JPH02190200A - 核酸断片の検出法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は核酸断片の検出法及び装置に関する。

［従来の技術］ 最近遺伝子工学の進歩に伴い、特定の塩基配列を持−つ
核酸断片の検出を行なう頻度が増加している。

従来の交雑させた核酸断片の検出法は核酸断片を寒天又
はポリアクリルアミドのゲルを用いた電気泳動で分画し
、これをニトロセルロース等の吸着膜に物理的又は電気
的に転写し、かかる転写物に放射性同位元素で標識され
た一本鎖核酸を反応させ、これをオートラジオグラフィ
ーにて検出する方法が知られている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら従来の検出法はゲルの調製、電気泳動、膜
への転写及びオートラジオグラフィーの操作が煩雑且つ
時間がかかり、自動化に不適等の問題点がある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記問題点に鑑みて、極めて迅速に交雑さ
せた核酸断片を単離・同定ができる方法及び装置を開発
すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち
本発明は核酸断片をクロマトグラフィーで分画し、吸着
膜上に採集した後に変性させた試料と、標識された一本
鎖核酸とを交雑させ、この交雑物を検出する一連の核酸
断片の検出法並び正確に制御された分注、加熱、冷却、
加圧、吸引および標識化物の物理化学的性質を測定でき
る機能を備え、請求項１の検出に使用される自動検出装
置である。

本発明における核酸断片としてはあらゆる生物に由来す
る核酸断片が対象として挙げられる。好ましくは微生物
及び醋乳動物由来の核酸断片である。このような核酸断
片は、生物から調製したままの核酸を加熱又は制限酵素
を用いて断片化することによって得られる。好ましくは
画一化した断片パターンが必要であることから制限酵素
による調製で得られる制限酵素消化断片である。制限酵
素による調製法は通常の方法［例えば、トム・マニアチ
ス著、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＴｏｍＭａｎｉａｔｉ
ｓ　、ＭＯＬＥＣＵＬΔＲＣＬＯＮＩＮＧｌＣｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ−ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）　ｐ１０４．１９８２記載の方法］によって行なうこ
とができるがこれに限られるものではない。

核酸断片を分画するクロマトグラフィーの方法としては
固相担体中を核酸断片を含む液を通過させ、分子篩又は
電気的性質で断片長を分離するカラムクロマトグラフィ
ーの方法が挙げられる。具体的には市販されている高圧
液体クロマトグラフィー（例えば、ウォーターズ製）に
弱塩基性陰イオン交換樹脂であるゲンーパック　ディー
エヌエ・−またはシリカ等の無機物のゲルであるウルト
ラハイドロジェルＤＮＡ　（いずれもウォーターズ製）
を装着して用いる方法が挙げられる。

分画時には適当な移動相を用いる。移動相としては有機
及び無機塩を含む緩衝液が挙げられ、通常リン酸、ホウ
酸、酢酸、トリス等の緩衝系が挙げられるが分画に影響
がなければこれ以外の組成物でもかまわない。分画時の
移動相の流速及び圧力はそれぞれ通常０．叶〜５．Ｏｍ
ｌ／ｍｉｎ及び　２．０〜３００ｋｇ／ｃｍ２、好まし
くはそれぞれＯ，、ｔ〜３．０ｒｎｌ／ｍｉｎ。

及び５０．０〜２００ｋｇ／ｃｍ２である。特にカラム
内の圧力は分離に著しい悪影響を与えない限り高くする
ことが時間短縮の点で、また移動相の流速は遅くするこ
とが分画精度の点でそれぞれ好ましい。

分画した核酸断片は吸着膜上に採集される。吸着膜とし
ては、吸着膜の表面上液同志の相互汚染を防止するため
に分割された膜が挙げられる。又この膜としては、具体
的にはニトロセルロース膜、ナイロン膜、ジエチルアミ
ノエチルセルロース膜、グラスフィルター膜等が挙げら
れる。好ましくは、吸着強度、再現性の点からニトロセ
ルロース膜及びナイロン膜である。

