JPH0242479B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アグマチンを酸化する酵素（以下ア
グマチンオキシダーゼという）を用いた新規なア
グマチンの定量法に関する。 更に詳細には、本発明は新規な酵素、アグマチ
ンオキシダーゼを用いて、アグマチンの新規な定
量法を提供するものである。 本発明者らは、ペニシリウム・クリソゲナムの
産生する多くの酵素を調査中、そのなかに特殊な
酵素が存在することを知り、その諸性質を調べた
ところ、本酵素がアグマチンを選択的に酸化する
新規酵素、アグマチンオキシダーゼであることを
確認し、このアグマチンオキシダーゼを用いて新
規なアグマチンの定量法を確立するに至つた。 一般に、アグマチンは、アルギニンが脱炭酸さ
れて生成する物質であり、ポリアミン類生合成経
路上の重要な物質である。又、ニトロソ化される
と強力な変異原性物質になることが知られてお
り、生体中あるいは種々の物質中のアグマチンの
量を知ることはきわめて重要で、かつ、必要とさ
れている。しかしながら、現在までに報告されて
いるアグマチンの分析法は、薄層クロマトグラフ
イー、ペーパークロマトグラフイー、アミノ酸分
析装置、ガスクロマトグラフイー等を用いる化学
的な分析方法のみであり、高価な器機と長時間の
分析時間を必要とする欠点を有し、アグマチン分
析の進歩に大きなさまたげとなつていた。 本発明者らは、こうした実情に鑑み、アグマチ
ンを酵素を用いて定量するために、アグマチンに
反応する酵素を工業的に、安価に、大量に製造す
る方法を確立すべく種々研究の結果、スペルミ
ン、スペルミジン、プトレツシン、アグマチン等
を単一の炭素及び窒素源、単一炭素又は単一窒素
源として生育しうるペニシリウム・クリソゲナム
（Penicillium chrysogenum）IFO4626をスペル
ミン、スペルミジン、プトレツシン、アグマチン
含有培地で培養し、培養物中に著量のしかも新規
なアグマチンの酸化酵素を生産蓄積することを見
い出し、これをアグマチンオキシダーゼと命名
し、このアグマチンオキシダーゼを用いて本発明
のアグマチンの定量法を完成したものである。 本発明に用いるアグマチンオキシダーゼは、ア
グマチンによる基質特異性を有し、他のジアミン
類には僅かに作用するが、ポリアミン類には実質
的に作用しない新規酵素である。 本発明に用いるアグマチンオキシダーゼは、次
の理化学的性質を有している。 １ 作用：次式に示す通り、アグマチンに作用し
て、１モルのアグマチンから１モルのγ−グア
ニジノブチルアルデヒドと１モルのアンモニア
と１モルの過酸化水素を生成する。 (イ) 過酸化水素の生成の確認 アグマチンに酵素の存在下でアグマチンオ
キシダーゼを作用させ、次いで該酵素系にペ
ルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、
フエノールを加えて反応させると反応系にキ
ノンイミン色素が生成する（過酸化水素とペ
ルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、
フエノールの反応についてはClin.Chem.20
巻、470頁（1974）に示されている）。 (ロ) アンモニアの生成の確認 アグマチンに酸素の存在下アグマチンオキ
シダーゼを作用させ、次いで該酵素系に次亜
塩素酸ナトリウム、フエノール、水酸化ナト
リウム、ニトロプルシドナトリウムを加え反
応させると反応液系にインドフエノールが生
成する（アンモニアと次亜塩素酸ナトリウ
ム、フエノール、水酸化ナトリウム、ニトロ
プルシドナトリウムの反応については、J.
Clin.Path.13巻、156頁（1960）に示されて
いる。） (ハ) γ−グアニジノブチルアルデヒドの生成の
確認 アグマチンに酸素の存在下アグマチンオキ
シダーゼを作用させ、次いで該酵素系に過マ
ンガン酸カリウムを添加し、生成されるアル
デヒドを酸化する。この溶液を以下に示す薄
層クロマトグラフイーで分析した結果、生成
アルデヒドの酸化物はγ−グアニジノブチル
酸と同定されたので、過マンガン酸カリウム
で酸化する前の生成物はγ−グアニジノブチ
ルアルデヒドと同定された。使用した薄層プ
レートはシリカゲル60−Ｆ−254（メルク社
製、西ドイツ）で展開溶剤は溶剤系１〔0.1モ
ルリン酸緩衝液PH7.0〕、溶剤系２〔ブタノー
ル：酢酸：水＝４：１：５（容量比）〕であ
る。展開後、ニンヒドリン反応、坂口反応を
行なつて、Rf値、色調が標品のそれと一致
することを確認した。 (ニ) 酸素の吸収量の確認 アグマチンにアグマチンオキシダーゼを作
用させた系中の酸素の消費は、酸素電極によ
つて測定した。その結果、過酸化水素の生成
量に見合う量の酸素の吸収が確認された。 ２ 基質特異性 アグマチンに対する活性を100としたときの
他の基質に対する相対活性の測定結果を表１に
示す。活性は生成する過酸化水素をペルオキシ
ダーゼ、フエノール、４−アミノアンチピリン
法で測定した。基質濃度はいずれも２ｍＭであ
る。

