JPH0561914B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 Ｌ−ヒスチジンはアミノ酸輸液及び総合アミノ
酸製剤等の重要な成分である。本発明はこのＬ−
ヒスチジンを発酵法で製造する方法を改良するも
のである。 〔従来技術〕 ブレビバクテリウム属及びコリネバクテリウム
属の微生物がＬ−ヒスチジン生産能を有するため
には、２−チアゾールアラニン（以下２−TAと
略す）米国特許第3716453号）２−TA及び／又
はサルフア剤（特公昭51−23594号公報）等への
耐性を付与せしめれば良いことがわかつている。
更に、２−TA耐性の他にアルギニン、フエニー
ルアラニン、プロリン、キサンチン、グアニン等
を要求する変異株（特公昭51−23593、51−24594
号公報）を使用する方法等が知られている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明が解決しようとする問題点はＬ−ヒスチ
ジンの製造コストを低下させるために発酵収率を
向上させることにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は上記問題点を解決するためになされた
ものであり、従来より知られているブレビバクテ
リウム属又はコリネバクテリウム属に属するＬ−
ヒスチジン生産能を有する微生物を改良して更に
発酵収率の向上した菌株を見い出すべく研究した
結果、ポリケタイド類に耐性を付与した菌株の中
に、従来のＬ−ヒスチジン生産菌よりも高収率で
Ｌ−ヒスチジンを生産する菌株が存在することを
発明した。 即ち、本発明はブレビバクテリウム属又はコリ
ネバクテリウム属に属し、ポリケタイド類に耐性
を有し、且つＬ−ヒスチジン生産能を有する微生
物を液体培地中で培養し、培地中に生成・蓄積し
たＬ−ヒスチジンを採取することを特徴とするＬ
−ヒスチジンの製造法に関する。 ポリケタイド類としては多くのものが知られて
いるが、例えばtriacetic acid lactone，
mycophenolic acid，terrin，cerulenin，
fallacinal，frenolicin，solorinic acid等がある。 本発明において用いられる微生物はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属に属し、ポ
リケタイド類に耐性を有し、かつＬ−ヒスチジン
生産能を有する変異株である。本発明の変異株を
得るには、下記野生株に、先にＬ−ヒスチジン生
産能を付与し、次いでポリケタイド類耐性を付与
しても良いし、下記野生株にポリケタイド類耐性
を付与し、次いでＬ−ヒスチジン生産能を付与し
ても良い。 本変異株の親株となる野生株は、ブレビバクテ
リウム属又はコリネバクテリウム属の特にコリネ
ホルムＬ−グルタミン酸生産菌として知られてい
るものであり、例えば、以下のものがある。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14022 ブレビバクテリウム・ブラバム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム
ATCC 14066 コリネバクテリウム・アセトアシトフイルム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC 13032 これらの親株より本発明の変異株を変異誘導す
る方法はＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンに接触せしめる等の通常の変異誘導
方法が適宜適用できる。変異処理した菌株から本
発明の変異株を分離する方法は、ポリケタイド類
を含む培地で生育するような菌株を採取すること
によつて行われる。 本発明の変異株の具体的な変異誘導方法はポリ
ケタイド類の中の一つであるミコフエノール酸
（以下MPAと略す）濃度と菌株の生育度の関係を
以下に示す。 〔変異誘導法〕 ブイヨン寒天スラント上に30℃で24時間生育さ
せたブレビバクテリウム・フラバムAJ11169、
FERM−P4161（ATCC14067より誘導した２−
TA耐性株）及びコリネバクテリウム・グルタミ
クムAJ12092、FERM−P7273（ATCC13032より
誘導した２−TA耐性株）の菌株をＭ／30リン酸
緩衝液に懸濁し菌体濃度10⁸〜10⁹／mlの菌体懸濁
液に500μｇ／mlのＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンを加え30℃に20分間保持し
た。ついで遠心分離して菌体を集め、Ｍ／30リン
酸緩衝液で良く洗滌した後、下記組成の培地に接
種し31.5℃で４〜10日間培養した。 培地組成（PH7.0） 成分 含量 グリコース 1.0 ｇ／dl 尿 素 0.2 〃 KH₂PO₄ 0.1 〃 MgSO₄・7H₂Ｏ 0.1 〃 FeSO₄・7H₂Ｏ 0.002 〃 MnSO₄・7H₂Ｏ 0.002 〃 ビオチン 100 μｇ／ サイアミン塩酸塩 100 〃 MPA 0.1 ｇ／dl 寒 天 2.0 〃 寒天培地に生育した菌株の中からＬ−ヒスチジ
ン生産能を高い菌株としてブレビバクテリウム・
フラバムAJ12249、FERM−P8371（２−TA耐
性、MPA耐性）及びコリネバクテリウム・グル
タミクムAJ12250、FERM−P8372（２−TA耐
性、MPA耐性）を得た。 このようにして得られた変異株のMPA耐性度
を親株と比較した。 グリコース0.5ｇ／dl、尿素0.15ｇ／dl、硫安
0.15ｇ／dl、KH₂PO₄0.3ｇ／dl、K₂HPO₄0.1
ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O0.01ｇ／dl、CaCl₂・2H₂
O0.1mg／dl、ビオチン100μｇ／、サイアミン
塩酸塩100μｇ／、FeSO₄・7H₂O0.002ｇ／dl、
MnSO₄・7H₂O0.002ｇ／dl及び表に示す量の
MPAを含み、PH7.0に調節した培地に、天然培地
（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、
NaCl0.5ｇ／dl、PH7.0）スラントで24時間培養し
た菌体を殺菌水に懸濁して接触し、24時間培養し
て生育度を濁度で測定した。

