JPH0218833B2 - - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、アグマチンを酸化する酵素（以下ア
グマチンオキシダーゼという）に関する。 更に詳細には、本発明は新規な酵素，アグマチ
ンオキシダーゼに関するものである。 本発明者らは、ペニシリウム・クリソゲナムの
産生する多くの酵素を調査中、そのなかに特殊な
酵素が存在することを知り、その諸性質を調べた
ところ、本酵素がアグマチンを選択的に酸化する
新しい酵素であることを見いだし、本酵素をアグ
マチンオキシダーゼと命名した。 一般に、アグマチンは、アルギニンが脱炭酸さ
れて生成する物質であり、ポリアミン類生合成経
路上の重要な物質である。又、ニトロソ化される
と強力な変異原性物質になることが知られてお
り、生体中あるいは種々の物質中のアグマチン量
を知ることはきはめて重要で、かつ、必要とされ
ている。しかしながら、現在までに報告されてい
るアグマチンの分析法は、薄層クロマトグラフイ
ー，ペーパークロマトグラフイー，アミノ酸分析
装置，ガスクロマトグラフイー等を用いる化学的
な分析方法のみであり、高価な器機と長時間の分
析時間を必要とする欠点を有し、アグマチン分析
の進歩に大きなさまたげとなつていた。 本発明者らは、こうした実情に鑑み、アグマチ
ンを酵素を用いて定量するために、アグマチンに
反応する酵素を工業的に、安価に、大量に製造す
る方法を確立すべく種々研究の結果、スペルミ
ン，スペルミジン，プトレツシン，アグマチン等
を単一の炭素及び窒素源，単一炭素又は単一窒素
源として生育しうるペニシリウム・クリソゲナム
（Penicillium chrysogenum）IFO 4626をスペル
ミン，スペルミジン，プトレツシン，アグマチン
含有培地で培養し、培養物中のしかも新規なアグ
マチンの酸化酵素を生産蓄積することを見い出
し、これをアグマチンオキシダーゼと命名し、本
発明を完成したものである。 本発明で得られたアグマチンオキシダーゼは、
アグマチンに基質特異性を有し、他のジアミン類
には僅かに作用するが、ポリアミン類には実質的
に作用しない新規酵素である。 本発明のアグマチンオキシダーゼは、次の理化
学的性質を有している。 １ 作用：次式に示す通り、アグマチンに作用し
て、１モルのアグマチンから１モルのγ―グアニ
ジノブチルアルデヒドと１モルのアンモニアと１
モルの過酸化水素を生成する。 イ） 過酸化水素の生成の確認 アグマチンに酸素の存在下でアグマチンオキ
シダーゼを作用させ、次いで該酵素系にペルオ
キシダーゼ，４―アミノアンチピリン，フエノ
ールを加えて反応させると反応系にキノンイミ
ン色素が生成する（過酸化水素とペルオキシダ
ーゼ，４―アミノアンチピリン，フエノールの
反応についてはClin.Chem.20巻，470頁
（1974）に示されている）。 ロ） アンモニアの生成の確認 アグマチンに酸素の存在下アグマチンオキシ
ダーゼを作用させ、次いで該酵素系に次亜塩素
酸ナトリウム，フエノール，水酸化ナトリウ
ム，ニトロプルシドナトリウムを加えて反応さ
せると反応液系にインドフエノールが生成する
（アンモニアと次亜塩素酸ナトリウム，フエノ
ール，水酸化ナトリウム，ニトロプルシドナト
リウムの反応については、J.Clin.Path.13巻156
頁（1960）に示されている）。 ハ） γ―グアニジノブチルアルデヒドの生成の
確認 アグマチンに酸素の存在下アグマチンオキシ
ダーゼを作用させ、次いで該酵素系に過マンガ
ン酸カリウムを添加し、生成されるアルデヒド
を酸化する。この溶液を以下に示す薄層クロマ
トグラフイーで分析した結果、生成アルデヒド
の酸化物はγ―グアニジノブチル酸と同定され
たので、過マンガン酸カリウムで酸化する前の
生成物はγ―グアニジノブチルアルデヒドと同
定された。使用した薄層プレートはシリカゲル
60―Ｆ―254（メルク社製、西ドイツ）で展開溶
剤は溶剤系１〔0.1モルリン酸緩衝液PH7.0〕、溶
剤系２〔ブタノール：酢酸：水＝４：１：５（容
量比）〕である。展開後、ニンヒドリン反応，
