JPH02430A - 組み換え家禽痘疹ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、伝染性上腫症（鳥禽ボックス）として一般に
知られている家禽痘痕の組換えウィルス及びワクチン又
は家禽代謝に有用な蛋白質の生産への応用に関するもの
である。

家禽ポックスウィルスが属するｐｏｘｖｉ　ｒｉｄａｅ
族のウィルスは、細胞の細胞質内で増殖し、複写に必要
な酵素的機構の大部分をコードする二本鎖のＤＮＡウィ
ルスである。

精製されたウィルス性ＤＮＡは、感染性はない。

なぜなら、ウィルス粒子に関連した酵素が、ＤＮＡの発
現及び複製を開始するのに必要であるためである。しか
しながら、ウィルス性ＤＮＡは、同じ細胞内に取り込ま
れた感染性ウィルスのＤＮＡと共に組換えに関与し得る
。この発見（サム及びダンベル、１９８１）は、ワクニ
シアウイルス由来の外来遺伝子のクローニング及び発現
のためのベクターの開発の基礎になるものである（マケ
ットら、１９８２．パニカリ及びパオレッテイ、１９８
２）。生きた組み換えワクニシアウイルスは、外来抗原
を発現することを可能にしており、それ故、種々のウィ
ルス性又は寄生虫性疾患に対する免疫法が得られる（ス
ミスら、１９８３．パニカリら、１９８３．キーニーら
、１９８４．チャクラパーティら、１９８６．ツーら、
１９８６．キニーら、１９８６）。

最近の論文にベクターとして家禽ボックスの使用が報告
さているが、（ブラウン、１９８５．ティラーら、１９
８７）、実験結果については、今のところ報告されてお
らず、家禽ポックスウィルスの分子生物学に関する詳細
な研究は、未だ行なわれていない。対照的に、種痘ウィ
ルスの生態学は、十分に研究されている（モスの総説を
参照、１９８５）。

本発明は、異種蛋白質の発現のために、ベクターとして
家禽痘痕ウィルスを使用することに関する。

更に詳細には、本発明の目的は、弱毒化つまり人工的に
非病原性とした株由来で、そのゲノムの必須でない部分
に異種蛋白質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列及
び適当な細胞内での家禽痘痕つイスルによる発現を可能
とする要素を含む組み換え家禽ポックスウィルスに関す
る。

このような見地の１つとして、本発明は、ワクチンの生
産、特に家禽を冒す疾病の少くとも１つに対して保護作
用を示すワクチンの生産に関連する。この場合、異種蛋
白質とは、異種ウィルスに対する免疫反応を誘発する蛋
白質をいう。興味ある異種ウィルスの中には、ニューカ
ッスル病ウィルス、感染性気管支炎ウィルス、マレック
病ウィルスが挙げられる。

本発明は、特に麻疹ウィルスに対するワクチンの生産の
ための家禽痘痕ウィルスの使用に関するものである。そ
れ故、本発明の対象は、麻疹ウィルスに対して免疫反応
を誘発する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む家禽痘
痕ウィルスである。

麻疹ウィルス族に属するウィルスとして、麻疹ウィルス
、カレ病ウィルス、牛皮ウィルス及び小反捌動物ペスト
（ｐｅｓｔｅ　ｄｅ　ｐｅｔｉｅｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔ
ｓ　）が挙げられる。

種々の麻疹ウィルスの研究により、麻疹ウィルスの表面
蛋白質のいくつかをコードするＤＮＡ間の配列相同性と
同様に、麻疹ウィルスの表面蛋白質とその他の麻疹ウィ
ルスの表面蛋白質間の免疫学的相関性を証明できた。こ
のような類似性は、カレ病、牛疫及び小反別動物ペスト
（ｐｅｓｔｅ　ｄｅｐｃｔｌｅｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔｓ
　）に対するワクチン接種のための麻疹ウィルス抗原の
使用を予想することを可能にする。また、同種又は異種
のワクチン接種系における麻疹ウィルスの各々から由来
する表面抗原の使用を予見することも可能である。

血球凝集蛋白質（ＨＡ）及び融合蛋白質（Ｆ）のような
表面蛋白質は特により有用である。しかしながら、核蛋
白質（ＮＰ）のような他の構造蛋白質も使用可能である
。対応するＤＮＡ配列が、麻疹ウィルスを中和する抗体
のｉｎ　ＶｉｔｒＯでの合成を誘発するのに十分なフラ
グメント（断片）又は全長蛋白質をコードすることがで
きる。

また、数種類の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ
配列の使用を予見することも可能である。

ま２こ、本発明は、例えば成長ホルモン又はＧＲＦの如
き成長ホルモン誘発因子のような物質の代謝に関与する
因子のｉｎ　ｖｉｖｏ　、家禽での生産に関る。この場
合、異種蛋白質は、上述の因子であり、家禽痘痕ウィル
スは、ｉｎ　ｖｉｖｏでのその発現に必要な要素を含ん
でいる。この生産のために、この因子をコードする遺伝
子を含む本発明の家禽痘痕ウィルスを生きたまま動物に
投与する。

最後に、本発明は、工業的又は治療上に重要な蛋白質を
、ｉｎ　ＶｉｔｒＯで細胞培養液中、特に鳥類細胞培養
液中で、及びｉｎ　ｖｉｖｏでは動物体内で生産するこ
とを可能とする。

