ｄ）、患者試料（血清または尿） ４６　　混合後、試験管にカッく−を力１ぶせて３７℃
で９０分間インキュベートした。

５　フンシュゲートおよび試料を含む反応液を吸引除去
した。

６、　ビーズを０．１％ツイー７２０を含むリン酸綴衝
溶液（ｐＨ７，４）　２．０ｍ／で３回洗った。

１２、両模定のデータはｈＣＧの各濃度でのシグナルを
ゼロ八〇〇でのシグナルで割った値を五〇〇の濃度に対
してプロットした。代表的なデータを第１図に示す。こ
こでＰＮＰＰは比色定量検定を、そしてＡ　Ｍ　Ｐ　Ｐ
　Ｄは化学発光検定を表す。化学発光検定は比色定量検
定よりも４倍以上高感度であった。

によろ） 市販のタンデムＩｃ０Ｎ　　［１検定キツトを使用した
。緩衝液および抗体はすべてこのキットの中に含まれて
いるものを使用し、アルカリフォスファターゼの基質は
実施例６で合成したジオキセタン（Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄ
　）を使用した。

方法 １、被検試料として使用するために、対照陰性（ｉ）尿
で希釈した０、５．１０．５ｏｍｌＵ／ｒｎｌの五〇Ｇ
標品を用意した。

２、　　ＩＣ０Ｎメンブラ／容器の中央に、１度５滴の
試料を滴下した。

３、各容器の中央に３＠の酵素抗体コ／シュゲートを加
えた。

４、　１分インキュベートした。

５、装置に・・イブリテクＩＣ０Ｎ洗液２ｍｌを加え、
排出させた。

６、　０．１Ｍ）リス、１　ｍＡＩ　　ＭｇＣＬｘ　（
ｐＨ’Ｌ８　）中の０１％Ｂ５Ａ３００１１ｔを加えた
。排出させた。

７、　５０　ｐ？／ｒｎｌ　ＡＭＰＰＤ、　　Ｏ，ｌ　
％ＢＳＡ％１ｍｕ　ＡｆｇＣｌ、を含むＱ、　Ｉ　Ｍ　
）リス緩衝Ｗ（、ｐＨ９，８）、２００μｔを加えた。

８、　　ＩＣ０Ｎ膜をとり出し１枚のマイラーに移行さ
せ、フィルムラ褪元すべく暗箱に入れた。

（ポラロイド型６１２）。

９、　フィルムを３０秒間露光した。代表的な検定の結
果を第２図に示す。陽性試料では強い化学発覚が３０秒
の反応時間内に起こった。

実施例１７゜ アルカリ性ホスファターゼ検定は次の方法で実施した。

成分 緩衝液二〇、０５Ｍ炭酸塩、Ｉ　ＭＬＭＭ　ｇ　Ｃ４（
ＰＨ９，５） 基質：０．４ｍＭ濃度の３−　（２’−スピロアダマン
タン）−４−メトキシ−４−（３“−ホスホリルオキシ
）フェニル−１，２−ジオキセタンジナトリウム塩（Ａ
ＭＰＰＤ） アルカリ性ホスファターゼ：緩衝液中１．１６８μ？／
ｒｎｌのアルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は
試験管内で次の最終酵素濃度となるように行った； ４．１７Ｘ１０”＆、　　　　　１．６７ｘｌＯ−”＆
８．３　４　　Ｘ　　１　０−１２Ｍ　　　　　　　　
　　８．３　４　　Ｘ　　１　０−”　ノＷ１．６７Ｘ
１０−”＆　　　　　　４．１７Ｘ１０”Ｍ３．３４Ｘ
１０’″１３Ｍ　　　　　　２．０９　Ｘ　１０−”Ｍ
６．６８　Ｘ　１０−１′Ｍ １．３４　Ｘ　１０−”Ｍ ３．３４　ｘ　１０−”Ｍ 手順： 上記濃度のアルカリ性ホスファターゼを含みさらに０．
４　ｍＭ　ＡＭ　Ｐ　Ｐ　Ｄを含む２通りの試験管は３
０°Ｃで２０分インキュベートした。インキュベーショ
ン後、ターナ−２０Ｅルミノメータ−で３０秒間の発光
積分量を測定した。アルカリ性ホスファターゼの検出限
界を表■に示す。第３図には、０．４　ｍｈｆ　Ａ　Ｍ
　Ｐ　Ｐ　Ｄを用いたアルカリ性ホスファターゼの検出
データを示す。発光は１ｏ−１４〜１０−１１　Ｍ酵素
の間で直線状であった。

表　　　１ １、緩衝液：０．０５Ａ（炭酸塩、１工Ｍ　ＭＱＣ１２
、ｐＨ＝　９．５゜　温度＝３０°Ｃ０化学発光化合物
濃度：　０．４　ｍＭｏ ２、かっこ内の数字は表示濃度での、＜ツクク゛ラウン
ドレベルの倍数である。