坂口反応を行なつて、Rf値，色調が標品のそ
れと一致することを確認した。 ニ） 酸素の吸収量の確認 アグマチンにアグマチンオキシダーゼを作用
させた系中の酸素の消費は、酸素電極によつて
測定した。その結果、過酸化水素，の生成量に
見合う量の酸素の吸収が確認された。 ２ 基質特異性 アグマチンに対する活性を100としたときの他
の基質に対する相対活性の測定結果を表１に示
す。活性は生成する過酸化水素をペルオキシダー
ゼ，フエノール，４―アミノアンチピリン法で測
定した。基質濃度はいずれも2mMである。
グマチンオキシダーゼという）に関する。 更に詳細には、本発明は新規な酵素，アグマチ
ンオキシダーゼに関するものである。 本発明者らは、ペニシリウム・クリソゲナムの
産生する多くの酵素を調査中、そのなかに特殊な
酵素が存在することを知り、その諸性質を調べた
ところ、本酵素がアグマチンを選択的に酸化する
新しい酵素であることを見いだし、本酵素をアグ
マチンオキシダーゼと命名した。 一般に、アグマチンは、アルギニンが脱炭酸さ
れて生成する物質であり、ポリアミン類生合成経
路上の重要な物質である。又、ニトロソ化される
と強力な変異原性物質になることが知られてお
り、生体中あるいは種々の物質中のアグマチン量
を知ることはきはめて重要で、かつ、必要とされ
ている。しかしながら、現在までに報告されてい
るアグマチンの分析法は、薄層クロマトグラフイ
ー，ペーパークロマトグラフイー，アミノ酸分析
装置，ガスクロマトグラフイー等を用いる化学的
な分析方法のみであり、高価な器機と長時間の分
析時間を必要とする欠点を有し、アグマチン分析
の進歩に大きなさまたげとなつていた。 本発明者らは、こうした実情に鑑み、アグマチ
ンを酵素を用いて定量するために、アグマチンに
反応する酵素を工業的に、安価に、大量に製造す
る方法を確立すべく種々研究の結果、スペルミ
ン，スペルミジン，プトレツシン，アグマチン等
を単一の炭素及び窒素源，単一炭素又は単一窒素
源として生育しうるペニシリウム・クリソゲナム
（Penicillium chrysogenum）IFO 4626をスペル
ミン，スペルミジン，プトレツシン，アグマチン
含有培地で培養し、培養物中のしかも新規なアグ
マチンの酸化酵素を生産蓄積することを見い出
し、これをアグマチンオキシダーゼと命名し、本
発明を完成したものである。 本発明で得られたアグマチンオキシダーゼは、
アグマチンに基質特異性を有し、他のジアミン類
には僅かに作用するが、ポリアミン類には実質的
に作用しない新規酵素である。 本発明のアグマチンオキシダーゼは、次の理化
学的性質を有している。 １ 作用：次式に示す通り、アグマチンに作用し
て、１モルのアグマチンから１モルのγ―グアニ
ジノブチルアルデヒドと１モルのアンモニアと１
モルの過酸化水素を生成する。 イ） 過酸化水素の生成の確認 アグマチンに酸素の存在下でアグマチンオキ
シダーゼを作用させ、次いで該酵素系にペルオ
キシダーゼ，４―アミノアンチピリン，フエノ
ールを加えて反応させると反応系にキノンイミ
ン色素が生成する（過酸化水素とペルオキシダ
ーゼ，４―アミノアンチピリン，フエノールの
反応についてはClin.Chem.20巻，470頁
（1974）に示されている）。 ロ） アンモニアの生成の確認 アグマチンに酸素の存在下アグマチンオキシ
ダーゼを作用させ、次いで該酵素系に次亜塩素
酸ナトリウム，フエノール，水酸化ナトリウ
ム，ニトロプルシドナトリウムを加えて反応さ
せると反応液系にインドフエノールが生成する
（アンモニアと次亜塩素酸ナトリウム，フエノ
ール，水酸化ナトリウム，ニトロプルシドナト
リウムの反応については、J.Clin.Path.13巻156
頁（1960）に示されている）。 ハ） γ―グアニジノブチルアルデヒドの生成の
確認 アグマチンに酸素の存在下アグマチンオキシ
ダーゼを作用させ、次いで該酵素系に過マンガ
ン酸カリウムを添加し、生成されるアルデヒド
を酸化する。この溶液を以下に示す薄層クロマ
トグラフイーで分析した結果、生成アルデヒド