痘痕ウィルスにより、特に家禽痘痕ウィルスにより外来
蛋白質をコードする配列の発現には、次の３段階が必要
である。

１）コードする配列は、痘疹ウィルスのプロモーターと
一直線をなし、適当な細菌プラスミドにクローン化され
た家禽ウィルスのＤＮＡの必須でない断片に挿入されな
ければならない。

２）コード配列の各側面に位置する家禽痘痕ウィルスの
ＤＮＡ配列は、受容細胞のウィルスゲノムとプラスミド
の間で同種組み換えが起こるようにさせなければならな
い。二重組み換えは、プラスミドから、増殖及び発現の
ためのウィルスゲノムへのＤＮＡインサートの移転をも
たらす。

３）組み換え家禽庖疹ゲノムに合体されたＤＮＡ配列は
、ウィルスの増殖に耐える適当な細胞で発現されなけれ
ばならない。

上述したように、外来ＤＮＡの挿入は、家禽庖疹ウィル
スゲノムの必須でない部分、つまり、その複製を妨げな
い部分で行わなければならない。組み換えワクシニアウ
ィルスにおけるように、ＴＫ遺伝子への外来遺伝子の導
入が予想されていたかもしれない。しかしながら、出発
株は弱毒化法であるため、複製に有用な機能の減損が非
常に大きな不利益となり、免疫原力が減少し、そのため
組み換えウィルスによって発現される外来抗原の効力を
低下させる虞れがある。

このため、本発明では、外来ＤＮＡ配列は、家禽痘痕ウ
ィルスの非コード遺伝子間領域に導入される。この遺伝
子間領域は、ドリリエンら（１９８７）によると、ゲノ
ムの１．　３Ｋｂｐ（キロ塩基対）　Ｈｉｎｄ　ｍ断片
のＯＲＦ７及び９の間に好ましく位置している。

また、本発明は、本発明の組み換えウィルスにより感染
され、その複製を可能にする真核細胞培養物にも関する
。予想され得る細胞のうちでも、鳥類細胞が特に挙げら
れる。

また、本発明は、生きているウィルスか又は不活性化ウ
ィルスの型で、これ等の組み換えウィルスから得られる
ワクチンに係る。この様なワクチン類の生産方法は、技
術的に詳細に知られているので、ここでは述べない。

また、本発明は、その投与によって、ウィルスの増殖の
間に家禽の代謝に有用な因子をｉｎ　ｖｉｖ。

で産生させる生きた組み換えウィルスに関する。

最後に、本発明は、各側面にＯＲＦ７の３′末端及びＯ
ＲＦ９の５′末端が付加し、痘痕ウィルスプロモーター
の制御の下にあり、家禽痘痕ウィルスに異種である少く
とも１つの遺伝子を含むＤＮＡ配列及びこれ等のＤＮＡ
配列を運搬するプラスミドにも関する。

このようなプラスミドは、特に、本発明により組み換え
ウィルスを得る過程で有用である。この場合、コンピテ
ントな細胞の培養液は、発明によるプラスミドのＤＮＡ
を用いてトランスフエクシ、ラン（形質転換）され、上
述の培養液は、必要ならば選択要素を含む家禽痘痕ウィ
ルスで予め感染させられている。

本発明の特徴及び利点は、以下の詳細な説明がら明らか
となろう。

実施例１　家禽痘痕ウィルスの温度感受性（ｔ　ｓ）変
異株の選択及び特徴付は 家禽天然痘又は家禽庖疹のウィルスのワクチン用法とし
て、例えばソールズベリー研究所で生産されたワクチン
（商標“Ｐｏｘｉｎｅ”ソールズベリー研究所、フラン
ス）が用いられた。

ウィルスの増殖は、３つの温度で測定された。

６日後の力価 ３３°Ｃ４，ｌＸｌ０５ｐｆｕ　／ｍｃ３７°Ｃ４，ｌ
Ｘｌ０５ｐｆｕ　／ｍｆ２３９．５℃　４．２ｘ１０５
ｐｆｕ　／ｍｌ非変異ウィルスは、３つの温度での全て
の場合に効率的に増殖した。

クローンされ、３９．５℃で増殖させたウィルスの１ス
トツクを１０又は２０μｇ／誦のニトロソグアニジンで
処理する。この変異処理後、ウィルスを、ひよこ胚線維
芽細胞培養液に、プラークが十分に分離できるような濃
度に希釈して接種した。培養液は、３３℃（許容温度）
で６〜７日間インキュベートされ、中性赤で染色し、ウ
ィルスのプラークを見えるようにした。

次いで、培養液を３９．５°Ｃ（制限温度）で２日間イ
ンキュベートした。大きさが変らないプラークを、温度
感受性であるとみなす。数個のプラークのウィルスを移
植し、３３℃で増殖させ、ｔｓ性（温度感受性）を確認
するために、３３°Ｃと３９．５℃で再び力価測定した
。次の表に、２つの温度で得られた力価を示す。

力価測定温度　　　３３℃　　　　３９．５℃コントロ
ール家禽　Ｉ　Ｘｌ０５１　Ｘｌ０５ｐｆｕ　／ｎ［庖
疹ウィルス 変異株ｔｓｌ　　　　２Ｘ１０５　　　＜１０変異株ｔ
ｓｌｌ　　　２ＸＬ０５　　　＜１０変異株ｔｓ２４　
　２ＸｌＯ５＜１０ 実施例２　温度感受性ウィルスと非変異ウィルスの精製
ＤＮＡとの間の組み換えの条件 の改善 制限条件下では、ｔｓ変異株（温度感受性株）は、もは
や増殖しない。