アルカリ性ホスファターゼ検定は次の方法で実施した。

成分 緩衝ｆｊ、：０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、１　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｔ２（ｐＨ９，５） 基質：０．４ｍ１ｄｅ度の３　、、、、　（２／−スピ
ロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホ
１ノルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンジナト
リウム塩（ＡＭＰＰＤ） アルカリ性ホスファターゼ：緩衝液中１．１６８μｆ／
ｒｎｌの原液 条件： １、緩衝液のみ（対照） ２、緩衝液＋０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３、
　　緩衝ｉ＋ｏ、１％ＢＳＡ−フルオレセイン（ＢＳＡ
対フルオレセインの比１：３）４、　　緩ｉｉ＋ｏ、１
％ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチル−アンモニ
ウムクロライド）〕（ＢＤＭＱ） ５　　緩ｌ液汁０．１％ＢＤＭＱ＋フルオレセイン（Ｂ
ＤＭＱ　　１ｍｌと混合したフルオレセインジナトリウ
ム塩０、ＯｌｍＦ） アルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試験管中
で次の最終酵素濃度となるように行った：４．１７Ｘ１
０”Ｍ　　　　　１．６７Ｘ１０−１５Ｍ８．３４Ｘ１
０−”Ｍ　　　　　８．３４Ｘ１０−１’Ａｆ１．６７
　Ｘ　１０−１２Ｍ　　　　　　４．１７　Ｘ　１０”
Ｍ３．３４×ｌ０−１３ＡＪ　　　　　　２．０９Ｘ１
０−”＆６．６８Ｘ１０−１４Ｍ　　　　　１．０Ｘ１
０−”Ａｆｌ、３４Ｘ１０−”Ｍ　　　　　５．０ｘｌ
Ｑ−”Ｍ３．３４　ｘ　１０−”Ｍ　　　　　　２．５
　ｘ　１０−”Ｍ手順： いろいろな条件において、上記各鍾濃度のアルカリ性ホ
スファターゼに０．４　ｍＭ　ＡＡｆ　Ｐ　Ｐ　Ｄを加
えた２通りの試験管を３０℃でインキュベートした。条
件１．４および５は２０分インキュベートし、条件２お
よび３は９０分インキュベートした。

インキュベーション後、ターナ−２０Ｅルミノメータ−
で３０秒間の発光積分量を測定した。アルカリ性ホスフ
ァターゼの検出限界に対するＢＳＡ、ＢＤＭＱおよびフ
ルオレセインの効果を第４図および辰■に示す。第４図
中−四−は上記条件１、−一一日一一一は条件２、−−
−０−ｍ−は条件３、−−一・−一−は条件４、−−−
△−−−は条件５を各々示す。

表 ■ ０．１％ＢＳＡ： フルオレセイン ０．１％ＢＤＭＱ １．３　Ｘ　１０−１’Ｊ／ ４、Ｏｘ　１＋　Ｏ−”　Ｍ （１，０６） ４．１７Ｘ１０’″＋６Ｍ （１，０４） １．００　Ｘ　１０−１’　Ｍ （１，０７） １゜ かっこ内の数字は表示濃度でのバックグラウンドレベル
の倍数である。

膜：ジーン・スクリーン拳プラス社（Ｇｅｎｅ　Ｓｔｒ
ｅｅｓＰｌｕｇ　　）、の陽性荷電したナイロン膜緩衝
ｔｉ、’に’＆ａ衝液：　０．５Ｍ　ＮａＯＨ中和緩ｋ
　ｉ　’　ｏ、　４　Ａ／　　ＮａＨ２ＰＯ＜　（４２
，０）負荷緩衝ｆｙ、：変性緩衝ｇ　１部 中和緩衝液　１部 膜湿潤緩衝液７０．４Ｍトリス（ｐｇ　７．５　）腹プ
レハイプリタ゛イゼーション緩衝液：最終濃度 ０．５ｍｌ　　　１００ＸＤｅｘ五ａｒｄｔ’ｓ浴液　
　　　　　５％０．５ｍｌ　　１０％ＳＤＳ　　　　　
　　　　Ｏ，５％２．５ｍｌ　　２０ｘＳＳＰＥ　　　
　　　　　５％２．０ｍ９　　変性、超音波処理サケ　
　　　２００μ？／ｍｌ猜子ＤＮＡ ｄｃｉＨ，Ｏ Ｏｍｌ 膜ハイブリダイゼーション緩衝液： ｙｓｍｌ Ｑ、　５　ｍｌ ２、５　ｍｌ ０ｍ９ ２．０ｒｎｌ ｄＨ２０ １ＱｉＡ’ １００　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ １０％　５ＤＳ ２０×５ＳＰＥ サケ精子ＤＮＡ ５０％硫酸デキストラン 洗浄緩衝液Ｉ： ｌｘ　Ｓ　Ｓ　ＰＥ７０．１％ＳＤＳ ２０ｍｌ　　２０ｘＳＳＰＥ ４ｍｌ　　１０％　５ＤＳ ３７６ｍｔ　　ｄｄＨ２０ ００ｍ１ 洗浄緩衝液■ ：洗浄温度に予備加温した０、ｌ ５ＳＰＥ７０．１％ＳＤＳ ２ｍｔ　　２０ｙ、ｓｓｐＥ ４ｍｌ　　ＩＱ％ＳＤＳ ３９４ｍｌ　　ｄｄＨ２０ ４００ｍＡ（加温） 最終濃度 ５％ ０．５％ ５％ ２００１１１７ｍ１ １０％ 洗浄緩衝液■： ０．１　ｘｓ　Ｓ　ＰＨ７０，１％ＳＤＳ２０ｍｌ　　
２０ｘＳＳＰＥ ４ｍ６１０％ＳＤＳ ３９４ｍｌ　　ｄｄＨ２０ ｏｏｍｔ 洗浄緩衝液■： ３ｍＭ　　）リス−１１Ｃｔ（ｐＨ９，５）０．６ｍｌ
　　ＩＭ　　）リズマ塩基（Ｔｒｉｚｍａ　＆ｓｇ）１
９９．４　ｍｌ　　ｄ　ｄＨ２０ ２００、Ｏｍｌ １００　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ　ｔ’ｓ溶液：分子ｉ４０
にのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−４０）：１Ｍ’お
よびフィコール２７を６５°Ｃ以上の沸点以下の温度で
溶解した。この溶液を約４０℃に冷即し、Ｂ５Ａ２？を
加え、ｔｄＨ２０で最終容量を１００ｍＡ！とじた。ア
リコートに分けて、−２０°Ｃで貯蔵した。