相互汚染を防止する方法としては膜上の分画線に沿って
樹脂等を含む液を含浸させ、硬化させる方法又は予め所
定の分割処理した樹脂等のフィルムを膜上に圧着し加熱
、含浸させる方法等が挙げられる。その際使用される樹
脂としてはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビ
ニル、シリコーン及びポリウレタン等の合成樹脂又は蝋
及び油脂等の天然物が挙げられる。好ましくは８０℃以
上で溶融しない点でポリプロピレン、シリコ−・ン及び
ポリウレタンである。

吸着膜上に採集する方法としては分画液を直接滴下し採
集する方法及び−旦試験管様の容器に補集し、改めて膜
上に滴下する方法が挙げられる。

好ましくは、筒便さの点で直接採集する方法である。

分画・採集された核酸断片は分子内の水素結合を解かれ
、−末鎖に変性されて試料を得る。

変性はアルカリ液又は加熱による変性が挙げられる。好
ましくは再現性及び煩雑さの点からアルカリ変性である
。アルカリ変性の方法として、具体的には、核酸断片を
分画・採集した吸着膜に水酸化ナトリウムを含む水溶液
等を適量添加し、通常常温で約１０〜４０分程度放置し
、最後に中性溶液で洗浄することで核酸を変性する方法
が挙げられる。

変性させた試料はこの段階で膜上に吸着するが、更に強
固に吸着させるために必要に応じて膜上ｌ＼の固定化を
行なうことができる。好ましくは後述する交雑操作の点
で固定化を行なう。

膜へ固定化する方法としては加熱による方法が挙げられ
る。具体的には、変性した核酸断片を付着させた吸着膜
を、通常７０〜９０℃で１〜３時間常圧又は減圧条件下
で加熱する方法が挙げられる。

上記試料は標識されたー・末鎖核酸と交雑させることが
できる。交雑させるために必要な一本鎖核酸としては、
測定しようとする特定の核酸断片の塩基配列と相補の配
列をもつ核酸が挙げられる。

−末鎖核酸の調製法としては天然の２本鎖核酸を分離・
精製してもよく、又化学的方法で重合してもよい。−末
鎖核酸の塩基数は、通常５〜５０００であり、精度及び
感度の点で長い方が好ましいが、一定の塩基数以上では
余り変化がない。好ましくは相補鎖が認識でき、且つ精
度及び感度を確保できる５〜１００塩基である。

標識物質としては放射性同位元素、蛍光物質、発光物質
、酵素及びこれらを間接的に結合し得る化合物からなる
群より選ばれた物質が挙げられる。

具体的には放射性同位元素として［３２ＰＪ、　［”５
Ｓ］、　［”Ｈ］及び［”ＣＦ’、蛍光物質としてフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴの、テトラメチ
ルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アクリ
ジンオレンジ、フルオレセイン及びエチジウムブロマイ
ド等、発光物質としてルミノール及びルシフェリン等、
酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、β・−刀ラクトシダー・−ゼ及びグルコースオキシ
ダーゼ等、そして間接的に結合し得る化合物としてビオ
チン（アビジンが結合し得る）及び抗体（抗原及び２次
抗体が結合し得る）等がそれぞれ挙げられるがこれらに
限られるものではない。

標識化は、通常の方法であるニックトランスレーション
［例えばトム・マニアチス著、モレキュラー・クローニ
ング、コールド・スプリング・ハ・−バー・ラボラトリ
−（Ｔｏｍ　Ｍａｎｉａ−ｔｉｓ　、ＭＯＬＥＣＵＬＡ
ＲＣＬＯＮＩＮＧ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ｐ１０９．１９８２
に記載の方法］又は末端標識法［例えばトム・！ニアチ
ス著、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリ
ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｔｏｍ　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
　ｐ１２２，１９８２に記載の方法」による方法によっ
て容易に行なうことができる。又、これらの方法は市販
されている試薬キットにツクトランスレーションキット 製、５゛−末端標識キット　宝酒造製）を用いて行なっ
てもよい。

上記試料と一本鎖核酸とを交雑させる方法としては、上
記条件下で加熱固定した吸着膜上の核酸断片を、、放射
性同位元素等の適当な標識物質で標識された一本鎖核酸
と混合し、通常５０〜８０℃程度で約２〜２０時間、加
温振盪する方法が挙げられる。

又、これらの方法は市販されている試薬キット（ラピッ
ド　ハイブリダイゼーション　システム「マルチプライ
ム」　アマ−ジャム・ジャパン製）を用いて行なっ′Ｃ
もよい。