痘疹ウィルス族のウィルスの精製ＤＮＡは、感染性では
ない。

もし、ｔｓウィルスと精製ＤＮＡとを同一細胞に導入す
ることにより、ウィルスの増殖が活発になるならば、そ
れは、２個のゲノム間の相補性又はｉｎ　ｖｉｖｏ組み
換えに起因する。

ひよこ胚線維芽細胞の培養芝を、温度感受性ウィルスで
感染させる（４Ｘ１０’　ｐｆｕ　／１０６細胞）。１
時間吸着させた後、培養液に新鮮培地を補充し、許容温
度（３３−３７°Ｃ）で２時間インキュベートした。

次いで、培地を除き、非変異ウィルスの精製ＤＮＡは、
リン酸カルシウム沈殿物として吸着されている（４個の
培養皿に対し、５μｌの緩衝液中にＤＮＡ１８ｇ）。

１時間の吸着後、培養液に新鮮培地を補充後、非許容温
度（３９，５℃）で２時間インキュベートした。その後
、グリセロール（１０％）ショックを与えた。

各培養液を再び３９．５℃で５日間インキユベートシた
。

ウィルスのプラークを、培養皿の半分については、操作
を行なったものを直接計数し、残りの半分は増幅後（つ
まり、−回目の培養皿を冷凍後、２回目の増殖を行なっ
た後）計数した。

ウィルスプラークの数 増殖操作なし　　　　増殖後 ＤＮＡ　　＋ＤＮＡ　　ＤＮＡ　　＋ＤＮＡなし　　　
　　　　なし ｔｓｌ　　０　　　　１５　　１０　　３ＸＬＯ’ｔｓ
ｌＬ　　０　　　　　２　　１０　　１ＸＩＯ’ｔｓ２
４　０　　　　　３　　１０　　１ＸＩＯ’実験は、家
禽庖疹ウィルス野生株の精製ＤＮＡは、ｔｓ変異株（温
度感受性株）によって再活性化され、感染性子孫を生じ
させることを示している。

ｔｓｌ変異株は、次の実験に用いられた。

実施例３　非相同ＤＮＡを家禽ポックスウィルスに転移
するためのベクターの構築 外来ＤＮＡ配列をウィルスのゲノムに転移させるために
、この配列をウィルスの正常配列の真中に合体させ、二
重相同組み換えを起こさせなければならない。外来ＤＮ
Ａは、ウィルスの増殖を妨げないように、ウィルスの非
必須領域に挿入されなければならない。

家禽庖疹ウィルスの非コード遺伝子間領域に、外来ＤＮ
Ａを挿入するのを促進するために、ベクターを組み立て
た。

ａ）家禽痘痕のＤＮＡ断片の細菌プラスミドへの挿入：
ｐＴＧ１１７０の構築。

種痘ウィルスのＤＮＡと実質的相同性を有している家禽
痘痕のＤＮＡ断片は、ドリリエンら（１９８７）により
述べられている。

この断片（種痘ウィルスのＨｉｎｄＩＩｒｊ断片と相同
性あり）は、５個の開かれた読みわ＜　　（ＯＲＦ）配
列を有しており、Ｆ８遺伝子がなく、これが３２塩基対
の遺伝子間の非コード領域により入れ替えられていると
いう点で、種痘ウィルスと異なる。

ミｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｒｏｖｌｐｏ。

この遺伝子間領域は、外来ＤＮＡの挿入部位として選ば
れた。

この領域を取り巻く大きなりＮＡ断片は、組み換えと合
体が家禽庖疹ウィルスゲノム中で行なわれることを可能
とする相同配列として使用するために回収された。この
断片は、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化した後に得られ
た。ＥｃｏＲＩ部位は、ＯＲＦ６の上流に位置しており
、ＰｓｔＴは、ＯＲＦ９に位置している（上図参照）。

ＥｃｏＲｒ　−ＰｓｔＩ断片は、Ｍ１３ＴＧ１３１ベク
ター（キーニら、１９８３）中に合体され、−Ｍ１３７
０１８８を得る。

外来ＤＮＡの挿入を可能にする制限酵素を認識する部位
を導入するために、Ｍ１３への導入は、局在変異誘発を
行なわせる。

次のような合成オリゴヌクレオチドを用いて、３２塩基
対の遺伝子間領域に、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ及びＥ　ｃ
ｏ　Ｉの３つの部位が作られた。

５′丁ＴＡＡＡＡＡＧＧ＾＾ＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧ
Ａ丁ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＴ　
　３’合成挿入物を運ぶ構造体をＭ１３７Ｇ１９５と命
名する。制限部位の存在は、対応する酵素で確かめられ
た。

変異家禽痘痕ＤＮＡ配列は、ＢｇｌＩｒ−ＰｓｔＩ断片
の形態で（ＢｇｌＩＩ部位は、ＯＲＦ６の始めにある。

ドリリエンら、１９８７）でＭ１３７Ｇ１９５から回収
され、いくつかの制限部位を含む合成アダプターを含む
ｐＭＬ２由来クローニングベクター、即ちポリｎ　（Ｐ
ＯＬＹＩｒ）とラテら（１９乏３７）によっての述べら
れたベクターに導入される。

家禽痘痕のＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩを、ＢａｍＨＩとＰｓ
ｔＩで開いたポリ■ベクターに挿入するとｐＴＧ１１７
０プラスミドが得られる。このプラスミドを図１に示し
た。

