JPH02182189A - 新規タイロシン生合成遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗生物質生合成遺伝子産物、組換えＤＮＡ発
現ベクター、該遺伝子によってコードされている産物、
および形質転換微生物宿主細胞に関するものである。

本発明はまた、抗生物質産生微生物の抗生物質産生能を
高めるだめの新規な方法を包含するものである。この方
法は、微生物宿主細胞を、本発明の遺伝子産物の発現を
コードしているＤＮＡ配列で形質転換することを意味す
る。

えＤＮＡベクター ２０、発現ベクターである請求項１９に記載の組換えＤ
ＮＡベクタ ２１、プラスミドである請求項１９に記載の組換えＤＮ
Ａベクター ２２、プラスミドｐＳＥＴ５５１、プラスミドｐＳＥＴ
５５２、プラスミドｐＳＥＴ５５５およびプラスミドｐ
ＳＥＴ５５６から選択される請求項２１に記載のプラス
ミド。

２３、請求項１９〜２２のいずれかに記載の組換えベク
ターで形質転換された宿主細胞。

２４、ストレプトマイセスである請求項２３に記載の宿
主細胞。

２５、ストレプトマイセス・フラジエである請求項２４
に記載の宿主細胞。

２６、Ｓ、フラジエＧＳ５、Ｓ、フラジエＧ５１４、Ｓ
、フラジエＧ５５０またはＳ、フラジエＧ５７７である
請求項２５に記載のストレプトマイセス・フラジエ。

２７、Ｅ、コリである請求項２３に記載の宿主細本発明
は、ストレプトマイセスの様な抗生物質産生微生物にお
ける組換えＤＮＡ法の重要な産業上の利用に関するもの
である。以前は、組換えＤＮＡ法の発展および開発は、
大部分は、Ｅ、コリ、幾つかの場合において哺乳動物細
胞の特定のポリペプチドの発現に限定されていた。これ
らの進歩によって、ヒトインシュリンＡおよびＢ鎖、ヒ
トプロインシュリン、ヒト成長ホルモン、ヒトプロティ
ンＣ，ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、ウシ成長
ホルモン、およびその他の治療上有用な化合物の様な、
ヘテロローガスな遺伝子産物が比較的容易に発現される
ようになった。それぞれの場合、ヘテロローガスな遺伝
子の発現は、本来、活動している生合成経路に無関係で
あり、それと相互作用したり、それに参加したり、それ
を変化させたりしない。しかし今や、組換えＤＮＡ法を
使用し、既知のまたは新規な抗生物質または抗生物質前
駆体の収率を高めるように発現させるために、選択され
た生合成経路を改善することができる。

ストレプトマイセスおよびその他の抗生物質産生微生物
に適用される組換えＤＮＡ法のほとんどは、クローニン
グベクターの開発に限定されていた。初期の試みには、
ロイサー（Ｒｅｕｓｓｅｒ）の米国特許第４．３３２，
８９８号およびマニス等（Ｍａｎｉｓ　ｅＬ　ａｌ、）
の米国特許第４，２７３，８７５　、４，３３２．９０
０　；　４．３３８，４００および４，３４０゜６７４
号の開示がある。これらの初期の参考文献には、ストレ
プトマイセテスの形質転換は開示または教示されなかっ
た。抗生物質産生微生物において使用するための、より
大きい活性を示す改良ベクターは、ファイヤーマン等（
Ｆ　ａｙｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）の米国特許第４，５
１３，０８６号：ナカツカサ等（Ｎａｋａｔｓｕｋａｓ
ａ　ｅｔ　ａｌ）の米国特許第４．５１３．０８５およ
び４，４１６，９９４号；マリン等（Ｍａｌｉｎ　ｅＬ
　ａｌ）の米国特許第４，４６８．４６２号、ＰＣＴＣ
１出際出願ＷＯ９１０ｌ　ｌ　６９号；ビブ等（Ｂｉｂ
ｂ　ｅＬ　ａｌ）の１９８０年、ネイチャー　（Ｎ　ａ
ｔｕｒｅ）２８４＋５２６；）ンブソン等（Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）の１９８０年、ネイチャー２８６
　：　５２５　；シュこの様な試験の１つは、ホップウ
ッド等（Ｈｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ）によって、１９
８５年、ネイチャー３１４：６４２に報告されている。

ホップウッド等は新規なハイブリッド抗生物質色素の生
成を報告したが、この開示は、この宿主細胞の抗生物質
産生能または生合成効率の増大に焦点をあてているので
はなく、ストレプトマイセスの１株からその他の株への
アクチノルホジン色素生合成遺伝子の転移を記載してい
る。

前記参考文献は、ストレプトマイセスゲノムの研究を先
導する研究のためのバックグラウンドとなった。とりわ
け、ヨーロッパ特許出願ＥＰＡ０２３８３２３（公開番
号８７３０２３１８．８．１９８７年９月２３日公開）
は、ストレプトマイセスφフラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ）ゲノムの小さな部分を開示
している。ゲノムのこの部分は、数種のタイロシン生合
成遺伝子からなる遺伝子群を含有している。

この後者の研究は、フィッシュマン等（Ｓ、Ｅ。

Ｆ　ｉｓｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　Ｕ。

アレン等（Ｓｕａｒｅｚ　ｅｔ　ａｔ）の１９８０年、
ネイチャー２８６：５２７；？ルパーチダ等（Ｍａｌｐ
ａｒｔｉｄａｅｔ　ａｌ）の１９８４年、ネイチャー３
０９：４６２；バーシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ
ｅｒ）の１９８２年、ファーメンテ−ジョン・プロセス
（Ｆ　ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｐ　ｒｏｃｅｓｓ）の
年報、５　：　１０１１２６（ツアオ編、アカデミツク
・プレス、ニューヨーク（Ｇ。

Ｔ、Ｔｓａｏ、　ｅｄ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　ＮＹ））　；　バーシュバーガー等（Ｈｅｒｓ
ｈｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）の１９８３年、ニューヨ
ーク・アカデミツク・サイエンス（Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、）年報、４１３：３ｉ４６；およびラルソ
ン（Ｌ　ａｒｓｏｎ）およびバーシュバーガー（Ｈｅｒ
ｓｈｂｅｒｇｅｒ）の１９８４年、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（Ｊ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　ｌ
　５７：３１４−３１７に記載された。これらの改良ベ
クターは、ストレプトマイセテスにおいて選択可能なマ
ーカーを含有し、多数の重要なストレプトマイセス株を
形質転換するために使用することができ、より複雑な遺
伝子クローニング試験を行うために必要な手段となる。

Ｓ、Ａ、、８４．８２４８（１９８７）およびコックス
等（Ｋ、Ｌ、Ｃｏｘ　ｅｔ　ａｌ）のＪ　、Ｎａｔｕｒ
ａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、４９　９７１（１９８６）に
記載されている。フィッシュマン等は、ｔｙｌＥ、　ｔ
ｙｌＤ、　ｔｙｌＨ，ｔｙｌＦ。

ｔｙｌＪ、　ｔｙｌｃＸｔｙｌＫＳｔｙｌＬおよびｔｙ
１Ｍ生合成遺伝子からなる生合成遺伝子群を記載してい
る。

しかしながら、これらの研究者等は、ｔｙｌＡＸｔｙｌ
Ｂ、ｔｙｐＧおよびｔｙｌ　ｒ生合成遺伝子に相当する
ＤＮＡ配列を定義することができなかった。これらの遺
伝子における突然変異は、タイラクトン生合成（ｔｙｌ
　Ｇ　）を遮断したり、全てのタイロシン糖（ｔｙＩＡ
）またはミカミノース（ｔｙｌ　Ｂ　）の結合または生
合成を妨害したり、タイラクトンのＣ−２０位の酸化を
遮断する。即ち、これらの遺伝子は、タイロシンの生合
成の初期過程に必要な活性に関与している。この点につ
いては、第１図参照。

この先行の研究と対照的に、本発明は、フィッシュマン
等の文献に記載の遺伝子群から物理的に取り出された、
予想外の第２の生合成遺伝子群を提供する。この群は、
ｔｙｌＧ、　ｔｙｌＢ、　ｔｙｌＡおよびｔＶＩＩ突然
変異を相補するＤＮＡ配列を含んでいることかわかった
。従って、本発明は、４種類のタイロンン生合成遺伝子
産物、即ち、ｔｙｌＡＳｔＹＩＢ、　ｔｙＩＧおよびｔ
ｙＩ　ＩをコードしているＤＮＡ配列を提供する。本発
明はまた、新規な組換えＤＮＡ発現ベクター、これらの
遺伝子の遺伝子産物およびこれらの遺伝子を含有するベ
クターで形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明は、ストレプトマイセテスおよびその他の抗生物
質産生微生物に組換えＤＮＡ法の商業的適用を可能にす
るという点でとりわけ有用である。

臨床上重要な抗生物質の２分の１以上はストレプトマイ
セテスによって産生されるので、この工業的に重要なグ
ループに適用し得る方法を開発することが、とりわけ望
ましい。本発明は、このような方法を提供し、抗生物質
産生微生物における抗生物質産生能を高めたり、新規な
抗生物質および抗生物質前駆体を産生させるための遺伝
子のクロニングを可能にする。

本発明を記載するために使用される語句を、以リウム（
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ミクロモノスポラ（
Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ノカルデイア（Ｎ　ｏｃａｒｄ
　ｉａ）およびストレプトマイセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）を包含するがこれに限定されない。

抗生物質耐性付与遺伝子−抗生物質に対する耐性を付与
する活性をコードしているＤＮＡセグメント。

ＡｐＲ−アンピシリン耐性表現型またはそれを付与する
遺伝子。

宿主細胞−組換ＤＮＡクローニングベクターで形質転換
され得る、その生育可能なプロトプラストを包含する微
生物。

抗生物質生合成経路の作動−−次代謝産物を抗生物質に
変換するために必要な、抗生物質生合成遺伝子の発現お
よび関連する生化学的反応。

組換えＤＮＡベクター−更にＤＮＡが付加され得るかま
たは付加された選択可能な、自律的に複製するかまたは
染色体に組込まれる物質であって、更に挿入されたＤＮ
Ａの発現に必要なりＮＡ配列下の様に定義する。

抗生物質−天然のまま、またはわずかな化学的修飾によ
って、他の微生物または真核細胞の生育を阻害するかま
たは殺滅する、微生物によって産生される物質。

抗生物質生合成遺伝子−一次代謝産物を、抗生物質活性
を有することもある抗生物質中間体、次いで抗生物質に
変換する過程の反応に必要な、酵素活性の様な活性をコ
ードしているか、または活性の発現を調節する産物をコ
ードしているＤＮＡセグメント。

抗生物質生合成経路−一次代謝産物を抗生物質中間体、
次いで抗生物質に変換する過程に必要な一連の抗生物質
生合成遺伝子および生化学的反応全体。

抗生物質産生微生物−抗生物質を産生ずるか、または発
現すると抗生物質を産生ずるであろう遺伝子を含有して
いる生物であって、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐ
ｌａｎｅｓ）、アクチノマデユラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄ
ｕｒａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セファロス
ポを含有することもあるＤＮＡ分子からなり、プラスミ
ドおよびファージを包含するがそれに限定されない物質
。

制限フラグメント−１またはそれ以上の制限酵素の作用
によって作成された直線状ＤＮＡ０感受性宿主細胞−抗
生物質に対する耐性を付与するＤＮＡセグメントなしで
は、与えられた抗生物質の存在下で生育し得ない、その
生存可能なプロトプラストを包含する宿主細胞。

形質転換体−形質転換された、その生存可能なプロトプ
ラストを包含する受容宿主細胞。

形質転換−受容細胞の遺伝子型を変える、その生存可能
なプロトプラストを包含する、受容宿主細胞へのＤＮＡ
の導入。

ｔｓｒ　Ｒ−チオストレプトン耐性表現型またはそれを
付与する遺伝子。

図面に記載のプラスミドおよび染色体地図は、はぼ一定
の率で拡大して描かれている。地図上の制限部位の間隔
は、ベクターの制限部位の実際の間隔に比例しているが
、実際の制限部位の距離は、計算上の距離と幾分具なっ
ているかもしれない。

本発明のタイロシン生合成遺伝子群は、結合されるが、
ＤＮＡの〜９．８ｋｂセグメントにまたがって分散して
いる。制限部位の位置データは、タイロシン生合成遺伝
子含有ＤＮＡフラグメントの僅かな領域についてのみ、
存在する。この地図は必ずしも、与えられた制限酵素の
全ての制限部位の完全なリストを提供するものではない
。

第１図−タイロシン生合成経路。

第２図−プラスミドｐＨＪ　Ｌ　４０１の制限部位およ
び機能地図。

第３図−プラスミドｐＫＣ６４４の制限部位および機能
地図。

第４図−プラスミドｐＫＣ６６８の制限部位および機能
地図。

第５図−プラスミドｐＳＥＴ５５１の制限部位および機
能地図。

第６図−プラスミドｐＳＥＴ５’５２の制限部位および
機能地図。

第７図−プラスミドｐＳＥＴ５５５の制限部位ている本
発明の抗生物質生合成遺伝子を含む組換クローニングベ
クターまたはその一部分で、抗生物質生合成経路によっ
て抗生物質または抗生物質前駆体を産生する微生物を形
質転換し、２）該ベクターで形質転換された該微生物を
、細胞の生育、該抗生物質生合成遺伝子の発現および該
抗生物質または抗生物質前駆体の産生に好適な条件下で
培養する ことからなる方法を提供する。

本発明の生合成遺伝子は、好ましくはストレプトマイセ
ス宿主細胞である宿主細胞中で安定に維持されるベクタ
ーに挿入された時、発現によって、高濃度の遺伝子産物
を産生ずることができる。次にこれは、その産生された
活性によって影響を受けるタイロシン生合成経路のステ
ップを促進し、その結果、最終的抗生物質産物の収量が
増大する。

また、本発明の生合成遺伝子をその他のマクロライドま
たは関連抗生物質産生微生物へ導入し、新規なハイブリ
ッド抗生物質を製造することかできる。例えば、前記の
様に、ｔｙｌＢはミカミノおよび機能地図。

第８図−プラスミドｐＳＥＴ５５６の制限部位および機
能地図。

第９図−８，フラジエのタイロシン生合成遺伝子のゲノ
ム地図。

本発明は、関連する抗生物質生合成遺伝子、組換ＤＮＡ
クローニングベクター、および該遺伝子およびベクター
で形質転換された抗生物質または抗生物質前駆体産生微
生物を包含する。とりわけ、本発明は、今まで知られて
いなかったｔ、ｙｌＡ、　ｔｙ１１３、ｔｙｌＧおよび
ｔｙｔ　Ｉ生合成遺伝子、これらの遺伝子を含有するベ
クター、およびこれらの遺伝子によって発現されたポリ
ペプチド活性を提供する。