の酸化物はγ―グアニジノブチル酸と同定され
たので、過マンガン酸カリウムで酸化する前の
生成物はγ―グアニジノブチルアルデヒドと同
定された。使用した薄層プレートはシリカゲル
60―Ｆ―254（メルク社製、西ドイツ）で展開溶
剤は溶剤系１〔0.1モルリン酸緩衝液PH7.0〕、溶
剤系２〔ブタノール：酢酸：水＝４：１：５（容
量比）〕である。展開後、ニンヒドリン反応，
坂口反応を行なつて、Rf値，色調が標品のそ
れと一致することを確認した。 ニ） 酸素の吸収量の確認 アグマチンにアグマチンオキシダーゼを作用
させた系中の酸素の消費は、酸素電極によつて
測定した。その結果、過酸化水素，の生成量に
見合う量の酸素の吸収が確認された。 ２ 基質特異性 アグマチンに対する活性を100としたときの他
の基質に対する相対活性の測定結果を表１に示
す。活性は生成する過酸化水素をペルオキシダー
ゼ，フエノール，４―アミノアンチピリン法で測
定した。基質濃度はいずれも2mMである。
【表】
【表】
３ 至適PH
PH6.5〜7.0付近である（第１図に示す通り）。
４ PH安定性
40℃で20分間処理した場合、PH5.5〜7.5におい
て90％以上の残存活性を有する（第２図に示す通
り）。 ５ 至適温度 PH7.0において45℃付近にある（第３図に示す
通り）。 ６ 温度安定性 PH7.0において40℃20分間処理でもほぼ100％の
活性が残存する（第４図に示す通り）。 ７ 阻害剤，金属イオンの影響 ａ） 各種阻害剤の影響について表２に示す。
て90％以上の残存活性を有する（第２図に示す通
り）。 ５ 至適温度 PH7.0において45℃付近にある（第３図に示す
通り）。 ６ 温度安定性 PH7.0において40℃20分間処理でもほぼ100％の
活性が残存する（第４図に示す通り）。 ７ 阻害剤，金属イオンの影響 ａ） 各種阻害剤の影響について表２に示す。
【表】
【表】
＊ パラクロロマーキユリベンゾエート
＊＊ エチレンジアミンテトラアセテート
ｂ） 金属イオンの影響について表３に示す。
＊＊ エチレンジアミンテトラアセテート
ｂ） 金属イオンの影響について表３に示す。
【表】
８ 等電点
PH5.7付近（アンホライン等電点電気泳動法）。
９ 分子量
160000（１量体）であるが、重合して320000を
示すこともある（セフアデツクスＧ―200ゲル
過法）。 10 サブユニツトの分子量 80000である（SDSデイスク電気泳動法）。 11 結晶形 六角板状（ピンク色）である。 12 補欠分子族銅イオン 上記理化学的性質を持つたアグマチンオキシダ
ーゼは全く新規な酵素であるが、基質特異性等か
ら分類するとジアミン酸化酵素に分類されると考
えられる。現在までに微生物起源のジアミン酸化
酵素としてはプトレツシンオキシダーゼが知られ
ているのみである。又、動物ではブタ腎臓のジア
ミンオキシダーゼが、植物ではマメ科のジアミン
オキシダーゼが知られている。又、Aspergillus
terreusのアミンオキシダーゼは、分類上、動物
又は植物のジアミンオキシダーゼと同じ型に属し
ている。これらのアミンオキシダーゼとアグマチ
ンオキシダーゼの性質を比較して表４に示した。
但し、プトレツシンオキシダーゼは、アダチら
（O.Adachi et al）によるAgricultural and
Biological Chemistry 30巻，1202〜1210頁
（1966）記載のものであり、ブタ腎臓のジアミン
オキシダーゼは、ヤマダら（H.Yamada et al）
によるBiochemical and Biophysical Besearch
Communications 29巻，723〜727頁（1967）記
載のものであり、マメ科のジアミンオキシダーゼ
は、ジエー．エム．ヒルら（Ｊ：M.Hill et al）
によるBiochemical Journal91巻，171〜182頁
（1964）およびMethod in Enzymology17巻Ｂ，
730〜735頁記載のものであり、Aspergillus
terreusのアミンオキシダーゼは、ヤマダら（H.