ｂ）ｐＴＧｌ　１７０ベクターへの庖疹ウィルスプロモ
ーターの挿入。

庖疹ウィルスによる外来遺伝子の発現を得るには、この
遺伝子を庖疹ウィルスプロモーターの制御下におく必要
がある。

まず、ワクニシアウイルスの十分に性質が明がとなった
プロモーター　７．５に蛋白質遺伝子のプロモーターで
、短＜　ｒ７．５にプロモーター」と命名されているも
のを用いた。種痘ウィルスの７．５にプロモーターは、
キーニーら（１９８４）が報告したＭ１３ＴＧ７．５に
ベクターから、Ｓａｌ　ｒ　−ＥｃｏＲＩ断片の形態で
回収され、ｐＴＧ１１７０ベクターに導入された。

このプロモーター配列は、ｐＴＧ１１７０の合成アダプ
ターのＸｈｏＩ　−ＥｃｏＲＩ部位間に導入された（図
１参照）。

その結果得られた構造体ｐＴＧ１１７１は、家禽痘痕の
ＯＲＦ６−７とＯＲＦ９の間に挿入された７、５にプロ
モーターを有し、そのすぐ下流にはＢａｍＨＩ部位（ｐ
７．５に配列により供給される）とＥｃｏＲＩ部位とが
ある。

実施例４　　ｐＴＧ１１７１ベクターへの外来遺伝子の
挿入 ベクター及び家禽痘痕つィルス組み換え体の選択系の有
用性を実証するために、モデル遺伝子として大腸菌のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた。この遺伝子が選ば
れたのは、Ｘ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄガラクトピラノシド）を加えると、
β−ガラクトシダーゼの作用下で青色に着色することに
よって容易に検出される発現型を有するからである。

大腸菌のβ−カラクシダーゼをコードするＩａｃＺ遺伝
子は、例えばｐｃＨ１１０プラスミド（ホールら、１９
８３）から回収される。Ｉａｃ　Ｚ遺伝子は、ＢａｍＨ
ＩとＨｉｎｄ■により切り取られ、ポリ■クローニング
ベクターに挿入され（上述）、ＢｇｌＩＩ　−ＢａｍＨ
Ｉ断片の形で取り上げられ、ＢａｍＨＩで開裂され、フ
ォスファクターゼで処理されたｐＴＧ１１７１に挿入さ
れる。

７．５にプロモーターの下流にＩａｃ　ｚ遺伝子を保持
する構造体をｐＴＧ１１７７と命名する。

実施例５　組み換え家禽痘痕ウィルスによる外来遺伝子
の発現 ｐＴＧ１１７７プラスミドのＤＮＡ　（１００ｎｇ／１
０６細胞）を、実施例２に述べた手順に従って、家禽痘
痕ウィルスｔｓｌ　（温度感受性株）で予め感染させた
ひよこ胚芽細胞にトランスフェクトさせた。

３９．５℃で５日間インキュベートした後、組み換えウ
ィルスを、細胞の冷凍溶解後集めた。

ウィルスは、寒天培地で、ひよこ胚線維芽細胞で力価測
定した。５日後、ウィルスプラークは、Ｘ−Ｇａ１　（
３０ｍｇ／ＩＴＩｅを含有し、ＰＢＳ培地中で１００倍
希釈された溶液＋１％アガロース）で肉眼観測された。

ウィルスプラークは、青色に染まり、機能を有するβ−
ガラクトシダーゼの存在を示した。

実施例６　非相同のＤＮＡを家禽痘痕ウィルスに転移さ
せるためのもう１つのベクター の構築 ａ）家禽痘痕ウィルスに異種ＤＮＡを転移させることが
できる別のベクターは、ＯＲＦのＦ７とＦ９の間により
大きな遺伝子間領域を保持しておくことにより構築され
る。この目的を達成するために、次のような合成オリゴ
ヌクレオチドを用いてＭ１３ＴＧ１８８ファージ（実施
例３で述べた）で最初の局在化変異が行なわれた。

５’　ＡＡＣＡＡＣＣＴＡＡＴＡＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
ＡＴＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴ　３’これに
より、Ｍ１３７Ｇ２１２３ファージが得られ、ＯＲＦ　
　Ｆ７部分の３′　−コード部分にＢａｍＨＩ部位を導
入したことになる。２回目の変異は、次のオリゴヌクレ
オチドを用いＭ１３ＴＧ２１２３ファージで行なわれた
。

５’　　ＣＣＴＡＡＴＡＴＣＡＣ工ＡＣＴＧＡＡＧＣＧ
ＣＡＡＣＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＴＡＡその結果得ら
れたＭ１３ＴＧ２１２５ファージでは、ＯＲＦ　　Ｆ７
とＯＲＦ　　Ｆ９の間の遺伝子間距離が約１５個のヌク
レオチド分だけが広がり、ＯＲＦ　　Ｆ７の３′側にあ
るコドンは、同じアミノ酸をコードする等価のコドンに
置き代る。

変異した家禽庖疹ＤＮＡ配列は、Ｂａ１ＩＩ−Ｐｓｔ■
断片の形でＭ１３ＴＧ２１２５から回収され、実施例３
と同様に、ポリ■ベクターに導入され、ｐＴＧ２１３４
プラスミドを形成する。

Ｉ ｂ）ｐＴＧ２１３４ベクターへの庖疹ウィルスプロモー
ターの挿入。

Ｍ１３７Ｇ２１１９　（実施例３でのべたＭ１３ＴＧ７
．５ｋから誘導された）ベクターのＢａｌｌＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片の形で回収された種痘ウィルスの７．５に蛋白
質遺伝子のプロモーターを、ＰＴＧ２１３４プラスミド
のＢａｍＨＩ部位に挿入した。

