JPH02186995A - 発酵法によるｌ‐アルギニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 Ｌ−アルギニンは肝機能促進薬、アミノ酸輸液及び総合
アミノ酸製剤等の重要な成分である。本発明はこのＬ−
アルギニンを発酵法で製造する方法を改良するものであ
る。

〔従来技術〕

ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム属の微生
物がＬ−アルギニン生産能を有するためには、２−チア
ゾールアラニン（以下２−ＴＡと略す。）、アルギニン
ヒドロキサメート等への耐性を付与せしめれば良いこと
がわかっている。更に、前記の薬剤耐性に加えてサルフ
ァ剤、アルギノール耐性又は８−アザグアニスα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を付与するこ
と、及びＬ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−トリプトファン又はＬ−リジン等のアミノ酸に
対する要求性を付与することによりＬ−アルギニンの生
産能が向上することは知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

Ｌ−アルギニンの製造コストを低下させるために発酵収
率を向上させることは重要な問題である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、従来より知られているブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属に属するしアルギニン生産能を有す
る微生物を改良して更に発酵収率の向上した菌株を見い
だすべく研究した結果、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪鎖又
は脂肪鎖の誘導体）（以下、Ｘ−ＧＮと略す。）に耐性
を付与した菌株の中に、従来のＬ−アルギニン生産菌よ
りも高収率でＬ−アルギニンを生産する菌株が存在する
ことを発見した。

即ち、本発明はブレビバクテリウム属又はコリネバクテ
リウム属に属し、Ｘ−ＧＮ耐性を有し、且つＬ−アルギ
ニン生産能を有する微生物を液体培地中で培養し、培地
中に生成・蓄積したＬ−アルギニンを採取することを特
徴とするＬ−アルギニンの製造法に関する。

本発明において用いられる微生物はブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属に属し、Ｘ−ＧＮ耐性を有
し、かつＬ−アルギニン生産能を有する変異株である。

本発明の変異株を得るには、下記の野生株に、先にＬ−
アルギニン生産能を付与し、次いでＸ−０Ｎ耐性を付与
しても良いし、又先にＸ−０Ｎ耐性を付与し、次いでＬ
−アルギニン生産能を付与しても良い。

Ｘ−ＧＮとしては、ブテニルグアニジン、ヘキシルグア
ニジン、オクチルグアニジン等の脂肪鎖グアニジン及び
４−メチル−３−ブテニルグアニジン等の脂肪鎖グアニ
ジンの誘導体があり、これらは何れもエネルギー転移阻
害剤として知られている。

本変異株の親株となる野生株は、ブレビバクテリウム属
又はコリネバクテリウム属の特にコリネホルムし一グル
タミン酸生産性細菌として知られているものであり、例
えば、以下のものがある。

ブレビバクテリウム・デイバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・テクトフェルメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・サソカロリティカムＡＴＣＣ１４
０６６ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２ これらの親株より本発明の変異株を変異誘導する方法は
、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
に接触せしめる等の通常の変異誘導方法が適宜適用でき
る。変異処理した菌株から本発明の変異株を分離する方
法は、Ｘ−０Ｎを含む培地で生育するような菌株を採取
することによって行われる。

本発明の変異株の具体的な変異誘導方法とＸ−ＧＮの１
種としてのオクチルグアニジン（以下、０−ＧＮと略す
）　ｆｉ度と菌株の生育度の関係を以下に示す。

〔変異誘導法〕

ブイヨン寒天スラント上に３０℃で２４時間生育させた
ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１１６９、　　Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ４１６１　　（ＡＴＣＣ１４０６７より誘導
した２−ＴＡ耐性株）及びコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＪ１２０９２ＦＥＲＭ−Ｐ７２７３　　（ＡＴ
ＣＣ１３０３２より誘導した２−ＴＡ耐性株）の菌体を
Ｍ／３０リン酸緩衝液に懸濁し菌体濃度１０Ｂ〜１０’
／ｍｊ２の菌体懸濁液に５００μｇ／ｍｌのＮ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを加え３０℃
に２０分間保持した。ついで遠心分離して菌体を集め、
Ｍ／３０１Ｊン酸緩衝液で良く洗滌した後、下記組成の
培地に接種し、３１，５°Ｃで４〜１０日間培養した。

グルコース　　　　　　　　１．Ｏｇｌｄｉ尿素　　　
　０．２ Ｋｌ１２ＰＯ４０，１ １’１ｇ５ｏ、・７１１□００．１ ＦｅＳＯａ’　７Ｎ（２００，００２４Ｍｎ５Ｏｎ”　
７　）１ｚＯＯ，００２”ビオチン　　　　　　　　１
００　　μｇ／ｌサイアミン塩酸塩　　　　ｌＯＯ〃 ０−ＧＮ　　　　　　　　　０．１　　　ｇ／ｄ！寒天
　　　　２．０〃 寒天培地に生育した菌株の中から、Ｌ−アルギニン生産
能の高い菌株としてブレビバクテリウム・フラバムＡＪ
１２４２９．ＦＥＲＭ−Ｐ（２−ＴＡ耐性、０−ＯＮ耐
性）及びコリネバクテリウム・グルタミクム゛ＡＪ　１
２４３０．　ＦＥＲＭ−Ｐ（２−ＴＡ耐性、０−ＧＮ耐
性）を得 た。