Yamada et al）によるAgricultural and
Biological Chemistsy29巻，864〜869頁（1965）
およびMethod in Enzymology17巻Ｂ，705〜
709頁記載のものである。
示すこともある（セフアデツクスＧ―200ゲル
過法）。 10 サブユニツトの分子量 80000である（SDSデイスク電気泳動法）。 11 結晶形 六角板状（ピンク色）である。 12 補欠分子族銅イオン 上記理化学的性質を持つたアグマチンオキシダ
ーゼは全く新規な酵素であるが、基質特異性等か
ら分類するとジアミン酸化酵素に分類されると考
えられる。現在までに微生物起源のジアミン酸化
酵素としてはプトレツシンオキシダーゼが知られ
ているのみである。又、動物ではブタ腎臓のジア
ミンオキシダーゼが、植物ではマメ科のジアミン
オキシダーゼが知られている。又、Aspergillus
terreusのアミンオキシダーゼは、分類上、動物
又は植物のジアミンオキシダーゼと同じ型に属し
ている。これらのアミンオキシダーゼとアグマチ
ンオキシダーゼの性質を比較して表４に示した。
但し、プトレツシンオキシダーゼは、アダチら
（O.Adachi et al）によるAgricultural and
Biological Chemistry 30巻，1202〜1210頁
（1966）記載のものであり、ブタ腎臓のジアミン
オキシダーゼは、ヤマダら（H.Yamada et al）
によるBiochemical and Biophysical Besearch
Communications 29巻，723〜727頁（1967）記
載のものであり、マメ科のジアミンオキシダーゼ
は、ジエー．エム．ヒルら（Ｊ：M.Hill et al）
によるBiochemical Journal91巻，171〜182頁
（1964）およびMethod in Enzymology17巻Ｂ，
730〜735頁記載のものであり、Aspergillus
terreusのアミンオキシダーゼは、ヤマダら（H.
Yamada et al）によるAgricultural and
Biological Chemistsy29巻，864〜869頁（1965）
およびMethod in Enzymology17巻Ｂ，705〜
709頁記載のものである。
【表】
【表】
表４より明らかな如く、本発明のアグマチンオ
キシダーゼは、微生物起源の唯一のジアミン酸化
酵素であるプトレツシンオキシダーゼとは基質特
異性，阻害剤に対する挙動，分子量，補欠分子族
等の点で明らかに異なる。又、動物起源，植物起
源のジアミンオキシダーゼともその基質特異性や
分子量において大きく異なる。従つて、本発明の
アグマチンオキシダーゼは、微生物起源の全く新
しいジアミンオキシダーゼである。 本発明のアグマチンオキシダーゼは、ペニシリ
ウム・クリソゲナムIFO4626を培養することによ
つて得られるが、使用する培地としては、炭素
源，窒素源，無機物その他栄養素を程よく含有す
る培地ならば合成培地または天然培地のいずれも
使用可能であり、液状でも固状でもよいが、通常
液体培地を使用する。そしてアグマチン，プトレ
ツシン，スペルミジン，スペルミンの如きアグマ
チンオキシダーゼの誘導物質を１種類又は２種類
以上適宜組み合わせて使用することが可能であ
る。 培養条件としては、培養開始時のPHは通常４〜
７の範囲で好適には５〜６付近で行われる。培養
温度は20〜40℃の範囲で好適には25〜35℃の範囲
で行われる。このような条件下で12〜120時間培
養すれば培養物中にアグマチンオキシダーゼが著
量生成する。 こうして培養物中に生産蓄積されたアグマチン
オキシダーゼは次のごとき方法で採取される。ア
グマチンオキシダーゼは主として菌体中に存在す
るので、培養終了後菌体は過等の方法で集めら
れ、水または緩衝液でよく洗浄し、適量の緩衝液
に懸濁し、菌体内のアグマチンオキシダーゼを抽
出する。この場合の抽出操作は、酵素単離の常法
によつて抽出されうる。一方、菌体から培養液中
に遊離されたアグマチンオキシダーゼについても
培養過から常法により採取することができる。
これら菌体抽出物又は培養液より得られる粗アグ
マチンオキシダーゼをさらに精製するには、例え
ば等電点沈澱法，イオン交換クロマトグラフイ
ー，硫安による分画沈澱，ヒドロキシアパタイト
によるカラムクロマトグラフイー，セフアデツク
スによるゲル過，アフイニテイークロマトグラ
フイー等の方法を適宜組み合せ、あるいは繰り返
すこと及び他の常法の精製手段を必要に応じて用
いることができる。このようにして得られた高純
度アグマチンオキシダーゼ含有液は、デイスク電
気泳動分析で単一であり、さらに濃縮し、硫安で