これにより２個のベクター、ｐＴＧ２１３５とｐＴＧ２
１３６が生じ、これらは、プロモーターの方向性がお互
いに異っていた。ｐＴ０２１３５プラスミドでは、プロ
モーターは、ＯＥＦ　　Ｆ７とＦ９と同方向性を有して
いるが、ｐＴＧ２１３６プラスミドは、逆方向である。

実施例７　ベクターｐＴＧ２１３５及びｐＴＧ２１３６
への外来遺伝子の挿入 実施例４と同様、ＢａｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形でβ
−ガラクタシダーゼ遺伝子を、予めＢｓａｍＨＩで開裂
し、フォスファクターゼで処理したベクターｐＴＧ２１
３５とｐＴＧ２１３６に挿入した。

このような操作により、ｐＴＧ２１３７ベクター（この
中でβ−カラクトシダーゼ遺伝子はＯＲＦのＦ７とＦ９
の遺伝子と同方向を向いている）及びｐＴＧ２１３８ベ
クター（この中ではβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の方向
は、上記とは逆である）を得た。

ｐＴＧ２１３７のＤＮＡを実施例５と同様に、家禽庖疹
ウィルスｔｓｌで感染させたひよこ胚芽細胞にトランス
フェクトした。

組み換えウィルスのプラークが、５日後に観察され、Ｘ
−Ｇａ１添加で青色に染った。

実施例８　β−ガラクトシダーゼ遺伝子とは異なる外来
遺伝子の家禽庖疹ゲノムへの挿 入及び組み換え家禽庖疹ウィルスで感 染させた細胞での発現 八　組み換えウィルスの構築 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を家禽庖疹ゲノム内に転移
させ、染色物質（Ｘ−Ｇａｌ）の存在下に家禽痘疹プラ
ークの青色により組み換えウィルスを認識させるベクタ
ー（ｐＴ０２１３７）の構築は、主特許の中で述べられ
ている。更に、家禽庖疹ゲノムが、新しい容易に検出で
きる表現型をウィルスに転移することなしに、このゲノ
ムに第２の遺伝子を合体させるために選択することがで
きる。このことは、麻疹ウィルスのＦ蛋白質をコードす
る遺伝子の場合について説明される。

各段階は次のようである。

まず、β−ガラクトシダーゼとは無関係に第２の遺伝子
の転写を準備するために、２つめのｐ７．５プロモータ
ーをｐＴＧ２１３７に添えた。

ｐ７．５プロモーターは、前述したようにＭ１３７Ｇ２
１１９ファージから切り取られたＢｇｌＩＩ〜ＢａｍＨ
Ｉ断片の形で得られる。ｐ７．５プロモーターは、ｐＴ
Ｇ２１３７ベクターのＢａｍＨＩ部位のＢ−ｇａｌ遺伝
子から下流に結合した。この場合、最初のｐ７．５プロ
モーターと同方向に結合するとｐＴＧ２１４９プラスミ
ドが得られ、逆方向だとｐＴＧ２１５０プラスミドが得
られる。

麻疹ウィルスのＦ遺伝子をコードするｃＤＮＡを、２つ
のベクターｐＴＧ２１４９とｐＴＧ２１５（１３）に、
新しいｐ７．５プロモーターから下流側に挿入した。ま
ず、Ｆ蛋白質のＮ−末端部分をコードするｃＤＮＡは、
酵素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩを用いてｐＴＧ１１７２を
切断して切り取られ、得らレタ断片は、ｐＴＧ２１４９
又ハｐ、　Ｔ　Ｇ　２１５０のＢａｍＨＩ部位に挿入さ
れた。ｐ７．５プロモーターに対しＦ遺伝子の転写の正
方向に挿入し、各々ＰＴＧ２１９２とｐＴＧ２１９３プ
ラスミドを得た。

Ｆ遺伝子のＣ−末端部分をコードするｃ　ＤＮＡを、Ｂ
ａｍＨＪ酵素で切断して、ｐＴＧ１１７３から分離し、
断片は、正常無傷Ｆ遺伝子を再形成するために、同じ酵
素で予め切ったｐＴＧ２１９２に加えられた。Ｉ）ＴＧ
１１７ＢプラスミドのＦ遺伝子のＣ−末端部分は、Ｍ１
３７Ｇ２１４Ｂファージの中で削られていたｐｏｌｙ（
Ａ）領域を含んでいる。Ｍ１３ＴＧ２１４３は、Ｂａｍ
ＨＩで切られたｐＴＧ２１９３プラスミドに添加された
ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形で、Ｆ遺伝子のＣ−末
端部分を供給した。上述のライゲーション中に形成され
たプラスミドは、ｐＴＧ３１１３と命名された。

従って、ｐＴＧ２１９５とｐＴＧ３１１３プラスミドは
、各々ｐ７．５プロモーターの制御下に麻疹ウィルスの
完全Ｆ遺伝子を含む。Ｆ遺伝子は、β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子（ｐＴＧ２１９５）の発現を支配する最初のｐ
７．５プロモーターと同方向又は逆方向に向いている。

組み換えプラスミドを生成するために行なわれたクロー
ニングの組み合わせは、図３にまとめた。

組み換えプラスミドｐＴＧ２１９５とｐＴＧ３１１３は
、実施例２と５で述べた技術に従って、家禽庖疹ウィル
スゲノムにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子及びＦ蛋白質遺
伝子を転移するために用いられた。