また、本発明は、本発明の個々の抗生物質生合成遺伝子
によってコードされているポリペプチド産物に関するも
のである。

本発明は更に、抗生物質産生微生物の抗生物質産生能を
高めるための方法であって、 ■）該抗生物質生合成経路において律速となる酵素また
はその他の遺伝子産物の発現をコードしスの生合成に関
与する活性をコードしている。この遺伝子は、例えばエ
リストマイシン産生微生物に導入されると、エリスロマ
イシンのミヵミノシル誘導体を産生ずることができた。

第■および■表は、本発明の生合成遺伝子が有用となり
得るマクロライドまたは類似抗生物質産生微生物のリス
トである。

箸上麦　　マクロライド、リンコサミド、およびストレ
プトグラミン抗生物質産生微生物監失曹 Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｒＯ５ａｒｌａ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌｉ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｌｕｓ １ｂｕｓ ａｌｂｕｓ　ｖａｒ。

ｃｏｉｌｍｙｃｅｔｉｃｕｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ 抗生物質 ロサラマイシン カルボマイシン ミコノマイシン アルボマイセチン コレイマイシン スピラマイシンおよび ７オロマシジンＤ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ｂｉｋｉｎ＋ｅｎｓ＋ｓ ｂｒｕｎｅｏｇｒ　１ｓｅｕｓ ｃａｅｌｅｓｔ＋ｓ ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ Ｃｉｒｒａｔ、ｕｓ ｅｌＬａｅ ｄｊａｋａｒｔｅｎｓｉｓ ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｓ ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ ｆａｓｃｉｃｕｌｕｓ ｆｅｌｌｅｕｓ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ ｆ’ｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ オレアンドマイシン アベル５ツクチン類 チャルコマイシン アルボサイクリン Ｍ２Ｂ５および セレスチセチン シラマイシンＢ シラマイシン デルタマイシン類 ニダマイシン エリスロマイシン類 メチマイシン アンゴラマイシン アクマイシン アルボマイシンおよび ピクロマイシン アマロマイシン アマロマイシンおよび シラマイシン類 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋｉｔａｓｔｏｅｎｓ＋５ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ １ｉｎｃｏｌｎｅｎｓ１ｓ １ｏｉｄｅｎｓ＋ｓ ｍａｃｒＯ８ｐｏｒｅｕｓ ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ ｎａｒｂｏｎｅｎｓ＋５ ｎａｒｂｏｎｅｎｓ＋ｓ　　ｖａｒ。

ｊｏｓａｍｙｃｅｔｚｃｕｓ ｏ１ｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｐｌａｔｅｎｓ＋ｓ ロイコマイシンＡ３およ びジョサマイシン アンゴラマイシン リンコマイシン ベルナマイシンＡ およびＢ カルボマイシン イングラマイシン アセチル−ロイコマイ シンおよびニスピノマ イシン ジョサマイシンおよび ナルポマイシン ロイコマイシンＡ３ およびジョサマイシン オレアンドマイシン ブラテノマイシン Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ　ｖａｒ。

ｅｓｐ＋ｎｏｍｙｃｅｔ＋ｃｕｓ ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ ｇｒｉｓｅｏｆａｃｉｅｎｓ ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ ｇｒ１ｓｅｏｓｐｔｒａｌｉｓ ｇｒｌｓｅｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ　ｓｓｐ。

ｓｕｌｐｈｕｒｕｓ ｈａｌｓｔｓｄｉ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ　１ｃｕｓ タイロシン ＮＡ−１８１ ニスピノマイシン類 ミルベマイシン パンダマイシン ＰＡ１３３ＡおよびＢ アクマイシン ブンドリン グリセオマイシン レロマイシン ポレリジン パフィロマイシン類 カルボマイシンおよび ロイカニシジン タイロシン ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　５ｕｂｓｐ。

ａｕｒｅｏｌａｃｒｉｍｏｓｕｓ　　ミルベマイシン類
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｃｈｅｉ タイロシンおよび ノイトラマイシン ランカシジンおよび ポレリジン ｒｏｃｈｅｉ　　ｖａｒ。

ｙｏｌｕｂｉｌｉｓ ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ｒＯ３ｅＯｃｌｔｒｅｕｓ ｓｐｉｎｉｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＳｕｒａｇａＯｅｎＳＩＳ ｅｎｄａｅ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ｖｌｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ アルボサイクリン アルボサイクリン ｖａｒ。

クジマイシン類 カルボマイシン カルボマイシン メチマイシン類 ランカシジン類および ランカマイシン 箪工太　　種々の抗生物質産生ストレプトマイセス抗生
物質の種類　ストレプトマイセス種　抗生物質アミノ酸
類似体　ｓｐ、　　　　　　　　　　　シクロセリンニ
トロ含有 ポリエン類 ｋａｓｕｇａｅｎｓ　ｉｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ ｇｒｌｓｅｕｓ ｎｏｄｏｓｕｓ オーレオスリシン およびチオルチン メチレノマイシンＡ クロラムフエニコ ル カンディシジン アンフォテリシンＢ ニスタチン リン、デメチルテト ラサイクリン、およ びデメチルクロルテ トラサイクリン オキシテトラサイタ リン 突然変異したクイロシン生合成遺伝子を有し、従ってこ
れらの由来株に比較すると、非常に少量しかまたは全く
タイロシンを産生じない数種のストレプトマイセス・フ
ラジエ株を本明細書に記載する。

第■表には、これらの突然変異株を記載する。

第■表　タイロシン生合成の不完全なストレプトマイセ
ス・フラジエ突然変異株 ＧＳ５　　　　　　　　ｔｙｌＧ　　　　ＮＲＲＬ　１
８４１５ＧＳ１４（Ａ２５２．５）＊　ｔｙｌＡ　　　
　ＮＲＲＬ　１２１８８１９８８年９月１４日 １９８０年６月１３日 １９８０年７月１０日 １９８０年ＩＯ月１６日 Ｇ５５０（Ａ２５２．６）＊　ｔｙｌＢ　　　　ＮＲＲ
Ｌ　１２２０１ＧＳ７７（Ａ２５２．８）＊　ｔｙｌＩ
、ｔｙｌＤ　ＡＴＣＣ３１７３３＊＊ＡＴＣＣは、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０
１バークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド
２０８５２　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ２０８５２）であり、ＮＲＲＬは
、アグリカルチュラル−リサーチ・カルチャー・コレク
ション・オブ・ザ・ノザーン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリ−、ペオリア、イリノイ６１６０４（Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｐｅｏｒｉａ、　ＩＬ６１６０４）
である。

これらの株は、ブダペスト条約の条項に従い、上記受託
機関の永久培養コレクションに寄託され、維持されてい
る。ＮＲＲＬＩ２１８８、ＮＲＲＬ１２２０１およびＡ
ＴＣＣ３］７３３は、上記受託番号で誰でも入手し得る
。ＮＲＲＬ１８４１５の入手における制限は全て、本特
許出願またはその外国対応出願の登録または公告後に、
撤回されることなく除かれるであろう。

ストレプトマイセス・フラジエＡＴＣＣ３１７３３およ
びこのｔｙ＋　１遮断突然変異株によって産生された産
物は、米国特許第４，３０４．８５６号（１９８１年１
２月８日）に詳細に記載されている。

ストレプトマイセス・フラジェＮＲＲＬ　ｌ　２１８８
およびこのｔｙｌＡ遮断突然変異株によって産生された
産物は、米国特許第４，３６６．２４７号（１９８２年
１２月２８日）に詳細に記載されている。

更に、ストレプトマイセス・フラジェＮＲＲＬＩ２２０
１およびこのｔｙＩＢ突然変異株によって産生された産
物は、米国特許第４，４４０．８５７号（１９８４年４
月３日）に記載されている。

これらの突然変異株は、本発明の遺伝子配列の存在また
は非存在の確認に役立つ。とりわけ、当業者周知の相補
性またはハイブリダイゼーションの研究を使用し、本発
明の遺伝子配列か個々の遺伝子フラグメントに存在する
か否かを調べることができる。例えば、特定の遺伝子産
物を欠乏しているストレプトマイセス・フラジエ突然変
異株を、欠損しているポリペプチド産物を発現させる発
現ベクターで形質転換すると、正常またはほぼ正常な、
例えばタイロシンの様な最終産物の産生が回復される。

例えば、ストレプトマイセス・フラジエＧ　Ｓ　１４　
（ｔｙｌＡ欠失、ＮＲＲＬ１２１８８）をｔ７１Ａ　Ｄ
ＮＡ配列を含んでいると思われる遺伝子で形質転換すれ
ばよい。細胞の増殖および形質転換遺伝子の発現に適切
な条件下で形質転換微生物を培養すると、Ｇ５１４は、
少なくともほぼ正常な量のタイロシン、即ち生合成経路
における最終産物を産生ずる。同様に、問題の配列がそ
れぞれ、ｔｙｌＧ、　ｔｙｌＢまたは１ｙ１１産物をコ
ードしているか否かを調へたい場合、ｔｙｌＧ、　ｔｙ
ｌＢまたはｔｙｌＩ産物を１種類欠損している突然変異
株を使用して同様の検定を行うことができる。配列か、
欠損している活性を供給し得ない場合、生合成経路は、
突然変異株が問題の活性を産生じ得ない段階でパ遮断″
されるであろう。Ｇ５７７の特殊な場合、ｔｙｌＤ遺伝
子に第２の突然変異か存在する。従って、最終産物とし
てタイロシンを見いだすためには、ｔｙｌＤ産物も供給
されなければならない。ｔｙｔＤ遺伝子は、ヨーロッパ
特許公開ＥＰＡＯ２３８３２３（１９８７年９月２３日
公開）にお載されている。しかしな２から、通常の状況
では、問題の配列が欠損している活性を与え得なかった
り、宿主細胞が例えば、ｔｙｌ　Ｉ遺伝子に１個の突然
変異のみを有している場合、発現ベクターで形質転換す
ると、Ｏ−ミカミノシルータイラクトンおよびシャント
生成物である４″−〇−ミカロシルーＯ−ミカミノシル
クイラクトンが、所望のタイロシン最終産物より集積し
やすい。

上記の目的のためには、当業者なら、上記特定の突然変
異株をその他の突然変異株で置き換え得ることが理解さ
れるであろう。また、当業者は、別の突然変異株を作成
するための方法を理解している。紫外光、Ｘ−線、ガン
マ線またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンによる処理の様な突然変異誘発法が、別の突然
変異株の作成に充分である。突然変異株がどの遺伝子を
欠損しているかがわかっている限り、得られた微生物を
使用し、上記の様にして、所望の遺伝子の存在または非
存在を調べることができる。

本発明のベクターは、欠損している遺伝子を与えるだけ
ではなく、突然変異株または非突然変異株中のｔｙｌＡ
、　ｔｙｌＢ、　ｔｙｌ　ＩおよびｔｙｌＧ生合成遺伝
子のコピー数を増大したり、これらの遺伝子によって特
定される産物の細胞内量を増大することによって、タイ
ロシン生合成経路の効率を高める手段を提供する。利用
し得るｔｙｔＧ遺伝子産物の濃度か、例えばこの様にし
て上昇すると、その結果、タイラクトンの合成に関与す
る活性の量が増大し、次いでタイロシン生合成経路にお
いてタイラクトンが０−ミカミノシルクイラクトンに、
さらにタイロシンへと変換されるであろう（第１図参照
）。同様に、利用し得るｔｙｌＡ、　ｔｙｌＢおよびＬ
ｙ１１遺伝子産物の濃度が上昇すると、タイロシン前駆
体の対応する変換を行うために必要なポリペプチド活性
の産生量を増大させることができる（第１図に記載）。

更に、これらの遺伝子の位置がわかれば、当業者には、
抗生物質生合成遺伝子およびコードされた産物に直接手
を加えることができるということが理解されるであろう
。従って、当業者は例えば、天然の遺伝子配列を突然変
異、切断、または直接化学修飾または合成によって修飾
し、これと同一であるか改善されているかまたは緩和さ
れた活性をコードしているＤＮＡ配列を得ることができ
るであろう。この様な修飾された活性は例えば、コード
された活性について、より広範なまたはより特異的な基
質特異性を生じたり、先に述べた様な方法で新規な抗生
物質の産生を可能にし得る。更に、当業者は、修飾され
た活性が天然の配列によつてコードされている活性と機
能的に同等であっても、活性の量または効率を高め得る
ように生合成遺伝子を修飾することができる。更に、生
合成経路の調節機能に関連する活性について、当業者は
、生合成経路における後段の工程でより大きな制御を可
能にする修飾法を知っている。従って、当業者は、経路
および製造された産物を所望のままに操作することがで
きる。これらの機能的に同等に修飾または合成された遺
伝子および遺伝子産物は、′“遺伝子””ＤＮＡ配列″
′、またはこの様な遺伝子によってコードされている ゛ポリペプチド活性、゛アミノ酸配列″′、“活性″ま
たは゛産物″なる語句に包含されるものとする。

タイロシン生合成経路の図式による説明を第１図に示す
。第１図における矢印は各々、それぞれの矢印の上に位
置する遺伝子名で示されるｌまたはそれ以上のタイロシ
ン生合成遺伝子産物によって触媒される、タイロシンの
生合成における変換ステップを示す。例えば、ｔｙｌＧ
はタイラクトンの合成に関与し、ｔｙＩＡはタイロシン
糖の結合または生合成に関与し、ｔｙｌＢはとりわけミ
カミノスの結合または合成に関与する。また、ｔｙｌＩ
は、Ｃ−２０位の酸化に必要である。各遺伝子型の名称
は、同−表現型に寄与する種々の遺伝子を表す。

多数のベクターを使用し、本発明を例示する。

これらのベクターは、■またはそれ以上のタイロシン生
合成遺伝子を含み、ノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリーズ（ＮＲＲＬ）、ペオリア、イリノイ６
１６０４から入手することができる。第■表は、本発明
のタイロシン生合成遺伝子を含有する各プラスミドを簡
単に記載したものである。

第二人　　タイロシン生合成遺伝子を含有するプラスミ
ドＥ、コリＫ１２ＤＨ５ａ　／ｐＳＥＴ５５１　　Ｇ、
　ＩＥ、コリＸ１２ＤＨ５ａ／ｐＳＥＴ５５２　１．Ａ
、ＢＥ、コリＫ１２ＤＨ５α／ｐＳＥＴ５５５　　Ｇ、
ｌ、Ａ、ＢＥ、コリに１２ＤＨ５σ／ｐＳＥＴ５５６　
　Ｇ、Ｉ、Ａ、Ｂ＊受託日：１９８８年９月１４日 Ｂ−１８４１１＊ Ｂ−１８４１２＊ Ｂ−１８４１３＊ Ｂ−１８４１４＊ 第５図 第６図 第７図 第８図 本発明によって提供されるｔｙｌＡ、　ｔｙｌＢ、　ｔ
ｙｌＧおよびｔｙ＋　ｒ遺伝子は、前記ストレプトマイ
セス・フラジエのタイロシン生合成遺伝子群（例えばヨ
ーロッパ特許出願公開ＥＰＡ、０２３８３２３（１９８
７年９月２３日）およびフィッシュマン等のＰｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、ＵＳＡ、８４．８２４
８（１９８７）参照）の約３０ｋｂ右側の、以前は知ら
れていなかったタイロシン生合成遺伝子内に位置する。