結晶化を行なうことにより、六角板状の結晶を得
ることができる。 次に本発明において用いたアグマチンオキシダ
ーゼの活性測定法を示す。 ４―アミノアンチピリン10mg，フエノール0.2
ml，ペルオキシダーゼ10mgを0.2Mリン酸緩衝液
（PH7.0）100mlに溶解して発色試薬を調製する。
この発色試薬1.5mlにアグマチン（10mM）0.5ml
と酵素液0.5mlを加えて反応させ、その１分間当
りの505nmの吸光度変化量を測定する。 酵素液のアグマチンオキシダーゼ活性単位は次
の如く算出する。すなわち、毎分1.0nmolの過酸
化水素を生成せしめるアグマチンオキシダーゼの
量を１単位と規定する。このアグマチンオキシダ
ーゼ１単位は上記505nmにおける吸収において毎
分0.0025の吸収増加に相当するものである。 次に本発明によつて提供される新規な酵素アグ
マチンオキシダーゼを利用するアグマチンの定量
法について説明する。アグマチンの定量法には、
(イ) 酸素の存在下アグマチンにアグマチンオキシ
ダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量す
る方法、(ロ) 同じく生成するアンモニアを定量す
る方法、(ハ) 同じく生成するγ―グアニジノブチ
ルアルデヒドに３―メチル―２―ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾンを作用させて670nmの吸光度を比
色定量することにより、アグマチンを定量する方
法〔アルデヒドの定量はM.A.Paz（Archives of
Biochemistry and Biophysics109巻548〜559
（1965））による〕、(ニ) 酸素の存在下アグマチン
にアグマチンオキシダーゼを作用させ、この系の
酸素の吸収量を測定する方法があげられる。ここ
では(イ)の、生成する過酸化水素量を測定すること
により、アグマチンを定量する方法について述べ
る。即ち、活性測定法の項中、アグマチンの濃度
を20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，
120μM，160μMと変え、比活性約5000の酵素を
約3000単位加えて20分間反応を行なつて505nmで
の反応液の吸収値を求めると次のような結果が得
られた。
キシダーゼは、微生物起源の唯一のジアミン酸化
酵素であるプトレツシンオキシダーゼとは基質特
異性，阻害剤に対する挙動，分子量，補欠分子族
等の点で明らかに異なる。又、動物起源，植物起
源のジアミンオキシダーゼともその基質特異性や
分子量において大きく異なる。従つて、本発明の
アグマチンオキシダーゼは、微生物起源の全く新
しいジアミンオキシダーゼである。 本発明のアグマチンオキシダーゼは、ペニシリ
ウム・クリソゲナムIFO4626を培養することによ
つて得られるが、使用する培地としては、炭素
源，窒素源，無機物その他栄養素を程よく含有す
る培地ならば合成培地または天然培地のいずれも
使用可能であり、液状でも固状でもよいが、通常
液体培地を使用する。そしてアグマチン，プトレ
ツシン，スペルミジン，スペルミンの如きアグマ
チンオキシダーゼの誘導物質を１種類又は２種類
以上適宜組み合わせて使用することが可能であ
る。 培養条件としては、培養開始時のPHは通常４〜
７の範囲で好適には５〜６付近で行われる。培養
温度は20〜40℃の範囲で好適には25〜35℃の範囲
で行われる。このような条件下で12〜120時間培
養すれば培養物中にアグマチンオキシダーゼが著
量生成する。 こうして培養物中に生産蓄積されたアグマチン
オキシダーゼは次のごとき方法で採取される。ア
グマチンオキシダーゼは主として菌体中に存在す
るので、培養終了後菌体は過等の方法で集めら
れ、水または緩衝液でよく洗浄し、適量の緩衝液
に懸濁し、菌体内のアグマチンオキシダーゼを抽
出する。この場合の抽出操作は、酵素単離の常法
によつて抽出されうる。一方、菌体から培養液中
に遊離されたアグマチンオキシダーゼについても
培養過から常法により採取することができる。
これら菌体抽出物又は培養液より得られる粗アグ
マチンオキシダーゼをさらに精製するには、例え
ば等電点沈澱法，イオン交換クロマトグラフイ
ー，硫安による分画沈澱，ヒドロキシアパタイト
によるカラムクロマトグラフイー，セフアデツク
スによるゲル過，アフイニテイークロマトグラ
フイー等の方法を適宜組み合せ、あるいは繰り返
すこと及び他の常法の精製手段を必要に応じて用
いることができる。このようにして得られた高純
度アグマチンオキシダーゼ含有液は、デイスク電
気泳動分析で単一であり、さらに濃縮し、硫安で
結晶化を行なうことにより、六角板状の結晶を得