ＦＰＶ２１９５及びＦＰＶ３１１３と命名された組み換
え家禽庖疹ウィルスのプラークは、Ｘ−ｇａｌの存在下
、青色となって同定される。プラーク中に存在するウィ
ルスを取り上げ、ひよこ胚芽細胞への感染により増殖さ
せ、再び培養皿に接種した。青色プラークが同定され、
上述の操作を繰り返した。

このような連続的クローニング技術により、最初は混り
合っていた非組み換えウィルスから解放されたＦＰＶ３
１１３ウィルスが、安定したβ−ガラクトシダーゼ表現
型を有することが示された。

これと対照的に、ＦＰＶ２１９５ウィルスは、同じ連続
クローニング操作を繰り返し行っても、不安定であった
。即ち、分離された青色プラークは、β−ガラクトシダ
ーゼをコードできない無色プラークを約２％与えた。そ
れ故、初期に分離されたＦＰＶ２１９５ウィルスは、Ｆ
蛋白質をコードする遺伝子を保有しているのに、β−ｇ
ａｌ遺伝子を分離する傾向がある。その結果、得られた
ウィルスは、ＦＰＶ２１９５　　β−ｇａドと命名され
た。β−ｇａ＋遺伝子の喪失は、恐らく、β−＋；ａｔ
遺伝子に関し、直接的繰り返しで配列された２個のｐ７
，５プロモーターの間での分子間又は分子内組み換え現
象に伴って起こるのであろう。

この方法は、まず物理的にその遺伝子と結合するβ−ｇ
ａｌマーカーによって選ばれた遺伝子（この場合、Ｆ遺
伝子）の合体のための一次的選択、次いでウィルスの自
然の組み換え機構によるマーカーの除去、及び最後に別
の遺伝子の挿入又は、ゲノムの別の領域に同じ遺伝子の
挿入のためにマーカーの再利用を可能にする利点を有す
る。

Ｂ　　Ｆ　Ｐ　Ｖ　２１９５β−ｇａｌ　−及びＦＰＶ
３１１３で感染させた細胞でのＦ蛋白質の発現ひよこ胚
芽細胞をＦＰＶ３１１３、ＦＰＶ２１９５β−ｇａｌ　
−又は野生型ＦＰＶにより約１ｐｆｕ／細胞で感染させ
た。４０時間の感染後、細胞を［３５３］メチオニンで
４時間ラベルし、免疫沈降緩衝液を用いて溶菌した。組
み換え体で感染させた細胞の溶解産物中に存在するＦ蛋
白質は、セファロースに結合したスタフィロコッカス、
アウレウス蛋白質Ａの存在下に、麻疹ウィルスの全ての
蛋白質に対するモルモットポリクローナル血清で免疫沈
降させた。免疫沈降させた蛋白質は、ＳＤＳ存在下にポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。乾燥させた
ゲルは、オートラジオグラフィーにかけた。組み換えＦ
ＰＶ３１１３に対して示された結果（図４）は、分解産
物Ｆ１及びＦ２ばかりでなく、Ｆ遺伝子（Ｆｏ）に対応
するｍＲＮＡの一次翻訳産物の存在を示している。

参考資料 ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、　Ｔ、　Ｄ、　Ｋ、　　５ｐ
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アール、シー、　　（Ｇａｌｌｏ、ＲｌＣ，）及びモス
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ル、　　（Ｄｒｌｌｌｉｅｎ、Ｒ，）　、スペーナー、
デイ−、（Ｓｐｅｈｎｅｒ、Ｄ、）、　ケイレヴアル、
デイ−、（Ｖｉｌｌｅｖａｌ、Ｄ、）、及びルコツク、
ジエイ、ピ（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　、ケイロロジ
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ニス、ジー、　（Ｋｏｓｏｗｓｋｉ、Ｓ、Ｇ、）及びダ
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ジエイ、エム、　　（Ｄａｂｒｙｍｐｌｅ、Ｊ、Ｍ、）
、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　　３２０，５３７−５
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アール、　　（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）及びルコツク、ジエ
イ、ピー（Ｌｅｃｏｃｑ　、　Ｊ　、　Ｐ　、　）ジー
ン（Ｇｅｎｅ）、２６．９１−９９　（１９８３）キー
ニー　エム、ビー、　　（Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、）、　
ラテ。

アール、　　（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）、　　ドリリアン、
アール。

（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、Ｒ，）　、スペーナー、デイ−、
（Ｓｐｅｈｎｅｒ。

Ｄ、）、スコリー、ニス、　　（Ｓｋｏｒｙ、Ｓ）　、
　　シュミット。

デイ（Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｄ、）、　ケイクター、ティ（
１（ｉｋｔｏｒ。

Ｔ、）、コブロウスキ、エイチ、　　（Ｋｏｐｒｏｗｓ
ｋｉ、Ｈ）及びルコック、ジエイ、ピー、　　（Ｌｅｃ
ｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）
　　３１２，１６３−１６６　（１９８４）キーニー、
エム、ビー、　（Ｋｉｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、）、ラウドマン
、ジー、　　（Ｒａｕｔｍａｎｎ、Ｇ、）　、　　シュ
ミット　デイ（Ｓｃｈｍｉｔｔ、Ｄ、）、　　ドツト、
ケイ（Ｄｏｔｔ、に、）　、　　ウエインーホプソン、
ニス、　　（Ｗｅｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、）、　　ア
リシン、エム、　　（ＡＩｉｚｏｎ、Ｍ、）　、　　ジ
ラール、エム。