この群は、右側でタイロシン耐性遺伝子、ＬｌｒＣに結
合し、左側で繰り返し配列、Ｒ３２およびＲ５，に結合
している。この点については、第９図参照。

これらの遺伝子は、コスミドベクターｐＫＣ４６２Ａに
挿入されたストレプトマイセス・７ラジよりＮＡのコス
ミドライブラリーから得られた。

コスミドベクターｐＫＣ４６２Ａは、宿主細胞Ｅ。

コリに１２ＳＦ−８にトランスフオームされ、ＮＲＲＬ
に寄託されている。このコスミドを含有している宿主の
試料は、受託番号Ｂ−１５９７３でＮＲＲＬから入手す
ることができる。

プラスミドｐＫＣ６６８は、Ｇ５１４およびＧ５５０の
様なｔｙｌＡおよびｔｙｌＢ突然変異株を相補するスト
レプトマイセス・アンポファシエンスＤＮＡのフラグメ
ントを含有している。このプラスミドは、上記ストレプ
トマイセス・フラジエのコスミドライブラリーから得た
フスミドに存在するホモローガスなストレプトマイセス
・フラジよりＮＡを識別するためのハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして役立つ。

プラスミドｐＫＣ６６８は、コスミドｐＫＣ６４４を制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、得られた〜１Ｏｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩ制限フラグメントを分離し、このフラグメントを
ＥｃｏＲＩ消化したプラスミドｐＨ，ＴＥ１０１とライ
ゲートさせることによって調製する（第２図）。プラス
ミドｐＨＪＬ４０１は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２
１７（受託臼１９８７年５月７日）でＮＲＲＬから入手
し得、ラルソンおよびバーシュバーガー（Ｌａｒｓｏｎ
　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ）、１９８６、プラ
スミド１５：１９９−２０９に記載されている。コスミ
ドＩ）ＫＣ６４４はＥ、コリに１２ＤＫ２２中、受託番
号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２３８で、ノーザン・リージョナ
ル・リサーチ・センター（ＮＲＲＬ）、ペオリア、イリ
ノイに寄託されている（１９８７年７月９日）。ｐＫＣ
６４４の制限地図を、第３図に示す。〜１０ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲ１フラグメントは、消化されたｐＨＪＬ４０１にラ
イゲートされると、挿入ＤＮＡの方向性のみが異なった
２個のプラスミドを生じる。これらのプラスミドをｐＫ
Ｃ６６８ＡおよびｐＫＣ６６８と呼ぶ。

〜ｌ　Ｏｋｂ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメントリ方向性は
、当業者に周知の制限酵素分析によって調べることがで
きる。

Ｓ、フラジエコスミドライブラリ−からの重複制限フラ
グメントを含むその他のフラグメントを使用し、相補性
によって、ｔｙ＋　Ｇ％ｔｙ＋　Ｉ％ｔｙｌ　Ａおよび
ｔｙｌＢ遺伝子配列の存在を調べた。例えば、ＡＵＤ８
−２と呼称されるコスミドベクターの１つは、ｐＨＪＬ
４０１にザブクローニングされた時、タイロシン突然変
異株ＧＳ５およびＧ５７７を相補する〜１３ｋｂ−Ｐｓ
ｔＩフラグメントを含有している。また、コスミドベク
ターｔｌｒｃ　８−６は、ｐＨＪＬ４０１にサブクロー
ニングされると、形質転換して、ＧＳ５、Ｇ５１４、Ｇ
５５０およびＧ５７７を相補することが見いだされ、そ
れによって、ｔｙｌＧ、　ｔｙｌＡ、　ｔｙｌＢおよび
ｔｙｌ　ｒ遺伝子それぞれの存在が確認される〜８．６
ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントを含有している。同様に
、プラスミドｔｌｒｃ４　　３．２４の〜９，８ｋｂ　
ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ■フラグメントは、ｐＨＪＬ４０
１に挿入されると、前記のｔｙｌ　Ｉ　、　ｔｙｌＡお
よびｔｙｌＢ突然変異株を相補することがわかる。

上記の様に、プラスミドｐＨＪ　Ｌ　４０１（ＮＲＲＬ
　　Ｂ−１８２１７）は、ストレプトマイセスにおいて
中程度のプラスミドコピー数を指定するレプリコンを含
有しており、Ｅ、コリ中でも複製可能なシャトルベクタ
ーである。プラスミドｐＨＪＬ４０１は、プラスミドの
１ａｃＺ領域のＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲＩ部位の
間に位置するポリリンカー配列を含有している（第２図
）。このポリリンカーは、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＰｓｔＩ、
ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｍａＩ、ＳｍａＩ、５ａｃＩ
およびＥｃｏＲＩのための独特の挿ｐＳＥＴ５５１また
はＩ）ＳＥＴ５５６の〜４．２ｋｂＢａｍＨＩ　−Ｅｃ
ｏＲＩフラグメントに含まれていることがわかるであろ
う。また、ｔｙｌＩ遺伝子は、ｐＳＥＴ５５５、ｐＳＥ
Ｔ５５６、ｐＳＥＴ５５１またはｐＳＥＴ５５２の〜１
，４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ■フラグメントに含ま
れている。ｔｙｌ　ＡおよびｔｙｌＢ生合成遺伝子の方
向性は第９図に示される様に明白ではないが、これらの
遺伝子は、ｐＳＥＴ５５２の〜６，２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ
−ＰｓＬＩ制限フラグメント上に単離され得る。当業者
には理解される様に、これらのベクターを適切な通常の
制限酵素で処理すると、本発明の生合成遺伝子を含有す
るフラグメントが得られるであろう。

上記のＬｙｌ遺伝子含有フラグメントを、その他のベク
ターにライゲートし、別の有用なベクターを調製するこ
とができる。この様なその他のベクターには、例えば米
国特許第４．６６８．４６２号、第４．５１３．０８６
号、第４，４１６，９９４号、第４，５０３．１５５号
および第４．５１３，１８５号に記載のベクター、およ
び更にプラスミドルＩ入部色を提供する。これらの部位
は、上記クイロジン生合成遺伝子フラグメントのための
“接着末端″ライゲーションに有用である。

とりわけ、ＡＵＤ８−２の〜１３ｋｂ　ＰｓｔＩ　フラ
グメントは、ＰｓｔＩ消化ｐＨＪＬ４０１に挿入される
と、プラスミドｐＳＥＴ５５１（ＮＲＲＬＢ−１８４１
１）を生じる。その制限地図を第５図に示す。また、Ｅ
ｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ消化したｐＨＪＬ４０１にｔｌ
ｒｃ　４−３．２４の〜９，８ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ
Ｉ［フラグメントを挿入すると、プラスミドｐＳＥＴ５
５２（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８４１２）が得られる。その
制限地図を第６図に示す。更に、ｔｌｒｃ　８−６の〜
８，６ｋｂ　ＢａｍＨＩフラグメントは、ＢａｍＨＩ消
化ｐＨＪＬ［ｏｌに挿入されると、プラスミドｐＳＥＴ
５５５（ＮＲＲＬ　　Ｂ１８４１３）およびｐＳＥＴ５
５６（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８４１４）が得られる。その
制限地図をそれぞれ第７および８図に示す。

更に、重複配列との相補性および制限部位分析を行うと
、ｔｙｌＧ生合成遺伝子が、ｐＳＥＴ５５５、Ｊ　１０
１　ｐＩ　Ｊ３５０、ｐｔ　Ｊ　７０２（ＡＴＣＣ３９
１５５）、ｓＣＰ　２＊（ＮＲＲＬ　ｌ　５０４１）、
ｐＯＪ１６０（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８０８８）、ｐＨＪ
Ｌ１９２、ｐＨＪ　Ｌ　１９７、ｐＨＪＬ１９８、ｐＨ
ＪＬ２１０、ｐＨＪＬ２１　Ｌ　ｐＨＪＬ４００．ｐＨ
ＪＬ３０２、ｐｒＪ９２２、ｐｌＪ９０３、ｐｚ９４１
、ｐｌＪ９４０およびｐｌＪ９１６がある。

これらのベクターはストレプトマイセス・フラジエおよ
びその他のタイロシン産生株中で複製し、安定に維持さ
れるので、本発明の抗生物質生合成遺伝子のクローニン
グに有用である。

また、下記の様に、ベクターのゲノムへの組み込みが所
望の場合、種々の手法を使用し得る。とりわけ有用な組
み込みベクターには、例えば、１ｌＣ３１の誘導体（チ
エイタ−等（Ｃｈａｔｅｒ、ｅｔ、ａｌ、Ｇｅｎｅ、２
６．６７（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｃｈ、４゜（１９８１））がある。

この様なベクターの１つは、Ｅ。

コリに１２ＢＥ４４７／ｐＫｃ３３１（ＮＲＲＬＢ−１
５８２８）から入手し得るプラスミドｐＫＣ３３１であ
る。また、その他の組み込みベクターは、Ｓ、コエリカ
ラー・ミニサークル（例えばｐｌＪ　４２　］　０）［
例えばリジエイト等（Ｌｙｄｉａｔｅ、ｅｔａｌ、　　
Ｐｒｏｃ、ｏｆ　ｔｈｅ　５Ｌｈ　Ｉ　ｎｔｌ、ｓｙｍ
ｐｏｓｉｕｍ　ｏｎｔｈｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　
Ｉ　ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓｐｐ、４９−５６（１９８６））　　；リジエイト等
（Ｌ　ｙｄｉａｔｅ、ｅｔａｌ、、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、
、　Ｇｅｎｅｔ、２０３．７９（１９８６））参照］、
またはｐＳＡＭ２の誘導体［例えばパーツプツト等（Ｐ
ｅｒｎｏｄｅｔ、ｅＬ　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇ
ｅｎｅｔ、１９８，３５（１９８４））　；シモネット
（Ｓ　ｉｍｏｎｅｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　５９１
３７（１９８７））参照］の様なベクターを包含する。

上記ベクターのだめの代表的宿主株には、例えばＳ、フ
ラジエ、Ｓ、フラジエＧＳ５、Ｓ、フラジエＧ５１４、
Ｓ、フラジエＧ５５０、Ｓ、フラジエＧ５７７、Ｓ、コ
エリカラー、Ｓ、リビダンス、Ｓ。

サーモトレランスおよびＳ、アンポファシエンスが包含
される。−Ｃ３１またはｐｓＡＭ２由米の組み込みベク
ターは、宿主株Ｓ、アンポファシエンス、Ｓ、コエリカ
ラー、Ｓ、リビダンスまたはＳ。

フラジエにトランスフオームされるのが好ましい。

ｐＨＪＬ４０１由来のベクターのだめの好ましいＣＩ９
６０９で、ノーザン・リージョナル・リザーチ・ラボラ
トリ−（ＮＲＲＬ）　、ペオリアくイリノイ６１６０４
およびＡＴＣＣから制限なしに入手し得る。ストレプト
マイセス・アンポファシエンスも周知であり、受託番号
ＡＴＣＣ１５１５４およびＡＴＣＣ２３８７７でＡＴＣ
Ｃから、または受託番号ＮＲＲＬ２４２０でＮＲＲＬか
ら入手することができる。また、Ｓ、コエリカラーの株
は、受託番号ＡＴＣＣ３３５５、ＡＴＣＣｌ０１４７、
ＡＴＣＣｌ　３４０５、ＡＴＣＣ１９８３２またはＡＴ
ＣＣ２１６６６でＡＴＣＣから入手可能である。Ｓ、リ
ビダンスは、受託番号ＡＴＣＣ１９８４４でＡＴＣＣか
ら入手し得る。最後に、Ｓ、サーモトレランスは、受託
番号ＡＴＣＣｌ　１４１６でＡＴＣＣから入手すること
ができる。

上記の様に、本発明のベクターは、非形質転換微生物に
比較して、抗生物質生合成経路において律速となる酵素
またはその他の遺伝子産物または活性の濃度を高めるこ
とによって、抗生物質産生微生物の抗生物質産生能を高
めることができる。

ストレプトマイセス宿主株は、Ｓ、フラジエＧＳ５、Ｓ
、フラジエＧ５１４、Ｓ、７ラジエＧ５５０またはＳ、
フラジエＧ５７７である。Ｓ、コエリカラー・ミニサー
クル由来のベクターは、宿主株Ｓ。

リビダンス、Ｓ、コエリカラーまたはＳ、フラジエにト
ランス７オームされるのが好ましい。その他の例示スト
レプトマイセス宿主株には、例えばＳ。

リモサスおよびＳ、ハイグロスコピクスがある。

ストレプトマイセス・ハイグロスコピクスおよびＳ、リ
モサスは既知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーラン
ド２０８５２に寄託されている。Ｓ、ハイグロスコピク
スの多数の株は、受託番号ＡＴＣＣ２７４３８、ＡＴＣ
Ｃ２１４４９、ＡＴＣＣ１５４８４、ＡＴＣＣｌ　９０
４０およびＡＴＣＣ１５４２０で入手し得、Ｓ、リモサ
スは、受託番号ＡＴＣＣ１０９７０で入手することがで
きる。ストレプトマイセス・フラジエも、とりわけ周知
の微生物であり、数種の株は、受託番号ＮＲＲＬ２７０
２、ＮＲＲＬ２７０３およびＡＴＣしかしながら、抗生
物質産生宿主細胞におけるプラスミドの維持はしばしば
、そうでなければ抗生物質を産生ずるために使用される
かもしれない細胞エネルギーの有意な消費を必要とする
。従って、自律的複製ベクターで形質転換されたある種
の微生物は、たとえ同一のベクターがその他の微生物の
抗生物質産生能を高めることができても、事実上、抗生
物質産生能の低下を示すことがある。

抗生物質の合成はまた、抗生物質産生微生物においてな
くてもよい機能であると考えられている。

なぜなら、抗生物質の生合成が遮断された突然変異株は
、抗生物質産生親株と同様に生存可能であり、増殖する
からである。野生型様は、比較的少量の抗生物質を産生
じ、これは微生物に淘汰有利性を与えるのに十分な様で
ある。