２０　Ｘ　５ＳＣ ２０×５ＳＣ（全量１００ｍＪ） ３．０Ｍ塩化ナトリウム１７．４Ｓ’ ０．３Ｍ　クエン酸ナトリウム　　　　８，８７容量を
ｌＱＱｍ／となし、０．４５μ濯ニトロセルロースフイ
ルターを通して濾過し、室温で貯蔵した。

２０　ｘ　５ＳＰＥ ２０　ｘＳＳＰＥ（ｐＨ７，４）Ｃ全量１ｔ）３．６Ｍ
ＮαＣＬ　　　　　　　　　２１０．２４Ｆ２００　ｍ
Ｍ　　リン酸ナトリウム　　　２３タニ塩基性５．９２
５’−塩基性 ２Ｑ　ｍｕ　Ｅ　ＤＴ　Ａ　　　　　　　　７．４４　
？溶解し、５ＮＮａＯＨでｐＨ７，４に調整し、容量を
ＩＬとし、０．４５μｍニトロセルロースフィルターを
通して濾過した。

　ＸＴＥ １　ｘＴＥ　緩衝液　　　１０　ｍＭ、　）リス（ｐＨ
７０）１□Ｍ　ＥＤＴＡ オートクレーブ処理 方法： １、膜を湿潤緩衝液で１５分間前もって湿らせた。

２、膜を真窒マニホールド装置に挿入した。

３、ＤＮＡ試料（既知コピー数のＨ５″　Ｉ　　ＤＮＡ
を含む）５０μｔを変性緩衝液２００μｔに加えろこと
によりＤＮＡ試料を変性した。室温で１０分インキュベ
ートした。氷冷した中和緩衝液２５０μＬを加え、変性
ＤＮＡを氷上に保持した。

４、各ウェルに負荷緩衝液２００　ｌｉｔを加え、膜を
通して吸引した。

５、各つ土ルに変性ＤＮＡ試料を加え、膜を通して吸引
した。

６、ステップ４を繰り返した。

７、マニホールドを屠体し、膜を取り出した。

８、　ＵＶトランスイルミネーターを使ってＤＮＡを膜
へ５分間ＵＶ固定した。

９、膜をプレハイブリダイゼーション緩衝液中７０℃で
１時間インキュベートした。

１０、膜ハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したＨ５
ＶＩ　に特異的なアルカリ性ホスファターゼ標識５ＮＡ
Ｐ　プローブを加えた。７０°Ｃで３〜５時間インキュ
ベートした。

１１、膜をハイブリダイゼーション緩衝液から取り出し
、洗浄緩衝液１４００ｍｊ中室温で撹拌しながら１０分
間インキュベートした。

１２、洗浄緩衝液１１４００ｍ／で５０℃、３０分洗浄
した。

１３、洗浄緩衝液１１１４０（１／で室温、１０分洗浄
した。

１４４洗浄緩衝液■２００ｒｎｔで室温、１０分洗浄し
た。

１５、膜を１枚のＷｈａｔｍａｎブロッティングペーパ
ー上に置いた。

１６、　３００　Ｐ？／ｍｅ　ＡＭＰＰＤを含むＯ，ｌ
　Ｍトリス、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　（ｐＥ　　９．８
　）　２　ｍｌを加え、膜を通過させた。

１７、その膜を１枚のマイラーへ移行させ、その後６１
２型ポラロイドフイルムを含む暗箱へ入れた。

１８　　フィルムを３０分露光した。代表的な結果を第
５図に示す。ここで第５Ａ図は６０μ？／ｍ１ＡｋｆＰ
ＰＤ　での結果を示し、第５Ｂ図は３００ｐ？／ｍｌ　
　ＡＭＰＰＤ　　での結果、ソシて第５Ｃ図は３００μ
ｔ７ｍ１　ＡＭＰＰＤ　での初めの３０分の反応後の結
果を示す。