（Ｇｉｒａｒｄ、Ｍ、）　、　　シャマレ、ニス（Ｃｈ
ａｍａｒｅｔ、Ｓ、）　。

ローシン、　工＋、　　（Ｌａｕｒｅｎｔ、Ａ、）、モ
ンタニエ、エル、　（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、）及
びルコツク、ジエイ、ピ（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ、Ｐ、）　
、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
　４，７９０−７９５　（１９８Ｂ）ラテ、アール、　
（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）、　　ケイロツテ、ジエイ、エル
、　（Ｖｉｌｌｏｔｔｅ、Ｊ、Ｌ、）及びクラーク、エ
イ。

ジェイ、　（Ｃ１ａｒｋ、Ａ、Ｊ、）、　　ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、印刷中マケット、エム、　　（Ｍａｃｋｅｔ
ｔ、Ｍ、）、スミス、ジェル、　　（Ｓｍｉｔｈ、Ｃ，
Ｌ、）及びモス、ビー、　　（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）　。

プロシーデインゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ
−オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイ
ツ　オブ　アメリカ　（ＰＮＡＳ　ＬＩＳＡ）。

７９．７４１５−７４１９（１９８２）モス、ビー、　
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ｇｙ）Ｊ　　（編集ビー、エヌ、フイ−ルズ（Ｂ、Ｎ、
Ｆｉｅｌｄｓ））　レイヴエン　プレス、−：ｘ−ヨー
ク（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　（
１９８５）パニカリ、デイ、　（Ｐａｎｉｃａｌｉ、Ｄ
、）　、デイヴイス。

ニス、ダブリュ、　　（Ｄａｖｉｓ、Ｓ、Ｗ、）、　　
ワインバーブ。

アール、エル、（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ，Ｌ、）　、パ
オレツテイ。

イー、　　（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、Ｅ、）　、プロシーデ
インゲス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サ
イエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイツ　オブア
メリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ
、　ＵＳＡ　）　。

８０．５３６４−５３６８　（１９８３）サム、シー、
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ケイ、アール、　（Ｄｕｍｂｅｌｌ、に、Ｒ，）、アナ
ルドゥー　ケイロロジイ（Ａｎｎ、Ｖｉｒｏｌ　、）　
（アンスティトウー　バストウール（Ｉｎｓｔ、Ｐａ５
ｔｅｕｒ））　１３２．１３５−スミス、ジー、エル、
　　（Ｓｍｉｔｈ、Ｇ、Ｌ、）、マケット。

エム、　　（Ｍａｋｅｔｔ、Ｍ、）　、モス、ケイ、　
　（Ｍｏｓｓ、Ｖ、）　。

ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、　３０２．４９０−４９
５　（１９８３）ティラー、ジエイ、　　（Ｔａｙｌｏ
ｒ、Ｊ、）　、　　ワインバーグ、アール、　　（Ｖｅ
ｉｎｂｅｒｇ、Ｒ，）　、　デスメトル、ビー（Ｄｅｓ
ｍｅｔｔｒｅ、Ｐ、）、パオレティ、イー、　　（Ｐａ
ｏｌｅｔｔｉ。

Ｅ、）「モダーン　アプローチイズ　トウニュー　ヴア
クシンズ　インクリューディングプリヴエンション　オ
ブ　エイズ（Ｍｏｄｅｒｎａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ
　ｎｅｗ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｒ
ｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＩＤＳ）　Ｊコールド　ス
プリングハーバ−１−ニーヨーク（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　　学会抄録　１２０頁（９月９日
−１３日、１９８７）

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明実施例で得られた結果を示すものである
。 図１：ｐＴＧ１１７１を得るために、ポリリンカーに導
入された７、５ｋｄプロモーターを有するインサート及
びプラスミドｐｔｇｌ１７０を図示する。 図２：β−ガラクトシダーゼを発現する組み換え家禽麻
疹ウィルスのプラークを示すひよこフィブロブラスト（
線維芽細胞）の培養皿の写真である。Ｘ−Ｇａ１の存在
下、青色に見えるのが当プラークである。 図３＝麻疹ウィルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子を家
禽麻疹ウィルスのゲノムに移転させる２個のベクターの
構築。 家禽麻疹ウィルスのゲノムのＤＮＡ配列は、Ｆ６−Ｆ７
又はＦ９を含む読みわくに従って表示された円の二重線
の弧で示される。円の一本線の弧は、細菌ベクターｐポ
リ■を示す。 ｐ７．５プロモーターは、転写の方向を示す太い矢印で
図式的に示されている。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ
及び麻疹ウィルスの蛋白質をコードする遺伝子は、夫々
１ａｃＺ及びＦ麻疹と名付けられ、正常な読み方向は、
各遺伝子の下流に位置するｐ７，５プロモーターと同じ
である。ＢＯと命名された部位は、ＢｇｌＩＩ部位とＢ
ａｍＨＩ部位の間の結紮点に相当する。 図４：ＦＰＶ３１１３ウィルスで感染させた細胞での麻
疹ウィルスのＦ蛋白質の合成の証明。 家禽庖疹の野生株（Ｔと記号化された列）又はＦＰＶ３
１１３の組み換え株のうちの３個の単離Ｋ　（１，２，
３と記した列）で感染させたひよこ細胞の蛋白質を、モ
ルモット抗麻疹血清で免疫沈降させ、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分析した。乾燥ゲルの放射能写真（オ
ートラジオグラフィー）を示した。Ｆ蛋白質（Ｆｏ、Ｆ
＋　、Ｆ２）の異なった型を矢印で示した。 （以　上） ＼−ノ ＦＩＧ−２ ＦＰＶ　ＦＰＶ　Ｍ３ ｆ　１２３ ＦＩＧ−４ 手続補正書 事件の表示 昭和６３年特許願第２７２８６４号 発明の名称 組み換え家禽庖疹ウィルス 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 トランスジーン　ソシエテ　アノニム