交雑させた核酸断片は、測定結果を即時的に明示または
記録する方法で検出することができる。

具体的には放射性同位元素を使用した場合の液体シンチ
レーションカウンター、蛍光及び発光を使用した場合の
蛍光光度計、酵素を使用した場合の吸光度光度計等で検
出する方法が挙げられる。検出時間は通常３〜４時間、
好ましくは１時間以内である。

本検出法によれば、具体的には核酸断片の調製から検出
器、通常４０〜５０時間要していた従来の方法に比べ１
７３以下の１５時間程度で可能である。

本検出法は正確に制御された分注、加熱、冷却、加圧、
吸引および標識化物の物理化学的性質を測定できる機能
を備えた自動検出装置を用いて行なうことができる。

この本発明の自動検出機器は本検出法を実施するにあた
り必要な機能、例えば試薬の分注、試料の分画・採集の
ための加圧、減圧及び反応のための加熱、冷却等を備え
ている他、検出を便ならしめるために種々の補助機能、
例えば試料の移動及び密封のための機能を付加させるこ
とができる。

本発明の検出装置の一例を第３図にフローダイアグラム
で示す。第３図において１はサンプルインジェクター、
２はＨＰＬＣ１３は定量分注器、４はアルカリ試薬タン
ク、５は中性緩衝液タンク、６はヒーター、７は標識化
サンプルタンク、８は恒温器、９は検出器、１０は記録
計を示す。

１のサンプルインジェクターに挿入された核酸断片のサ
ンプルは２を通過することで物理特性（例えば分子量、
荷電等）の順序で分画され、３の定量分注器で吸着膜上
に一定量づつ採集される。

かかる吸着膜上のサンプルは次に４のアルカリ試薬で一
本鎖に変性され、続いて中性緩衝液で洗浄される。（こ
の変性したサンプルは必要に応じて６のヒーターで加熱
され固定化される）　次に７の標識化サンプルを吸着膜
上の変性サンプルに滴下し８の恒温器で一定時間加温す
ることで交雑反応が行なわれる。この膜を中性緩衝液で
洗浄し、交雑しなかった標識−末鎖核酸を洗い落とし９
の検出器に導入する。検出器は標識物質の種類により特
定の検出器が用いられ、検出された結果は即時的に１０
の記録計に記録される。　本検出器に具備した一連の機
能により特定の核酸断片の検出が行なわれる。

［′実施例］ 以下、実施例及び比較例により、本発明を更に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１　プラスミドＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２）の特定
の断片の検出 １）核酸断片の調製 市販のｐＢＲ３２２（宝酒造製）と制限酵素ＢｇｌＩ（
ＴＯＹＯＢＯ製、ｐＢＲ３２２を３断片に切断する）と
からメーカー推薦の反応条件で完全消化し、フェノール
抽出、エタノール沈殿等の通常の操作を経て精製し、こ
れを核酸断片（ｐＢＲ３２２−Ｂｇｌ　Ｉ　’）として
以下の検討に用いた。

２）標識した一本鎖核酸の調製 市販のｐＢＲ３２２Ｐｒｉｍｅｒ　Ｈ（宝酒造製、塩基
数１６でｐＢＲ３２２と相補な塩基配列をもつ）及び［
γ−：１２ｐ］ＡＴＰ（５０００Ｃｉ／＋ｎｍｏｌｅ　
１０ｍＣ１／ｍｌ）とから市販の末端標識キット“ＭＥ
ＧＡＬＡＢＥＬ””’　　（宝酒造製）を用いてメーカ
ー推薦の反応条件でリン酸付加反応及び精製を行ない、
［”２Ｐ］Ｐｒｉｍｅｒ　（比活性：ＩｌＸ１０７ｃｐ
／μｇ）なる−末鎖核酸を調製した。

３）核酸断片の分画、変性及び固定化 ｐＢＲ３２２−Ｂｇｌ　Ｉ　　１０μｇＨＰＬＣＬＣ−
６Ａ　（島津製） カラム　　　　ＧＥＮ−ＰＡＫ　ＤＮＡ　（ウオ・−タ
ーズ製） 流速　　　　　１．０ｍｌ／ｍｉｎ。