【表】

【表】 ３ 至適PH PH6.5〜7.0付近である（第１図に示す通り）。 ４ PH安定性 40℃で20分間処理した場合、PH5.5〜7.5にお
いて90％以上の残存活性を有する（第２図に示
す通り）。 ５ 至適温度 PH7.0において45℃付近にある（第３図に示
す通り）。 ６ 温度安定性 PH7.0において40℃20分間処理でもほぼ100％
の活性が残存する（第４図に示す通り）。 ７ 阻害剤、金属イオンの影響 (a) 各種阻害剤の影響について表２に示す。

【表】

【表】 ＊ パラクロロマーキユリベンゾエート
＊＊ エチレンジアミンテトラアセテート
(b) 金属イオンの影響について表３に示す。

【表】 ８ 等電点 PH5.7付近（アンホライン等電点電気泳動
法）。 ９ 分子量 160000（１量体）であるが、重合して320000
を示すこともある（セフアデツクスＧ−200ゲ
ル濾過法）。 10 サブユニツトの分子量 80000である（SDSデイスク電気泳動法）。 11 結晶形 六角形状（ピンク色）である。 12 補欠分子族 銅イオン 上記理化学的性質を持つたアグマチンオキシダ
ーゼは全く新規な酵素であるが、基質特異性等か
ら分類するとジアミン酸化酵素に分類されると考
えられる。現在までに微生物起源のジアミン酸化
酵素としてはプトレツシンオキシダーゼが知られ
ているのみである。又、動物ではブタ腎臓のジア
ミンオキシダーゼが、植物ではマメ科のジアミン
オキシダーゼが知られている。又、Aspergillus
terreusのアミンオキシダーゼは、分類上、動物
又は植物のジアミンオキシダーゼと同じ型に属し
ている。これらのアミンオキシダーゼとアグマチ
ンオキシダーゼの性質を比較して表４に示した。
但し、プトレツシンオキシダーゼは、アダチら
（O.Adachi et al）によるAgricultural and
Biological Chemistry30巻、1202〜1210頁
（1966）記載のものであり、ブタ腎臓のジアミン
オキシダーゼは、ヤマダら（Y.Yamada et al）
によるBiochemical and Biophysical Research
Communications29巻、723〜727頁（1967）記載
のものであり、マメ科のジアミンオキシダーゼ
は、ジエー・エム・ヒルら（J.M.Hill et al）に
よるBiochemical Journal91巻、171〜182頁
（1964）およびMethod in Enzymology17巻Ｂ、
730〜735頁記載のものであり、Aspergillus
terreusのアミンオキシダーゼは、ヤマダら（Y.
Yamada et al）によるAgricultural and
Biological Chemistry29巻、864頁〜869頁
（1965）およびMethod in Enzymology17巻Ｂ、
705〜709頁記載のものである。