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）家禽痘痕ウィルスの弱毒株由来の組み換え家禽痘
   痕ウィルスであって、そのゲノムの非必須部分に、家禽
   痘痕ウルイスにとって異種である蛋白質の全部又は一部
   をコードするＤＮＡ配列及び上述組み換えウィルスで感
   染された細胞でのこの蛋白質の発現を可能とする要素を
   含む組み換え家禽痘痕ウィルス。 （２）ＤＮＡ配列が家禽痘痕ウィルスの非コード遺伝子
   間領域にクローンされている請求項（１）に記載の家禽
   痘痕ウィルス。 （３）非コード遺伝子間領域が、ウィルスＤＮＡの１．
   ３キロ塩基対ＨｉｎｄIII断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９と
   の間に位置する領域である請求項（２）に記載の家禽痘
   痕ウィルス。 （４）組み換えウィルスが、家禽痘痕ウィルスのワクチ
   ン株から由来したものである請求項（１）〜（３）のい
   ずれかに記載の家禽痘痕ウィルス。 （５）組み換えウィルスが、家禽痘痕ウィルスの温度感
   受性株から由来したものである請求項（４）に記載の家
   禽痘痕ウィルス。 （６）組み換えウィルスで感染させた細胞の中で発現さ
   れる選択マーカーをコードする遺伝子を含む請求項（２
   ）〜（５）のいずれかに記載の家禽痘痕ウィルス。 （７）ＤＮＡ配列が、異種ウィルスに対する免疫反応を
   誘発させる蛋白質をコードする請求項（１）〜（６）の
   いずれかに記載の家禽痘痕ウィルス。 （８）異種ウィルスが、ニューカッスル病ウィルス、感
   染気管支炎ウィルス及びマレック病ウィルスの中から選
   ばれる請求項（７）に記載の家禽痘痕ウィルス。 （９）ＤＮＡ配列が、麻疹ウィルスに対する免疫反応を
   誘発する蛋白質をコードする請求項（１）〜（７）のい
   ずれかに記載の家禽痘痕ウィルス。 （１０）麻疹ウィルスが、はしかウィルス、カレ病ウィ
   ルス、牛疫ウィルス及び小反芻動物ペスト（ｐｅｓｔ　
   ｄｅｓ　ｐｅｔｉｔｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔｓ）から選ば
   れる請求項（９）に記載の家禽痘痕ウィルス。 （１１）ＤＮＡ配列が、はしかウィルスの少くとも１つ
   の構造蛋白質の全部又は一部をコードする請求項（１０
   ）に記載の家禽痘痕ウィルス。 （１２）ＤＮＡ配列が、家禽の代謝に関与する因子をコ
   ードする請求項（１）〜（７）のいずれかに記載の家禽
   痘痕ウィルス。 （１３）家禽痘痕ウィルスにとって異種である少くとも
   １個の遺伝子を含むＤＮＡ配列であり、痘痕ウィルスプ
   ロモーターの制御下に、各末端をＯＲＦ７の３′末端及
   びＯＲＦ９の５′の末端により保護されたＤＮＡ配列。 （１４）そのプロモーターが、種痘ウィルスの７．５に
   蛋白質プロモーターである請求項（１３）に記載の配列
   。 （１５）請求項（１３）又は（１４）に記載のＤＮＡ配
   列を含むプラスミド。 （１６）請求項（１）〜（１２）のいずれかに記載の組
   み換えウィルスを得る方法であって、コンピタントな細
   胞の培地を請求項（１５）に記載のプラスミドのＤＮＡ
   でトランスフェクトし、上述の培地は、予め家禽痘痕ウ
   ィルスで感染させてある方法。 （１７）請求項（１）〜（１２）のいずれかに記載の組
   み換え家禽痘痕ウィルスで感染させた真核細胞培養物。 （１８）細胞が、鳥類の細胞である請求項（１７）に記
   載の細胞培養物。 （１９）請求項（１）〜（１２）のいずれかに記載の家
   禽痘痕ウィルスを含むワクチン。（２０）請求項（１７
   ）又は（１８）に記載の細胞培養液中での複製により得
   られる家禽痘痕ウィルスを含むワクチン。 （２１）請求項（１９）又は（２０）に記載されたワク
   チンであって、その中の家禽痘痕ウィルスが生きている
   ワクチン。 （２２）請求項（１９）又は（２０）に記載されたワク
   チンであって、その中の家禽痘痕ウィルスは不活性化さ
   れているワクチン。 （２３）請求項（１）〜（１２）のいずれかに記載の家
   禽痘痕ウィルスに対して産生された抗体を含む抗血清。 （２４）請求項（１２）に記載された生きた家禽痘痕ウ
   ィルスを家禽に投与し、家禽の代謝に関与する因子をｉ
   ｎ　ｖｉｖｏで生産する方法。 （２５）請求項（１７）又は（１８）に記載された様に
   真核細胞を培養し、そこで得られた蛋白質を回収する、
   工業的又は治療上で重要な蛋白質を生産する方法。