抗ＡＦＰ抗体被覆ビーズおよび抗ＡＦＰ抗体：アルカリ
ホス７アターゼコンジュゲートはノ・イフリテク・タン
デム・アッセイ・キットから得られた。

ｌ　も試験管に試料２０μｔを加えた。試料は０．２５
．５０，１００、および２００　ｍ９７ｍｅＡＦＰであ
った。

２　各試験管に１個のビーズを入れた。

３、各試験管に抗ＡＦＰ抗体アルカリホスファターゼコ
ンジュゲート２００μｔを加えた。

４、　ラックを撮って試験管の内容物を混合した。

５、試験管にカバーをかけた。

６、３７℃で２時間インキュベートした。

７、抗体および試料を吸引除去した。

８、　ビーズをリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）中の０．
１％ツイー７２０　２．０ｒｌｔｌで３回洗った。

９゜ ＩＱ、０．ＩＡｆグリシン、ｌ Ｊ　ＭＱＣＬ、　、Ｉ Ｍ　ＭｇＣＬｚ（ｐ” １０．４）中の１ｍｇ／ Ｉｎｊｐ−二トロフェニ ルーホス７エート （ＰＮＰＰ）２００ μｔを加えた。

■、室温で３０分インキ ュベートした。

９．０．０５Ｍ炭酸塩、ｌＴｎＭ ＭＱＣＬｚ　（ｐＨ９，５）で １回洗った。

１０、　０．０５Ｍ炭醒塩、１ｍｕ Ｍｆ　ＣＬｘ　（ｐ　Ｈ９，５）中 の０．４　ｍＭ　ＡＭＰ　Ｐ　Ｄ ２５０μｔを添加した。

１１．３０℃で２０分インキ ュベートした。

１２、発色を止めるべく ０．１Ｍグリシン、 １０ｍＡ１　　　ＥＤＴＡ （ｐＨ９，５）　１．５＋ｎｌ を加えた。

１２゜ １３、分光元度計で４１０　　１３．　　ターナ−ルミ
ノメータ％ｍでの吸光度を読　　　　−で各試験管の１
０秒み取った。　　　　　　　　間積分を読み取った。

１４、両検定のデータはＡＦＰの各濃度でのシグナルを
ゼロＡＦＰでのシグナルで割った値をＡＦＰのｇ２に対
してプロットした。第６図に示すように、比色定量検定
の結果はＰＮＰＰ曲線で表され、そして化学発光検定の
結果はＡＭＰＰＤ　曲線で表される。後者の検定は前者
の検定の約１０倍の感度であることが分かる。

物質： 被分析体捕獲用のイインチビーズを、マウスモノクロー
ナル抗ＴＳＨ−β抗体で被覆した。マウスモノクローナ
ル抗ＴＳＨ抗体はアルカリ性ホスファターゼと精舎させ
て、検出用抗体（抗体酵素コンジュゲート）として使用
した。

ＴＳＨはＣａｌｂｉｏｃｈｇｍ社カタログ番号６０９３
９６から得られ、ＢＳＡ（Ｖ型−脂肪酸不含）はＳｉｇ
ｍａ　社カタログ番号、（６００３かも得られた。

被検液および抗体酵素コンジュゲートに用いた緩衝液は
０．１　Ｍ　）リス−ＨＣ１、ｌ　ｒｙＬＭ　Ｍ　ｇ　
Ｃ４および２重量％ＢＳＡ　（ｐＨ７，５）である。基
質緩衝液は０．１　Ｍ　）リス、０．１　ｍＭ　ＭＱＣ
Ｌ２（ｐＨ９，５）および基質ＡＭＰＰＤ（５０μ？／
ｍｌ）を含んでいた。

手順： ＴＳＨ含有被検溶液（１５μｔ）は抗体＃累・コンジュ
ゲート溶液１３５μｔと混合した。この溶液に上記のよ
うに被覆したイインチビーズ２個を加え、２３℃で２時
間インキュベートした。その後、ビーズを０．１　Ｍ　
）リス（ｐＨ７，５）で４回洗い、反応試験管へ移した
。上記の基質を含む緩衝液２００μＬを試験管に加えた
。２０分インキュベーション後、ベルトールド・クリニ
ルマット・ルミネツセンス・アナライザー（Ｂｇｒｔｈ
ｏｌｄＣｌｉｔＬｉｌｕｍｃＬｔ　ＬｌＬｍｉｎｅｓｃ
ｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使って１０秒間のカウ
ント数として発光量を記録した。

第７図（下記表工、のデータのプロットである）は所定
のＴＳＨ濃度に対する発光強度を示す。１μＵ／ａｔと
８μＵ／ｍｌのＴＳＨの間で直線性を示した。

辰　工 ０．２５ ０．４９ １．１ 比較のために、ＢＳＡの不存在下で同じくＴＳＨ検定を
行った。第８図に示す工うに、ＢＳＡ含有試料（臼ｇＡ
）＆よりＳＡを含まない試料（曲線Ｂ）よりも所定のＴ
Ｓｇ濃度に対して強い発光強度を示した。

抗ＣＥＡ　’ｇｌ覆ビーズおよび抗ＣＥＡ抗体：アルカ
リ性ホスファターゼコンジュゲートはハイブリチク・タ
ンデム・アッセイ・キットのものを使用した。

１、各試験管に試料２０μＬを加えた。０．２．５．５
．１０．２０および５０　ｎ？／ｍｌ　ＣＥＡの凛準を
使用した。

２、各試験管に１個のビーズを入れた。

３、各試験管に抗ＣＥＡ抗体酵素コンジュゲート２００
μｔを加えた。

４、　ラックを振って試ｉｆの内容物を混合した。

５、試験管にカバーをかけた。

６、３７℃で２時間インキュベートした。

７、反応液を吸引除去した。

８、　ビーズを０１％ノイー７２０を含むリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７，４）　２．０ｍＪテ３回洗ッた。