移動相　　　　１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，
５）塩勾配　　　　０．７−１．０Ｍ−ＮａＣ１分画液
各０．２ｍｌを、分画液が相互に湿潤し合うことを防止
する目的でブロック状に分割したニトロセル口、−ス膜
に捕集し、風乾した。次に１．５Ｍ−ＮａＣ１ト０．５
Ｍ−ＮａＯＨ各０．２ｍｌをそれぞれのブロックに添加
し、室温で１時間放置した。更に続いて１．ＯＭ−Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　＋　１．５Ｍ−ＮａＣ１
各０．２ｍｌを各ブロックに添加し、同様に室温で１時
間放置した。最後にこのニトロセルロー”ス膜を減圧下
８０℃で２時間加熱し、固定化した。

４）交雑 Ｒａｐｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅ
ｍ−Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ　（アマージャム社製）を用
い［：１２Ｐ］Ｐｒｉｍｅｒと膜−ヒのｐＢＲ３２２−
Ｂｇｌ　Ｉとを交雑させた。交雑条件は以下の通り。

［””Ｐ］Ｐｒｉｍｅｒ濃度　　　４ｎｇ／ｍｌ交雑時
間　　　　　　２時間 ５）測定 交雑後のニトロセルロース膜を所定のサンプルバッグに
入れ、ヒー　トシールで密封した。このサンプルバッグ
を液体シンチレーションカウンタにて放射強度を直接測
定することで交雑した特定の核酸断片を検出した。

第１図に本検出法によるｐＢＲ３２２の特定の断片の測
定結果を示した。■は分画後の核酸断片の検出パターン
（２６０ｎｍの吸光度）、■は［３１２ｐ］標識−末鎖
核酸と交雑後の放射強度のパターン（ｃｐｍ）をそれぞ
れ示す。横軸は核酸断片をＨＰＬＣで分画した時の分画
順序である。この結果、塩基数１８１０の核酸断片が標
識−末鎖核酸と交雑することから、この部分に一本鎖核
酸の塩基配列に相補な塩基配列が存在していることがわ
かる。

因みに本実施例で核酸断片の調製から測定迄に要した実
時間は約１３時間であった。

実施例２　プラスミドＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２）の特定
の断片の検出 １）核酸断片の調製 実施例１．１）に準じた。

２）標識（ッた一本鎖核酸の調製 ｐＢＲ３２２における制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位の上
流に相補な塩基配列を持つ５０塩基のＰｒｉｍｅｒを化
学合成にて調製し、これとＰｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎ　（
コスモバイオ社製）とを通常の条件で混合し、光照射し
、Ｐｈｏｔｏｂｉｏｔ、ｉｎ標識Ｐｒｉｍｅｒ（Ｐｈｏ
−Ｐｒｉｍｅｒと記す）を調製しこれを、−末鎖核酸と
して使用した。

３）核酸断片の分画、変性及び固定化 実施例１．３）に準じた。

４）交雑 実施例１．４）に準じ、Ｐｈｏ−Ｐｒｉｍｅｒと膜上の
ｐＢＲ３２２−Ｂｇｌ　Ｉとを交雑させた。

５）測定 交雑後のニトロセルロース膜を分割線に沿って切り離し
、分画の順序で試験管に入れた。これにアビジン−パー
オキシダーゼ試薬及び基質溶液を加え、通常の酵素免疫
測定法にて実施されるように処理し、黄褐色液の４９２
ｎｍの吸光度を測定し、特定の核酸断片を検出した。

この結果も同様に、塩基数１８１０の核酸断片が標識−
末鎖核酸と交雑することから、この部分に一本鎖核酸の
塩基配列に相補な配列があることがわかった（結果省略
）。

尚、本結果は約１６時間の所要時間を要した。

比較例１ 実施例１ど比較するため上記と同様の試料を用いて通常
行なわれている方法に従った。

１）核酸断片の調製 実施例１．１）に準じた。

２）標識した一本鎖核酸の調製 実施例１．２）に準じた。

３）核酸断片の分画、変性及び固定化 ｐＢＲ３２２−Ｂｇｌ　Ｉ　（１０μｇ）を１．０％寒
天ゲル中で約４時間電気泳動し分画した。分画後、エチ
ジウムブロマイドにより蛍光染色し、核酸断片の位置を
確認し、続けてトム　・マニアチス著、モレキュラー・
クローニング、コールド・スプリング・ハバー・ラボラ
トリ−（Ｔｏｍ　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲＣＬＯＮＴＮＧ、Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　　３８３３８６、１
９８２に記載の方法に従ってニトロセルロース膜上に固
定化した。