ることができる。 次に本発明において用いたアグマチンオキシダ
ーゼの活性測定法を示す。 ４―アミノアンチピリン10mg，フエノール0.2
ml，ペルオキシダーゼ10mgを0.2Mリン酸緩衝液
（PH7.0）100mlに溶解して発色試薬を調製する。
この発色試薬1.5mlにアグマチン（10mM）0.5ml
と酵素液0.5mlを加えて反応させ、その１分間当
りの505nmの吸光度変化量を測定する。 酵素液のアグマチンオキシダーゼ活性単位は次
の如く算出する。すなわち、毎分1.0nmolの過酸
化水素を生成せしめるアグマチンオキシダーゼの
量を１単位と規定する。このアグマチンオキシダ
ーゼ１単位は上記505nmにおける吸収において毎
分0.0025の吸収増加に相当するものである。 次に本発明によつて提供される新規な酵素アグ
マチンオキシダーゼを利用するアグマチンの定量
法について説明する。アグマチンの定量法には、
(イ) 酸素の存在下アグマチンにアグマチンオキシ
ダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量す
る方法、(ロ) 同じく生成するアンモニアを定量す
る方法、(ハ) 同じく生成するγ―グアニジノブチ
ルアルデヒドに３―メチル―２―ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾンを作用させて670nmの吸光度を比
色定量することにより、アグマチンを定量する方
法〔アルデヒドの定量はM.A.Paz（Archives of
Biochemistry and Biophysics109巻548〜559
（1965））による〕、(ニ) 酸素の存在下アグマチン
にアグマチンオキシダーゼを作用させ、この系の
酸素の吸収量を測定する方法があげられる。ここ
では(イ)の、生成する過酸化水素量を測定すること
により、アグマチンを定量する方法について述べ
る。即ち、活性測定法の項中、アグマチンの濃度
を20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，
120μM，160μMと変え、比活性約5000の酵素を
約3000単位加えて20分間反応を行なつて505nmで
の反応液の吸収値を求めると次のような結果が得
られた。
【表】
即ち、基質濃度（アグマチン濃度）と505nmで
の反応液の吸光度値とは直線関係が認められる。
この原理により、溶液中の未知の濃度のアグマチ
ンを定量できる。又、この様に溶液中のアグマチ
ン濃度がアグマチンオキシダーゼによつて測定可
能となつた。この事実は、アグマチンの定量が関
与する分野において新たな定量手段、定量用キツ
トの作成を示唆するものである。 次に本発明の実施例について述べる。 実施例 １ ペニシリウム・クリソゲナムIFO4626を、培地
組成グルコース0.1％，スペルミジン0.025％，
KH2PO40.1％，K2HPO40.15％，MgSO4・
7H2O0.02％からなる培地９に接種して28℃で
48時間培養する。こうして得られた種培養液をプ
トレツシン0.25％，KH2PO40.1％，K2HPO40.15
％，MgSO4・7H2O0.02％からなる培地（殺菌前
PH5.5）80に加えて、28℃で48時間本培養を行
なう。培養終了後、過で菌体を集め（約420
ｇ）、0.02％メルカプトエタノールと0.1mM
EDTAを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）（以下
リン酸緩衝液にはすべて0.02％メルカプトエタノ
ールと0.1mM EDTAを含む）で洗浄し、同一緩
衝液に懸濁後、ダイノーミルで破砕する。この破
砕液より遠心分離（7000rpm，20分）で上澄画分
3.2を得た。該抽出液は直ちに上記緩衝液で平
衡化されたDEAE―セルロースカラム1.2に通
す。この操作で、アグマチンオキシダーゼは吸着
される。同じ緩衝液で吸着されない不純蛋白質を
洗浄し、次に緩衝液濃度を0.2Mに上昇させてア
グマチンオキシダーゼを溶離する。溶離された活
性画分は45％飽和の硫安濃度で硫安分画を行な
い、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で透析する。
透析酵素は0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡
化したDEAE―セルロースカラムに通す。同一緩
衝液で洗浄後、0.01M〜0.2Mリン酸緩衝液（PH
7.0）による直線濃度勾配法で酵素を溶離せしめ
る。活性画分は35％〜45％飽和の硫安濃度で硫安