天然の単離株から工業的抗生物質産生株を開発するには
、抗生物質産生をより高くするために、突然変異および
選択を多数回繰り返す必要がある。

抗生物質の合成は、増殖および維持機能から一次代謝物
および細胞エネルギーを消耗するので、抗生物質産生を
より高くするための選択はしばしば、微生物の活性を犠
牲にする。従って、抗生物質産生株の作成には、増殖−
維持機能と抗生物質産生間に細胞の栄養とエネルギー供
給をうまく平衡させることが必要である。この微調整の
故に、高収量産生株は、細胞生理学的に影響を与える因
子に非常に影響され易い。例えば、自律的複製ベクター
、非常に高コピー数のプラスミドの導入はしばしば、通
常高レベルで抗生物質を産生ずる微生物の抗生物質産生
能を低下させがちである。この阻害のメカニズムは明ら
かではないが、これらの条件下では測定し得るレベルの
抗生物質前駆体が蓄積しないので、これは抗生物質の生
合成における初期段階で起こると思われる。更に、自律
的複製ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成のための前
駆体の蓄積を消費したり、または高コピー数でＲＮＡポ
リメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ活性化
物質または遺伝子発現のリプレッサーの様なりＮＡ結合
タンパクをくいつぶす（滴定）ことがある。自律的複製
ベクターにしばしば法の選択は、十分選択された抗生物
質産生能および従来法によって改善された抗生物質産生
微生物の改善に重要である。抗生物質低度生能を有する
微生物または株は、組み込みまたは自律的なベクターの
複製のいずれかによる形質転換によって改善することが
できる。発酵技術の当業者には理解できるように、本発
明が抗生物質産生株に適用される場合に、抗生物質産生
能に最も大きな改善がみられる。

従って、所望により、プラスミドＤＮＡの組み込みは、
通常の形質転換法に従い、抗生物質産生株またはその突
然変異株を、株中で分離的に不安定であるか、または複
製し得ないベクターで形質転換し、形質転換株を選択ま
たは識別し、次いで、増殖および複製するために宿主細
胞のためのプラスミドＤＮＡ配列の存在を必要としない
条件下で細胞を培養することによって容易に行われる。

非選択的条件下での数世代培養後には、ある種の細胞は
もはや遊離プラスミドＤＮＡを含有しないであろう。宿
主細胞中に存在するプラスミドＤＮＡ起こりがちなその
他の制限は、自然損失である。

自然損失は、しばしば起こるように、ベクターが増殖速
度な低下させる時、とりわけ問題である。

プラスミド上の耐性マーカーの選択は、ホモジニアスな
、プラスミド含有群の増殖を保証するが、これはまた、
抗生物質発酵の生理学的バランスを崩壊することもある
。不安定なプラスミドの選択は、プラスミドを失うバク
テリアを殺滅または阻害することによって行い、その結
果、増殖速度が低下することがある。

微生物の抗生物質産生能に対する自律的複製ベクターの
負の効果は、しばしば観察されるが、増殖−維持機能と
抗生物質産生について微妙な平衡が保たれている高産生
株において最も大きい。高産生株における自律的プラス
ミド複製の負の効果の問題は、組み込みプラスミドを含
有している形質転換細胞の識別を容易にするように形質
転換された宿主細胞を培養し、更に組み込みの検出を容
易にする特性を有するベクターを与えることによって克
服することができる。組み込みを生じる培養−４４−・ 配列を選択または識別することによって、プラスミドＤ
ＮＡが細胞の染色体（ゲノム）ＤＮＡに組み込まれた宿
主細胞を識別することができる。ベクターＤＮＡの組み
込みを得るためのこの培養法は、形質転換宿主細胞中で
本来不安定であるベクターと組み合わせて使用される場
合に、とりわけ有用であり、ベクターを維持するだめの
選択圧なしで培養すると、プラスミドを含まない分離体
を生じる。ビブ等（Ｂ　ｉｂｂ　ｅｔ　ａｌ、、１９８
０．Ｎａｔｕｒｅ　３８４：５２６５３１）は、ベクタ
ーの安定な遺伝性質に必要なりＮＡ配列を記載し、この
安定配列を欠いた種々のベクターが構築された。

例えば、本発明のプラスミドを構築するために使用され
たクローニングベクターｐＨ，ＴＬ４０１（ＮＲＲＬ　
Ｂ−１８２１７）は、この安定配列を欠いている。使用
される“不安定″なる語句は、形質転換細胞がプラスミ
ドの維持のための選択圧の非存在下で培養される時のみ
、これらの細胞によって高頻度で失われるプラスミドを
意味する。形質転換宿主細胞に選択圧が適用される時、
通常、ｐＨＪＬ４０１の様なプラスミドはかなり安定で
ある。

安定なベクターで形質転換された宿主細胞を選択圧の非
存在下で培養すると、ベクターは、不安定なベクターで
観察される高頻度では失われず、組み込み体の識別は、
非選択的条件下で増殖した後でも自律的に複製するプラ
スミドを含有する多数の細胞によって困難になる。組み
込み体の選択は、以下に、より詳細に記載する。ベクタ
ーＤＮＡが宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたら、
その宿主細胞の抗生物質産生能の最大の増大が観察され
る。なぜなら、自律的複製プラスミドによる阻害はもう
起こらないからである。

生産微生物のゲノムへの、クローニングされた遺伝子を
含有しているベクターの組み込みは、多数の方法で行う
ことができる。一つの方法は、宿主株のゲノムに組み込
み得る溶原性バクテリオファージまたはその他のファー
ジベクターの使用である。他の方法は、クローニングさ
れた遺伝子を有するプラスミドベクターを使用し、クロ
ーニングされた配列とホモローガスな染色体配列間の１
回法は、ｔｙ＋配列への組込みの突然変異誘発効果を避
けられるが、二重交差組換えか所望の場合、ベクターは
、ホモローガスなりＮＡの別の配列に囲まれた抗生物質
生合成遺伝子を包含するべきである。

タイロシン産生においてわずかであるが起こり得る組換
えプラスミド（自律的複製または組込み）の悪影響を回
避するために、ストレプトマイセス・７ラジエの能力を
使用して培養培地からタイロシン前駆体を回収し、それ
をタイロシンに変換することができる。

従って、高コピー数の本発明生合成遺伝子および高い酵
素濃度を含有するＳ、フラジエの特異株を開発し、蓄積
した前駆体からタイロシンへのコンバーターとして作用
させることができる。これらのコンバーター株は、幾つ
かの異なった方法で使用することができる：（１）コン
バーター株ヲ、正常な産生株と一緒に、低い、コンバー
ター：産生株の割合で発酵槽に接種する；（２）コンバ
ータ株を、中間体を変換するためのサイクルの後期の組
換えによる宿主ゲノムへの組換えプラスミドの組み込み
をスクリーニングすることである。ベクターの組み込み
頻度は、ベクターに、宿主細胞のゲノムＤＮＡにホモロ
ーガスなりＮＡを付加することによって飛躍的に増大さ
せることができる。

使用される“′組み込み″なる語句は、キャンベル型組
換えとして知られている１回組換えおよび更にベクター
と染色体間の遺伝情報の交換を生じる２重交差の両者を
意味する。二重交差組換えの場合、一部分のベクターの
みが染色体ＤＮＡに組み込まれる。

例えば、クローニングされたタイロシン生合成遺伝子（
ｔｙｌ）を有するプラスミドは、プラスミド上のｔｙｔ
遺伝子とゲノム中のホモローガスなｔｙ＋遺伝子間の１
回交差によってストレプトマイセス・フラジニゲツムへ
組込むことができる。その他の方法は、クローニングさ
れたＬｙｌ遺伝子以外に、プラスミドに非−ｔｙｔｓ、
フラジよりＮＡ配列を位置させ、非−ｔｙｌ配列に相当
する位置での組込みをスクリーニングすることであろう
。後者の方に産生発酵培養物に導入する；（３）コンバ
ータ株を別の″反応器″中で維持し、これに、産生株か
らの発酵産生ブロスを加える；（４）コンバーター株を
、カラムに固定化し、産生株からの発酵ブロスを通す。

当業者には、別個に産生させ、各々の群を変換すると、
組換えプラスミドがしばしば抗生物質産生株における抗
生物質産生に対して有する悪影響が排除されるというこ
とが理解されるであろう。

プラスミドの維持のための抗生物質選択または幾つかの
その他の選択手段を注意深く調節および制御し得る小さ
な容器中で変換株を増殖させることができるので、別個
の群にすると、ベクターの安定性の問題も排除される。

本来、変換株は、酵素の供給源であり、これらの酵素を
高濃度で産生させるには、Ｅ、コリにおいて組換えプラ
スミドからタンパクを産生させるのとほとんど同様に行
うことができる。

通常、抗生物質の産生は、形質転換ＤＮＡが、その発現
が非形質転換株の律速的産物の活性を高める遺伝子を含
有するときにのみ増大する。抗生物質の生合成における
律速的段階を調べるための種々の方法は、当該技術分野
既知である（セノおよびポルッ（Ｓｅｎｏ　ａｎｄ　Ｂ
ａ１ｔｚ、１９８２．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａ
ｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　２１
ニア５８−７６３））が、抗生物質産生株に導入するた
めの一連の抗生物質生合成遺伝子が全て入手可能である
時には律速的段階を識別する必要はない。律速的酵素が
未知である場合、抗生物質産生株を一連の抗生物質生合
成遺伝千金てで形質転換すると、どの酵素が律速になろ
うとも、形質転換宿主細胞は非形質転換宿主細胞より高
濃度の律速的酵素を有するであろうということを保証す
る。しかしながら、抗生物質生合成経路の律速的酵素は
しばしば、知られるところとなり、本発明の遺伝子を使
用し、律速的抗生物質生合成酵素をコードしているベク
ターで微生物を形質転換することによって、微生物の抗
生物質産生能を高めることができる。

本発明に記載の組換えプラスミドは各々、１またはそれ
以上の抗生物質生合成遺伝子を含有して他の調節要素を
非タイロシン抗生物質生合成遺伝子のコード配列に結合
させ、Ｓ、フラジエ中テ機能するであろうハイブリッド
遺伝子を調製することができる。従って、本発明の各プ
ラスミド上の個々の抗生物質生合成遺伝子の各要素は、
本発明の重要な構成要素である。即ち、本発明の生合成
遺伝子のプロモーター、転写活性化配列、タンパク質コ
ード配列および転写終止配列は各々、本発明の重要な態
様である。

ストレプトマイセス・フラジエ株は、数種類の培地のい
ずれかを使用し、多数の方法で培養することができる。

培養培地に好ましい炭水化物供給源には例えば、糖蜜、
グルコース、デキストランおよびグリセロールがあり、
窒素供給源には例えば、ダイズ粉、アミノ酸混合物およ
びペプトン類がある。栄養無機塩類も培地に加えられ、
ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リ
ン酸、塩化物、硫酸等のイオンを生じ得る通常の塩類を
包含する。他の微生物の増殖および成長に必要な様に、
必須微量元素も加えられる。この様いる。多シストロン
の一部分でない場合、抗生物質生合成遺伝子は通常、（
１）遺伝子の転写を指示するプロモーター；（２）ｍＲ
ＮＡに転写された時、転写物の翻訳を指示する配列（パ
翻訳活性化配列″）；（３）タンパク質コード配列：お
よび（４）転写ターミネータ−を含有している。これら
の要素は各々、独立して有用であり、組換えＤＮＡ法に
よって、非常に多種の組換え遺伝子を形成させるために
使用することができる。１例として、ｔｙＩＧ遺伝子の
ためのタンパク質コード配列を非ストレプトマイセス・
フラジエ遺伝子からのプロモーター転写活性化配列およ
び転写終止配列に結合させ、非Ｓ、フラジエ配列が分離
された宿主中で機能する組換え遺伝子を作成することが
できる。この様な新規な遺伝子は、タイロシン経路で見
いだされないが、新規な遺伝子産物のだめの基質として
働くことができる抗生物質または抗生物質中間体を産生
じた微生物中に導入されると、ハイブリッド抗生物質を
製造するために使用することができる。

同様に、ｔｙｌＧ遺伝子のプロモーターおよびそのな微
量元素は通常、培地のその他の成分の添加に伴う不純物
として供給される。Ｓ、７ラジ工株は、約６〜８の比較
的広範なｐＨ範囲、約２５°〜３４°Ｃの温度範囲の好
気性培養条件下で増殖させる。

以下に例を挙げ、本発明を更に例示および説明するが、
本発明の範囲はいかなる意味においてもこれらの例によ
って限定されるものではない。試薬の供給源は単に便宜
的に提供するものであり、いかなる意味においても本発
明を限定するものではない。

製造例１　コスミドｐＫＣ６４４の単離コスミドｐＫＣ
６４４（第３図）は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２３
８（受託口１９８７年７月９日）でノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・センター（ＮＲＲＬ）、ペオリア、イ
リノイ６１０４に寄託されているＥ、コリ（大腸菌）Ｋ
１２ＤＫ２２から入手することができる。このｐＫＣ６
４４コスミドＤＮＡを使用し、本発明の遺伝子の単離に
有用なベクターを構築する。アブラマイシン２００μｇ
７ｍＱを含有しているＬ−アガープレート（１Ｑ当たり
、トリプトン１０ｇ、ＮａＣＪｌ　０ｇ、酵母エキス５
ｇおよび寒天１５ｇ）にＥ、コリに１２ＤＫ２２／ｐＫ
Ｃ６４４の凍結乾燥菌を蒔き、この株の単一コロニー単
離物を得る。このコロニーを使用し、アブラマイシン２
００μｇ／ｍＱを含有しているＬグロス（寒天を含まな
いＬアガー）（約５００　ｍ（１）に接種し、得られた
培養物を細胞が静止期に達するまで、空気を吹き込みな
がら３０°Ｃでインキュベートする。

ラオ等（Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ、）の方法［１９８７、メ
ソ・ンズ・イン・エンザイモロジー、１５３：１６６１
９８、アール・つ（Ｒ，Ｗｕ）およびグロスマン（Ｌ　
、　Ｇ　ｒｏｓｓｍａｎ）編、アカデミツク・プレス、
ＮＹＩに従い、以下の様にして細胞からコスミドＤＮＡ
を得る。

細胞を８００Ｏｒｐｍで１０分間遠心する。上清をデカ
ントした後、２５％シュクロース、５０ｍＭトリス・Ｈ
ＣＱ、ｐＨ８，０（７蛯）に細胞を再懸濁する。この溶
液に、新たに調製したりゾチーム（５ｒｎｇ／ｍＱ溶液
０．２５ｍＱ、）、および０．５Ｍ　ＥＤ５回抽出する
ことによって、臭化エチジウムを除去する。ＤＮＡ溶液
をＴＥバッファー（１０ｍＭトリス・ＨＣ：Ｑ、ｐＨ８
，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡＸ２リッＩ・ル）に対して透析
し、２時間後、新しいＴＥで置き換える。透析した溶液
をフェノールで２回、クロロホルム：イソアミルアルコ
ール（２４：１）で２回抽出する。１０分の１容量の３
Ｍ酢酸ナトリウムおよび３倍容量のエタノールを加え、
ＤＮＡをエタノール沈澱させる。１０，０００ｒｐｍで
１０分間遠心してＤＮＡを集め、７０％エタノール次い
で１００％エタノールで洗浄し、乾燥し、滅菌ＴＥ（約
２５０μＱ）に溶解する。２６０および２８０ｎｍで光
学密度を測定することによって、濃度および純度を調べ
る。ｐＫＣ６４４の制限部位および機能地図を添付の図
面の第３図に示す。