【表】

【表】

【表】 表４より明らかな如く、本発明に用いるアグマ
チンオキシダーゼは、微生物起源の唯一のジアミ
ン酸化酵素であるプトレツシンオキシダーゼとは
基質特異性、阻害剤に対する挙動、分子量、補欠
分子族等の点で明らかに異なる。又、動物起源、
植物起源のジアミンオキシダーゼともその基質特
異性や分子量において大きく異なる。従つて、本
発明に用いるアグマチンオキシダーゼは、微生物
起源の全く新しいジアミンオキシダーゼである。 本発明に用いるアグマチンオキシダーゼは、ペ
ニシリウム・クリソゲナムIFO4626を培養するこ
とによつて得られるが、使用する培地としては、
炭素源、窒素源、無機物その他栄養素を程よく含
有する培地ならば合成培地または天然培地のいず
れも使用可能であり、液状でも固状でもよいが、
通常液体培地を使用する。そしてアグマチン、プ
トレツシン、スペルミジン、スペルミンの如きア
グマチンオキシダーゼの誘導物質を１種類又は２
種類以上適宜組み合わせて使用することが可能で
ある。 培養条件としては、培養開始時のPHは通常４〜
７の範囲で好適には５〜６付近で行なわれる。培
養温度は20〜40℃の範囲で好適には25〜35℃の範
囲で行なわれる。このような条件下で12〜120時
間培養すれば培養物中にアグマチンオキシダーゼ
が著量生成する。 こうして培養物中に生産蓄積されたアグマチン
オキシダーゼは次のごとき方法で採取される。ア
グマチンオキシダーゼは主として菌体中に存在す
るので、培養終了後菌体は濾過等の方法で集めら
れ、水または緩衝液でよく洗浄し、適量の緩衝液
に懸濁し、菌体内のアグマチンオキシダーゼを抽
出する。この場合の抽出操作は、酵素単離の常法
によつて抽出されうる。一方、菌体から培養液中
に遊離されたアグマチンオキシダーゼについても
培養濾過から常法により採取することができる。
これら菌体抽出物又は培養液より得られる粗アグ
マチンオキシダーゼをさらに精製するには、例え
ば等電点沈澱法、イオン交換クロマトグラフイ
ー、硫安による分画沈澱、ヒジロキシアパタイト
によるカラムクロマトグラフイー、セフアデツク
スによるゲル濾過、アフイニテイークロマトグラ
フイー等の方法を適宜組み合わせ、あるいは繰り
返すこと及び他の精製手段を必要に応じて用いる
ことができる。このようにして得られた高純度ア
グマチンオキシダーゼ含有液は、デイスク電気泳
動分析で単一であり、さらに濃縮し、硫安で結晶
化を行なうことにより、六角板状の結晶を得るこ
とができる。 次に本発明において用いたアグマチンオキシダ
ーゼの活性測定法を示す。 ４−アミノアンチピリン10mg、フエノール0.2
ml、ペルオキシダーゼ10mgを0.2Mリン酸緩衝液
（PH7.0）100mlに溶解して発色試薬を調製する。
この発色試薬1.5mlにアグマチン（10ｍＭ）0.5ml
と酵素液0.5mlを加えて反応させ、その１分間当
りの505nｍの吸光度変化量を測定する。 酵素液のアグマチンオキシダーゼ活性単位は次
の如く算出する。すなわち、毎分1.0nmolの過酸
化水素を生成せしめるアグマチンオキシダーゼの
量を１単位と規定する。このアグマチンオキシダ
ーゼ１単位は上記505nｍにおける吸収において
毎分0.0025の吸収増加に相当するものである。 次に本発明の新規酵素アグマチンオキシダーゼ
を用いるアグマチンの定量法について説明する。
アグマチンの定量法には、(イ)酸素の存在下アグマ
チンにアグマチンオキシダーゼを作用させ、生成
する過酸化水素を定量する方法、(ロ)同じく生成す
るアンモニアを定量する方法、(ハ)同じく生成する
γ−グアニジノブチルアルデヒドに、３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを作用させ
て、670nｍの吸光度を比色定量することにより、
アグマチンを定量する方法〔アルデヒドの定量は
M.A.Paz（Archives of Biochemistry and
Biophizics109巻548〜559（1965）による〕、(ニ)酸
素の存在下アグマチンにアグマチンオキシダーゼ
を作用させ、この系の酸素の吸収量を測定する方
法があげられる。ここでは(イ)の、生成する過酸化
水素量を測定することにより、アグマチンを定量
する方法について述べる。即ち、活性測定法の項
中、アグマチンの濃度を20μM、40μM、60μM、
80μM、100μM、120μM、160μM、と変え、比活
性約5000の酵素を約3000単位加えて20分間反応を
行なつて、505nｍでの反応の吸収値を求めると
次のような結果が得られた。