分画を行ない、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
透析する。透析酵素液は同一緩衝液で平衡化した
ヒドロキシアパタイトカラムに通して吸着させ
る。未吸着蛋白質を同一緩衝液で洗浄し、酵素は
0.01〜0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）の直線濃度勾
配法で溶離する。該溶離液は45％飽和硫安で濃縮
後、セフアデツクスＧ―200による分子篩を行な
う。通過液中に含まれるアグマチンオキシダーゼ
の活性画分を濃縮し、硫安を添加して結晶化を行
なう。得られた結晶は六角板状である。精製酵素
は細胞抽出液に比べて比活性は約640倍に上昇し、
活性の収率は約30％である。 参考例 イ） 用いる試薬 (1) 被検液アグマチン含有（濃度未知）0.5ml。 (2) 次の組成からなる発色試薬 1.5ml 0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）100ml中に10mg４
―アミノアンチピリン，５mgペルオキシダーゼ
（比活性1000），0.2mlフエノールを含む。 (3) 酵素（6000unit／ml）0.5ml 上記(1)と(2)を試験管に入れて35℃で３分間予熱
する。次いで酵素液を加えて35℃で20分間反応さ
せる。一方コントロールとして、被検液の代りに
水を用いたものを同様に処理する。被検液の
505nmでの吸収値を求め、コントロールとの差△
Ａは0.235であつた。第５図の検量線より被検液
中のアグマチン含量は37.6μMすなわち94nmolで
あると分析した。
の反応液の吸光度値とは直線関係が認められる。
この原理により、溶液中の未知の濃度のアグマチ
ンを定量できる。又、この様に溶液中のアグマチ
ン濃度がアグマチンオキシダーゼによつて測定可
能となつた。この事実は、アグマチンの定量が関
与する分野において新たな定量手段、定量用キツ
トの作成を示唆するものである。 次に本発明の実施例について述べる。 実施例 １ ペニシリウム・クリソゲナムIFO4626を、培地
組成グルコース0.1％，スペルミジン0.025％，
KH2PO40.1％，K2HPO40.15％，MgSO4・
7H2O0.02％からなる培地９に接種して28℃で
48時間培養する。こうして得られた種培養液をプ
トレツシン0.25％，KH2PO40.1％，K2HPO40.15
％，MgSO4・7H2O0.02％からなる培地（殺菌前
PH5.5）80に加えて、28℃で48時間本培養を行
なう。培養終了後、過で菌体を集め（約420
ｇ）、0.02％メルカプトエタノールと0.1mM
EDTAを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）（以下
リン酸緩衝液にはすべて0.02％メルカプトエタノ
ールと0.1mM EDTAを含む）で洗浄し、同一緩
衝液に懸濁後、ダイノーミルで破砕する。この破
砕液より遠心分離（7000rpm，20分）で上澄画分
3.2を得た。該抽出液は直ちに上記緩衝液で平
衡化されたDEAE―セルロースカラム1.2に通
す。この操作で、アグマチンオキシダーゼは吸着
される。同じ緩衝液で吸着されない不純蛋白質を
洗浄し、次に緩衝液濃度を0.2Mに上昇させてア
グマチンオキシダーゼを溶離する。溶離された活
性画分は45％飽和の硫安濃度で硫安分画を行な
い、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で透析する。
透析酵素は0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡
化したDEAE―セルロースカラムに通す。同一緩
衝液で洗浄後、0.01M〜0.2Mリン酸緩衝液（PH
7.0）による直線濃度勾配法で酵素を溶離せしめ
る。活性画分は35％〜45％飽和の硫安濃度で硫安
分画を行ない、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
透析する。透析酵素液は同一緩衝液で平衡化した
ヒドロキシアパタイトカラムに通して吸着させ
る。未吸着蛋白質を同一緩衝液で洗浄し、酵素は
0.01〜0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）の直線濃度勾
配法で溶離する。該溶離液は45％飽和硫安で濃縮
後、セフアデツクスＧ―200による分子篩を行な
う。通過液中に含まれるアグマチンオキシダーゼ
の活性画分を濃縮し、硫安を添加して結晶化を行
なう。得られた結晶は六角板状である。精製酵素
は細胞抽出液に比べて比活性は約640倍に上昇し、