製造例２　プラスミドｐＨＪＬ４０１の単離プラスミド
ｐＨＪＬ４０１（ラルソン（Ｌ　ａｒｓｏｎ）およびバ
ーシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ）、１９８６
、プラスミド１５　：１９９−２０９）は、ＮＲＲＬに
受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２１７（受託口ＴＡ（ｐＨ
８Ｘ０．４ｍＱ）および５　ｒｎｇ／ｍＱＲＮａ５ｅＡ
（０，０５ｍ＋２）を加える。この混合物を３７℃で１
５分間インキュベートする。この混合物に、トリトン溶
菌ミックス（１５０ｍＭｊ−リス・Ｔ（Ｃα、ｐＨ８，
０，３％トリトンＸ　　１００Ｒ，２００ｍＭ　ＥＤＴ
ＡＸｏ、７５ｒｎ１２）を加え、混合し、氷上で１５分
間インキュベートする。溶菌が完全でない場合は、これ
を３７°Ｃで更に約５分間インキュベートする。混合物
を２０．０００ｒｐｍで４０分間遠心する。上清を取り
出し、保存する。ＤＮＡ溶液（３１，２ｍ１２）にＣ３
ＣＱ（２８，６５ｇ）を加えることによって、Ｃ５Ｃ（
２グラジエント（密度１．５５）を調製する。このグラ
ジェント溶液を混合してＣ５ＣＱを溶解し、大きな超遠
心チューブに移す。チューブを臭化エチジウム（１０ｍ
ｇ／　ｍＱ）Ｃ〜０　、６　ｍＱ）で満たし、封をして
混合する。

グラジェントを４９　＋　０００　ｒｐｍ（ベックマン
ｖＴ１５０ローター）で１８時間遠心する。長波ＵＶ光
で見えるプラスミドＤＮＡの下方のバンドを集める。

Ｃ５Ｃ（ｌを飽和させたイソアミルアルコールで４〜１
９８７年５月７日）で寄託されたＥ、コリＫ１２ＪＭＩ
　０９から入手することができる。プラスミドｐＨＪＬ
４０１は、Ｅ、コリまたはストレプトマイセス中で複製
可能であり、２種の抗生物質、アンピシリンおよびチオ
ストレプトンに対する耐性マーカーを含有しているので
、有用なベクターである。チオストレプトンはストレプ
トマイセス中においてのみ選択可能であり、アンピシリ
ンはＥ。

コリ中において選択可能である。プラスミドｐＨＪＬ４
０１はまた、１ａＣＺ遺伝子中にポリリンカー複数クロ
ーニング部位領域を有している。従って、ＤＮＡ挿入物
は、細胞をＸガル上に蒔し）だ後、白色コロニーを採取
することによって選択することができる。Ｅ、コリに１
２ＪＭ１０９／ｐＨＪＬ４０１の凍結乾燥菌を、１００
μｇ／Ｉｌｌαアンピシリン、４０μｇＸガル／ｍＱお
よび４０　μｌ？Ｉ　ＰＴＧ／罰を含有しているし一ア
ガープレートに蒔き、この株の単一の青色コロニー単離
物を得る。このコロニーヲ使用し、１００μｇ／ｍ（ｌ
アンピシリンを含有しているしブロス（約５００　ｒｎ
＋２）に接種し、得られた培養物を、細胞が静止期に達
するまで、空気を吹き込みなから３７°Ｃでインキュベ
ートする。

実質上、上の製造例１に記載の方法に従い、細胞からプ
ラスミドＤＮＡを得る。プラスミドｐＨＪＬ４０１の制
限部位および機能地図を添付の図面の第２図に示す。

製造例３　プラスミドｐＫＣ６６８の構築プラスミドｐ
Ｋｃ６６８は、Ｇ５１４およびＧ５５０の突然変異ｔｙ
ｌＡおよびｔｙｌＢ遺伝子を相補するＳ、アンボファシ
エンスからのＥｃｏＲｒ制限フラグメント（〜１０ｋｂ
）を含有している。従って、このベクターは、本発明の
ｔｙｉＡおよびｔｙｌＢ生合成遺伝子についてＳ、フラ
ジエをプローブするのに有用である。このプラスミドは
、以下の方法で構築した。１ＯＸＥｃｏＲＩバツフアー
（ＩＭ　トリス−ＨＣ１２，ｐＨ＝７．５　；　０．５
Ｍ　ＮａＣ０，；および５０ｍＭ　ＭｇＣｆｆｚＸ２　
／’４）、ＨｚＯ（（３７ｄｌ）、制限酵素ＥｃｏＲＩ
（〜４０単位；本明細書中、特に断らない限り、単位の
定義は、ニュー・イングラｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　
Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　Ｉ　ｎｃ、　（Ｉ
　Ｂ　Ｉ　）。

Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘｌ　５６５　、　　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ
、　　ＣＴＯ６５０６）（約ｌ／ｌρＸＯ，１単位）を
ＤＮＡ溶液に加え、この反応物を６５°Ｃで１時間イン
キュベートする。

反応混合物をフェノール：クロロホルムのｌ：ｌ溶液（
４００μａ）で抽出し、次にクロロホルム（４００μａ
）で抽出する。ＥｃｏＲＩ−消化し、脱ホスホリル化し
たプラスミドｐＨＪＬ４０１ＤＮＡを、前記の様にして
エタノール沈澱および遠心によって集め、このＤＮＡペ
レットをＴＥバッファー（１０μＱ）に再懸濁する。

ＴＥバッフｙ−ＣＩＯｐＱ’）中コア、ミドｐＫＣ６４
４（約ＩＯμｇ）を、Ｒ２０（７５μＱ）、１０ＸＥｃ
。

Ｒ１バッファー（１Ｍトリス−ＨＣＱＸｐＨ＝７．５；
　０．５Ｍ　ＮａＣＱ：および５０　ｍＭ　ＭｇＣＬＸ
　１０ｐＱ）および制限酵素ＥｃｏＲＩ　（５／！１Ｉ
２Ｘ−１００単位）に加える。得られた反応物を３７°
Ｃで２時間インキュベートする。前記の様にして反応混
合物を抽出し、ＤＮＡを集める。ＤＮＡペレットをＴＥ
バッファー（〜ｌＯμａ）に溶解する。実質上ンド・バ
イオラプス（ＮＥＢ）、３２トザー・ロード、ビバリー
、マサチューセッツ０１９１５−９９９０　（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ　１ｏｌａｂｓ（Ｎ　Ｅ　Ｂ）、　
３２Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ　　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ
　Ｏｌ　９１５　９９９０の定義に従う）（２μＱ）に
、プラスミドｐＨＪＬ４０１ＤＮＡ（製造例２から）（
約ｌＯμｇＸＩＯμａ）を加える。得られた反応物を３
７°Ｃで２時間インキュベートする。ＥｃｏＲＩ−消化
プラスミドｐＨＪＬ４０１ＤＮＡをフェノール／クロロ
ホルム（１／ｌ）で抽出し、次いで反応混合物の水相の
酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）濃度を［１，３０Ｍに調
節し、２．５倍容量のエタノールを加え、反応混合物を
一７０’Ｏに冷却し、遠心して沈澱したＤＮＡをペレッ
ト化することによって集める。ＥｃｏＲＩ−消化プラス
ミドｐＨＪＬ４０１ＤＮＡのペレットをＴＥバッファー
（４００μＱ）に再懸濁する。

バクテリアアルカリホスファターゼ（インターナショナ
ル・バイオテクノロジー・インコーホレイテッド（Ｉ　
Ｂ　Ｉ）、ピー・オー・ボックス１５６５、ニュー・ヘ
イブン、コネチカット０６５０６（Ｉｎマニアティス等
の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌ　９８
２　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ））に従い、低融点アガａ
−スゲル（バイオラド、２２００ライト・アベニュー、
リッチモンド、ジョーシア９４８０４（ＢｉｏＲａｄ、
　２２００Ｗｒｉｇｈｔ　Ａｖｅ、、　Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ、　ＧＡ、　　９４８０４））上で、このＤＮＡを電
気泳動する。

低融点アガロース０．８ｇを含有するＩＸＴＡＥバッフ
ァ　（４０ｍＭ）リス−酢酸、ｐＨ＝７．５．２ｍＭ　
ＥＤＴＡＸＩ　００ｍ＋２）をアガロースが溶解するま
で加熱することによって、ゲルを調製する。

この混合物を３７°Ｃに冷却して注ぎ、４℃で放置する
。ＤＮＡ試料に、ローディングバッファー（Ｈ，Ｏ中、
０．２５％ブロムフェノールブルー、０゜２５％キシレ
ンシアツール、３０％グリセロール）（２μＱ）を加え
る。この試料をゲルに負荷した。

４°Ｃでゲルに１００ｖをかけ、ブロムフェノールブル
ー染料がゲルの底部に接近するまで泳動させる。ゲルを
０．５μｇ／ｍ（を臭化エチジウムで染色し、所望の〜
１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩバンドを長波ＵＶ蛍光で検出し、
切り取った。ゲル切片に、５倍容量の２ＱｍＭトリスー
ＨＣ４（ｐＨ８，０）および１ｍＭＥＤＴＡを加える。

ゲルを６５°Ｃで５分間融解させる。この試料を等容量
のフェノールで抽出する。

試料を遠心し、水層を回収し、再抽出し、前記の様にし
てＤＮＡを集める。

ＤＮＡペレットをＴＥバッファー（４０μＱ）に溶解す
ると、コスミドｐＫＣ６４４の所望の〜１０ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩ制限フラグメント（〜２μ９）Ｉ含有している。

ＥｃｏＲＩ消化し、脱ホスホリル化したプラスミドｐＨ
ＪＬ４０１　　ＤＮＡ（１μＱ）を、ｐＫＣ６４４から
のＥｃｏＲＩ制限フラグメント（１０μＱ）（〜０゜５
μｇ）、１０×リガーゼバツフアー（６６０ｍＭ　トリ
ス−ＨＣｆ１１ｐＨ＝８　；　６６ｍＭ　ＭｇＣＱ２；
　１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）；およびｌＯ
ｍＭＡＴＰＸ２ｐＱ’）、８よびＨ２０（６ｐ　ｆｆ）
　ニ加える。

Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（約２μｍ２Ｘベーリンガーマ
ンハイム、インデイアナポリス、インデイアナ（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　　Ｉ　ｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ、　　Ｉ　Ｎ）すると、１ａＣＺα−フ
ラグメントをコードする配列が崩壊され、付随的に、△
Ｍ１５突然変異を相補するグラスミドｐＨＪＬ４０１誘
導体の活性が消失する。β−ガラクトシダーゼは、Ｘ−
ガル、即ち、無色の化合物である５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加
水分解してインチ４５色の生成物を生じるので、出発物
質たるグラスミドｐＨＪＬ４０１を含有している形質転
換体と、プラスミドｐＫＣ５６８の様なプラスミドｐＨ
ＪＬ４０１誘導体を含有している形質転換体を区別する
ための好適なスクリーニング法となる。

凍結したコンピテントなりＨ５α細胞（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド、ピー・
オー・ボックス６００９、ゲイザーズバーグ、メリーラ
ンド、２０８７７　（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、（Ｂ　Ｒ
Ｌ）、　Ｐ　。

０、Ｂｏｘ６００９　、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、
　ＭＤ　、　２０８７７））を、製造業者の指示に従っ
て形質転換する。

細胞を氷上で解凍し、１回の形質転換あたり、ｌの定義
によると１単位／μＱ）をこのＤＮＡ溶液に加え、得ら
れた反応物を１５°Ｃで一夜（〜１６時間）インキュベ
ートする。ライゲートされたＤＮＡは、−１０ｋｂ　Ｅ
ｃｏＲＩ挿入フラグメントの方向のみが異なっている所
望のプラスミドｐＫＣ６６８およびｐＫＣ６６８Ａを含
有している。プラスミドｐＫＣ６６８の制限部位および
機能地図を第４図に示す。

プラスミドｐＨＪＬ４０１のＥｃｏＲ１部位は、それ自
体が１ａｃＺα−フラグメントをコードしているＤＮＡ
配列の一部を構成するポリリンカー内に存在する。Ｅ、
コリに１２ＤＨ５αの様なＥ、コリ△Ｍ１５株において
Ｉａｃ　Ｚα−フラグメントが発現すると、機能的β−
ガラクトシダーゼ酵素を産生ずるこの株の活性が回復さ
れる。この様に、プラスミドｐＨＪＬ４０１は、Ｅ、コ
リＫ　１２ＤＨ５α株にβ−ガラクトシダーゼ活性を回
復させることができる。しかしながら、プラスミドｐＫ
Ｃ６６８の構築の時の様に、プラスミドｐＨＪ　Ｌ　４
０１上のポリリンカーの制限部位へＤＮＡが挿入００μ
ａの細胞を取り出し、使用しない細胞をドライアイス−
エタノール浴中で再凍結させる。氷上で予め４°Ｃに冷
却した細胞（１００μＱ）に、水で５倍希釈したライゲ
ーション反応混合物（１μＱ）を加える。細胞を氷上で
３０分間インキュベートし、４２°Ｃで４５秒間熱シヨ
ツクを与え、２−５分間、氷にもどす。ＳＯＣ培地培地
１企Ｑえ、振盪しながら細胞を３７°Ｃで１時間インキ
ュベートした。ＳＯＣ培地は２％（ｗ／ｖ）トリプトン
、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２０ｍＭグルコース
、ｌｏｍＭ　ＮａＣＱ、２．５ｍＭ　ＫＣＱ、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　Ｍｇ（４ｈおよび１０　ｍＭ　ＭｇＳ　Ｏ、である
。

１００μｙアンピシリン／ｍＱ、　　４０　μｇＸ−ガ
ル／ｍＱおよび４０　μｇｌ　ＰＴＧ／ｍＱを含有して
いるし一アガープレートに、形質転換混合物の一部を蒔
く。Ｉ　ＰＴＧは、プラスミドｐＨＪＬ４０１に存在す
るｌａｃプロモーターの抑制を解除するのに役立つ。プ
レートを３７°Ｃで一夜インキユベートする。Ｅ、コリ
Ｋ　ｌ　２ＤＨ５α／ｐＨＪＬ４０１の様な挿入物を伴
わないプラスミドを含有しているコロニーはこれらのプ
レートで青色を呈する。ＥコリＫ１２ＤＨ５α／ｐＫＣ
６６８の様な挿入物を伴ったプラスミドを含有している
コロニーは、白色である。数個のアンピシリン耐性白色
コロニーを選択し、次いでこれらのプラスミドＤＮＡを
制限酵素分析によってスクリーニングする。細胞を３０
°Ｃではなく３７°Ｃで生育させ、アブラマイシンでは
なくアンピシリンを１００μｇ／ｍｕ含有しているブロ
ス中で生育させる以外、前記製造例１に記載のプラスミ
ドｐＫＣ６４４ＤＮＡを単離するための方法に従い、Ｅ
、コリに１２ＤＨ５α／ｐＫＣ６６８形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを得た。プラスミドｐＫＣ６６８ＤＮＡ
を使用し、下記のようにして、例えばストレプトマイセ
ス・フラジエＧＳ　１４（ＮＲＲＬ　ｌ　２１８８）、
Ｓ、フラジエＧＳ　５０（ＮＲＲＬ　１２２０１）のよ
うなストレプトマイセスを形質転換することができる。