【表】 即ち、基質濃度（アグマチン濃度）と505nｍ
での反応液の吸光度値とは直線関係が認められ
る。この原理により、溶液中の未知の濃度のアグ
マチンを定量できる。又、この様に溶液中のアグ
マチン濃度がアグマチンオキシダーゼによつて測
定可能となつた。この事実は、アグマチンの定量
が関与する分野において新たな定量手段、定量用
キツトの作成を示唆するものである。 次に本発明の製造例及び実施例について述べ
る。 製造例 ペニシリウム・クリソゲナムIFO4626を、培地
組成グルコース0.1％、スペルミジン0.025％、
KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.15％、MgSO₄・
7H₂O0.02％からなる培地９に接種して28℃で
48時間培養する。こうして得られた種培養液をプ
トレツシン0.25％、KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.15
％、MgSO₄・7H₂O0.02％からなる培地（殺菌前
PH5.5）80に加えて、28℃で48時間本培養を行
なう。培養終了後、濾過で菌体を集め（約420
ｇ）、0.02％メルカプトエタノールと0.1ｍＭリン
酸緩衝液（PH7.0）（以下リン酸緩衝液にはすべて
0.02％メルカプトエタノールと0.1ｍＭ EDTA
を含む）で洗浄し、同一緩衝液に懸濁後、ダイノ
ーミルで破砕する。この破砕液より遠心分離
（7000rpm、20分）で上澄画分3.2を得た。該抽
出液は直ちに上記緩衝液で平衡化されたDEAE−
セルロースカラム1.2に通す。この操作で、ア
グマチンオキシダーゼは吸着される。同じ緩衝液
で吸着されない不純蛋白質を洗浄し、次に緩衝液
濃度を0.2Mに上昇させてアグマチンオキシダー
ゼを溶離する。溶離された活性画分は45％飽和の
硫安濃度で硫安分画を行ない、0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.0）で透析する。透析酵素は0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.0）で平衡化したDEAE−セルロ
ースカラムに通す。同一緩衝液で洗浄後、0.01M
〜0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）による直線濃度勾
配法で酵素を分離せしめる。活性画分は35％〜45
％飽和の硫安濃度で硫安分画を行ない、0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）で透析する。透析酵素液は
同一緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカ
ラムに通して吸着させる。未吸着蛋白質を同一緩
衝液で洗浄し、酵素は0.01〜0.1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）の直線濃度勾配法で溶離する。該溶離液
は45％飽和硫安で濃縮後、セフアデツクスＧ−
200による分子櫛を行なう。通過液中に含まれる
アグマチンオキシダーゼの活性画分を濃縮し、硫
安を添加して結晶化を行なう。得られた結晶は六
角形状である。精製酵素は細胞抽出液に比べて比
活性は約640倍に上昇し、活性の比率は約30％で
ある。 実施例 １ (イ) 用いる試薬 (1) 被検液アグマチン含有液（濃度未知）0.5
ml (2) 次の組成からなる発色試薬1.5ml 0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）100ml中に10mg
４−アミノアンチピリン、５mgペルオキシダ
ーゼ（比活性1000）、0.2mlフエノールを含
む。 (3) アグマチンオキシダーゼ（6000unit／ml）
0.5ml 上記(1)と(2)を試験管に入れて35℃で３分間予熱
する。次いで酵素液を加えて35℃で20分間反応さ
せる。一方コントロールとして、被検液の代りに
水を用いたものを同様に処理する。被検液の
505nｍでの吸収値を求め、コントロールとの差
ΔAは0.235であつた。第５図の検量線より被検液
中のアグマチン含量は37.6μMすなわち94nmolで
あると分析した。 実施例 ２ 酵素液：0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）にアグマ
チンオキシダーゼ（3000unit／ml）を溶解 酵素液１mlに上記実施例１の(1)被検液100μ
を入れて、30℃、20分間反応させ、酵素電極によ
り酵素活性にともなう消費酵素量を測定した。一
方コントロールとして、被検液の代りに水を用い
たものを同様に処理する。別に、被検液の代りに
濃度既知のアグマチン溶液より同様に操作して検
量線を作成した。その結果、被検液のアグマチン
含量は35μMであつた。 実施例 ３ 酵素液：0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）にアグマ
チンオキシダーゼ（6000unit／ml）を溶解 グルタミン酸脱水素酵素含有酵素液：0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）にα−ケトグルタール酸
（15ｍＭ）、NADPH（0.4ｍＭ）、グルタミン酸脱
水素酵素（15unit／ml）を溶解 上記実施例１の(1)被検液100μに酵素液１ml
を入れて、37℃、20分間反応させた。その後、グ
ルタミン酸脱水素酵素含有酵素２mlを添加し、37
℃、５分間反応後、340nｍにおける吸光度を測
定した。一方コントロールとして、被検液の代わ
りに水を用いたものを同様に処理する。別に、被
検液の代りに濃度既知のアグマチン溶液より同様
に操作して検量線を作成した。その結果、被検液
のアグマチン含量は36μMであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いることのできるアグマチ
ンオキシダーゼのPH活性曲線であり、第２図は同
じくPH安定性を、第３図は至適温度を、第４図は
温度安定性をそれぞれ示すものである。第５図は
アグマチン定量における表５を図示したものであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アグマチンもしくはその含有物に酸素の存在
   下アグマチンオキシダーゼを作用せしめて、酸素
   消費量を測定するか、あるいは生成するアンモニ
   ア、アルデヒドもしくは過酸化水素を定量するこ
   とを特徴とするアグマチンの定量法。