活性の収率は約30％である。 参考例 イ） 用いる試薬 (1) 被検液アグマチン含有（濃度未知）0.5ml。 (2) 次の組成からなる発色試薬 1.5ml 0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）100ml中に10mg４
―アミノアンチピリン，５mgペルオキシダーゼ
（比活性1000），0.2mlフエノールを含む。 (3) 酵素（6000unit／ml）0.5ml 上記(1)と(2)を試験管に入れて35℃で３分間予熱
する。次いで酵素液を加えて35℃で20分間反応さ
せる。一方コントロールとして、被検液の代りに
水を用いたものを同様に処理する。被検液の
505nmでの吸収値を求め、コントロールとの差△
Ａは0.235であつた。第５図の検量線より被検液
中のアグマチン含量は37.6μMすなわち94nmolで
あると分析した。
第１図は本発明のアグマチンオキシダーゼのPH
活性曲線であり、第２図は同じくPH安定性を、第
３図は至適温度を、第４図は温度安定性をそれぞ
れ示すものである。第５図はアグマチン定量にお
ける表５を図示したものである。
活性曲線であり、第２図は同じくPH安定性を、第
３図は至適温度を、第４図は温度安定性をそれぞ
れ示すものである。第５図はアグマチン定量にお
ける表５を図示したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするアグマチンオキシダーゼ。 ａ 作用 アグマチンに作用して、１モルのアグマチンよ
り１モルのγ―グアニジノブチルアルデヒドと１
モルのアンモニアと１モルの過酸化水素を生ず
る。 ｂ 基質特異性 アグマチンに特異性を有し、他のジアミン類に
は僅かに作用するが、ポリアミン類には実質的に
作用しない。 ｃ 至適PH 6.5〜7.0付近。 ｄ 安定PH範囲 5.5〜7.5（40℃、20分）。 ｅ 分子量 160000（ゲル濾過法）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8888781A JPS57206387A (en) | 1981-06-11 | 1981-06-11 | Acmatine oxidase and determining method of agmatine by the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8888781A JPS57206387A (en) | 1981-06-11 | 1981-06-11 | Acmatine oxidase and determining method of agmatine by the same |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13165389A Division JPH02119797A (ja) | 1989-05-26 | 1989-05-26 | アグマチンの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57206387A JPS57206387A (en) | 1982-12-17 |
| JPH0218833B2 true JPH0218833B2 (ja) | 1990-04-26 |
Family
ID=13955482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8888781A Granted JPS57206387A (en) | 1981-06-11 | 1981-06-11 | Acmatine oxidase and determining method of agmatine by the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57206387A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3954973B2 (ja) * | 2003-01-28 | 2007-08-08 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 酵素を組み合わせたアグマチンの電気化学的測定法 |
-
1981
- 1981-06-11 JP JP8888781A patent/JPS57206387A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57206387A (en) | 1982-12-17 |
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