このようにして得られた変異株の０−ＧＮ耐性度を親株
と比較した。

グルコース０．５ｇ／ｄ！、尿素０．１５８／ｄ！、硫
安０．１５ｇ／ｄ！、にＨ２ＰＯｔ　０．３　ｇ　／　
ｄｌ、Ｋ、ＨＰＯ４０，１ｇ／ｄ１、ＭｇＳＯ４・７　
ｔｈｏ　０．　Ｏｌ　ｇ　／　ｄｌ、ＣａＣ１。

２Ｈ，００，１■／設、ビオチン１００μｇ／ｌ、サイ
アミン塩酸塩１００ｐｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７１（ｚ。

Ｏ，００２ｇ／ｄ！、ＭｎＳＯ４・７８２００．００２
　ｇ／ｄ１および表に示す量の０−ＧＮを含み、ｐＨ７
，０に調節した培地に、天然培地（ペプトン１ｇ／ｄ！
、酵母エキス１ｇ／ｄｌ、ＮａＣ１Ｏ，５ｇ／ｄｌＳｐ
）１７．０）スラントで２４時間培養した菌体を殺菌水
に懸濁して接種し、２４時間培養して生育度を濁度で測
定した。

一萎一一」−一二友一 上述の変異株にサルファグアニジン耐性、アルギニツー
ル耐性、８−アザグアニン耐性のようにすでにＬ−アル
ギニンの生産性を向上せしめることが知られている性質
を更に付加することにより収率が向上する場合が多い。

〔作　用〕

このような変異株を培養する際に用いる培地は、炭素源
、窒素源、無機イオン、上記要求性を満足させるべき物
質及び必要に応じビタミン等その他の有機微量栄養素を
含有する通常の培地である。

炭素源としてはグルコース、シュクロース等の炭水化物
、酢酸等の有機酸等が、窒素源としてはアンモニア水、
アンモニアガス、アンモニウム塩等が好適である。無機
イオンとしてはカリイオン、ナトリウムイオン、マグネ
シウムイオン、リン酸イオンその他が必要に応じ適宜培
地に添加される。

培養は好気的条件が望ましく、培養の間培地のｐｉｌを
４ないし８に温度を２５℃ないし３７℃に調節しつつ行
えばより好ましい結果が得られる。かくして１ないし７
日間も培養すれば培地中に著量のＬ−アルギニンが生成
蓄積される。

培養液よりＬ〜アルギニンを採取する方法は、イオン交
換樹脂による方法等通常の方法で採取できる。

以下実施例にて説明する。

実施例 グルコース１０　ｇ　／　ｄｌ−（ＮＨ４）ｚｓＯ４７
ｇ　／　ａ、ＫＬＰＯａ　Ｏ，１ｇ　／　ａ、ＭｇＳＯ
４・７Ｈｚ００．０４　ｇ　７ｄｌ。

Ｆｅ５Ｏａ　・７　ＬＯ１１ｗｒ　／　ａ、Ｍｎ５Ｏａ
　Ｈ４Ｈｚｏ　　１　ｍｇ　／　ａ、サイアミン・ＨＣ
ｌ２１００μｇ／ｅ、ビオチン１００μｇ／β、大豆蛋
白酸加水分解液６０■／ｄ！（全窒素として）炭酸カル
シウム５ｇ／ｄ１（別殺菌）を含む培地をｐＨ１，０に
調節し、その２０ｍ１を５００ｎｔ？容肩付フラスコに
入れ加熱殺菌した。

これに第１表に示す菌株を一白金耳接種し、３１゜５℃
に保ちつつ４日間振盪した。各菌株の培養液中には第２
表に示す量のＬ−アルギニンがそれぞれ生成蓄積してい
た。

ＡＪ１２４２９を上記の方法で培養して培養液１βを得
、これより遠心分離にて菌体他を除き、上清を弱酸性イ
オン交換樹脂「アンバーライト」Ｃ−５０（ＮＨ４”型
）に通過させた。樹脂を水洗後、２Ｎ　ＮＨ，ＯＨにて
Ｌ−アルギニンを溶出し、ついで溶出液を濃縮し、これ
よりし−アルギニンの粗結晶１９．５　ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属し
   Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪鎖又は脂肪鎖の誘導体）に耐
   性を有し、且つＬ−アルギニン生産能を有する微生物を
   液体培地中で培養し、培地中に生成・蓄積したＬ−アル
   ギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製
   造法。