９、　０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、１　ｍＭ　Ｍ　ｇ　
Ｃｊ２（ｐＨ９，５）で１回洗った。

１０．０．４ｍＷ　ＡＭＰＰＤを含有する０、　０５　
ＡＩ炭酸ナトリウム、１　ｍＡｆ　ＭｇＣｔ２（ｐＨ９
，５）　２５０μＬを加えた。

ｎ　３０°Ｃで２０分インキュベートした。

１２、　　ターす一２０Ｅルミノメータ−で各試験管の
発光を１０秒間の積分値としてカウントした。

１３、ＣＥＡの各濃度でのシグナルをゼロＣＥＡでのシ
グナルで割った値をＣＥＡのｆｉ！に度に対してプロッ
トした。ＡＭＰＰＤ　を用いたＣＥＡ検定の代表的デー
タを第９図に示す、Ｏｎ？／ｍｌと２０？Ｌｆｌ／Ｉｌ
ｌのＣＥＡ濃度の間で直線性を示した。

直径約３龍のナイロン膜（ポール１ムノダインＣＰａ１
ｌ　ｌｍｍ５ｎｏｄｙｎｅ　）　！！、孔サイズ０．４
５ミクロン）を、リン酸塩緩衝液中に固相用の捕捉モノ
クローナル抗ＬＨ抗体（メデイツクス（Ｍｅ　ｄ　ｉ　
ｚ　）より市販、カタログ＃Ｌ−４６１−０９）１μＶ
ｍｌの溶液５μｌで感作した。続いて、上記膜をｐＨ７
，３のリン酸塩緩衝液添刀ロ生理塩水中２％カゼイン溶
液でブロックした。次いでこの膜を第１０図て示した装
置（プロッティングペーパー層を含む）にセットした。

第１０図中αはプレフィルタ−カップを示し；ｂｒｒ’
ｚプレキシグラストップを示し；Ｃはポールイムノダイ
ンメンブレム（孔サイズ０．４５μ）を示し；ｄはポリ
プロピレンアセテートの羽毛状層を示し；ｅはプロッテ
ィングペーパーを示し；ｆはプレキシグラスを示す。

使用された検出抗体は、メデイツクスより市販のマウス
モノクローナル抗ＬＨ抗体（カタログ＃Ｌ−４６１−０
３）を用いた。この抗体を、グルタルアルデヒドカップ
リング法［Ｖｏｌｌｅｒ＋Ａ　ｅｔ。

ａｌ、ＢｕＬｌ、ＩＩｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇ
、、　　５３　、５５（１９７６））によりアルカリ性
ホスファターゼ（バイオザイム（Ｈｉ　ｏ　ｚｙｍｅ　
）より市販、カタログ＃ＡＬＰＩ−１１Ｇ）と結合させ
て抗ＬＨ抗体アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート
を調製した。

方法 ５０μｔの上記検出抗体コンジュゲートを下記濃度のｈ
ＬＨ溶液２００μｔを含有する試験管に秀加した： 試験管＃　　　）、ＬＨ濃度（ｎ？／ｍｅ（Ｐ　ＢＳ　
）　）各試験管の内容物を捕捉抗体（前述）であらかじ
め感作しておいた４枚のナイロン膜に加えた。

５分間インキュベーション後、プレフィルタ−カップを
取り除き、上記膜を、リン酸塩緩衝液添加生理塩水中０
．０５％トウイーン（Ｔｗｅｇｎ）　２０溶液４００μ
ｔで洗った。統（・て、０．０５Ｍ炭酸塩、１７７ＬＭ
ＭｇＣＬ２．０．１重量％ＢＳＡ　（ｐＨ９−５）中Ｑ
、４　ｍＭ　（３−（２’−スピロアダマンタン）−４
−メトキシ−４（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−
１，２−ジオキセタンジナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ　）
浴液１００μｔを加えた。上記ナイロン膜をタイプ６１
２ポラロイドインスタント白黒フィルムを入れたカメラ
ルネミノメーターに入れ、１分間露光した。フィルムに
画像形成した検定結果を第１１図に示す。