Ｂ、プラスミドｐＫＣ６６８のＳ、フラジよりＮＡへの
ハイブリダイゼーション ｐＫＣ６６８の〜１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメント含
有していた。Ｉ　ＸＴＢＥ（０，０８９Ｍ　　トリスホ
ウ酸、０．０８９Ｍホウ酸、０．００２ＭＥＤＴＡ）中
ゲル（０，８％アガロース）を５０Ｖで約１６．５時間
泳動させ、その後、これらをＩＸＴＢＥ中臭化エチジウ
ム（１μｇ／ｍＱ）中で１５分間染色し、ＵＶ先光下可
視化し、次いで写真撮影しｌこ。

次に、ゲルを０．２５Ｍ　ＨＣＱ中、室温で１０分間、
次に１．５Ｍ　ＮａＣＱおよび０．５ＭＮａＯＨ中、室
温で３０分間、最後に３．ＯＭ　ＮａＣＱ。

０．５Ｍ　　ト！Ｊス−ＨＣｆ２（ｐＨ８，０）中、室
温で３０分間洗浄した。次いで、ＤＮＡを、２ＸＳＳＣ
（２０ｘ”ｓ　ｓ　ｃ”は３Ｍ　ＮａＣＱ、０．３Ｍク
エン酸ナトリウム）を使用し、毛管の作用によってナイ
ロン膜（ハイボンド１、アマ−ジャム・コーポレイショ
ン、シカゴ、イリノイ（ＨｙｂｏｎｄＲ，Ａｍｅｒｓｈ
ａｍＣｏｒｐ、、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬ））に移し
た。移した後、ゲルを捨て、ナイロン膜を２ＸＳＳＣお
よび１％ＳＤＳ中で洗浄する。次いでＤＮＡをＵＶ光に
５分間さらすことによって膜に交差結合させる。

を、上のｐＫＣ６４４についての記載と同様にしてｐＫ
ｃ６６８を制限酵素ＥｃｏＲＩで処理することによって
分離した。このフラグメントを、オリゴヌクレオチド標
識キット（ファルマシア、８００センテニアル・アベニ
ュー、ビス力タウェイ、ニューシャーシー０８８５４　
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、８００Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　
Ａ　ｖｅｎｕｅ、　Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ　、
　Ｊ　、０８８５４））を使用し、製造業者の指示に従
って、α−３２ｐｄＣＴＰで標識した。

２個のゲルを泳動させ、以下の記載の様にしてナイロン
膜に移した： 第１のゲルは、Ｇｓ　ｌ　４　（ｔｙｌＡ突然変異体）
およびＧ５５０（ｔｙｌＢ突然変異体）を含むストレプ
トマイセス・フラジエ株からのＢａｍＨＩ切断ＤＮＡを
含有していた。第２のゲルは、Ｓ、フラジェ染色体ＤＮ
Ａからの挿入物を含有するプラスミド／ロスミドからの
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを含有していた
。とりわけ、このゲルは、ＡＵＤ８−２、ｔｌｒｃ　８
−６およびｔｌｒｃ８　１と名付けられたベクターから
の制限酵素消化ＤＮＡを膜を、以下の、２０ＸＳＳＣ２
５ｍＱ、Ｈ２Ｏ２２蛯、脱イオンホルムアミド５０＋＋
＋ｆｆ、１０％ＳＤＳ１ｍｆｆ、１００Ｘデンハーツ溶
液（フィニル（Ｆ　ｉｃｏｌｌ）ＸＭ、Ｗ、４０．００
０）４．０ｇ、ポリビニルピロリドン（Ｍ、Ｗ、３６０
．０００）４．０９、ＢＳＡ　　４．０９およびＨ２０
２００ｍＱ）　１　ｍＱおよび音波処理によって変性さ
せたウシ胸腺ＤＮＡ（５ｍｇ／ｍＱ月」Ｑからなる溶液
１０−２５＋＋＋１２中、４５０Ｃで２時間予めハイブ
リダイズさせる。

ハイブリダイゼーションは、予め変性させたプローブフ
ラグメント１．５Ｘ１０７ｃｐｍを補足した上記プレハ
イブリダイゼーション溶液１０ｍＱ中、穏やかに撹拌し
なから４５°Ｃで一夜行われる。インキュベーション後
、膜を、１回の洗浄につき約１５分間、２ＸＳＳＣおよ
び０．１％ＳＤＳ　５００罰を使用し、室温で３回洗浄
した。この最初の洗浄の後、膜を、１回の洗浄につき約
１５−３０分間、０．Ｉ　Ｘ５ＳＣおよび０．１％５Ｄ
Ｓ５００蛯を使用し、６０°Ｃで３回洗浄した。次に膜
を、０．１ＸＳＳＣを使用し、室温で２回濯いだ。

膜を、増強スクリーンを使用し、−７０°ＣでＸ線フィ
ルムにさらす。ｐＫＣ６６８の〜１０ｋｂＥｃｏＲＩフ
ラグメントは、Ｇ５１４およびＧ５５０ＤＮＡからの２
種のＢａｍＨＩ制限フラ制限フラグメントノリダイスす
ることがわかった。これらのフラグメントのサイズは、
〜８　、７　ｋｂおよび〜４゜５ｋｂであり、最も強い
ハイブリダイゼーションは〜８．７ｋｂフラグメントに
対してであった。

更に分析すると、ｐＫＣ６６８の〜ｌ　Ｑｋｂ　Ｅｃ。

ＲＩフラグメントはＳ　フラジニゲツムの〜９．８ｋｂ
の領域にハイブリダイズすることがわかった。

この領域は、ＡＵＤ８−２およびｔｌｒｃ　８−６上の
ＥｃｏＲＩ部位および、ｔｌｒｃ　８−６およびｔｌｒ
ｃ８−１からのＢａｍＨＩ部位に結合している。これら
のベクターからのフラグメントは、本発明のタイロシン
生合成遺伝子を更に調べるための基礎として役立つ。

実施例１　プラスミドｐＳＥＴ５５１の構築Ａ、ロコス
ドＡＵＤ８−２の消化 コスミドＡＵＤ８−２約１０　ｐ　ｇ（０，５＋ｎｇ／
ｍ約１０分間インキュベートし、その後、約１０分間遠
心することによって沈澱を集めた。次に、得られたＤＮ
Ａを、水４０μｇおよび５×ゲル負荷染料（水中５０％
グリセロール、５０ｍＭＥＤＴＡＸｐＨ８，０，０，２
５％ブロムフェノールプル、０．２５％キシレンシアツ
ール）１０μＱにＤＮＡを再溶解した。ＤＮＡをＩＸＴ
ＢＥ中０．８％アガロースゲルに負荷し、４０Ｖで１６
時間電気泳動させた。ゲルをＩＸＴＢＥ中１μｇ／ｍＱ
臭化エチジウムで１５分間染色し、バンドを紫外光下で
見えるようにした。小さいゲルスライスを切り取ること
によって、ＡＵＤ８−２の１３ｋｂＰｓｔＩフラグメン
トの直前にＤＥＡＥセルロース（シュライヒヤーおよび
シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅｌ
ｌ、　ＮＡ−４５Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ膜）を埋め込んだ。

この小さなゲルスライスをもとの場所に鐙き、１３ｋｂ
ＰｓｔＩフラグメントをＤＥＡＥ膜上、１５０Ｖで１５
−３０分間電気泳動させた。次いで、膜を取り出し、蒸
留水中で洗浄し、ＮＥＴ緩衝液（１ＭＮａｃ（２、Ｏ，
ＩｍＭ　　ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリＣ）を、１ＱＸＰｓ
ｔＩ緩衝液（ＩＭ　ＮａＣＱ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（ｔ（ｐＨ７，５）、Ｏ，ｌ　Ｍ　ＭｇＣＬ）１０ｐ
Ｑ、Ｂ５Ａｌ　ＯｐｇＣ１ｍｇ／ｍＱ　）、制限酵素−
ＰｓｔＩ　５μＱ（１０単位／　ｍＱ　−＝　：ｘ、−
・イングランドバイオラプス・インコーホレイテッド（
ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、、
　　３２　　Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ。

Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）および水５５μαに加えた。

３７°Ｃで２時間消化を行い、その後、この混合物にｌ
　ＸＴＥ緩衝液（１３ｍＭトリス−ＨＣｌ２．ｐＨ８゜
０．１ｍＭＥＤＴＡ）を飽和させたフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４／２４／１）１０
０μ０を加えた。この混合物を撹拌して遠心機で２分間
遠心することによって、消化されたコスミドを抽出し、
層を分離させた。水層を取り、クロロホルム／イソアミ
ルアルコール（２４／１）１００μＱで抽出し、混合物
を２分間遠心して層を分離し、その後、水層を取った。

この溶液に３Ｍ酢酸ナトリウムｌＯμａと無水エタノー
ル２５０μαを加えることによって、水層からＤＮＡを
沈澱させた。次いで、混合物を一７０°Ｃでス、ｐＨ８
，０）４００　ｐＱを含有する１、５ｍ１２エツペンド
ルフチユーブに入れ、６５°Ｃで４時間インキュベート
した。次にこの紙を除去し、無水エタノールｌ＋＋＋４
を加え、混合物を一２０°Ｃで一夜インキユベートした
。得られたＤＮＡを、１０分間遠心することによってペ
レットとし、このペレットをｌ　ＸＴＥ緩衝液５０μα
に再懸濁した。

Ｂ、プラスミドｐＨＪＬ４０１のＰｓｔＩ消化上の製造
例２によって調製したプラスミドｐＨＪＬ４０１を、以
下の様にして制限酵素ＰｓｔＩで消化したニ プラスミドｐＨＪ　Ｌ　４０１　（０，５ｍｇ／＋１１
２）約５ｐｇを、１ＯＸＰｓｔＩ緩衝液５μα、ＢＳＡ
（１ｍｇ／ｒｎＱ）５　ｐ　ｇ、　Ｐｇｔ　■制限酵素
にュー・イングランド・バイオラプス・インコーホレイ
テッド、３２トザー・ロード、ビバリー、マサチューセ
ッツ）３μＱ（１０単位／μＱ）および水２７μＱと合
した。３７℃で２時間消化を行い、その後、５０ｍＭト
リス（ｐＨ８，０）５０μａおよびウシ腸アルカリホス
ファターゼ（ベーリンガーーマンハイム・バイオケミカ
ルズ、Ｐ、Ｏ，ボックス５０８１６、インデイアナポリ
ス、インデイアナ４６２５０）５μＱＣ２単位／μａ）
を加えた。この混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベ
ートし、その後、更にアルカリホスファターゼ５μＱを
加えた。次いで、混合物を３７℃で３０分間インキュベ
ートした。

インキュベーション後、混合物にｌ　ＸＴＥ緩衝液を飽
和させたフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２４／２４／１）１００μａを加えた。混合物を
撹拌し、２分間遠心した後、水相を取り出した。水相を
クロロホルム／イソアミルアルコール（２４／ｌ）で抽
出し、遠心した後、水相を取り出した。水相を、３Ｍ酢
酸ナトリウムｌＯμαおよび無水エタノール２５０μＣ
を加えた後に一２０°Ｃで１０分間インキュベートする
ことによって、混合物からＤＮＡを沈澱させた。沈澱を
遠心によってペレットとし、ペレットをｌ　ＸＴＥ緩衝
液１００μαに再懸濁した。

Ｃ，ＰｓｔＩ消化ｐＨＪＬ４０１とＰｓｔＩ消化コスミ
ドＡＵＤ８−２（〜１３ｋｂフラグメント）のうそれ自
体がｌａｃ　Ｚα−フラグメントをコードしているＤＮ
Ａ配列の一部分を構成するポリリンカー内に位置してい
る。Ｅ、コリに１２ＤＨ５αの様なＥ、コリ△Ｍ１５株
において１ａｃＺα−フラグメントが発現すると、機能
的β−ガラクトシダーゼ酵素を産生ずる株の活性を回復
させる。即ち、プラスミドｐＨＪＬ４０１は、Ｅ、コリ
に１２ＤＨ５α株に、β−ガラクトシダーゼ活性を回復
させることができる。しかしながら、プラスミドｐＨＪ
Ｌ４０１のポリリンカーの制限部位にＤＮＡが挿入する
と、下記の、プラスミドｐＳＥＴ５５１゜ｐＳＥＴ５５
２、ｐＳＥＴ５５６およびｐＳＥＴ５５５の構築におい
て起こるのと同様に、ＩａｃＺαフラグメントコード配
列を崩壊し、それに付随し、プラスミドｐＨＪＬ４０１
誘導体のΔＭ１５突然変異相補能を消失させる。β−ガ
ラクトシダゼは、Ｘ−ガル、即ち無色化合物である５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドをインディゴ色の生成物に加水分解するの
で、出発物質たるプラスミドｐＨＪ　Ｌイゲーション 上からのＰｓＬＩ消化した脱ホスホリル化ｐＨＪＬ４０
１を、ＩＸ、ＴＥ緩衝液で１：１０に希釈した。１０×
ライゲーシヨン緩衝液（６６０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐ
Ｈ８；　６６ｍＭ　Ｍｇ（４２；　１０ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）；およびｌＯｍＭＡＴＰ）２μａを
、ＰｓｔＩ消化溶液２μα、上からのコスミドＡＵＤ８
−２からの〜ｌ　３ｋｂ　ＰｓＬＩフラグメントｌＯμ
ＱおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（１単位／μＱ；ベーリン
ガーーマンハイム、ｐ、ｏ、ボックス５０８１６、イン
デイアナポリス、インデイアナ）２μａおよびＨ２Ｏ４
μａに加えた。この混合物を１５°Ｃで一夜インキユベ
ートした。インキュベーション後、３Ｍ酢酸ナトリウム
３μＱおよび無水エタノール６０μａを加え、混合物を
−２０００で約１０分間インキュベートした。沈澱した
ＤＮＡを遠心によってペレット化し、ペレットをＩＸＴ
ＥＩＯμαに再懸濁した。

プラスミドｐＨＪＬ４０１のＥｃｏＲ１部位と同様に、
プラスミドｐＨＪＬ４０１のＰｓｔＩ部位は、４０１を
含有している形質転換体と、プラスミドｐＳＥＴ５５１
ＳｐＳＥＴ５５２、ｐＳＥＴ５５５またはｐＳＥＴ５５
６の様なプラスミドｐＨＪ　Ｌ　４０１誘導体を含有し
ている形質転換体を区別するための好適なスクリーニン
グ法となる。