４）交雑 実施例１．４）に準じた。

５）測定 交雑後のニトロセルロース膜をそのままラップフ、ｆル
ムに包み、Ｘ線フィルムに密着させ、−７０℃で約２０
時間静置し、そのオートラジオグラムを撮影し、特定断
片を検出した。

第２図に本検出法によるｐＢＲ３２２の特定の核酸断片
の測定結果を示した。図中太い実線部分は核酸断片の電
気泳動開始位置で破線は分画後の核酸断片の位置を示す
。この結果からも塩基数１８１０の核酸析片部分に−・
末鎖核酸と交雑し、感光したことがわかった。

但し、本比較例で特定の断片の調製から測定迄に要した
時間は実に約５０時間になった。

［発明の効果Ｊ 本発明は対象となる核酸断片に対して、標識された相補
配列を持つ−・末鎖核酸（プローブ）を交雑させ、特定
の核酸配列の存在を迅速に検出するのに適した検出法及
び検出装置である。本発明の検出法及び検出装置によれ
ば、従来の核酸断片の検出法と比較して安全且つ著しい
検出時間の短縮が可能となる。すなわち従来の検出法は
精度及び感度については概ね優れているが、操作が煩雑
で手間と時間がかかり、大量の試料を処理することは困
難である。特に本技術の対象分野である臨床検査分野で
は大きな問題となる。加えて、従来放射性同位元素を用
いる検出法では放射強度の大きい［：１２ｐｌを使用す
るため使用者の被爆が問題となる。しかし本発明の検出
法では放射強度の小さい［”Ｈ］及び［＋４ｃ］の使用
が可能となり、被爆量が軽減される。又更に安全を考慮
する場合には非放射性測定である蛍光又は吸光度等の利
用も考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における分画した核酸断片の吸光度の
パターン及び［：ｌ　２　ｐ］標識−末鎖核酸と交雑後
の放射強度のパターンをそれぞれ示す。 第２図は比較例１における核酸断片の電気泳動終了後の
位置及び［：ｌ　２　ｐ］標識−末鎖核酸と交雑後のオ
ートラジオグラムをそれぞれ示す。 又第３図は本発明の検出法に供される装置のフローダイ
アグラムである。図中１はサンプルインジェクター、２
はＨＰ　Ｌ　Ｃ１７は標識化サンプルタンク、９は検出
器をそれぞれ示す。 電気泳動終了後 オ ドラジオグラフィ 終了後

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、核酸断片をクロマトグラフィーで分画し、吸着膜上
   に採集した後に変性させた試料と、標識された一本鎖核
   酸とを交雑させ、この交雑物を検出する一連の核酸断片
   の検出法。 ２、核酸断片が制限酵素消化断片である請求項１記載の
   検出法。 ３、クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー
   である請求項１または２記載の検出法。 ４、吸着膜がニトロセルロース、ナイロン、ジエチルア
   ミノエチルセルロース及びグラスフィルターからなる群
   より選ばれる膜である請求項１〜３項のいずれか記載の
   検出法。 ５、吸着膜が、吸着膜の表面上で液同志の相互汚染を防
   止するために分割処理された膜である請求項１〜４のい
   ずれか記載の検出法。 ６、変性をアルカリ又は加熱により行なう請求項１〜５
   のいずれか記載の検出法。 ７、一本鎖核酸が、放射性同位元素、蛍光物質、発光物
   質、酵素及びこれらを間接的に結合し得る化合物からな
   る群より選ばれた物質で標識された請求項１〜６のいず
   れか記載の検出法。 ８、一本鎖核酸が化学的方法で合成させた核酸である請
   求項１〜７のいずれか記載の検出法。 ９、正確に制御された分注、加熱、冷却、加圧、吸引お
   よび標識化物の物理化学的性質を測定できる機能を備え
   、請求項１の検出に使用される自動検出装置。