次に、上記画像の反射濃度を、トビアスＲＢＰポータプ
ル白黒反射デンントメーター（ＴｏｂｉａｓＲＢＰ　　
Ｐｏｒｔａｂｌｅ　Ｂｌａｃｋ　ａｔＬｄ　Ｗｈｉｔｅ
　Ｒｅｆｌｅｃ−ｔｉｏ？ＬＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ
　）　（ペンシルバニア州１８９７４−０３４７アイビ
ーランド私書箱２６９９インダストリアルドライブ５０
のトビアスアソシエーツ（Ｔｏｂｉａｓ　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｅｓ　）製）を使用して測定した。反射濃度をＬＨ
濃度に対してプロットして第１２図に示すような五ＬＨ
についての標準曲線を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は基質としてＰＮＰＰおよびＡＭＰＰＤを用いた
ｈＣＧ検定の結果の比較を示す図であり；第２図はタン
デムＩＣ０Ｎ　ｌ［五ＣＧ検定の結果を示す写真である
； 第３図は０．４　ｍＡｆ　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄを用イタ
アルカリ性ホスファターゼ検定の結果を示す図であり；
第４図はウシ血清アルブミンおよび／または螢光物質の
存在下にアルカリ性ホスファターゼ検足を行なった結果
を示す図であり； 第５Ａ図は６０１１？／ｍｌ　　ＡＭＰＰＤ　ヲ用イｆ
、：Ｈ５ＶＩ　　ＤＮＡ　プローブ検定の結果を示す写
真であり、第５Ｂ図は３００１１１７ｍ１　　ＡＭＰＰ
Ｄ　テノ結果を示す写真であり、そして第５Ｃ図は３０
０ｐ　？　／ｍｌ　　Ａ　ＩＩＩ　Ｐ　Ｐ　Ｄでの初め
の３０分の反応の後の結果を示す写真であり； 第６図は基質としてＡ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　ｆ）およびＰＮＰ
Ｐを用いたＡＦＰ検定の結果の比較を示す図であり；第
７図は基質としてＡＭＰＰＤを用いたＴＳＨ検定の結果
を示す図であり； 第８図はＢＳＡの存在下および不存在下でのＴＳＨ検定
の結果の比較を示す図であり；第９図は基質としてＡＭ
ＰＰＤ　を用いたＣＥＡ検定の結果を示す図であり； 第１０図はｈＬＨ検定に使用した装置の構成を示す図で
あり； 第１１図はｈＬＨ検定に使用したフィルム上の画像を示
す写真であり； 第１２図はんＬＨ検定に使用したｈＬＨ濃度の漂準曲緋
を示す図であり、縦軸は反射濃度である。 加面の浄魯（内容に変更なし） Ｆｉｇ、　１ ｈＣＧ、　ｍｌＵ／ｍｌ Ｆｉｇ、２ 工具ン、、入ポ、ト９ 陽・はせ庶 Ｆｉｇ、　６ ＡＦＰ、　ｎｇ／ｍ！ Ｆｉｇ、　７ １１￥ｔＬ？　ＡＭＰＰＤ’ｅ−ｆｆ１ｕ３　ＴＳＨ＃
ｆＬＦｉｇ、　９ 養ずｔｌＴ△Ｈ叩几罪−３ こＥＡ刊Ｕ辷 Ｆｉｇ、　１０ ＬＨ不便乞