凍結したコンピテントなりＨ５α細胞（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド（ＢＲＬ
）、Ｐ、０．ボックス６００９、ゲイザーズバーグ、メ
リーランド、２０８７７）を、製造業者の指示および製
造例３の記載に従って形質転換した。

形質転換混合物の１部分を、１００μ９アンピシリン／
ｍα、４０μｇＸ−ガル／ｍＱおよび４０μ９ＩＰＴＧ
／ｍ１２を含有しているし一寒天プレートに蒔いた。Ｉ
　ＰＴＧは、プラスミドｐＨＪＬ４０１に存在するｌａ
ｃプロモーターの抑制を解除するのに役立つ。プレート
を３７°Ｃで一夜インキユベートした。Ｅ、コリに１２
ＤＨ５α／ｐＨＪＬ４０１の様な挿入物を伴わないプラ
スミドを含有するコロニーは、これらのプレートで青色
を呈する。挿入物を伴ったプラスミドを含有しているコ
ロニは白色である。１２個のアンピシリン耐性白色コロ
ニーを選択し、次いで、プラスミドＤＮＡを制限酵素分
析によってスクリーニングした。細胞を、３０’０では
なく３７°Ｃで増殖させ、アブラマイシンではなくアン
ピシリン１００μｇ／ｍＱを含有しているブロスで増殖
させる以外、製造例１に記載の、プラスミドｐＫＣ６４
４ＤＮＡの単離のための方法に従い、Ｅ　コリＫ１２Ｄ
Ｈ５α形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。形質転
換体の１個は、所望の構築を有する、ｐＳＥＴ５５１と
呼ばれるプラスミドを含有していた。ｐＳ　Ｅ　Ｔ　５
５１の制限部位および機能地図を第５図に示す。

宿主株Ｅ、コリに１２ＤＨ５αにトランスフオームされ
たプラスミドｐＳＥＴ５５１は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ
−１８４１１（受託口１９８８年９月１４日）で、アグ
リカルチュラル ビス、ノーザン、リージョナル・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｌＩ
Ｓｅｒｖｉｃｅ。

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓノール）５μＱ，　８ｇ
１２１１制限酵素（１０単位／罰）３μＱおよびウシ血
清アルブミン（１ｍｅ／ｍＤ．）５μａと、ＥｃｏＲＩ
消化反応混合物３７μＱを合することによって、Ｂｇｉ
制限酵素で消化した。この消化は、３７°Ｃで２時間行
い、その後、反応混合物にｌ×ＴＥ緩衝液５０μＱを加
えた。次いで、ＴＥ緩衝液を飽和させたフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２４／２４／ｌ）
でＤＮＡを抽出した。混合物を撹拌した後、遠心によっ
て相を分離した。水相を取り出し、クロロホルム／イソ
アミルアルコール（２４／ｌ）１００μαで抽出した。

撹拌および遠心した後、水相を取り、３Ｍ酢酸ナトリウ
ムｌＯμａおよび無水エタノール３００μＱを加えた。

−７０°Ｃで３０分間インキュベートした後、沈澱した
ＤＮＡを遠心によってペレット化し、ペレットをＴＥ緩
衝液４０μＱに再懸濁しｔこ。

Ｂ．ｐＨＪＬ４０１のＥｃｏＲ　Ｉ　−　ＢａｍＨ　Ｉ
消化製造例２に略記した方法によって、プラスミドｐＨ
ＪＬ４０１を調製した。次いで、製造例３に（”ＮＲＲ
Ｌ’″））から入手することができる。

実施例２　　ｐＳＥＴ５５２の構築 プラスミドｔｌｒｃ４−３．２４は、上の製造例３に記
載のコスミドｔｌｒｃ　８　−　６と、ゲノムの同一領
域からのＳ．フラジよりＮＡを含有している。

このベクターは、ｐＳＥＴ５５２のための挿入ＤＮＡの
供給源として役立つ。

Ａ．Ｓ．フラジよりＮＡのＥｃｏＲ　Ｉ　−　Ｂｇ（ｉ
ｌｌ制限フラグメントの調製 ｔｌｒｃ４−３．２４ＤＮＡ（３７μＧ）を、ＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液５μα、ｌ　ｍｇ／ｍ（ＩＢ　Ｓ　Ａ　５　ｐ
　（２および制限酵素ＥｃｏＲＩ（１０単位／ｐ（１）
３ｐＱと合した。３７°Ｃで２時間消化を行い、その後
、３Ｍ酢酸ナトリウム５μａおよび無水エタノール１５
０μａを加えた。ＤＮＡを一７０℃で３０分間沈澱させ
た。

次いで、ＤＮＡを遠心によってペレット化し、Ｈ２０７
４μＱに再懸濁した。

次いでＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを、Ｂｇｌｌｌ緩衝液（１
Ｍ　ＮａＣ＋２；　０．１Ｍ　トリス−Ｈ　ｃＱ（ｐＨ
７　、４　）　；０　、Ｉ　Ｍ　ＭｇＣ（２２　；　０
　、　Ｉ　Ｍ　２−メルカプトエタ既述した様にして、
ベクターをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。次ぎに、Ｅ
ＣＯＲＩ消化ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ緩衝液をＢａｍＨＩ
緩衝液（１．５Ｍ　ＮａＣＱ；５ＱｍＭ）リス−ＨＣＩ
２（ｐＨ７．９）；　６　０ｍＭＭｇＣＬ；　６０ｍＭ
　２−メルカプトエタノール）で置き換え、ＥｃｏＲＩ
制限酵素をＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで置き換えた
以外、ＥｃｏＲＩ消化の方法と同様にして、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで消化した。

次ぎに、得られたフラグメントを、前記と同様、ウシア
ルカリホスファターゼを使用して脱ホスホリル化した。

消化後、４０ポルトで１６時間、ゲル（ＴＢＥ中０．８
％アガロース）電気泳動することによって〜５．８ｋｂ
ＤＮＡフラグメントを分離し、実施例１の記載と同様に
して精製した。次ぎに、得られたＤＮＡをＴＥ緩衝液６
０μａに再懸濁した。

Ｃ．プラスミドｐＳＥＴ５５２を製造するだめのライゲ
ーション ＥｃｏＲ　Ｉ　−　８ｇ１２Ｉ［消化ｔｌｒｃ４　　３
．２４（２０μＱ）を、上からのＥｃｏＲ　Ｉ　−　Ｂ
ａｍＨ　Ｉ消化ｐＨＪＬ４０１と合し、実施例１に記載
の方法と同様にしてＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲートし
た。

ライゲーション後、得られたＤＮＡを、実施例１の記載
に従って、Ｅ、コリＫｌ　２ＤＨ５α細胞にトランフオ
ームした。形質転換細胞を実施例１に記載のし一寒天に
蒔いた。３７℃で一夜インキユベーションした後、実質
上、製造例１に記載の方法に従い、１２個の白色コロニ
ーを選択し、形質転換体からプラスミドＤＮＡを得た。

形質転換体の１つは、所望の構築を有する、ｐＳＥＴ５
５２と名付けられたプラスミドを含有していた。ｐＳＥ
Ｔ５５２の制限部位および機能地図を第６図に示す。宿
主株Ｅ、コリＫ１２ＤＨ５αにトランスフオームされた
プラスミドｐＳＥＴ５５２は、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−
１８４１２（受託口１９８８年９月１４［Ｅ）でＮＲＲ
Ｌから入手可能である。

実施例３　プラスミドｐＳＥＴ５５５およびｐＳＥＴ５
５６の構築 製造例３に記載のコスミドｔｌｒｃ　８−６は、ｐＫＣ
６６８のＳ、アンポファシエンスＤＮＡとハイブリダイ
ズし、ｔｙｌＡおよびｔ、ｙｌＢ突然変異株を相補する
ＤＮＡ配列を含有している。このコスミドおよびｐＨＪ
Ｌ４０１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、得られたフラ
グメントをライゲートしてプラスミドｐＳＥＴ５５５お
よびｐＳＥＴ５５６を調製する。これらの後者のベクタ
ーは、挿入ＤＮＡの方向性のみが互いに異なっている。

Ａ、　ｔｌｒｃ　８−６およびｐＨＪＬ４０１のＢａｍ
ＨＩ消化 各ベクターを、実質上実施例２の記載と同様にして制限
酵素ＢａｍＨＩで消化した。得られたＤＮＡフラグメン
ト（ｔｌｒＣ８−６からの〜８ｋｂフラグメントおよび
ｐＨＪＬ４０１からの〜５．８ｋｂフラグメント）をラ
イゲートし、実施例１および２に記載の方法を使用し、
Ｅ、コリに１２ＤＨ５αにトランスフオームした。１２
個の白色アンピシリン耐性コロニーを選択し、それぞれ
のＤＮＡを分析した。形質転換体は所望の構築を有して
おり、ｐＳＥＴ５５５およびｐＳＥＴ５５６と名付けら
れた２個のプラスミドを更に分析するために選択した。

ｐＳＥＴ５５５およびｐＳＥＴ５５６についての制限部
位および機能地図を、それぞれ第７図および第８図に示
す。これらのベクターは各々、Ｅ。

コリＫｌ　２ＤＨ５αにトランスフオームされ、ＮＲＲ
Ｌに寄託された（１９８８年９月１４日）。これらのベ
クターは、受託番号ＮＲＲＬＢ１８４１３（ｐＳＥＴ５
５５）およびＮＲＲＬ　　Ｂ−１８４１４（ｐＳＥＴ５
５６）でノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リーズから入手可能である。

実施例４　ストレプトマイセスにおける形質転換および
タイロシンの産生 実施例１から３で製造したプラスミドを、３００Ｃの代
わりに３７°Ｃで培養を行い、アブラマイシンの代わり
にアンピシリン１００μｇ／ｍＱを使用する以外、実質
上、ｐＫＣ６４４の単離のために製造例１に記載した方
法に従い、Ｅ、コリ株から分離した。これらのプラスミ
ドを、突然変異株ストレプトマイセス・フラジエＧＳ５
、Ｇ５１４、Ｇ５５０およびＧ５７７を包含するストレ
ブトマイセスにトランスフオームした。前記の様に、こ
れらの突然変異株各々の相補性から、本発明のｔｙｌＡ
、　ｔｙｌＢ、　ｔｙｌＧおよびＬｙｌ　Ｉ遺伝子の存
在または非存在が確認される。

Ａ、ストレプトマイセスの形質転換 所望のストレプトマイセス株の培養物をトリブチカーゼ
−ツヤブロス（ＴＳＢ）２０＋＋＋４に接種し、水浴イ
ンキュベーター中、２９℃、２６　Ｏｒｐｍで一夜（約
１６時間）インキュベートした。培養物を、ホモジナイ
ジング容器（トーツス・サイエンティフィック（Ｔｈｏ
ｍａｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒ
ｏ。

ＮＪ））およびＴ−ライン研究室用撹拌機を使用してホ
モジナイズし、次いで、ソニフィア・セル・デイスラブ
ター（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｓｒｕｐｔｏ
ｒ）（ヒート・システムズ・ウルトラソニックス・イン
コーホレイテッド（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔ
ｒａｓｏｎｉｃｓ。

Ｉ　ｎｃ、））を使用して７６ワツトで７秒間フラグメ
ント化した。ホモジナイズし、フラグメント化した培養
物４ｍＱを、０，３％重量／容量グリシンを含有してい
るＴＳＢ１６ｍｆｆに接種し、培養物を再び、２９°Ｃ
で一夜インキユベートした。翌朝、培養物を上記と同様
にしてホモジナイズし、再培養した。この第３の一夜イ
ンキュベーションの後、培養物をホモジナイズし、集め
、次ぎにＰ培地で２回洗浄した。Ｐ培地は、Ｋ２Ｓ０．
０．２５ｇおよびＭｇＣ０，、−６Ｈ２０２，０３９に
シュクロース１０３９を加え、次ぎに終容量７００ｔｎ
Ｑまで脱イオン水を加えることによって調製する。次い
で、混合物を滅菌し、溶液各々７０ｍＱに、０．０５９
ＫＨ２ＰＯ，／ｌ　ＯＯｍａ脱イオン水；２．７８ｇＣ
ａＣＱ２／　ｌ　００　ｍＱ脱イオン水；および０．２
５ＭＴＥＳ（２−（［トリス−（ヒドロキシメチル）メ
チル１アミノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ＝７．２を約
１０ｍＱずつ加える。

細胞のペレットを、１　ｍｇ／　ｍＱリゾチーム（カル
ビオケム、う・ジョラ、カリフォルニア９２０３７（Ｃ
ａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　　９２
０３７））を含有しているＰ培地１５１ｎ＋２に再懸濁
し、次いで、室温で約１　ｌ／２時間インキュベートし
てプロトプラストを形成させる。プロトプラストを遠心
トに蒔いた。Ｒ２プレートはＲ２培地３０ｍ（ｌを含有
し、３７°Ｃで約４日間乾燥させた。Ｒ２培地は、水７
００ｍＱに１０３ｇシュクロース、０．２５ｇＫ２Ｓ０
い２ｒｎＱ微量元素溶液、１０．１２ｇＭｇ（４２−６
Ｈ２０，ｌｏ、０ｇグルコース、２．ＯｇＬ−アスパラ
ギン、０．１ｇカザミノ酸および２２９寒天を加え、得
られた溶液を滅菌し、最後に以下の、０．０５ｇＫＨ２
Ｐ、０４／ｌｏｏｍ（ｌ脱イオン水；　２−２２９Ｃａ
ＣＬ／　ｌ　ＯＯｒｎＯ脱イオン水；および０．２５Ｍ
　ＴＥＳ　ｐＨ＝７．２からなる溶液をそれぞれ１００
ｍ１２加えることによって調製される。最終溶液のｐＨ
を７．２に調節する。微量元素溶液は、１リツトル当た
り、Ｚｎ００２４０ｍｇ、ＦｅＣα３　６Ｈ２０２００
ｍｇ、ＣｕＣＯ３２Ｈ２Ｈ２Ｏ１０、ＭｎＣＱ２−４Ｈ
２０１０ｍｇ、Ｎａ２Ｂ４ｃ）ｙｌ　０　ＨｘＯ１０ｍ
ｌ？、および（Ｎ　Ｈ、）６Ｍｏ７０２．　・４Ｈｚ０
１０ｍｇを含有する。軟−Ｒ２−寒天層は、終容量５０
０ｍ（ｌを得るのに十分な脱イオン水に、シュクロース
５１．５ｇ、ＭｇＣｌ２６ＨｚＯ５，０６ｇ、ＣａＣＬ
　ｌ　、　１１　ｇ、０．２５Ｍ　ＴＥＳ（ｐＨによっ
て穏やかに集め、Ｐ培地で２回洗浄し、Ｐ培地２罰に再
懸濁し、使用時まで氷上でインキュベートした。所望の
プラスミドＤＮＡ約１μりを１ｍｇ／ｍＱヘパリン硫酸
塩（シグマ社製）約５０μρに加え、氷上で約１０分間
インキュベートした。