【表】

〔作用〕

このような変異株を培養する最に用いる培地は
炭素源、窒素源、無機イオン、上記要求性を満足
させるべき物質及び必要に応じビタミン等、その
他の有機微量栄養素を含有する通常の培地であ
る。 炭素源としてはグルコース、シユクロース等の
炭水化物、酢酸等の有機酸等が、窒素源としては
アンモニア水、アンモニアガス、アンモニウム塩
等が好適である。無機イオンとしてはカリイオ
ン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、リ
ン酸イオン、その他を必要に応じ適宜培地に添加
させる。 培地は好気条件が望ましく、培養の間培地のPH
を４ないし８に温度を25℃ないし37℃に調節しつ
つ行えばより好ましい結果が得られる。かくして
１ないし７日間も培養すれば培地中に著量のＬ−
ヒスチジンが生成蓄積される。 培養液よりＬ−ヒスチジンを採取する方法は、
イオン交換樹脂による方法等通常の方法が採用さ
れる。 以下実施例にて説明する。 実施例 グルコース10ｇ／dl、（NH₄）₂SO₄4.5ｇ／dl、
KH₂PO₄0.2ｇ／dl、MgSO₄／7H₂O0.2ｇ／dl、
FeSO₄／7H₂O1mg／dl、MnSO₄／7H₂O1mg／dl、
サイアミン・HCl100μｇ／、ピオチン100μｇ／
、酢酸アンモニウム1.0ｇ／dl、大豆蛋白酸加
水分解液70mg／dl、（全窒素として）、炭酸カルシ
ウム５ｇ／dl（別殺菌）を含む培地をPH7.0に調
節し、その20mlを500ml容肩付フラスコに入れ加
熱殺菌した。これに第１表に示す菌株を一白金耳
接種し、31.5℃に保ちつつ４日間振盪した。各菌
株の培養液中には第２表に示す量のＬ−ヒスチジ
ンがそれぞれ生成蓄積していた。

【表】 AJ12249を上記の方法で培養して培養液１を
得、これより遠心分離にて菌体他を除き、上清を
強酸性陽イオン交換樹脂“ダイヤイオンSK−
1B”（NH₄ ⁺型）に通過させた。樹脂を水洗後、
2N・NH₄OHにてＬ−ヒスチジンを溶出し、つ
いで溶出液を濃縮し、これよりＬ−ヒスチジンの
粗結晶9.8ｇを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
   ム属に属しポリケタイド類に耐性を有し、且つＬ
   −ヒスチジン生産能を有する微生物を液体培地中
   で培養し、培地中に生成蓄積したＬ−ヒスチジン
   を採取する事を特徴とするＬ−ヒスチジンの製造
   法。