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔ−はポリシクロアルキル基であり；Ｙおよび
   Ｒ＾１は下記定義通りである）で表される化合物とＲ化
   剤（Ｒは下記定義通り）とを極性非プロトン性溶媒中で
   アルカリ金属アルコキシドの存在下に反応させることか
   ら成る、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔ＝はポリシクロアルキリデン基であり；Ｒお
   よびＲ＾１はそれぞれ独立してＣ＿１−Ｃ＿２＿０アル
   キル基、アルアルキル基、またはシクロアルキル基であ
   り；そしてＹは螢光発色団である）で表される化合物の
   製造方法。 （２）Ｔ＝はアダマント−２−イリデン、Ｔ−はアダマ
   ント−２−イル、Ｒはメチル、ＹＯＲ＾１は▲数式、化
   学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等が
   あります▼であり、Ｒ化剤は硫酸ジメチルであり、アル
   カリ金属アルコキシドはカリウムｔ−プトキシドであり
   、そして極性非プロトン性溶媒はジメチルスルホキシド
   である、請求項１記載の方法。 （３）Ｒ＾ｌはメチルである、請求項２記載の方法。 （４）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ＝、ＲおよびＹは下記定義通り）で表される化
   合物と次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲンである）で表される化合物とを非プ
   ロトン性有機溶媒中でルイス塩基の存在下に反応させる
   ことから成る、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔ＝はポリシクロアルキリデン基であり；Ｒは
   Ｃ＿１−Ｃ＿２＿０アルキル基、アルアルキル基または
   シクロアルキル基であり；そしてＹは螢光発色団である
   ）で表される化合物の製造方法。 （５）Ｔ＝はアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル、
   ＹＯＨは ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ であり、ルイス塩基は第三アミンであり、そして非プロ
   トン性有機溶媒は液状芳香族化合物である、請求項４記
   載の方法。 （６）ルイス塩基はトリアルキルアミンであり、非プロ
   トン性有機溶媒はベンゼンである、請求項５記載の方法
   。 （７）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ＝、ＲおよびＹは下記定義通り）で表される化
   合物と次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲンであり、Ｒ＾２およびＲ＾３は下記
   定義通りである）で表される化合物とを非プロトン性有
   機溶媒中でルイス塩基の存在下に反応させることから成
   る、次式：▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ＝はポリシクロアルキリデン基であり；ＲはＣ
   ＿１−Ｃ＿２＿０アルキル基、アルアルキル基またはシ
   クロアルキル基であり；Ｙは螢光発色団であり；そして
   Ｒ＾２およびＲ＾３はそれぞれ独立してシアノ基、ニト
   ロフェニル基、ジニトロフェニル基、アリールスルホニ
   ル基またはアルキルスルホニル基である）で表される化
   合物の製造方法。 （８）Ｔ＝はアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル、
   Ｒ＾２およびＲ＾３はシアノ、ＹＯＨは▲数式、化学式
   、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があり
   ます▼ であり、ルイス塩基は第三アミンであり、そして非プロ
   トン性有機溶媒は液状芳香族化合物である、請求項７記
   載の方法。 （９）ルイス塩基はトリアルキルアミンであり、非プロ
   トン性有機溶媒はベンゼンである、請求項８記載の方法
   。 （１０）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ−はポリシクロアルキル基であり；Ｙは螢光発
   色団であり；Ｗ＾−は酸アニオンであり；そしてＲ＾１
   はＣ＿１−Ｃ＿２＿０アルキル基、アルアルキル基また
   はシクロアルキル基である）で表される化合物。 （１１）Ｔはアダマント−２−イル、Ｗ＾−はハロゲン
   アニオン、そしてＹＯＲ＾１は ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ である、請求項１０記載の化合物。 （１２）Ｗ＾−は塩素イオンであり、Ｒ＾１はメチルで
   あろ、請求項１１記載の化合物。（１３）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ−はポリシクロアルキル基であり；Ｙは螢光発
   色団であり；そしてＲ＾１はＣ＿１−Ｃ＿２＿０アルキ
   ル基、アルアルキル基またはシクロアルキル基である）
   で表される化合物。 （１４）Ｔ−はアダマント−２−イルであり、ＹＯＲ＾
   １は ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ である、請求項１３記載の化合物。 （１５）Ｒ＾１はメチルである、請求項１４記載の化合
   物。 （１６）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ＝はポリシクロアルキリデン基であり；Ｙは螢
   光発色団であり；そしてＲはＣ＿１−Ｃ＿２＿０アルキ
   ル基、アルアルキル基またはシクロアルキル基である）
   で表される化合物。 （１７）Ｔ＝はアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル
   、そしてＹは ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ である、請求項１６記載の化合物。 （１８）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｔはポリシクロアルキリデン基であり；Ｙは螢光
   発色団であり；ＲはＣ＿１−Ｃ＿１＿２非分枝鎖または
   分枝鎖の、置換されていないまたは置換された、アルキ
   ル基、アルアルキル基またはシクロアルキル基であり）
   ；そしてＲ＾４は ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＭ＾＋はアルカリ金属、アンモニウムまたは第
   四アンモニウムカチオンである）である〕で表される化
   合物。 （１９）Ｔ＝はアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル
   、Ｍ＾＋はＮα＾＋、そしてＹは▲数式、化学式、表等
   があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ である、請求項１８記載の化合物。 （２０）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ＝はポリシクロアルキリデン基であり；ＲはＣ
   ＿１−Ｃ＿２＿０アルキル基、アルアルキル基またはシ
   クロアルキル基であり：Ｙは螢光発色団であり；そして
   Ｒ＾２およびＲ＾３はそれぞれ独立してシアノ基、ニト
   ロフェニル基、ジニトロフェニル基、アルキルスルホニ
   ル基またはアリールスルホニル基である）で表される化
   合物。 （２１）Ｔ＝はアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル
   、そしてＲ＾２およびＲ＾３はシアノである、請求項２
   ０記載の化合物。 （２２）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ＝はポリシクロアルキリデン基であり；Ｙは螢
   光発色団であり；ＲはＣ＿１−Ｃ＿２＿０非分枝鎖また
   は分枝鎖の、置換されていないまたは置換された、アル
   キル基、アルアルキル基またはシクロアルキル基であり
   ；そしてＭ＾＋は各々独立してアルカリ金属、アンモニ
   ウムまたは第四アンモニウムカチオンである）で表され
   る化合物。 （２３）Ｔはアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル、
   Ｍ＾＋はＮα＾＋、そしてＹは ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ である、請求項２２記載の化合物。 （２４）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔ＝ポリシクロアルキリデン基であり；Ｙは螢光
   発色団であり；ＲはＣ＿１−Ｃ＿２＿０アルキル基、ア
   ルアルキル基またはシクロアルキル基であり；そしてＭ
   ＾＋はそれぞれ独立してアルカリ金属、アンモニウムま
   たは第四アンモニウムカチオンである）で表される化合
   物。 （２５）Ｔはアダマント−２−イリデン、Ｒはメチル、
   Ｍ＾＋はそれぞれ独立してＮα＾＋またはＮＨ＿４＾＋
   、そしてＹは ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ である、請求項２４記載の化合物。 （２６）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物。 （２７）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物。 （２８）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＿１は光を発生させる電子供与有機基であり；
   Ｒ＿２はＲ＿３−オキシ基（ここでＲ＿３は酵素によつ
   て除去しうる不安定基である）で置換されたアリール基
   であり；そしてＴはＲ＿３−オキシ基が酵素によつて切
   断される前にジオキセタンが分解するのを防ぐ安定化基
   である〕で表され、酵素と反応して光学的に検出可能な
   エネルギーを放出することができるジオキセタン化合物
   。 （２９）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｔは置換されていないまたは置換されたシクロア
   ルキル基、もしくはジオキセタン環にスピロ結合により
   結合された縮合ポリシクロアルキリデン基であり；請求
   項２８のＲ＿１中のＸは水素原子、アルキル、アリール
   、アルアルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテ
   ロアリール、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキ
   ル基、もしくはジオキセタン環に結合された電子に富む
   成分をもたらすべく酵素によつて切断しうる結合を含む
   酵素切断可能基であり；Ｙ−Ｚは請求項２８のＲ＿２で
   あり、ここでＹはエネルギーを吸収して励起エネルギー
   状態を形成し、その励起エネルギー状態から光学的に検
   出しうるエネルギーを放出してもとのエネルギー状態へ
   戻ることができる螢光発色団であり；そしてＺは水素原
   子、ヒドロキシル基、またはジオキセタン環に結合され
   た電子に富む成分をもたらすべく酵素によつて切断しう
   る結合を含む酵素切断可能基であり、ＸおよびＺの少な
   くとも一方は酵素切断可能基である）で表される、請求
   項２８記載のジオキセタン化合物。 （３０）Ｙはフェニレン、アントラセン、ローダミン、
   フルオレセイン、エオシン、クマリン、エリトロシン、
   アクリジン、ピレン、スチルベン、ナフチレン、ニトロ
   ベンゾオキサンアゾール、キノリン、アクリジン、アシ
   ドアクリジン、カルバゾール、螢光シアニン、カルボシ
   アニン、ピリジニウム塩、オキソノールまたはレゾルフ
   イン基の残基、もしくはこのような基の誘導体の残基で
   ある、請求項２９記載のジオキセタン化合物。 （３１）Ｚは酵素によつて切断可能なリン酸エステル基
   、酢酸エステル基、カルボキシル基、１−ホスホ−２，
   ３−ジアシルグリセリド基、１−チオ−Ｄ−グルコシド
   基、アデノシン三リン酸類似体基、アデノシン二リン酸
   類似体基、アデノシン−リン酸類似体基、アデノシン類
   似体基、α−Ｄ−ガラクトシド基、β−Ｄ−ガラクトシ
   ド基、α−Ｄ−グルコシド基、β−Ｄ−グルコシド基、
   α−Ｄ−マンノシド基、β−Ｄ−マンノシド基、β−Ｄ
   −フルクトフラノシド基、β−Ｄ−グルコシドウロネー
   ト基、ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニン染料エ
   ステル基、またはｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギ
   ニン染料アミド基である、請求項２９記載のジオキセタ
   ン化合物。 （３２）Ｙはヒドロキシフェニル基の残基である請求項
   ２９記載のジオキセタン化合物。（３３）Ｙはヒドロキ
   シアントラセン基の残基である、請求項２９記載のジオ
   キセタン化合物。 （３４）Ｙはヒドロキシナフタレン基の残基である、請
   求項２９記載のジオキセタン化合物。 （３５）Ｔはスピロ結合によつてジオキセタン環に結合
   された、２個以上の縮合環（それぞれ５〜１２個の炭素
   原子を有する）をもつ縮合ポリシクロアルキリデン基で
   あり、Ｚは酵素により切断可能なリン酸エステル基であ
   る、請求項３２、３３または３４記載のジオキセタン化
   合物。 （３６）Ｔはアダマント−２−イリデン基である、請求
   項３５記載のジオキセタン化合物。 （３７）Ｔはアダマント−２−イリデン基である、請求
   項２９記載のジオキセタン化合物。 （３８）Ｘはメトキシ基である、請求項２９記載のジオ
   キセタン化合物。 （３９）Ｔはアダマント−２−イリデン基、Ｚは酵素に
   より切断可能なリン酸エステル基、そしてＸはメトキシ
   基である、請求項２９記載のジオキセタン化合物。 （４０）Ｔはアダマント−２−イリデン基、Ｚは酵素に
   より切断可能なリン酸エステル基、Ｘはメトキシ基、そ
   してＹはフェニレン基の残基である、請求項２９記載の
   ジオキセタン化合物。 （４１）Ｔはアダマント−２−イリデン基、Ｚは酵素に
   より切断可能なリン酸エステル基、Ｘはメトキシ基、そ
   してＹはナフタレン基の残基である、請求項２９記載の
   ジオキセタン化合物。 （４２）（ａ）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＿１は光を発生させる電子供与有機基であり；
   Ｒ＿２はＲ＿３−オキシ基（ここでＲ＿３は酵素により
   除去しうる不安定基である）で置換されたアリール基で
   あり；そしてＴはＲ＿３−オキシ基が酵素により切断さ
   れる前にジオキセタンが分解するのを防ぐ安定化基であ
   る〕で表され、酵素と反応して光学的に検出可能なエネ
   ルギーを放出し得るジオキセタン化合物を用意し； （ｂ）その安定な１，２−ジオキセタンを酵素により分
   解する； ことから成る光の発生方法。 （４３）酵素がホスファターゼ、エステラーゼまたはガ
   ラクトシダーゼである請求項４２の方法。 （４４）請求項３５の化合物を使用する請求項４２の方
   法。 （４５）抗原抗体反応に用いる請求項４２の方法。 （４６）酵素免疫測定法に用いる請求項４５の方法。 （４７）ポリヌクレオチドプローブ法に用いる請求項４
   ２の方法。