Ｓ、フラジエ宿主から製造される場合、非常に少量のプ
ラスミドＤＮＡ、約５−１００ナノグラムの使用で、ス
トレプトマイセス・フラジェを形質転換することができ
る。ストレプトマイセスプラスミドＤＮＡを分離するた
めの方法は、ホップウッド等（Ｈｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ　
ａｌ、）の１９８５　、　ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ　ｔｒｅｐＬｏｍａｙｃｅｓ　
：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｊ　ｏ
ｈｎ　Ｉ　ｎｎｅｓ　Ｆ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ。

Ｎｏｒｗｉｃｈ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）に記載されている
。ＤＮＡ／ヘパリン溶液を先ず、約２００μρのプロト
プラストに加え、次いで、Ｐ培地中５５％ＰＥＧＩＯ０
０（シグマ社製）からなる溶液約０　、９　ｍＱをＤＮ
Ａ／プロトプラスト混合物に加え、得られた混合物を室
温で穏やかに混合した。混合物を、軟−Ｒ２−寒天層４
ｍＱを使用し、種々の量でＲ２ブレー−７．２）５０ｍ
Ｑおよび寒天２．０５ｇを加えることによって調製され
る。混合物を蒸気加熱して寒天を融解し、４罰量にデカ
ントし、使用前にオートクレーブ滅菌する。形質転換プ
ロトプラストを蒔いた後、プレートを２９°Ｃで２４時
間インキュベートし、次いで、ＤＭＳＯ中５０ｍｇ／＋
＋＋１２チオストレプトン（スクイブ社製（Ｅ、Ｒ，５
ｑｕｉｂｂ、Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ　　０８５４０
））２５μαを含有している軟−Ｒ２−寒天４純をプロ
トプラスト上に広げた。再生が終了するまで、通常、約
７−１４日間、プレートを２９°Ｃでインキュベートし
続け、所望のＳ、フラジエ形質転換体を選択した。

Ｂ、形質転換株におけるタイロシン産生形質転換ストレ
プトマイセス・フラジェ株を培養し、実質上、ポルッお
よび七ノ（Ｂａｌｔｚ　ａｎｄＳ　ｅｎｏ）の１９８１
、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　２０　：　２１４−２２５
に記載の方法に従い、タイロシン産生（または、Ｇ５７
７におけるｔｙ＋　Ｉ突然変異の相補性の場合、デマイ
シノシルクイロシン）を分析することによって、突然変
異遺伝子を有する株の相補性を調べた。

特に、株がプラスミドを有して培養される場合、更に２
０μｇ／ｍＱチオストレプトンを含有する発酵培地（ポ
ルツおよびセノ（Ｂａｌｔｚ　ａｎｄ　５ｅｎｏ）の１
９８１、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ＡｇｅｎＬｓ　
ａｎｄ　Ｃｈｅｍ。

ｔｈｅｒａｐｙ　２０　：　２１４−２２５）で、形質
転換株を培養した。形質転換突然変異株、ＧＳ５、Ｇ５
１４、Ｇ５５０およびＧ５７７は、低タイロシン産生で
あり、容易に検出し得ないタイロシン量を産生ずるので
、自律的複製ベクターとしてのプラスミドの維持のだめ
の選択圧（チオストレプトン）の存在下で培養された。

上記形質転換体は、組み込み体、即ち、全部または１部
分のプラスミドＩ）Ｎ　Ａが宿主細胞のゲノムに組み込
まれた形質転換体に変換することができる。組み込み体
を得るために、２つの方法が使用される。第１の方法で
は、形質転換体を選択（チオストレプトン含有）および
非選択グレーｉ・で培養し、２９°Ｃで約７日間インキ
ュベートして、増殖斑点を得る。選択プレート上でチオ
ストレプト検体が得られない場合、選択圧を維持するた
めのチオストレプトンを栄養および発酵培地（以下に記
載）の両者に使用するべきである。次いで、増殖期培養
物を使用し、同様にチオストレプトンを欠いた発酵培地
（上記性と同じ）に接種（１０％接種物）する。

タイロシン発酵培地は、ビート糖蜜（２％）、コーン・
ミール（１，５％）、フィッシュ・ミール（０゜９％）
、コーン・グルテン（０，９％）、塩化ナトリウム（０
，１％）、リン酸アンモニウム（二塩基性）（０，０４
％）、炭酸カルシウム（０，２％）および粗ダイズ油（
３％）からなる。培地のｐＨは、ｌＮＮａＯＨで７．１
に調節する。発酵は、２６　Ｏｒｐｍ。

２９°Ｃで７日間行う。発酵ブロスのマクロライド総含
有量は、メタノール／ＣＨＣＱ３で抽出し、２９０ｎｍ
における吸収を読み取り、標準曲線に比較することによ
って測定する。タイロシンの因子は、シリカゲルＴＬＣ
プレートに発酵ブロスをスポットシ、プレートを９５１
５酢酸エチル／ジエチルアミンの溶媒系で展開させるこ
とによって識別さン耐性である非選択プレート上の斑点
を、単一コロニーが、選択なしで比較的安定であること
が見いだされるまで、同様にして数回繰り返して培養す
る。組み込み体を得るための第２の方法では、綿棒を使
用し、プレートの表面からスボアを移すことによって、
形質転換体を非選択的に数回培養する。数回の培養の後
、コロニーを非選択的、液体培地（ＴＳＢ）中で増殖さ
せ、ホモジナイズし、音波処理によってフラグメント化
し、希釈し、選択および非選択培地に蒔き、比較的安定
な組み込み体を識別する。当業者には、安定な組み込み
体を得るためのその他の方法が明らかであろう。

比較的安定な組み込み体を使用し、栄養培地（複合栄養
培地は、１リツトル当たり、コーンステイープリキュー
ル１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ひき割りダイズ５ｇ、炭酸
カルシウム３ｇおよび粗ダイズ油４．５ｇを含有し、ｐ
ＨはＮａＯＨで７．８に調節される）に接種する。安定
な形質転換体が得られたら、チオストレプトンを有して
いないＴＳＢ（非選択圧）も好適な栄養培地である。安
定な形質転れる。個々のマクロライド成分の濃度は、総
Ａ２９゜ＸＨＰＬＣによって測定された各成分の百分率
である。

第７表は、本発明のプラスミドが上記の突然変異株ＧＳ
５、Ｇ５１４、Ｇ５５０およびＧ５７７にトランスフオ
ームされた時に観察されたタイロシン産生のレベルを示
す。

第７表　クローニングされたｔｙｔ遺伝子による、ｔｙ
＋突然変異の相補または修復によるタイロシンまたはデ
マイシノシルタイロシン産生の回復 Ｓ５ ｙｌＧ なし ｐＨＪＬ４０１ ｐＳＥＴ５５１ ｐＳＥＴ５５２ ｐＳＥＴ５５５ ｐＳＥＴ５５６ ＜０．０１ ＜０．０１ １．１８ ＜０．０１ ０．８６ ０．５８ 兇２祁 Ｇ５１４ Ｓ５０ Ｓ７７ ｙｌＡ ｔｙｔＢ ｔｙｔＤ、　ｔｙｌＩ なし ｐＨＪＬ４０１ ｐＳＥＴ５５１ ｐＳＥＴ５５２ ｐＳＥＴ５５５ ｐＳＥＴ５５６ なし ｐＨＪＬ４０１ ｐＳＥＴ５５１ ｐＳＥＴ５５２ ｐＳＥＴ５５５ ｐＳＥＴ５５６ なし ｐＨＪＬ４０１ ｐＳＥＴ５５１ ｐＳＥＴ５５２ ｐＳＥＴ５５５ ｐＳＥＴ５５６ ０．０１ ＜０．０１ ＜０．０１ ２．７０ ０．４８ ０．４０ ＜０．０１ ＜０．０１ ＜０．０１ １．４８ ０．５９ ０．７８ ＜０．０１ ＜０．０１ ０．７３ ０．８１ Ｎ、Ｔ、＊＊ ０．５８ ＊　　ｔｌ／ＩＤ突然変異の相補がない場合、デマイシ
ノシルクイロシン（ＤＭＴ）は、Ｇ５７７におけるｔｙ
ｔ　Ｉ突然変異の相補によって予想される最終産物であ
る（コックス等（Ｋ、Ｌ、Ｃｏｘ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｎａｔ、Ｐｒｏｄ、４９．９７１　（１９８６））
参照）＊＊Ｎ、Ｔ、−試験せず

【図面の簡単な説明】

第１図はタイロシン生合成経路を示す模式図であり、第
２図はプラスミドｐＨＪＬ４０１の制限部位および機能
地図であり、第３図はプラスミドｐＫＣ６４４の制限部
位および機能地図であり、第４図はプラスミドＩ）ＫＣ
６６８の制限部位および機能地図であり、第５図はプラ
スミドｐＳＥＴ５５１の制限部位および機能地図であり
、第６図はプラスミドｐＳＥＴ５５２の制限部位および
機能地図であり、第７図はプラスミドｐＳＥＴ５５５の
制限部位および機能地図であり、第８図はプラスミドｐ
ＳＥＴ５５６の制限部位および機能地図であり、第９図
はＳ、フラジエのタイロシン生合成遺伝子のゲノム地図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｔｙｌＡ、ｔｙｌＢ、ｔｙｌＧおよびｔｙｌＩ生合
   成遺伝子産物から選択される活性をコードしている遺伝
   子配列を含有しているＤＮＡ配列。 ２、ｔｙｌＡ遺伝子産物をコードしている遺伝子配列を
   含有している請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ３、ｔｙｌＢ遺伝子産物をコードしている遺伝子配列を
   含有している請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ４、ｔｙｌＧ遺伝子産物をコードしている遺伝子配列を
   含有している請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ５、ｔｙｌＩ遺伝子産物をコードしている遺伝子配列を
   含有している請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ６、プラスミドｐＳＥＴ５５２の〜９．８ｋｂＥｃｏＲ
   Ｉ−ＢｇｌIIフラグメント、プラスミドｐＳＥＴ５５５
   の〜８．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメント、またはプラス
   ミドｐＳＥＴ５５６の〜８．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメ
   ントを含有する請求項２に記載のＤＮＡ配列。 ７、プラスミドｐＳＥＴ５５２の〜６．２ｋｂＥｃｏＲ
   Ｉ−ＰｓｔＩフラグメントを含有する請求項２に記載の
   ＤＮＡ配列。 ８、プラスミドｐＳＥＴ５５２の〜９．８ｋｂＥｃｏＲ
   Ｉ−ＢｇｌIIフラグメント、プラスミドｐＳＥＴ５５５
   の〜８．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメント、またはプラス
   ミドｐＳＥＴ５５６の〜８．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメ
   ントを含有する請求項３に記載のＤＮＡ配列。 ９、プラスミドｐＳＥＴ５５２の〜６．２ｋｂＥｃｏＲ
   Ｉ−ＰｓｔＩフラグメントを含有する請求項３に記載の
   ＤＮＡ配列。 １０、プラスミドｐＳＥＴ５５１の〜１３ｋｂＰｓｔＩ
   フラグメント、プラスミドｐＳＥＴ５５５の〜８．６ｋ
   ｂＢａｍＨＩフラグメント、またはプラスミドｐＳＥＴ
   ５５６の〜８．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメントを含有す
   る請求項４に記載のＤＮＡ配列。 １１、プラスミドｐＳＥＴ５５１、プラスミドｐＳＥＴ
   ５５５またはプラスミドｐＳＥＴ５５６の〜４．２ｋｂ
   ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを含有する請求項
   ４に記載のＤＮＡ配列。 １２、プラスミドｐＳＥＴ５５１の〜１３ｋｂＰｓｔＩ
   フラグメント、プラスミドｐＳＥＴ５５２の〜９．８ｋ
   ｂＥｃｏＲＩ−ＢｇｌIIフラグメント、プラスミドｐＳ
   ＥＴ５５５の〜８．６ｋｂＢａｍＨＩフラグメント、ま
   たはプラスミドｐＳＥＴ５５６の〜８．６ｋｂＢａｍＨ
   Ｉフラグメントを含有する請求項５に記載のＤＮＡ配列
   。 １３、プラスミドｐＳＥＴ５５１、プラスミドｐＳＥＴ
   ５５２、プラスミドｐＳＥＴ５５５、またはプラスミド
   ｐＳＥＴ５５６の〜１．４ｋｂＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフ
   ラグメントを含有する請求項５に記載のＤＮＡ配列。 １４、ｔｙｌＡ、ｔｙｌＢ、ｔｙｌＧまたはｔｙｌＩ遺
   伝子。 １５、ｔｙｌＡ遺伝子。 １６、ｔｙｌＢ遺伝子。 １７、ｔｙｌＧ遺伝子。 １８、ｔｙｌＩ遺伝子。 １９、請求項１に記載のＤＮＡ配列を有する組換えＤＮ
   Ａベクター。 ２０、発現ベクターである請求項１９に記載の組換えＤ
   ＮＡベクター。 ２１、プラスミドである請求項１９に記載の組換えＤＮ
   Ａベクター。 ２２、プラスミドｐＳＥＴ５５１、プラスミドｐＳＥＴ
   ５５２、プラスミドｐＳＥＴ５５５およびプラスミドｐ
   ＳＥＴ５５６から選択される請求項２１に記載のプラス
   ミド。 ２３、請求項１９〜２２のいずれかに記載の組換えベク
   ターで形質転換された宿主細胞。 ２４、ストレプトマイセスである請求項２３に記載の宿
   主細胞。 ２５、ストレプトマイセス・フラジエである請求項２４
   に記載の宿主細胞。 ２６、Ｓ．フラジエＧＳ５、Ｓ．フラジエＧＳ１４、Ｓ
   ．フラジエＧＳ５０またはＳ．フラジエＧＳ７７である
   請求項２５に記載のストレプトマイセス・フラジエ。 ２７、Ｅ．コリである請求項２３に記載の宿主細胞。 ２８、Ｅ．コリＫ１２ＤＨ５α／ｐＳＥＴ５５１、Ｅ．
   コリＫ１２ＤＨ５α／ｐＳＥＴ５５２、Ｅ．コリＫ１２
   ＤＨ５α／ｐＳＥＴ５５５、Ｅ．コリＫ１２ＤＨ５α／
   ｐＳＥＴ５５６である形質転換宿主細胞。 ２９、請求項１〜１８のいずれかに記載のＤＮＡ配列に
   よってコードされている生合成遺伝子産物。 ３０、ｔｙｌＡ、ｔｙｌＢ、ｔｙｌＧまたはｔｙｌＩ生
   合成遺伝子産物。